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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSFACULTAD DE FARMACÌA Y BÌOQUÍMÌCA DEPARTAMENTO ACADÉMÌCO DE QUÍMÌCA BÁSÌCA APLÌCADA Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante TESÌS Para optar al Título Profesional de: QUÍMÌCO FARMACÉUTÌCO AUTOR Lady CIaudia BaItodano Torres; Juan Eduardo Yaipen Chicoma ASESOR Mg. César Máximo Fuertes Ruitón LIMA - PERÚ 2006 . . 1 AGRADECIMIENTOS . 3 RESUMEN . 5 SUMMARY . . 7 I. INTRODUCCIÓN . . 9 1.1. HIPÓTESIS: . . 10 1.2. OBJETIVO GENERAL: . . 10 1.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: . 10 II. GENERALIDADES . 11 2.1. BREVE RESEÑA HISTÓRICA. . . 11 2.2. QUITOSANO . 12 2.2.1. FUENTES Y MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE QUITINA . . 12 2.2.2. OBTENCIÓN DEL QUITOSANO . 13 2.2.3. CARACTERIZACIÓN DEL QUITOSANO. . 14 2.2.4. APLICACIONES DEL QUITOSANO . . 16 2.3. CICATRIZACIÓN DE LAS HERIDAS . 18 2.3.1. DEFINICIÓN . 18 2.3.2. FASES O PERIODOS DEL PROCESO DE CICATRIZACIÓN DE LAS HERIDAS . . 18 2.3.3. TIPOS DE CICATRIZACIÓN . . 21 2.3.4. FACTORES QUE MODIFICAN LA CICATRIZACIÓN. . . 22 2.3.5. EXPERIMENTOS REALIZADOS EN CICATRIZACIÓN. (42, 44, 45) . 23 2.4. CONSIDERACIONES FARMACOTÉCNICAS (46, 49, 50) . . 24 2.4.1. CONSIDERACIONES DE LAS FORMAS FARMACÉUTICAS DE USO TÓPICO . . 24 2.4.2. TIPOS DE FORMAS FARMACÉUTICAS DE USO TÓPICO . 25 III. PARTE EXPERIMENTAL: . 27 3.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS. . . 27 3.1.1. DEL ESTUDIO QUÍMICO: . . 27 3.1.2. DEL ESTUDIO FARMACOLÓGICO: . 28 3.2. METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS . . 29 3.2.1. DEL ESTUDIO QUÍMICO: . . 29 3.2.2. DEL ESTUDIO FARMACOLÓGICO: . 33 IV. RESULTADOS . 37 4.2.1. DEL ESTUDIO QUÍMICO: . 37 4.2.1.1. Rendimiento de quitina y de quitosano. . . 37 4.2.1.2. Caracterización deI Quitosano. . . 38 4.2.2. DEL ESTUDIO FARMACOLÓGICO. . 48 4.2.2.1 Determinación deI efecto cicatrizante de Ios ungüentos a base de quitosano por eI método de Ia fuerza de tensión (Método de Howes y coI.) . . 48 4.2.2.2 Determinación deI efecto cicatrizante de Ios ungüentos a base de quitosano por eI método deI corte histoIógico. . 52 V. DISCUSIÓN . . 55 VI. CONCLUSIONES . . 59 RECOMENDACIONES . 61 VII. BIBLIOGRAFÍA . . 63 ANEXOS . 67 Dedico la presente tesis a mis padres Aidé y Mariano, quienes con su ejemplo, paciencia e infinito amor, me han hecho la persona humana, integra y profesional que soy hoy en día. A mis hermanos Dany y July por escucharme, apoyarme y siempre estar a mi lado. A mis sobrinas Xiomara, Sofía, Daniela y Camila por ser la luz que ilumina mis días y la esperanza de un nuevo e inocente sonreír. A mi compañera de tesis Lady por ser la persona que ha sabido apoyarme y comprenderme, y estar conmigo tanto en los buenos y malos momentos. A mis profesores, amigos de la Facultad por estar conmigo en todo este tiempo transcurrido en la universidad. JUAN Dedico este logro a mis padres Erico y Candy por enseñarme a transformar en realidad mis sueños y aspiraciones, por su gran corazón, apoyo y dedicación para con sus hijas. A mis hermanas Mirella y Celia por su amor, apoyo infinito y estar en todo momento conmigo. A mis familiares, es casi imposible nombrarlos a todos, pero ello no reduce su contribución y mi expresión de gratitud. A mi compañero de tesis Juan, a quien admiro por sus esfuerzos para el logro de su carrera y de este trabajo, por su paciencia y comprensión. A mis maestros y compañeros por su tiempo, por su apoyo así como por la sabiduría que me transmitieron en el desarrollo de mi formación profesional. LADY "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 1 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 2 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" AGRADECIMIENTOS Expresamos nuestros más sinceros agradecimientos a: · - A Dios, quien nos ilumina y guía en todo momento. · - A nuestra Alma Mater y en especial a la Facultad de Farmacia y Bioquímica por nuestra formación profesional y permitirnos ser parte de ella. · - Nuestro Profesor Guía Dr. Cesar M. Fuertes Ruitón, por su amistad, paciencia y su constante apoyo durante el desarrollo de esta tesis. · -A nuestros profesores de la Facultad de Farmacia y Bioquímica - UNMSM, por sus aportes académicos y amistad. · - A las cátedras de: Química Orgánica, Farmacognosia, Farmacotecnia y Farmacología, por su cooperación para la realización de esta tesis. · - Al Departamento de Histopatólogia del Hospital Arzobispo Loayza. · - Asimismo agradecemos a aquellas personas amigas, familiares que mediante su apoyo brindado y motivación hicieron posible este logro. · - De igual forma deseamos expresar nuestro agradecimiento al Jurado Examinador y Calificador de esta tesis - Presidente: Dr. Pablo Bonilla Rivera - y los Miembros: Mg. Luis Rojas Ríos - Q.F. Rosario Carreño Quispe - Q.F. Alfredo Castillo Calle por sus sugerencias. AGRADECIMIENTOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 3 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 4 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" RESUMEN En el presente trabajo se estudió el efecto cicatrizante del quitosano, obtenido por desacetilación a partir de quitina de los caparazones del cangrejo de la variedad Cancer cetosus “Cangrejo Peludo”, bajo la forma farmacéutica de ungüento a diferentes concentraciones. Para ello se aisló la quitina de los caparazones de cangrejos, se obtuvo el quitosano por desacetilación y se identificó por método espectrofotométrico (IR), solubilidad y determinando el grado de desacetilación mediante titulación potenciométrica y posteriormente se formuló el ungüento. Para la determinación del efecto cicatrizante se utilizó el test de cicatrización descrito por Howes y col, para heridas incisas, en el cual se emplearon 48 ratones albinos hembras de la especie Mus músculos de 1 mes y medio de edad, con un peso dentro del rango de 25 a 33g. Las muestras se administraron cada 12 horas por un periodo de 72 horas, al término del cual se cuantificó la resistencia que ofrecían las heridas tratadas, comparándolas con sus respectivos controles y se realizaron cortes histológicos para observar el grado de evolución histológica del proceso de cicatrización. El quitosano, obtenido por desacetilación a partir de quitina presenta mayor efecto cicatrizante bajo la forma farmacéutica de ungüento al 0,25% (79,28% efecto cicatrizante) en comparación con el grupo control (base del ungüento) se concluye que en las condiciones de ensayo el quitosano posee un significativo efecto cicatrizante. Palabras Clave: quitosano, quitina, espectro IR, titulación potenciométrica, ungüento, efecto cicatrizante. RESUMEN "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 5 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 6 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" SUMMARY In the present work the wound healing effect of the chitosan was studied, the chitosan obtained for desacetylation of chitin from the crab´s shells of the variety Cancer cetosus "Shaggy Crab ", under the pharmaceutical form of unguent at different concentrations. For it there was isolated the chitin from the shell of crabs, the chitosan was obtained for desacetylation and identified by spectrophotometric method (IR), solubility, determining the degree of desacetylatión by way of potentiometric qualifications and later the unguent was formulated. For the determination of the wound healing effect we used the test of wound healing described by Howes and col., for incision wounds; we used 48 female albino mice of the species Mus músculos of 1 month and a half of age, with a weight inside the range of 25 to 33g. The samples were administrated every 12 hours for a period of 72 hours., at the conclusion of the experiment the resistance that the treated wounds were offering, was quantified verifying them with their respective controls and histological cuts were realized to observe the degree of histological evolution of the process of wound healing. The chitosan, obtained by desacetylation from Chitin presents major wound healing activity under the pharmaceutical form of unguent at 0,25% (79,28% wound healing effect) in comparison with the group control (base of the unguent), it is concluded that under the test conditions chitosan possesses a significant healing wound effect. Key words: Chitosan, chitin, IR spectrum, potentiometric titration , unguent, wound healing effect. SUMMARY "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 7 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 8 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" I. INTRODUCCIÓN La producción mundial de crustáceos (cangrejo, camarón, langosta, etc.) se ha incrementado enormemente en los últimos años. En general solamente el 20 a 30 %, del peso vivo de estas especies de crustáceos es utilizado para la alimentación humana; el resto constituido por vísceras y exoesqueleto, considerados como contaminantes ambientales (desechos), constituyen compuestos de valor comercial no aprovechados tales como quitina, proteínas, pigmentos y minerales. Debido a la variabilidad de fuentes de materias primas de caparazones de crustáceos y métodos de obtención de quitina es oportuno realizar este trabajo con el fin de obtener productos de interés comercial, y tecnología transferible a los sectores productivos del país. Los derivados de quitina tienen un inmenso campo de aplicación con relevante valor económico, así el uso en la industria alimentaría involucra importantes volúmenes, en la industria farmacéutica para la preparación de productos de liberación prolongada, entre otros. La búsqueda de nuevos biomateriales con propiedades específicas, es un campo de interés científico y tecnológico que orienta los esfuerzos de muchos centros de investigación. La utilización en la medicina, industria textil, la agricultura y el tratamiento de aguas como bioremediador, son ejemplos de sus vastas aplicaciones. El presente trabajo de tesis trata de satisfacer de algún modo las necesidades de salud de nuestro país mediante la transformación de caparazones de cangrejos, tan abundantes en nuestro país, en un producto farmacéutico eficaz en el proceso reparador de la piel. I. INTRODUCCIÓN "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 9 1.1. HIPÓTESIS: La forma farmacéutica semisólida (ungüento) de aplicación tópica elaborada a base de quitosano, obtenido y caracterizado, posee efecto sobre la reparación tisular como cicatrizante externo. 1.2. OBJETIVO GENERAL: - Obtener, caracterizar el quitosano a partir de la quitina y diseñar una forma farmacéutica semisólida (ungüento), de aplicación tópica con efecto cicatrizante. 1.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: - Extraer y aislar quitina - Obtener quitosano a partir de la quitina. - Caracterizar la quitina y quitosano. - Determinar el grado de desacetilación del quitosano. - Comprobar el efecto cicatrizante de quitosano bajo una forma farmacéutica. Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 10 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" II. GENERALIDADES 2.1. BREVE RESEÑA HISTÓRICA. Por su amplia distribución en la naturaleza la quitina es el segundo polisacárido en abundancia, después de la celulosa. Se encuentra principalmente en los caparazones de crustáceos y formando parte del exoesqueleto de los insectos, así como también en las paredes celulares de muchos hongos, levaduras y algas. (1,2) La quitina fue aislada por primera vez en 1811, a partir de hongos superiores, por Braconnot, quien le asignó el nombre de fungina. Posteriormente Odier, en un artículo sobre insectos reportó que había encontrado en algunos insectos la misma sustancia que forma la estructura de las plantas, llamándola "quitina¨ (del griego tunic, envoltura). El quitosano fue descubierto por Rouget en 1859, quien encontró que al tratar quitina con una solución caliente de hidróxido de potasio se obtiene un producto soluble en ácidos orgánicos. Esta "quitina modificada¨, como él la llamó, se tornaba de color violeta en soluciones diluidas de ioduro y ácido, mientras la quitina era de color verde. Pero no es hasta 1894 cuando Hoppe-Seyler sometió la quitina a reflujo a 180 ºC en hidróxido de potasio y observó que el producto que se formaba era bastante soluble en ácido acético y clorhídrico y lo denominó quitosano. (2,3) II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 11 2.2. QUITOSANO El quitosano es un polisacárido obtenido por desacetilación de la quitina. Se encuentra en estado natural en las paredes celulares de algunos hongos; sin embargo, su principal fuente de producción es la hidrólisis de la quitina en medio alcalino, usualmente en soluciones de hidróxido de sodio o de potasio, a altas temperaturas. (2) Figura Nº 1 Estructura química de (A) quitina y (B) quitosano parcialmente desacetilado El quitosano posee un comportamiento marcadamente básico debido al grupo amino libre en su estructura, lo cual además le proporciona ciertas características químico-físicas de gran interés industrial. (3,4) 2.2.1. FUENTES Y MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE QUITINA La principal fuente de obtención de la quitina son los desechos de los crustáceos especialmente de los caparazones de cangrejo peludo, cangrejo violáceo, jaiva, langosta, langostino que se encuentra en mayor cantidad a lo largo de las costas del litoral peruano. Estos compuestos con proporciones variables de proteínas, sales de calcio, quitina y pequeñas cantidades de grasa y pigmentos. El aislamiento de quitina requiere tres operaciones básicas (4, 5) - Desmineralización: Para eliminar la materia inorgánica. - Desproteinización: Para la separación de la proteína. - Decoloración: Para la separación de los pigmentos lipídicos (carotenoides). 2.2.1.1. Acondicionamiento de Ia materia prima Consiste en el lavado con agua de los caparazones a procesar y separación de la masa orgánica que pueda quedar adherida a los mismos. Posteriormente se seca la muestra hasta peso constante y luego se procede a su molienda hasta el tamaño de partículas adecuado para la extracción, que generalmente es de varios milímetros. 2.2.1.2. DesmineraIización El principal componente inorgánico de los caparazones de los crustáceos es el carbonato Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 12 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" de calcio, y en menor proporción por fosfato de calcio, los cuales son eliminados empleando soluciones diluidas de ácido clorhídrico (hasta 10%) a temperatura ambiente, aunque también se han utilizado otros ácidos (HNO 3 , HCOOH, H 2 SO 4 , y CH 3 COOH). La concentración del ácido y el tiempo de tratamiento dependen de la fuente, pero deben evitarse los tratamientos a temperaturas altas, que provocan la degradación del polímero. Un tratamiento alternativo para disminuir la degradación consiste en el empleo del agente acomplejante EDTA (8,9). 2.2.1.3. Desproteinización La desproteinización puede ser química o enzimática. En el proceso químico los exoesqueletos de los crustáceos son tratados, normalmente, con soluciones de hidróxido de sodio que varía de 1 a 10% a temperaturas entre los 65 y 100 ºC durante un periodo de 1 a 24 horas con el fin de disolver la proteína. En ocasiones se prefiere realizar dos tratamientos consecutivos por tiempos cortos. Hay que tener en cuenta que tratamientos por largo tiempo o a temperaturas muy altas pueden provocar ruptura de las cadenas y la desacetilación parcial del polímero. (8,10). El proceso enzimático consiste en la digestión enzimática o fermentación con bacterias proteolíticas con actividad no quitinolítica, por ejemplo, Pseudomonas maltophila. Este proceso presenta la ventaja de que disminuye la degradación química de la quitina y además protegen las condiciones del medio ambiente, sin embargo no se consigue la eliminación completa de la proteína. (3) 2.2.1.4. DecoIoración La coloración de los caparazones de crustáceos se debe fundamentalmente a la presencia de pigmentos carotenoides tales como la astaxantina, la cantaxantina, el astacina, la luteína y el µ-caroteno. Los tratamientos anteriores generalmente no son capaces de eliminar estos pigmentos, los que suelen extraerse a temperatura ambiente con acetona, cloroformo, éter, etanol, acetato de etilo o mezcla de solventes. También se han empleado agentes oxidantes tradicionales, como el peróxido de hidrogeno (0.5-3%), el hipoclorito de sodio (0.32%) y permanganato de potasio al 0.02% a 60 ºC, aunque debe tenerse presente que éstos suelen atacar los grupos aminos libres e introducir modificaciones en el polímero. (3, 10, 11) 2.2.2. OBTENCIÓN DEL QUITOSANO La obtención del quitosano se produce por desacetilación de la quitina y se puede realizar mediante procesos químicos o enzimáticos. Sin embargo las condiciones específicas de la reacción dependerán de diversos factores, tales como el material de partida, el tratamiento previo, y el grado de desacetilación deseado. (6, 7) 2.2.2.1. EI Método químico: Se puede llevar a cabo de dos formas, homogénea y heterogénea (12). II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 13 2.2.2.1.1. La desacetiIación homogénea. Consiste en que la quitina es suspendida en el álcali y la suspensión es refrigerada con hielo para disolver la quitina en la solución. Luego se somete a desacetilación a temperaturas cercanas a la del ambiente durante períodos largos de tiempo. Esto permite que la reacción no se localice en determinados lugares de la cadena y que el ataque a los grupos amidas sea más uniforme (13). 2.2.2.1.2. La desacetiIación heterogénea. Consiste en que las moléculas de quitina son dispersadas en una solución alcalina caliente, generalmente de hidróxido de sodio. Las condiciones en las que se lleva a cabo la desacetilación heterogénea pueden reducir la longitud de la cadena por este motivo es conveniente repetir varias veces el tratamiento alcalino por cortos periodos de tiempo y aislando el producto en cada etapa. Para disminuir la pérdida de peso molecular del polímero es conveniente la ausencia de oxígeno o la presencia de un antioxidante para evitar su despolimerización (13, 14). Se ha demostrado que mientras que el quitosano obtenido en el proceso heterogéneo presenta polidispersión del grado de acetilación de sus cadenas, mientras que el obtenido por vía homogénea tienen la misma composición (15). 2.2.2.2. EI método enzimático. La principal ventaja de este método respecto al químico es la obtención de un material uniforme en sus propiedades físicas y químicas, hecho muy apreciado para aplicaciones biomédicas. La quitina desacetilasa es la enzima que cataliza la conversión de quitina a quitosano por la desacetilación de los residuos N-acetil-D-glucosamina. La limitación de este método es que la enzima no es muy efectiva en la desacetilación de quitina insoluble y por lo tanto es necesario un pre tratamiento. En la actualidad se exploran otros métodos más novedosos para desacetilar la quitina que hace uso de la radiación con microondas o de tratamientos termo-mecánicos, entre otros. (16, 17) 2.2.3. CARACTERIZACIÓN DEL QUITOSANO. Tanto la composición de las cadenas de quitosano, como sus dimensiones, suelen variar dependiendo del material de partida y de la rigurosidad del método de obtención. Por este motivo, la aplicación de método espectrofotométrico (ÌR), la solubilidad y el grado de desacetilación son parámetros que se deben conocer para caracterizar una muestra de este polisacárido ya que tienen gran incidencia en sus propiedades. Otros parámetros a determinar para su caracterización más completa serían, el peso molecular, el porcentaje de humedad, el contenido de cenizas, las proteínas totales, la cristalinidad, la determinación del contenido de material insoluble, etc.(4, 10) Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 14 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 2.2.3.1. Método espectofotométrico (IR). Uno de los métodos mas usados para la identificación de quitina y quitosano es la identificación por Espectrofotometría Ìnfrarroja (ÌR). En el análisis de estos compuestos por espectroscopía ÌR se puede identificar principalmente los grupos funcionales amida y carbonilo. Para la quitina las vibraciones de estiramiento del grupo NH tienen dos frecuencias moderadamente intensas. En los espectros de muestra sólida, estas bandas se observan en rango de 3500 a 3180 cm -1 debido al enlazamiento de hidrogeno; la frecuencia del carbonilo se observa en la banda intensa en la región de 1680 a 1630 cm-1y una banda intensa en la región de 1640 a 1550 que corresponde a la deformación del enlace NH, cuando se examina en estado sólido. Mientras que para el quitosano las bandas de intensidad media correspondientes a vibraciones de estiramiento del NH ubicadas en la región de 3500-3300 cm -1 y la banda deabsorción de intensidad media a fuertes relativa a vibraciones de deformación del grupo amino a una frecuencia entre 1640 a 1500 cm -1 . (18, 19) 2.2.3.2. SoIubiIidad La presencia de grupos amino a lo largo de la cadena de quitosano permite la disolución de esta macromolécula en disoluciones de ácidos diluidos, por medio de la protonación de esos grupos. En medios ácidos diluidos tiene lugar el siguiente equilibrio: Al adquirir carga positiva la amina, el quitosano aumenta su capacidad hidrofílica y pasa a ser soluble en soluciones ácidas diluidas formando sales ya que el pKa del grupo amino en el quitosano es 6,5. El quitosano se puede solubilizar en ácido clorhídrico, bromhídrico, iodhídrico, nítrico y perclórico diluidos. En cambio es insoluble en ácido sulfúrico diluido. También es insoluble en la gran mayoría de disolventes orgánicos como el alcohol. El quitosano, al igual que la quitina, es insoluble en agua. (3) 2.2.3.3. Determinación deI grado de desacetiIación El grado de desacetilación se define como el contenido en grupos aminos presentes en la cadena polimérica. Existen numerosos métodos para determinar el grado de desacetilación del quitosano basados en diversas técnicas. Entre estas técnicas podemos destacar la espectroscopía de infrarrojo (ÌR) (20), la espectroscopía de UV (21), La espectroscopía de RMN (21), la potenciometría (4) y la conductimetría (23). 2.2.3.3.1. VaIoración potenciométrica Consiste en disolver quitosano en un exceso conocido de ácido clorhídrico y se valora con hidróxido de sodio. Se obtiene, así, una curva de pH frente a volumen de NaOH II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 15 añadido que presenta dos puntos de inflexión. La diferencia de volumen entre estos dos puntos se corresponde con el ácido consumido para la protonación de los grupos amino y permite determinar el grado de desacetilación. La valoración se realiza utilizando un potenciómetro (4). 2.2.4. APLICACIONES DEL QUITOSANO El quitosano debido a sus propiedades físico-químicas, funcionales y biológicas tiene una gran variedad de aplicaciones que abarcan campos tan diferentes como la medicina, la farmacia, la agricultura, la alimentación y el sector textil entre otros. (3, 10, 24) Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 16 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" ÁREAS APLICACIONES TRATAMÌENTOS DE AGUA Removedores de iones metáIicos. Quelantes de metales de transición y contaminantes ambientales. Floculantes, coagulantes y precipitantes de proteínas, aminoácidos, tintes, colorantes, algas, aceites, metales radioactivos, partículas en suspensión y pesticidas. ÌNDUSTRÌA ALÌMENTARÌA. Aditivos en los alimentos. Espesantes, gelificantes y emulsionantes. Mejora la textura. Estabilizantes del color. Agentes que previene la precipitación del vinagre. Aditivos con características nutricionales. Aditivos para la alimentación animal. Envoltura y recubrimiento protector de alimentos. Retrasa el envejecimiento. Disminuye la oxidación. Disminuye las perdidas por transpiración y Protege frente al ataque de hongos. PROCESOS ÌNDUSTRÌALES Agente purificador de azúcar. Clarificador en industrias de bebidas. Coagulación del queso. Retardador del oscurecimiento enzimático de manzana y pera. MEDÌCÌNA Propiedades antimicrobianas. Capacidad de retención de humedad. BÌOTECNOLOGÍA Ìnmovilización de enzimas. Separación de proteínas. Ìnmovilización celular. Reacción con aldehídos. Captación de células y enzimas. AGRÌCULTURA Bioestimulante de plantas en tratamientos de semillas, raíces y hojas. En tratamientos post cosecha de frutas y verduras con el fin de aumentar su conservación. Recubrimientos de semilla. Conservación de frutas. Protección frente a plagas y hongos, virucida. Estimulante del crecimiento. COSMÉTÌCOS Propiedades humectantes. Propiedades abrasivas. ÌNDUSTRÌA PAPELERA Elaboración de papeles. Aumenta el rendimiento de la pulpa. La capacidad de retención de agua. II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 17 ÁREAS APLICACIONES TECNOLOGÍAS DE MEMBRANA Para la separación de componentes. Absorbentes de encapsulación. Control de permeabilidad. Osmosis inversa. ÌNDUSTRÌA TEXTÌL Evita el encogimiento de los tejidos. Fija el color. Componentes de fibras que se utilizan en la mejora de lanas. Ìmpermeabilización de algodones y linos. 2.2.4.1. ApIicaciones deI quitosano en medicina y farmacia El quitosano es un polímero biocompatible, biodegradable, no-tóxico y muco adhesivo, lo que la hace atractiva para aplicaciones en medicina y farmacia. Es degradada por la lizosima y la lipasa. Los productos de la degradación enzimática del quitosano no son tóxicos (25). Además el quitosano es un buen hemostático (26). Se sabe que el quitosano es hipocolesterolémico e hipolipidémico, posee actividad antimicrobiana, antiviral y antitumoral. El quitosano presenta actividad cicatrizante y se ha sugerido que el mecanismo por el cual el quitosano ejerce su acción cicatrizante es mediante la activación de neutrófilos y macrófagos, la migración de polimorfonuclear y células mononucleares, acelerando la regeneración de tejido conectivo y angiogénesis (27,28). Es posible que las moléculas positivamente cargadas de quitosano adsorban algunas sustancias implicadas en la proliferación de célula y la migración, como factores de crecimiento y citocinas, del plasma en la sangre o exudado en la herida y que las sustancias adsorbidas estimulan la proliferación de célula y la migración. (29-32) 2.3. CICATRIZACIÓN DE LAS HERIDAS 2.3.1. DEFINICIÓN La cicatrización es el conjunto de procesos biológicos, físico-químicos y celulares que se producen como respuesta de los tejidos a una lesión y tiene como finalidad, obtener la recuperación funcional de los mismos, mediante la formación de un tejido fibroso. (33-36) 2.3.2. FASES O PERIODOS DEL PROCESO DE CICATRIZACIÓN DE LAS HERIDAS Ìndependientemente del tipo de la herida de que se trate y de la extensión que abarque la Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 18 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" pérdida de tejido, cualquier curación de herida discurre en fases que se solapan en el tiempo y no pueden ser disociadas unas de otras. Por lo general la curación se divide en tres fases a saber: (Figura Nº 2) Figura Nº 2 Fases de la Cicatrización 2.3.2.1. La Fase infIamatoria / exudativa: Hemostasia y Iimpieza de Ias heridas La fase inflamatoria / exudativa se inicia en el momento en que se produce la herida y su duración es aproximadamente de tres días dependiendo de las condiciones fisiológicas. Las primeras reacciones vasculares y celulares consisten en la coagulación y la hemostasia y concluyen después de haber transcurrido aproximadamente 10 minutos. Por medio de la dilatación vascular y un aumento de la permeabilidad vascular se consigue intensificar la exudación de plasma sanguíneo en el intersticio. Con ello se fomenta la migración de los leucocitos hacia la zona de la herida, sobre todo de granulocitos y macrófagos neutrófilos, cuya función prioritaria consiste en limpiar y proteger a la herida de posibles infecciones a través de la fagocitosis. Al mismo tiempo liberan mediadores bioquímicamente activos, que activan y estimulan células de gran importancia para la siguiente fase del proceso curativo de la herida. Los macrófagos juegan un papel clave en esta fase. 2.3.2.2. La Fase proIiferativa o de proIiferación: Reconstitución de Ios tejidos granuIares II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 19 En la segunda fase de la curación de la herida predomina la proliferación celular con el fin de alcanzar la reconstitución vascular y de volver a rellenar la zona defectuosa mediante el tejido granular. Esta fase comienza aproximadamente a partir del cuarto día desde que se produjo la herida, las condiciones necesarias ya han sido previamente establecidas en la fase inflamatoria-exudativa: los fibroblastos ilesos de los tejidos colindantes pueden migrar al coágulo y a la retícula de fibrina que ha sido formado mediante la coagulación sanguínea y utilizarla como matriz provisoria, las citocinas, y los factores de crecimiento estimulan y regulan la migración y proliferación de las células encargadas de la reconstitución de tejidos y vasos. 2.3.2.3. La Fase de diferenciación y de reconstitución: Maduración, cicatrización y epiteIización. Aproximadamente entre el 6º y el 10º día comienza la maduración de las fibras de colágeno. La herida se contrae, se reduce cada vez más la presencia vascular y de agua en el tejido granular, que gana en consistencia y se transforma finalmente en el tejido cicatricial. La epitelización cierra el proceso de curación de la herida. Este proceso incluye la reconstitución de las células epidermales a través de la mitosis y la migración celular, principalmente desde los bordes de la herida (Figura Nº 3). (37-39) Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 20 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Figura Nº 3 Fases de la cicatrización (1) Fase inflamatoria (2) Fase proliferativa (3a) Fase de maduración y (3b) Reparación 2.3.3. TIPOS DE CICATRIZACIÓN Los Tipos de cicatrización se dividen en primera y segunda intención (Figura Nº 4). (40-42) TabIa Nº 2 Cuadro comparativo de Ios tipos de cicatrización. II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 21 Cicatrización por primera intención Cicatrización por segunda intención Poca pérdida de tejido Gran pérdida de tejido Bordes superpuestos Bordes tortuosos Tejido de granulación en pequeña cantidad Abundante tejido de granulación Cicatriz pequeña Cicatriz grande Evolución rápida Evolución lenta Figura Nº 4 Tipos de Cicatrización 2.3.4. FACTORES QUE MODIFICAN LA CICATRIZACIÓN. Existen factores generales y locales que influyen en la cicatrización. (43, 44) 2.3.4.1. Factores generaIes: - Edad: A mayor edad, disminuye la circulación y la formación de colágeno, lo que Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 22 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" produce enlentecimiento del proceso de cicatrización. - Nutrición: En personas con proteinemia baja, oligoelementos (Ca, Mg, ZnO) y vitaminas A, C y E bajas, el proceso de cicatrización se enlentece por la escasa síntesis de colágeno. - Enfermedades: Algunas de ellas, como diabetes, ateroesclerosis, cáncer y patologías renales provocan disminución en la producción de colágeno. - Fármacos: ACTH, cortisona y otros glucocorticoides, usadas en dosis altas retarda la síntesis proteica y la fibroplastia. También disminuyen los fenómenos inflamatorios locales que intervienen en el proceso de cicatrización. Mientras que los citotóxicos usados por vía general o tópica inhiben la proliferación de los tejidos de alta capacidad mitósica, como es el tejido de granulación. - Ìrradiación: Las altas dosis de radiación en especial durante los tres primeros días del proceso de cicatrización, retrasan notablemente la ganancia de resistencia. 2.3.4.2. Factores IocaIes: - Ìnfección: Es la más importante porque produce disminución de la formación de colágeno, aumento de su síntesis y destrucción del tejido de granulación. - Humedad: El ambiente húmedo favorece la cicatrización de acuerdo a lo demostrado en diversos estudios. - Suministro sanguíneo: Mantener una circulación adecuada es vital para el aporte de nutrientes y oxígeno necesarios para una buena cicatrización. - Oxígeno: Sin él se produce destrucción celular. - Calor: Se debe mantener una temperatura fisiológica para evitar la vasoconstricción o la vasodilatación perjudiciales a la cicatrización. - Agentes corrosivos: El uso indiscriminado de ciertos antisépticos que pueden dañar los tejidos, retrasa lógicamente la cicatrización. 2.3.5. EXPERIMENTOS REALIZADOS EN CICATRIZACIÓN. (42, 44, 45) Se han utilizado muchos parámetros mecánicos para medir las propiedades físicas de las cicatrices. Unas de las más empleadas es la resistencia a la tensión o tracción, que mide la carga necesaria por área de sección transversal para provocar la rotura y que ha sido medido por primera vez por Howes y col. (Figura Nº 5) A nivel mundial se busca factores que coadyuven a incrementar significativamente la resistencia a la ruptura en heridas de piel de ratas. Estas investigaciones son corrientemente complementadas con estudios histológicos y/o bioquímicos. En nuestro país se ha aplicado este método empleando ratones, constituyendo un procedimiento usual para determinar el efecto cicatrizante de plantas medicinales de uso popular. II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 23 Figura Nº 5 Relación entre la fuerza de tensión y el tiempo transcurrido desde la herida. 2.4. CONSIDERACIONES FARMACOTÉCNICAS (46, 49, 50) 2.4.1. CONSIDERACIONES DE LAS FORMAS FARMACÉUTICAS DE USO TÓPICO Para la preparación de un medicamento de aplicación y acción tópica, se debe considerar: A) Elección del principio activo adecuado Debe tenerse presente que los principios activos deben presentar una alta especificidad para el tipo de afección. B) Elección de la forma farmacéutica y excipientes adecuados Hay que tener precaución en la elección de la forma farmacéutica, que liberen con facilidad el principio activo. Los vehículos utilizados en las formas farmacéuticas tópicas deben poseer una serie de características farmacotécnicas de tipo general y otras específicas, relacionadas con las condiciones de su utilización concreta. Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 24 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Características de las formas farmacéuticas. - pH: Debe ser neutro o débilmente ácido (4.5 ÷ 7.0), lo más próximo posible al de la piel. - Características organolépticas no desagradables. - Compatibilidad con los principios activos que incorporan asegurando su estabilidad física y química. - El preparado debe presentar un adecuada extensibilidad y adaptabilidad a la superficie y cavidades cutáneas: Propiedades reológicas. Para ello es recomendable que posea un flujo de tipo plástico ÷ tixotrópico, lo que permite mantenerlo localizado y adherido a la zona tratada. - No deben presentar efectos de irritación primaria ni sensibilizaciones. - Buena tolerancia. C) Permeabilidad de la piel y efectos cosméticos del vehículo Se debe definir a que nivel de la piel debe llegar el principio activo (dermis, epidermis o tejido celular subcutáneo) para ello debemos tener en cuenta ciertas premisas para una adecuada absorción: - Peso molecular - Estructura molecular ( configuración química) - Grado de hidratación de la capa córnea Aplicando conjuntamente las premisas anteriormente expuestas, y asumiendo que el medicamento está correctamente aplicado podrá obtenerse el éxito terapéutico del mismo. 2.4.2. TIPOS DE FORMAS FARMACÉUTICAS DE USO TÓPICO Se clasifican de acuerdo al tipo de lesión a tratar: 2.4.2.1. Tratamiento de Iesiones de tipo crónico. Entre estas lesiones tenemos: heridas y costras, xerosis, liquenificación, descamación las formas farmacéuticas de este grupo deben presentar como característica principal la oclusividad, que conlleva a evitar la pérdida de agua y genera un efecto hidratante acusado. Como ejemplos de estas formas farmacéuticas tenemos: apósitos oclusivos, pomadas propiamente dichas, ungüentos hidrófobos o lipogeles, pomadas absorbente de agua, pomadas hidrofílicas, cremas A/O. (47) 2.4.2.2. Tratamiento de Iesiones de tipo agudo. Entre las lesiones o consecuencias de las lesiones tenemos: eritema, vesículas, ampollas y exudación. Las formas farmacéuticas de este grupo deben presentar como II. GENERALIDADES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 25 característica principal un mayor efecto penetrante, que conlleva a la evaporación del agua y rebajar la hidratación. Como ejemplo de estas formas farmacéuticas tenemos: hidrogeles, polvos, pastas acuosas, lociones, suspensiones, soluciones, cremas O/A. Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 26 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" III. PARTE EXPERIMENTAL: 3.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS. 3.1.1. DEL ESTUDIO QUÍMICO: Reactivos - Ácido clorhídrico (2.0N y 0.3N) - Hidróxido de sodio (2.0N, 0.1N y 50%) - Permanganato de potasio - Ácido oxálico - Soluciones tampones (Buffer pH 4.00, Buffer pH 7.00, Buffer pH 10.00 ) - Biftalato de potasio - Fenolftaleina - Ácido acético (0.1N y 1%) - Hipoclorito de sodio (0.5%) III. PARTE EXPERIMENTAL: "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 27 - Vaselina sólida - Agua destilada Equipos y MateriaIes - Espectrofotómetro ÌR: PERKÌN ELMER FT-ÌR Modelo: Spectrum 1000. - Potenciómetro Accumet® Modelo: pHmetro 910. - Balanza analítica Metller. - Molino manual. - Estufa - Hornilla - Agitador magnético - Horno con agitador magnético NUOVA ÌÌ STÌR PLATE - Material de vidrio de uso general en el laboratorio. 3.1.2. DEL ESTUDIO FARMACOLÓGICO: Test de cicatrización. - 48 Ratones albinos hembras, especie Mus músculus, cepa Balb/c/CNPB , de 1 meses y medio de edad, 25-33 g de peso. - Crema depilatoria Veet® - Neomicina, bacitracina, glicina, L-cisteina, LD-treonina (Cicatrin®) - Vaselina sólida, Ácido Acético al 1%, NaOH 1N, tiras reactivas. - Pentobarbital sódico 6,5g/100mL (Halatal®, medicamento veterinario) - Aguja, hilo y guantes quirúrgicos - Equipo de disección y jeringas, - Equipo de tensión con agua. - Balanza. Estudio histoIógico. - Micrótomo (con cuchillas de acero, produce cortes de 5-10 micrómetros de espesor) - Microscopio electrónico - Cámara digital - Formaldehído al 10 %, agua destilada, parafina, xilol; mezcla de colorantes hematoxilina-eosina para histología, albúmina, glicerina, bálsamo de Canadá. - Láminas portaobjetos y cubreobjetos, pinzas y otros. Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 28 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 3.2. METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA DETERMINACION DEL EFECTO CICATRIZANTE DEL QUITOSANO 3.2.1. DEL ESTUDIO QUÍMICO: 3.2.1.1. Obtención de Ia quitina 3.2.1.1.1. RecoIección Los Cangrejos de la Variedad "peludo¨ Cancer cetosus se adquirieron en el Terminal III. PARTE EXPERIMENTAL: "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 29 pesquero de Ventanilla ubicado en el Callao. 3.2.1.1.2. Acondicionamiento Los cangrejos fueron separados de sus caparazones, para luego ser lavados de manera acuciosa con abundante agua, separando los restos orgánicos que pudieran estar presentes. Posteriormente se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 0.5%, para luego ser lavados con agua y finalmente ser llevado a una estufa por 48 horas a 50 º C hasta peso constante. Los caparazones secos se sometieron a reducción de tamaño de partícula, con ayuda de un molino manual obteniéndose aproximadamente de 400 g (409.81g), de material en polvo que fue guardado en un recipiente de vidrio color ámbar cerrada herméticamente. 3.2.1.1.3. DesmineraIización El polvo obtenido se sometió a desmineralización para ello pesamos 200 gramos de la muestra y se le adicionó a un matraz de 10 Litros que contiene 6 litros de ácido clorhídrico 2 N, la adición se realizo de manera lenta para evitar el levantamiento de la muestra por efervescencia. Dejando en reposo por un tiempo de 24 horas, se decantó y se procedió al lavado de la muestra con abundante agua hasta neutralidad para luego ser colocado en una estufa a una temperatura de 50 ºC por 12 horas. 3.2.1.1.4. Desproteinización. La muestra obtenida se sometió al proceso de desproteinización con 2 Litros de hidróxido de sodio 2N primero a temperatura ambiente por 24 horas y luego a baño Maria a 60 ºC por un periodo de 4 horas con agitación constante para asegurar la desproteinización. Pasado el tiempo establecido se lavó la muestra con abundante agua hasta neutralidad para luego ser lavado con alcohol y finalmente secado en una estufa a 50 ºC por 12 horas. 3.2.1.1.5. DecoIoración. A la muestra obtenida en el proceso anterior, se sometió al proceso de decoloración. Para ello se le adiciono 500 mL de agua destilada y se le llevo a baño Maria por 15 min luego se le adicionó 500 mg de permanganato de potasio y se continuó con el calentamiento por 10 min más, para finalmente adicionarle 2 g de ácido oxálico con agitación constante hasta decoloración de la muestra se dejó enfriar y luego fue lavado hasta neutralidad. La muestra finalmente se desecó en estufa con flujo de aire a 60 ºC por 12 horas. (Fotografía Nº 1) 3.2.1.2. Obtención deI quitosano. La quitina obtenida, se sometió al proceso de desacetilación, para ello se pesaron 22 gramos de quitina se colocó en un equipo de reflujo con 500 mL de hidróxido de sodio al 50 % y a una temperatura de 120 ºC con agitación constante por un periodo de 3 días por intervalos de tiempo de 8 horas cada uno. Transcurrido el periodo la muestra fue lavada Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 30 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" con abundante agua hasta neutralidad y finalmente secado en estufa a una temperatura de 60 ºC por 24 horas. (Fotografía Nº 2) 3.2.1.3. Caracterización deI quitosano. 3.2.1.3.1. Método espectrofotométrico. (IR) La quitina y quitosano fueron identificados mediante espectroscopia infrarroja (ÌR), utilizando un espectrofotómetro PERKÌN ELMER FT-ÌR Modelo: Spectrum 1000. Los espectros obtenidos se interpretaron y compararon. 3.2.1.3.2. SoIubiIidad. Ensayos de Solubilidad: en 5 tubos de ensayo se colocó una pequeña porción de la muestra (100mg) y se le agrego 5 mL del solvente respectivo: Agua, etanol, ácido acético, ácido oxálico y ácido clorhídrico, se agitó, se dejó en reposo por 24 horas y se observan los resultados. 3.2.1.3.3. Determinación deI grado de desacetiIación (dga): Método: Valoración titulométrica de los grupos aminos. (4) Procedimiento: Para mediciones precisas se calibró el potenciómetro. Para la determinación del contenido de grupos amino de la muestra de quitosano se procede a la disolución de 0,1g de quitosano en 20 mL de ácido clorhídrico 0,3 M, luego se tituló con una solución de hidróxido de sodio 0.1M, la cual fue valorada previamente con biftalato de potasio como patrón. La valoración se llevó a cabo midiendo el cambio de pH cada 2 mL de base añadida, la adición se realizó de forma lenta y con agitación continua para homogenizar la solución y evitar errores debido a la posible precipitación del polímero. Las mediciones se realizaron 3 veces por muestra. La diferencia entre los dos puntos de inflexión en la curva de titulación corresponde a la cantidad de ácido requerido para protonar los grupos aminos del quitosano, la concentración de éstos se determina utilizando la expresión: Donde: "Y¨ = Punto de inflexión mayor. III. PARTE EXPERIMENTAL: "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 31 "X¨ = Punto de inflexión menor. Ambos expresados como volúmenes. "F¨ = Molaridad de la solución de NaOH. "W¨ = Peso en gramos de la muestra 16.1 = Valor relacionado con el peso equivalente del quitosano. 3.2.1.4. Diseño de Ia forma farmacéutica (ungüento) de apIicación tópica a base de quitosano Objetivo Desarrollar una forma farmacéutica tópica (ungüento) estable a base de quitosano que conserve el efecto cicatrizante. Para el diseño se tomo como principal referencia que la forma farmacéutica a elaborar seria utilizada tópicamente como cicatrizante, por tal motivo esta debería contar con poder de penetración a través de la piel, por lo que se pensó en una forma farmacéutica semisólida como un gel o ungüento. Dadas las propiedades físico-químico del quitosano obtenido y la solubilidad se optó por diseñar un ungüento. Los ungüentos son preparaciones semisólidas destinadas para la aplicación externa sobre la piel o las membranas mucosas. Las bases para ungüentos que se utilizan como vehículos se pueden clasificar en cuatro grupos generales: - Bases de hidrocarburos (Vaselina blanca y el ungüento blanco) - Bases de absorción (Vaselina hidrofílica y lanolina) - Bases que se eliminan con agua (Ungüento hidrofílico) - Bases hidrosolubles. (Ungüento de polietilenglicol) Para la elección de la base para ungüentos depende de los factores: - La acción deseada. - La naturaleza del medicamento. - La biodisponibilidad y estabilidad. - La vida útil requerida para el producto terminado. Dadas las propiedades físico-químico del quitosano obtenido y la solubilidad se optó por diseñar un ungüento con una base hidrocarbonada la cual está representada por la vaselina blanca y el ungüento blanco, la que permite incorporar una cantidad mínima de componente acuoso. Sirven para mantener los medicamentos en contacto prolongado con la piel y actúan como vendaje oclusivo (47-50). Las bases hidrocarbonadas se usan, principalmente, por sus efectos emolientes y son difíciles de eliminar. No se "secan¨ ni se modifican en forma notoria con el envejecimiento. Son muy recomendables en el proceso de cicatrización de heridas. Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 32 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 3.2.1.4.1. Preparación deI ungüento. - Se trabajó con una solución de quitosano disuelto en ácido acético al 1%. - La solución de quitosano se neutralizó con gotas de hidróxido de sodio 1N, homogenizando hasta obtener un pH cercano al de la piel (pH=6.5). - Se fundió la vaselina sólida a una temperatura de aproximadamente 60ºC en un recipiente con agitación. - Se incorporó la solución de quitosano, previamente neutralizado, al recipiente que contiene la vaselina fundida y se homogenizó. - Se retiró el recipiente del calor y continuó agitando hasta que la mezcla llegó a la temperatura ambiente. - Con este procedimiento se prepararon los siguientes ungüentos 0.25% P/P, 0.50% P/P, 1.00% P/P y base del ungüento solo. - Una vez preparadas las diversas concentraciones de quitosano, se procedió a envasar los ungüentos en tubos colapsibles y potes de 100g, sanitizados con formol al 10% (Fotografías Nº 3,4). 3.2.2. DEL ESTUDIO FARMACOLÓGICO: 3.2.2.1 Determinación deI efecto cicatrizante de Ios ungüentos a base de quitosano por eI método de Ia fuerza de tensión (Método de Howes y coI.) (51) Objetivo Determinar el efecto cicatrizante del ungüento a base de quitosano en comparación con un control (Cicatrin®) por el método de la fuerza de tensión. Grupos de estudio Es un estudio experimental pre-clínico se realizó en ratones. Cada grupo experimental contiene 8 animales según Tabla Nº 3: Tabla Nº 3 Distribución de los grupos experimentales III. PARTE EXPERIMENTAL: "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 33 Alimentación: Dichos animales se mantuvieron durante todo el estudio experimental con alimentación y agua "ad libitum¨ MetodoIogía Fundamento: El método de la Fuerza de Tensión mide la fuerza necesaria para abrir una herida incisa de 1 cm de largo, realizada en el tercio anterior del lomo y perpendicular al eje longitudinal de un ratón. - Ambientación o acondicionamiento Los 48 ratones albinos hembras, cepa Balb/c/CNPB provenientes del Bioterio del Centro Nacional de Producción de Biológicos (ÌNS), fueron distribuidos al azar en 6 grupos de 8 ratones cada grupo y colocados en jaulas individuales. Se mantuvieron en observación por un periodo de una semana (7 días), verificándose la condición óptima de los ratones para el estudio. A dichos animales se les mantuvo en un ambiente ventilado apropiadamente, en jaulas individuales, con alimento balanceado (ÌNS) y agua Ad-libitum, por un periodo de 7 días previos al inicio de la experiencia. Se procuró un ciclo de luz/oscuridad de 12 cada uno por día. (Fotografía Nº 5) - DepiIación Después de una semana de ambientarse los ratones al lugar de trabajo, se procedió a depilarlos con crema depilatoria Veet® en el primer tercio dorsal anterior en un área aproximada de 2 cm 2 , se anestesió con pentobarbital sódico por vía subcutánea a una concentración de 50 mg / Kg de peso. La depilación se realizó previa humectación (con agua tibia) de la zona a depilar, luego se agrega la crema depilatoria Veet® la cual permaneció 3 minutos para ejercer su efecto. Finalmente con la ayuda de gasas húmedas se retiró la crema. Posterior a la depilación, los ratones se colocaron en sus respectivas jaulas individuales teniendo estos libre acceso a bebida y comida. La depilación se realizó 24 horas antes del procedimiento quirúrgico a fin de descartar cualquier reacción alérgica a la crema depilatoria (Fotografía Nº 6). - Incisiones y sutura Después de 24 horas de la depilación, se procedió a anestesiar a los ratones administrándoles una dosis de 50 mg/Kg de pentobarbital sódico vía subcutánea (tercio inferior del lomo. Se colocó al ratón sobre la mesa de trabajo, desinfectando el área depilada y marcando 2 puntos equidistantes en 1cm y perpendicular al eje longitudinal del ratón (zona de corte). Se realizó el corte sobre la zona indicada (cicatriza de primera intención), se unieron los bordes con un punto de sutura con hilo en la parte central del corte. Esta etapa se realizó cumpliendo condiciones de asepsia (Fotografía Nº 7). - ApIicación Obtenido el punto de sutura, se administró en forma tópica la primera dosis del tratamiento sobre la incisión con la ayuda de un hisopo, logrando obtener una distribución homogénea sobre la incisión. Se aplicaron tanto las formulaciones a base de quitosano, a los controles: la base del ungüento y el Cicatrin® en sus respectivos grupos, mientras que el blanco no recibió tratamiento. Se repitió el tratamiento cada 12 horas en un lapso de 72 horas (Fotografía Nº 8) Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 34 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" - Determinación de Ia fuerza de tensión Pasadas las 72 horas de tratamiento, se procedió a realizar la medición de la fuerza de tensión en el equipo de tensión. (Fotografía Nº 9) Para ello los ratones fueron previamente anestesiados con una dosis de 100 mg/Kg de pentobarbital sódico vía intraperitoneal. Luego se colocaron en la mesa de trabajo y se procedió a marcar los puntos donde se engancharan las agujas del equipo de tensión, a 0,5 cm de ambos extremos del punto de sutura. Se retiró con mucho cuidado el punto de sutura y colocó al animal en posición en decúbito ventral sobre el aparato de tensión, luego se insertó las agujas, retirando las base del recipiente y de inmediato se abrió la bureta para dejar caer el agua hasta que se generó una fuerza de tensión capaz de abrir la herida en toda su longitud. Finalmente, se anotó el nivel de agua requerido (Fotografía Nº 9). Usando los datos obtenidos por el Método de Fuerza de Tensión según Howes y col., se determinó el porcentaje de efecto cicatrizante utilizando la siguiente fórmula: 3.2.2.2. Determinación deI efecto cicatrizante de Ios ungüentos a base de quitosano por eI método deI corte histoIógico. Objetivo Corroborar los resultados obtenidos en el método tensiométrico y observar la evolución macroscópica y microscópica de la cicatriz. MetodoIogía La ambientación o acondicionamiento, la depilación, las incisiones y sutura, y la aplicación. Se realizaron en forma similar a lo descrito anteriormente Corte HistoIógicos. Pasadas las 72 horas de tratamiento, se procedió a realizar los cortes histológicos. Los ratones fueron previamente sacrificados con una dosis de 100 mg/ Kg de pentobarbital sódico vía intraperitoneal, las muestras de tejidos con cicatrices experimentales fueron obtenidos inmediatamente a la muerte de los animales, seleccionando un área de 2 cm de ancho por 2.5 cm de largo, estos tejidos fueron sujetados cuidadosamente en trozos de tecnopor, para evitar el enrollamiento natural del tejido separado, y depositados en una solución de formaldehído amortiguado neutro al 10 % para lograr la fijación que conserva una imagen del tejido, como si estuviera vivo, luego viene la deshidratación con soluciones de concentraciones crecientes de etanol y el aclaración del tejido (se vuelve transparente) con xilol, después, para poder hacer los cortes se realiza la infiltración o inclusión en parafina, formándose un bloque solidó, la III. PARTE EXPERIMENTAL: "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 35 etapa siguiente es el corte que se realiza en un micrótomo, a continuación se hace el montaje en una lamina portaobjetos cubierta con material adherente (albúmina de huevo), luego se retira la parafina restante con xileno, después se realizó la tinción en este caso con hematoxilina-eosina, después se rehidrata con soluciones de concentraciones decrecientes de etanol, de modo que pueda fijarse con un medio de montaje como el bálsamo de Canadá, que tiene índice de refracción similar al vidrio, se cubre con un cubreobjetos y se sella con esmalte transparente.(44) (Dicho ensayo lo realizó el Departamento de Histopatológia del Hospital Nacional Arzobispo Loayza). Teniendo los cortes histológicos fijos en placas portaobjetos, se realizó las observaciones en el microscopio. Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 36 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" IV. RESULTADOS 4.2.1. DEL ESTUDIO QUÍMICO: 4.2.1.1. Rendimiento de quitina y de quitosano. TabIa Nº 4 Composición química de caparazones de cangrejos peIudo 'Cancer cetosus" en base a 200 g de muestra seca y puIverizada Composición Química Peso (g) (%) Minerales 168.45 84.23 Proteínas y pigmentos 8.61 4.30 Quitina 22.94 11.47 Total 200 100 TabIa Nº 5 Rendimiento de quitosano obtenido a partir de quitina por método químico IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 37 Quitosano (%) En relación a la muestra total 7.02 % En relación a la quitina 61.78 % 4.2.1.2. Caracterización deI Quitosano. 4.2.1.2.1. Método Espectrofotométrico. (IR) Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 38 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Figura Nº 6 Espectro infrarrojo de la quitina en el rango de 4000-650 cm-1 Figura Nº 7 Espectro infrarrojo de la quitina en el rango de 2000-650 cm-1 Figura Nº 8 Espectro infrarrojo del quitosano en el rango de 4000-650 cm-1 IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 39 Figura Nº 9 Espectro infrarrojo del quitosano en el rango de 2000-650 cm-1 Figura Nº 10 Comparación de los espectros infrarrojo de la quitina y quitosano en el rango 4000-650 cm-1 4.2.1.2.2. SoIubiIidad. TabIa Nº 6 Determinación de Ia soIubiIidad de Ia quitina y eI quitosano AGUA ALCOHOL ÁCIDO ACÉTICO ÁCIDO OXÁLICO ÁCIDO CLORHÍDRICO QUÌTÌNA - - - - - QUÌTOSANO - - +++ ++ ++ - ÌNSOLUBLE + LÌGERAMENTE SOLUBLE ++ MEDÌANAMENTE SOLUBLE Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 40 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" +++ SOLUBLE 4.2.1.2.3. Determinación deI grado de desacetiIación por tituIación potenciométrica Tabla Nº 7 Resultados de la titulación potenciométrica- Muestra 1 (Quitosano) Peso: 0.1041 g Solución valorante NaOH 0.1N (F=0,99725) CÁLCULOS: % NH2 = 16.1 (Y-X) x F/ W ( Ver fórmula 1) %NH2 = 16.1 (6) x 0.099725 / 0.1041 g % NH2 = 92.54 % IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 41 Figura Nº 12 Curva de titulación potenciométrica del quitosano ( pH Vs Gasto)- Muestra 1 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 42 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Figura Nº 13 Curva de titulación potenciométrica del quitosano ( 1º derivada Vs Gasto)- Muestra 1 Peso: 0.1076 g Solución valorante NaOH 0.1N (F=0,99725) IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 43 CÁLCULOS: % NH2= 16.1 (Y-X)x F/ W ( Ver fórmula 1) %NH2 = 16.1 (6,5) x 0.099725 / 0.1076 g % NH2 = 97.00 % Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 44 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Figura Nº 14 Curva de titulación potenciométrica del quitosano ( pH Vs Gasto)- Muestra 2 Figura Nº 15 Curva de titulación potenciométrica del quitosano (1º derivada Vs Gasto)- IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 45 Muestra 2 Peso: 0.1064 g Solución valorante NaOH 0.1N (F=0,99725) CÁLCULOS: % NH2 = 16.1 (Y-X)x F/ W ( Ver fórmula 1) %NH2 = 16.1 (6,5) x 0.099725 / 0.1064 g % NH2 = 98.00 % Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 46 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Figura Nº 16 Curva de titulación potenciométrica del quitosano ( pH Vs Gasto)- Muestra 3 Figura Nº 17 Curva de titulación potenciométrica del quitosano ( 1º derivada Vs Gasto)- Muestra 3 IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 47 Tabla Nº 10 Resultados de la eterminación del grado de desacetilación por titulación potenciométrica del quitosano 4.2.2. DEL ESTUDIO FARMACOLÓGICO. 4.2.2.1 Determinación deI efecto cicatrizante de Ios ungüentos a base de quitosano por eI método de Ia fuerza de tensión (Método de Howes y coI.) Tabla Nº 11 Determinación de la fuerza de tensión de los grupos Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 48 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Figura Nº 18 Determinación de la fuerza de tensión Tabla Nº 12 Valores medios de fuerza necesaria para abrir lesiones cicatrizadas en ratones Tabla Nº 13 Análisis de varianza de los datos de fuerza necesaria para abrir lesiones cicatrizadas en ratones Determinación del efecto cicatrizante de los ungüentos a base de quitosano por el método de la fuerza de tensión (Método de Howes y col.) IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 49 Tabla Nº 14 Resultados de la eterminación del efecto cicatrizante de los ungüentos a base de quitosano frente al grupo control (Base del ungüento) Figura Nº 19 Determinación del efecto cicatrizante Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 50 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Tabla Nº 15 Análisis de múltiples comparaciones de la media mediante la prueba LSD IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 51 Figura Nº 20 Distribución de la tensión según dosis de quitosano 4.2.2.2 Determinación deI efecto cicatrizante de Ios ungüentos a base de quitosano por eI método deI corte histoIógico. - Corte histoIógico de cicatriz experimentaI tratada con ungüento a base de quitosano aI 1.0% Se observa que el tejido epidérmico ha formado una solución de continuidad con escasa fibrina (costra) el lecho de la lesión se encuentra en vías de completar su reepitelización, se evidencia la presencia de fibroblastos (como células alargadas con núcleos pequeños y oscuros) y de tejido colágeno, caracterizados por la coloración sonrosadas (Fotografía Nº 11) - Corte histoIógico de cicatriz experimentaI tratada con ungüento a base de quitosano aI 0.5% Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 52 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" Se observa que la cicatrización presenta tejido de granulación, la epidermis se encuentra en solución de continuidad con reepitelización incompleta. El lecho de la lesión es discontinuo con infiltración mononuclear y macrófagos en número de 40 por campo. Se evidencia la presencia de fibroblastos en la dermis profunda (Fotografía Nº 12) - Corte histoIógico de cicatriz experimentaI tratada con ungüento a base de quitosano aI 0.25% Se observa que el tejido epidérmico ha formado una solución de continuidad con fibrina (costra) en la superficie, en la epidermis se observa reepitelización, asimismo se evidencia la presencia de tejido fibroso ( fibroblastos) y tejido conjuntivo ( colágeno) en el lecho de la lesión. Hay infiltración mononuclear en número de 20 macrófagos por campo (Fotografía Nº 13) - Corte histoIógico de cicatriz experimentaI tratada con base deI ungüento (VaseIina) Se observa reepitelización, tejido de granulación subepitelial y fibroblastos. (Fotografía Nº 14) - Corte histoIógico de cicatriz experimentaI tratada con Cicatrin ® Se observa una epidermis delgada con solución de continuidad con pared costrosa y tejido fibroso (fibroblastos), se observa reepitelización, en el lecho de la lesión se observa con solución de continuidad con gran infiltración mononuclear, cicatrización incipiente (Fotografía Nº 15) - Corte histoIógico de cicatriz experimentaI sin tratamiento Se observa una epidermis delgada con solución de continuidad con tejido de granulación insuficiente, no hay reepitelización, existe incipiente proliferación y migración celular (Fotografía Nº 16) IV. RESULTADOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 53 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 54 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" V. DISCUSIÓN Como paso previo a la caracterización y diseño de la forma farmacéutica de aplicación tópica, se efectúo el aislamiento de la quitina a partir de los caparazones de cangrejos de la variedad Cancer cetosus "Cangrejo Peludo¨ y obtención de quitosano a partir de ella. En el aislamiento de la quitina, por el método químico, se obtuvo un rendimiento de 11,47% de quitina con respecto al peso de los caparazones de cangrejos de la variedad Cancer cetosus "Cangrejo Peludo¨ en polvo (Tabla Nº 4) que concuerdan con el obtenido por otros autores con la misma especie donde obtuvieron un rendimiento de 14,04% sin el proceso de decoloración (52), la cual esta relacionada con estudios en otras especies; podemos decir que es mayor que el rendimiento de quitina en jaiba azul Callinectes sapidus (7.3%) y el langostino Penaeus spp (11%), pero menor que en los cangrejos de la variedad Paralithodes camtschaticus y Chionectes opilio (15.5 y 26.65% respectivamente) (10). El método químico empleado permite la remoción de una manera efectiva de las sustancias que acompañan a la quitina en la materia prima el grado de pureza se evidencia mediante la espectroscopia infrarroja (Figura Nº 6, 7) La obtención del quitosano por método químico a partir de la quitina alcanzó un rendimiento de 7,02% de quitosano con respecto a la muestra total y de 61,78 % con respecto a la quitina (Tabla Nº 5). El método químico empleado para la obtención de quitosano permitió obtener un producto con un características fisicoquímicas aceptables (identificación por ÌR, solubilidad, grado de desacetilación) en comparación con otros estudios realizados con diferentes especies (19, 53) la cual se puede evidenciar en el espectro infrarrojo de quitosano.(Figura Nº 8, 9) V. DISCUSIÓN "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 55 La caracterización de quitina y quitosano por el método de espectroscopía Ìnfrarrojo se basa principalmente en la comparación de los espectros relacionados con la presencia o ausencia del grupo carbonilo y el radical acetilo. La quitina presenta un espectro con una banda a 1650 cm -1 que corresponde a la vibración del grupo carbonilo y una vibración secundaria del grupo amino secundario con una banda de 1603,95 cm -1 ; el espectro de quitosano presenta una banda a 1636,33 cm -1 que se debe a la presencia de grupo amino primario (18, 19). En el espectro de la quitina la absorción del oxidrilo debería presentar una banda aguda. Sin embargo se observa una absorción corta a 3432,43 cm -1 y otro a 3270,27 cm-1. La magnitud de la absorción se debe primero a la ausencia de grupo primario y en segundo lugar a la conformación de la molécula de quitina, donde posiblemente los oxidrilos se encuentren formando puentes de hidrogeno con el átomo de oxigeno del anillo piranosico. (Figuras Nº 10, 11) En el espectro de quitosano se observa una banda muy pronunciada a 3315,79 cm -1 probablemente del resultado de acumulación del grupo oxidrilo y amino primario. La solubilidad de la quitina y quitosano nos permite confirmar las características propias de estos compuestos y así poderlos identificarlos. En los ensayos de solubilidad se observó que la quitina es insoluble en agua, ácidos orgánicos (Ácido acético, ácido oxálico) e inorgánicos diluidos (Ácido clorhídrico) esto debido a los grupos acetilos que presenta la quitina, mientras que el quitosano es insoluble en agua pero presenta solubilidad en ácidos orgánicos (Ácido acético, ácido oxálico) e inorgánicos diluidos (Ácido clorhídrico) debido a la protonación de los grupos aminos (-NH 2 ) en amonio (-NH 3 +) (3)(Tabla Nº 6). El grado de desacetilación con el fin de conocer el contenido de grupos aminos en las muestras de quitosano se determinó por titulación potenciométrica (Tablas Nº 7, 8, 9) donde se produce una curva de titulación con dos puntos de inflexión cuyos valores se determinaron según el criterio de la primera derivada. La diferencia entre los dos puntos de inflexión en la curva de titulación corresponden a la cantidad de ácido requerido para protonar los grupos aminos del quitosano (Figuras Nº 12-17) el análisis se realizo por triplicado donde se observa que la proporción de los grupos aminos libres es alta (95.85%) lo que es indicativo que el método utilizado permitió la obtención de un producto altamente desacetilado (Tabla Nº 10). Los resultados son congruentes con los obtenidos previamente por espectroscopia infrarroja que indica la desacetilación de la quitina. Para la preparación de la forma farmacéutica tópica a base de quitosano, se selecciono una base hidrocarbonada: la vaselina sólida, debido a que permite un contacto prolongado con la piel actuando como un vendaje oclusivo; Asimismo, por ser una sustancia químicamente inerte en comparación con las bases de geles como Carbomer 940, Carboximetilcelulosa y Sepigel las cuales presentan incompatibilidad con el quitosano debido a los grupos aminos libres. Las concentraciones elaboradas a base de quitosano fueron de 0.25%, 0.50% y 1.0% los cuales fueron establecidas de acuerdo a la propiedades fisicoquímicas del quitosano especialmente a su solubilidad en un medio acuoso y a la capacidad de la vaselina de permitir incorporar agua en su composición obteniéndose una forma Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 56 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" farmacéutica estable en el tiempo. (32,47,48,50) En el estudio del efecto cicatrizante de los ungüentos de quitosano por el método de la fuerza de tensión, se determinó que el porcentaje de efecto cicatrizante máximo fue de 79.28% a la concentración de 0.25% de Quitosano seguido por los ungüentos a la concentración de 1% y 0.50 % de quitosano (30.45% y 15.32% respectivamente) en comparación con el grupo control ( base del ungüento) (Tabla Nº 14). En el análisis estadístico de los valores medios de fuerza necesaria para abrir lesiones cicatrizadas en ratones según porcentajes de quitosano (mL de agua empleados), el error estándar o coeficiente de variación máximo es de 3% indicando que los datos obtenidos de las medias son confiables (Tabla Nº 12) En el análisis de varianza de los datos de fuerza necesaria para abrir lesiones cicatrizadas de ratones tratadas con los ungüentos, compara las medias de los 5 grupos experimentales definidos por la dosis, obteniéndose un p < 0.001; con lo cual podemos afirmar que hay diferencia significativa entre las medias de los grupos de quitosano a diferentes concentraciones (Tabla Nº 13) Para el análisis de múltiples comparaciones de la media mediante la prueba de LSD, se hizo uso del programa SPSS, versión 13, 2004, el cual nos permitió identificar los tratamientos estadísticamente significativos y eliminando aquellos que no los son. En la tabla Nº 15 podemos observar que todos los tratamientos aplicados son estadísticamente significativos en comparación con el blanco, indicando que los resultados obtenidos son debido a las sustancias aplicadas. Además el ungüento de quitosano al 0.25% es estadísticamente significativo, en comparación con los demás tratamientos, mientras que el ungüento de quitosano al 1.0% es significativo con los demás tratamientos excepto con el ungüento de quitosano al 0.50%. Asimismo podemos observar que no hay diferencia significativa entre la base del ungüento (vaselina) y el cicatrin. El cicatrin es una combinación de antibióticos que favorecen indirectamente en el proceso de cicatrización mediante su acción antibacteriana, mientras que la base del ungüento (Vaselina) por sus propiedades oclusivas evita la exposición de la herida con el medio ambiente En ambos casos se observa que el "efecto cicatrizante¨ que presentan es debido a estas propiedades, no atribuyéndoles actividad cicatrizante propiamente dicha. La cicatrización también fue evaluada por un estudio histológico, debido a la relación existente entre el aumento de la fuerza de tensión y la evolución positiva histológica del tejido. En la observación microscópica de los cortes histológicos, se demostró que el ungüento al 0.25% presenta una evolución de la cicatrización mas avanzada la cual se manifiesta principalmente en el aumento de células basales epidérmicas , observándose la formación de una solución de continuidad con fibrina ( costra) en la superficie, reepitelización, presencia de tejido fibroso ( fibroblastos) y tejido conjuntivo ( colágeno). También se observó que la cantidad de linfocitos es menor debido al inicio de la fase de fibroplasia, que indica el final de la fase inflamatoria, observándose la formación de tejido conectivo laxo, confirmando la presencia de fibroblastos y angiogénesis. V. DISCUSIÓN "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 57 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 58 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" VI. CONCLUSIONES - La caracterización de la quitina, aislada de los caparazones del "Cangrejo peludo¨ Cancer cetosus, y el quitosano, obtenido por desacetilación química de la quitina, cumplen con las propiedades fisicoquímicas, de solubilidad, grado de desacetilación y espectroscopia ÌR. - El método de obtención de quitosano permitió obtener un producto altamente desacetilado (95.85% ) - Se comprobó que el quitosano bajo la forma farmacéutica semisólida (ungüento) presenta actividad terapéutica como cicatrizante externo. El ungüento con mayor eficacia en el tratamiento fue el de 0.25% a base de quitosano con un 79.28%, seguido por el ungüento al 1 % con 30.45%, el ungüento al 0.50% con 15.32%, tomando como valor referencial al grupo control. - Los estudios histológicos demuestran que los ungüentos a base de quitosano estimulan la proliferación y migración celular siendo el ungüento al 0.25% el que presenta mejores resultados. VI. CONCLUSIONES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 59 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 60 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" RECOMENDACIONES - Promover la transformación de desechos marinos en productos con actividad biológica. - Continuar los estudios clínicos de la actividad terapéutica como cicatrizante externo del ungüento a base de quitosano. - Continuar con el estudio y evaluación de la actividad cicatrizante de quitosano obtenido de otras especies marinas peruanas. RECOMENDACIONES "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 61 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 62 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" VII. BIBLIOGRAFÍA Muzzarelli R. Chitin. Editorial Pergamon Press. Primera edición, New York; 1974. p. 2 Lárez C. Algunos usos del quitosano en sistemas acuosos. Revista Iberoamericana de Polímeros.2003; 4(2):91-93. Vílchez S. Nuevos tratamientos de lana con enzimas (Tesis para optar al grado de doctor). Barcelona-España: Universitat de Barcelona; 2005. Parada et al. Caracterización de quitosano por viscosimetría capilar y valoración potenciométrica. Revista Iberoamericana de Polímeros.2004; 5(1):1-3. Unidad de investigaciones de invertebrados marinos. Instituto del Mar del Perú. Informe del seguimiento de la pesqueria de invertebrados marinos en el litoral peruano. Primer trimestre 2003. Beaney P, Lizardi-Mendoza J, Healy M. Comparison of Chitins Produced by Chemical and Bioprocessing Methods. J. Chem. Technol. Biotechnol., 2005. 80(2):145-150. Mukherjee D, inventor, LSU Health Sciences Center –Shreveport, assignee. Method for producing chitin or chitosan. United States patent US 20010310188. 2001 Octubre 30 Roberts G. Chitin chemistry. The Macmillan Press Ltd, London; 1992 Austin P. et al. Chitin: new facets of research. Science, 1981; 212(4496):749-753. Peniche C. Estudios sobre quitina y quitosana (Tesis para optar por el grado cientifico de doctor en ciencias).La Habana-Cuba. Universidad de La Habana; 2006 Ayala M. “Obtención de Quitosana del Caparazón de Langostino (Familia Penaideae) y VII. BIBLIOGRAFÍA "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 63 su aplicación como crioprotector en filetes congelados de jurel” tesis para optar el grado de Magíster Scientiae en la Especialidad de Tecnología de Alimentos. UNALM 1992. Lima. Varum K, Smidsrod O, inventores, Advanced Biopolymers AS, assignee. Chitosan Preparation. Europe Patent US2004/0215005 A1. 2004 Octubre 28. Mima S, Miya M, Iwamoto R, Yoshikawa S. Highly Deacetylated Chitosan and Its Properties. J Appl Polym Sci. 1983; 28(6):1909-1917. Domard A, Rinaudo M. Preparation and characterization of fully deacetylated chitosan. Internacional Journal of Biological Macromolecules. 1983;5: 49-52 Roberts G. Chitosan production routes and their role in determining the structure and properties of the product. Advances in Chitin Science, Domard A, Roberts G, Vårum K, Editors. Jacques André Publisher: Lyon; 1998. p.22-31. Goycoolea F, et al. Preparation of chitosan from squid (Loligo spp.) pen by a microwave accelerated thermochemical process. Advances in Chitin Science, Domard A, Roberts G, Vårum K, Editors. Jacques André Publisher: Lyon. 1998. p.78-83. Pelletier A, et al. Chitin/chitosan transformation by thermo-mechano-chemical treatment including characterization by enzymatic depolymerization. Biotechnol. Bioeng. 1990; 36(3):310-315. Socrates, G. Infrared Characteristic Group Frequencies: Tables and Charts, 3ª ed., Wiley, 2001. Mármol Z, Gutiérrez E, Páez G, Ferrer J, Rincón M. [base de datos en internet] Desacetilación termoalcalina de quitina de conchas de camarón.[citado 10 ene 2006] multiciencias4(2)completa. Disponible en: http://www.serbi.luz.edu.ve/pdf/mc/v4n2/art_03.pdf Brugnerotto J. et al. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization. Polymer. 2001; 42(8): 3569-3580. Liu D, Wei Y, Yao P, Jiang L. Determination of the degree of acetylation of chitosan by UV spectrophotometry using dual standards. Carbohydrate Research.2006;341(6):782-786 Lavertu M. et al. A validated 1H NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003; 32:1149-1158 Raymond L, Morin F, Marchessault R. Degree of deacetylation of chitosan using conductometric titration and solid-state NMR. Carbohydrate Research. 1993;246:331-336 Mesquita da Silva L. Síntese e Estudo de Derivados do Quitosano com Potencial Interesse Biológico e Ambiental. Departamento de Química Faculdade de Ciências da Universidade do Porto. Junho 2005. Chandi T, Charma C.P. Chitosan as a biomaterial. Artif. Cells, Artif. Org., 1990; 18(1): 1-24. Hirano S, et al. Chitin and chitosan for use as novel biomedical materials, in Advances in Biomedical Polymers, L.G. Gebelein, Editor. 1987, Plenum: New York. p. 285-297. Bianco I, Balsinde J, Beltramo D ,et al. Chitosan-induced phospholipase A2 activation Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 64 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" and arachidonic acid mobilization in P388D1 macrophages[J].FEBS Letters.2000;466:292-294. Kweon DK, Song SB, Park YY. Preparation of water-soluble chitosan/heparin complex and its application as wound healing accelerator. Biomaterials 2003; 24:1595–601. Ishihara M. Photocrosslinkable Chitosan Hydrogel as a Wound Dressing and a Biological Adhesive. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2002;14(80): 331–341 Balassa Ll, Prudden JF. Applications of Chitin and Chitosan in Wound Healing Aceleration .Conference. New York, (1978) Hassan E, inventor, Ionic Chitosan – Iodine Complexes antiseptic hydrogeles and wound healing promoters. United States Patent US2002119205 2002 Agosto 29 Gouda I, Larm O, Inventores, Medicarb AB, Assignee, Method Of Promoting Dermal Wound Healing With Chitosan And Heparin Or Heparin Sulfate. United States patent US5902798 1999 Mayo 11 Peacock E., Van Winkle W. “Wound Repair” Ed. Saunders Company, Philadelphia, London, Toronto 1976. Robson M. “Cicatrización de heridas y reparación de tejidos” Fundación Alberto J. Roemmers, Buenos Aires 1998. MacKay D, Miller A. Nutritional Support for Wound Healing Alternative Medicine Review. 2003; 8(4): 359-377 León P. Estudio Clínico del Efecto antiinflamatorio y cicatrizante de Plantago major L. (Llantén) trabajo de aptitud profesional para optar el titulo de Químico Farmacéutico. UNMSM 1995 Lima. Prathiba V, Gupta P. Cutaneous wound healing: Significance of proteoglycans in scar formation. Current Science. 2000; 78(6):1-5 Modolin M. Biología de la cicatrización de los tejidos. En: Melega J M, Zanini S A, Psillakis J M (eds), Cirugía Plástica, Reparadora y Estética. Río de Janeiro, Medsi, 1992: 9-13 Carrico TJ, Mehrhofai, Cohen IK: Biología de la cicatrización. Clín Quir Norte Am 1984; 64: 721-35 Cotran RS, Kumar V, Collins T. Robbins. Patología Estructural y Funcional. 6º Edición. McGraw Hill-Interamericana. 2000. Fig. 4-17, p 115 C. Salem et al. Heridas. Conceptos generales. Cuadernos Cirugía. 2000; 14: 90-99 J Sanchez .Sociedad Ecuatoriana de Cirugía.Quito.2002 Fernandez F. Tratado de Enfermería en Cuidados Críticos Pediátricos y Neonatales. Primera Edición.2006. Guillermo R. Comprobación del Efecto Cicatrizante de Peperomia scutellaefolia R. et P., Aspectos Etnofarmacológicos, Botánicos y estudio Químico. Tesis para optar al Título de Químico Farmacéutico. 2002 UNMSM. Lima Carreño María. Efecto cicatrizante del Plantago major L. (Llanten) en heridas incisas de ratones albinos. Trabajo de Aptitud Profesional para optar al Titulo de Químico Farmacéutico. 1992 UNMSM. Lima VII. BIBLIOGRAFÍA "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 65 Paucar S, Rojas M. Diseño de una forma Farmacéutica semisólida de aplicación tópica a base de bálsamo de copaiba con efecto cicatrizante. Titulo de Químico Farmacéutico. 2004 UNMSM. Lima Trillo, F. tratado de Farmacia Galenita. Editorial Egraf S.A. 1er Edicion. Madrid 1996. Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América. Farmacopea de los Estados Unidos de América: formulario nacional. 2006. USP 29 NF 24. Washington, D.C.: Ed. The United States Pharmacopeial Convention, 2005: 3273. Remington, Farmacia, Tomo I, 19ª ed. Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires; 1998. Vila Jato, J. L Tecnología Farmacéutica. Formas Farmacéuticas. Vol. II, Ed. Síntesis, Madrid; 1997 Howes E, Sooy J, Harvey S. The healing of wound as determined by their tensile strength J.A.M.A. (The Journal of the American Medical Association) 1929; 42(5). Huerta M. Inmovilización de termolisina en quitina para la síntesis enzimática de aspartamo, determinación de las condiciones optimas. Titulo de Químico Farmacéutico. 2003 UNMSM. Lima Delgado-Aparicio L, Nakamatsu J. Modificación de una superficie de politetrafluoroetileno con un plasma de aire. Revista de Química (PUCP), vol. 2006;10 (2): 165-176 Obtención, caracterización y diseño de una forma farmacéutica semisóIida (ungüento) a base de quitosano con efecto cicatrizante 66 "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" ANEXOS Consultar capítulo completo en: http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2006/yaipen_chj/pdf/yaipen_chj-TH.back.2.pdf ANEXOS "Programa Cybertesis PERÚ - Derechos son del Autor" 67