Virologia: Es reconocida como una ciencia biológica básica.Es una rama de la microbiología que se ocupa de los virus y de las enfermedades virósicas. VIRUS: La palabra virus deriva del latin y significa líquido venenoso, ponzoñoso. Es un agente infeccioso, potencialmente patógeno que contiene como génoma un solo tipo de ácido nucleico, sea RNA o DNA, nunca ambos a la vez, como los microorganismos. Son considerados como parásitos intracelulares obligados. Son bioquímicamente inertes, no contienen ribosoma ni otros elementos, no se reproducen por división binaria como las células. Los virus se replican, aprovechando a las células que están metabolizando activamente. El primer descubrimiento de un virus se debe a Dimitri Iwanowski, quién en 1892 señaló que este agente producía la enfermedad del mosaico en la planta del tabaco, en 1898 lo confirmó el bacteriólogo holandés Martinus Beijerinck, en el mismo año Loeffer y Frosch describieron el primer virus animal, el virus de la fiebre aftosa. Desde entonces el estudio de los virus ha progresado constantemente como consecuencia de los avances técnicos de los investigadores donde el invento del microscopio electrónico en 1931 por Ruska y Knoll fue una de las más importantes contribuciones para los conceptos actuales sobre la morfología de los virus. I.Propiedades fisicas de los virus a) Tamaño: Mientras que los microorganismos se miden en micra (µ), los virus se miden en nanómetros (nm) Su medida oscila entre 15 a 350 nm 1 µ (micra) = 1000 μμ (milimicra) 1 μµ (milimicra) = 1 nm (nanómetro) b) Forma: La forma de los virus se estudia a través de su simetria. La simetría es la configuración o forma que adopta la nucleocápside del virus. Existen dos formas bien definidas de simetria viral, cúbica y helicoidal y una forma indefinida o compleja. 1 Simetria cúbica o icosaédrica constituye una cápside isométrica, corresponde a la disposición icosaédrica de las subunidades en una cubierta cerrada, el icosaedro tiene 20 caras, c/u un triángulo equilátero, 12 vértices y ejes de simetría rotacional. Simetría helicoidal constituye una cápside tubular, las subunidades proteínicas están fijas de manera periodica al ácido nucleico viral, con lo que lo amplian en un espiral de una cubierta que contiene lipidos. Simetría compleja o indefinida: Algunos virus poseen una estructura compleja, es decir donde el tamaño del núcleo es más grande que los demás, rodeados por una serie muy complicada de membranas y sub-estructuras que contienen muchas enzimas y proteinas, pero que no muestran ambos tipos de simetria. Algunas particulas virales no presentan simetría cúbica o helicoidal sino que tienen combinación de estructuras y además complicadas. c) Arquitectura o estructura del virus: 1 °. De acuerdo a su estructura los virus se dividen en dos grandes grupos: Virus simples o desnudos: Este grupo de virus se componen de ácido nucleico rodeado de una fina capa protectora la cápside, y que jtintos constituyen la nucleocápside, desprovista de envoltura, es decir permanece sin protección, por la que se los denomina desnudos. Virus con Envoltura o Cubierta: En este grupo de virus la nucleocápside se halla protegida por una envoltura o cubierta que en la mayoría de los casos deriva de la membrana citoplasmática de la célula huésped. Esta envoltura consta de una membrana interna proteínica específica del virus, una doble capa de lípido que deriva de la membrana plasmática de la célula huesped y de una capa externa de glucoproteína con proyecciones específicas del virus (peplómeros) 2°. De acuerdo a su ACIDO NUCLEICO se dividen también en dos grupos: VIRUS RNA Picornavirus Reovirus Arbovirus Myxovirus VIRUS DNA Papovavirus Adenovirus Herpesvirus Poxvirus 2 el único. Los virus pueden cultivarse de tres maneras: *Inoculación a animales de laboratorio: Ventajas: Ha sido el primer método de cultivo de Ios virus y durante muchos años. ordenada simétricamente denominada cápside. y si bien actualmente se prefiere el empleo de huevos embrionados todavía se emplean con éxito para estudios clínicos. patológicos. y para la producción de sueros antivirales.Método químico 1. Envoltura o cubierta: membrana que contiene lípidos y que circunda a ciertas partículas virales. Nucleocápside: La cápside junto con el ácido nucleico encapsulado Capsómeros: unidad morfológica de la cápside representada por un grupo de Polipéctidos. es decir la partícula viral infectante a través de su núcleo que consta de: Acido Nucleico: ya sea RNA o DNA se encuentra encerrado en una cubierta proteínica. está formada de pequeñas sub-unidades protéicas llamadas unidades estructurales o capsómeros. mientras que otros solamente crecen en el hospedador animal natural. la cual puede estar rodeada por una membrana que contiene lípidos llamada envoltura.d) Partes esenciales constitutivas del virus Virión es sinónimo de virus inmaduro. Cäpside: es la capa de proteína que rodea al ácido nucleico. Se adquiere durante la maduración del virus por un proceso de gemación a través de una membrana celular. Método biológico: Se basa principalmente en eI cultivo de los virus. pues algunos virus pueden multiplicarse con éxito por cualquiera de los tres métodos. En algunos casos también pueden emplearse para el diagnóstico al considerarse 3 . e) Métodos de estudio de los virus Existe tres métodos principales de estudio de Ia actividad viral Método biológico – Método físico . titulación. alteraciones macro y/o micro-patológicas.Antes de ser inoculados. pero actualmente para algunos virus fue reemplazado por los cultivos celulares. Constituye el elemento fundamental para la multiplicación viral in vitro. Son también muy irnportantes como suministro de tejidos para realización de cultivos celulares. El éxito de la infección puede manifestarse con la muerte del embrión. * Inoculaciones en huevos embrionados: a partir de 1930 se comenzaron a utilizar los huevos embrionados luego que Good Pasture y colaboradores enfatizaron su valor potencial para la multiplicación viral. conejos. estudio y conservación de cepas. depósitos de ureas. Los animales de experimentación más utilizados son ratones. En Ios 20 siguientes años fue el sistema más empleado. etc. detección y titulación de anticuerpos antivirales. Desventajas: Algunos inconvenientes del empleo de animales de experimentación son: • elevado costo en algunos casos • limitación del espacio disponible para jaulas y materiales • infección cruzada entre anirnales • posible infección humana • existencia de virus latente o aberrante que pueden complicar Ia interpretacíón de la infección específica • inmunidad producida por infección inaparente anterior a Ia inoculación del virus que investigamos. Los huevos embrionados pueden ser utilizados para el diagnóstico etiológico por aislamiento directo.una respuesta clínica positiva o negativa ante la infección experimental. producción de antígenos producción de vacunas. La presencia de virus endógeno representa un peligro potencial porque pueden interferir en la multiplicación del agente inoculado o ser llevados con los sucesivos pasajes junto con el virus que se trate de aislar . hámsters. los huevos deben ser incubados durante el tiempo óptimo para que el embrión. cobayos. hemorragias sobre las membranas. monos y pollos. cuerpos de inclusion. Cultivos celulares: el cultivo de células es unas de las técnicas básicas del Iaboratorio de virología. urones. fibrosis de la mernbrana. retraso del crecimiento embrionario. ya que ofrece células 4 . edematización. Ias cavidades extraembrionarias y sus membranas posean eI tamaño necesario según la vía de inoculación a emplear. etc. Los huevos utilizados para estudios virológicos deben ser obtenidos de aves sanas. libres de infecciones bacterianas o virales. engrosarniento. Las condiciones óptimas de cultivo varían en los diferentes tipos de células. El éxito de Ia fíltración depende en gran parte del conocimiento de las propiedades de los diversos filtros y de Ios virus que van a ser filtrados. Son muchas las variables a tener en cuenta y cada una de ellas merece particular atención según el tipo de cultivo que se realice y las células con que se trabaje: monocapa estática. El conocimiento sobre el tamaño y morfología de los virus ha progresado a medida que se han descubierto y perfeccionado instrumentos y técnicas. • Centrifugación: la centrifugación del material que contiene virus puede hacerse con dos finalidades: para concentrar las partículas de virus a fin de purificarlo para estudios detallados y para estudiar la velocidad de sedimentación. placas de asbesto y la membrana de colodión y celulosa. • Otros factores específicos 2.vivas rodeadas de un medio inanimado que provee el máximo de condiciones favorables para Iograr infección y multiplicación viral. 5 . a pesar de esta dificultad. siendo Ias más importantes: • temperatura • Composición del medio de cultivo • Ph • Concentración de gases disueltos • Características del soporte inerte en el cual se propaga el cultivo. lo cual exige el conocimiento del sistema para asegurar buenos resultados. Sin embargo. Método flsico: los científicos del principio de siglo sabían que existían seres vivos capaces de provocar enfermedades. Existen varios tipos de filtros de acuerdo al fabricante de porcelana. de barro de diatomeas. Las técnicas más importantes son: Filtración: los experimentos de filtración fueron empleados por Jwanowski (1892) en su trabajo original que probó la existencia de un virus. monocapa en sistema roller. y que estos agentes eran más pequeños que los objetos visibles con eI microscopio óptico corriente. Se emplean filtros de porosidades diferentes y haciendo pasar los virus a través de éstos se determina su tamaño aproximado. que es un dato para determinar el tamaño de los corpúsculos elementales. Empleó filtros con poros que retenían las bacterias. muchas de las propiedades fisicas de varios virus fueron determinadas con notable exactitud. cultivos en suspensión. Desde entonces se ha empleado esta técnica para separar la bacteria de los virus. pero que en el filtrado se encontraba un agente infeceioso que había pasado a través del filtro. cultivos de alta densidad (microcarriers) etc.. • Cromatografta: este método consiste en separar los componentes de tina mezcla compleja donde el flujo de un Iíquido o un gas se cuela a través de una fase absorvente. este colorante tiene afinidad por el ácido nucleico según el color de la reacción por microscopía de fluorescencia. eI DNA y RNA de uria sola tira es de color rojo. 3. por microscopía electrónica y por análisis directo del azúcar mediante el empleo de valoración clorimétrica de difenilamina. Los virus icosaédricos (cúbicos). ellos son: tinción con naranja de acridina. adenovirus. por hibridación molecular. como el reovirus. Métodos químicos: a través de la utilización de agentes químicos se pueden aislar u observar cada uno de los constituyentes virales.• Ultracentrjfugación: es el método más utilizado que se basa en la densidad. Los virus cubiertos o envueltos son mucho más termolábiles (que se alteran o descomponen fácilmente por el 6 . tamaño y forma del virus. Los virus reunidos resultante de Ia centrifugación son obtenidos en la porción superior o mediante perforación en el fondo del tubo de centrífuga. La determinación del tipo del ácido nucleico puede efectuarse por análisis de la composición básica. es decir difieren en su totalidad al calor. Comparado con el microscopio ordinario el microscopio electrónico utiliza electrones en lugar de rayos luminosos y el enfoque se realiza mediante lentes electromagnéticos en vez de lentes de cristal. • Método indirecto: se utilizan también varios métodos para determinar el ácido nucleico viral. El ácido nucleico se puede determinar por método directo o indirecto. povavirus. poxvirus tienden a ser estables y pierden poca infectividad después de varias horas a 37°C y se pueden conservar a 4° C por algunos meses. Se usa centrifugación diferencial para separar los virus de los constituyentes celulares. Los virus son concentrados mediante su acumulación en bolitas o esferas diminutas por centrifugación a alta velocidad. pero no ejerce efecto alguno sobre el RNA o DNA. El efecto DNA y RNA de doble tira produce flourescencia verde-amarilla. • Método directo: Ios ácidos nucleicos de Ios virus se extraen por fenol o sulfato sódico cada uno de los cuales desnaturaliza por completo la proteína. papovavirus. Los virus pueden ser observados en preparaciones hechas a partir de extractos de tejidos en cortes ultra delgados de células infectados. f) Efectos de los agentes flsicos sobre Ios virus • Calor y frío: hay gran variabilidad en la termoestabilidad de los diferentes virus. • Microscopía electrónica: la microscopía electrónica es el método más ampliamente utilizado para el cálculo de la partícula viral. Los rayos ultravioleta lesionan los ácidos nucieicos causando formación de dímeros entre moléculas y por ende se impide la multiplicación. que codifica Ia información genética necesaria del virus. La infectividad de los virus generalmente se destruye por calentamiento de 50°C a 60°C durante 3Omin. El calor húmedo comprende la esterilización por ebullición directa y la otra por autoclave bajo presión de vapor de agua a 121°C por 15 a 20 minutos e incluso hasta 30. virus tumorales. y algunos pueden resistir la liofilización y ser conservados eri estado seco a 4°C e incluso a temperatura de laboratorio.0 y 9. el principal papel corresponde a la desnaturalización de las proteínas La inactivación por calor: húmedo y seco. Los rayos X inactivan virus porque producen ruptura en la cadena de los ácidos nucleicos.90 °C y son particularmente sensibles a la congelación y descongelación repetidas. Los virus pueden ser preservados por almacenamiento a temperaturas de subcongelación. La reducción de la infecciosidad de los virus es directamente proporcional a la energía recibida (por el ácido nucleico). El número de tiras. segmentado o no. especialmente rayos X y gamma y radiaciones no ionizantes como las ultravioletas.0. el génoma puede ser de una sola tira o de doble tira circular o lineal. etc. El calor seco mediante el horno seco de Pasteur con una temperatura de 180 a 200°C por dos horas como mínimo. • Ph: los virus son generalmente estable entre valores de Ph 5. Todos Ios virus de 7 . Los virus encapsulados tienden a perder infecciosidad después de un almacenamiento prolongado aun a .calor) y su título disminuye con rapidéz a 37°C y a 57°C no viven más de una hora como el mixovirus. Todos los virus se destruyen en condiciones alcalinas II. es el mejor por su poder de penetración. La inactivación a temperatura ambiente se debería a la acción de enzirnas (ej. el tipo de ácido nucleico y el peso molecular constituyen las principales características usadas para la clasificación de los virus en familia Todos los virus de DNA poseen doble tira de ácido nucleico. Algunos virus como los enterovirus son resistentes a las condiciones ácidas. proteasas bacterianas) que dañan la superficie viral a temperaturas superíores. excepto eI grupo de parvovirus que tiene una sola. •Radiaciones: todos los virus son inactivados por radiaciones ionizantes. Propiedades quimicas de los virus Composición-función Ácidos nucleicos: Ios virus contienen una sola clase de ácido nucleico ya sea DNA o RNA. y probablemente carecen de importancia para la estructura de las partículas virales. El lípido se adquiere cuando la nucleocáside viral experimenta gemación a través de una membrana celular durante la maduración. Las proteinas estructurales de los virus desempeñan varias funciones importantes. por otra parte las glucoproteínas actuan como determinantes antigénicos importantes a los cuales se dirige a menudo la inmunidad del huésped. El ácido nucleico infeccioso aislado de los viriones pueden ser hidrolizados por nucleasas. sin einbargo. Proteínas: eI principal constituyente del virión. Sirven para proteger al génoma viral contra la inactivación por las nucleasas. En coiitraste con los lípidos de Ias membranas virales que se derivan de la célula huésped las giucoproteínas de la cubierta están codificadas por virus. Las enzimas se encuentran en cantidades muy pequeñas.RNA son de tira única excepto el grupo de reovirus en el cual es doble. La composición específica fosfolípida de la ctibierta de un virión se determina por eI tipo particular de rnembrana celular que participa en el proceso de gemación b) Efecto de los agentes químicos sobre los virus Sensibilidad 8 . la proteína representa el 50 a 70 % aproximadamente. pero la partícula viral intacta es insensible a tal tratamiento. participan en la adhesión de Ia partíctila viral a una célula sensible y proporcionan la simetría estructural de la partícula viral. lo cual incluye proteínas estructurales y enzimas. Enzimas: algunos virus poseen enzirnas ( que son proteínas) dentro de los viriones. Por otra parte el antisuero viral no neutraliza el ácido nucleico. además establecen las características antigénicas del virus. Glucoproteínas: el carbohidrato es la parte prineipal de la glucoproteína en las cubiertas virales. Lípidos virales: múltiples virus contienen envolttLras de lípidos como parte de su estructura. Casi todas las proteínas del virión son específicas del virus y las no estructurales específicas del virus desempeñan un papel durante la multiplicación viral. son indispensables para iniciar el cicio de replicación viral cuando el virión entra en la célula huésped. Su finalidad principal es facilitar la transferencia del ácido nucleico viral de una célula huésped a otra. excepto contra unos pocos virus. hánsters. mientras que otros varían en su sensibilidad. Las soluciones desinfectantes estándar de compuiestos de amonio cuaternario. ovinos. sin embargo se disponen de algunos fármacos antivirales como la acidotimidina. desintegran las cápside en polipéptidos separados. cresol y las de yodo orgánico no son tan eficaces. de los que no Ia poseen. el aciclovir. vdarabina y otros que han demostrado cierta actividad antivral con ciertas condiciones. Método Biológico: se basa principalmente en el cultivo de virus a través de células vivas. fenol. urones y pollos y algunos otros animales grandes como perros. Entre Ios desinfectantes que demuestran mayor eficacia de inactivación destacan agentes oxidantes corno peróxidos de hidrógeno. como dodecilsulfato de sodio. permanganato de potasio e hipoclorito sódico. danciclovir. Antibióticos y agentes antibacterianos: carecen de efectos en los virus. equinos. fisico-químico y serológico. Los virus que tienen génomas de una sola tira quedan inactivadas con mucha mayor facilidad que los que tienen doble. Los animales de experirnentación mãs utilizados son ios ratones.Al éter: puede distinguir a los virus que poseen una cubierta rica en Iípidos. 9 . METODO DE ESTUDÍO Y CARACTERIZACION DEL VIRUS Para el estudio de los virus se requiere de una buena cantidad de virus para lo eual se debe en primer lugar cultivar y replicar in vitro. A detergentes: los detergentes no iónicos como el triton x-100 solubilizan a los constituyentes Lípidos de las membranas virales. Formaldehído: destruye Ia infectividad viral al reaccionar con el ácido nucleíco. huevos embrionados y en cultivo de células. solubilizan las cubiertas virales. Algunos virus son inactivados por el éter otros son resìstentes. Los detergentes aniónicos. las proteínas virales de las mismas quedan liberadas (desnaturalizadas). caprinos. Estos pueden desarrollarse y multiplicarse en animales. Multiplicación viral en animales de laboratorio: El uso de animales receptivos fue eI primer método utilizado para la multiplicación viral. Para lograr este objetivo básicamente consideraremos tres métodos de estudio esenciales que son método biológico. conejos. la didesoxilinosina. además. cobayos. además ejerce efectos adversos mínimos sobre la antigenicidad de las proteínas por lo tanto se utilizan a menudo para producir vacunas de virus inactivados. Los ratones son en su mayoría utilizados en su período de lactancia hasta los 2 1 días de edad.05 ml en cobayas adultas.Dentro de estos aniinales de laboratorio los más utilizados son los ratones. lo que signifïca que se ha conseguido Ia multiplicación viral.48 horas post inoculación son descartados debido a que se consideran muertes inespecíficas. horas después entran en celo lo cual lo habilita de vuelta a la reproducción (preñéz-cria). buena ventilación. sea producto de la inoculación..bovinos y monos. los que mueren deben ser necropsiados (si hay lesiones en la necropsias se recogerá el material infectado) y los sobrevivientes al fïnal deben ser sacrificados autoclavados o incinerados en hornos crematorios. Para la investigación de algunas enfermedades se relacionará con el animal a emplearse eI volumen del inóculo y la vía a ser utilizada. Los inoculados deben observarse diariamente para detectar toda sintomatologia posible. El cultivo viral en animales (hospedador experimental) se basa en las inoculaciones de pasajes sucesivos. de la vía empleada o contaminación bacteriana. aquellos que mueran dentro de las 24 . etc. intranasal (IN) e intracerebral (ICe). Los funcionarios afectados al bioterio al entrar en el laboratorio deben cambiarse de ropa y a la salida se bañan y se cambian de ropa de calle nuevamente esto es con el fin de evitar la introducción o salida de microorganismos al local. EI bioterio debe tener suficiente espacio. influenza. Los animales deben estar perfectamente ídentificados. Ej.01 ml en cobayas lactantes y de 0. La ventaja de estos ratones blancos es que inmecliatamente después del parto. etc. piso y pared azulejado para fácil lavado y desinfección. intraperitoneal (IP). rabia. hasta obtener Ia infección. enfermedades vesiculares de los animales domésticos. Los animaies de Iaboraiorio pueden ser utilizados para Producción de vacunas: Control de vacunas (inocuidad y potencia) Titulación de virus (nivel de virus en suero) Seroneutralización (dosage del nivel de anticuerpo en suero) 10 . endovenosa (EV). Las vías de inoculación a utilizar dependerá del virus a ser estudiado y su posible histotropismo. enfermedades neurotrópicas . iritramuscular (IM). estos son criados exclusivamente para uso de laboratorio y mantenidos en condiciones estéril en locales especiales llamados Bioterios los cuales están ubicados aislados del laboratorio. se puede realizar el inóculo por váa subcutánea (SC). hánsters y cobayos y de preferencia los ratones blancos. se emplean ratones lactantes vía ICe y un volumen de 0. intracardiaca (lCa). meso y ectodermo. ya que después de dispersada la célula tiene un período de refactariedad a la infección. relativamente libre de proteínas extrañas Multiplicación viral en células cultivadas Si bien conocemos que el cultivo de células es una de Ias técnicas básicas actual de laboratorio de virología. ya que ofrece células vivas rodeadas de un medio inanimado que provee el máximo de condiciones favorables para lograr la infección y multiplicación viral.Ia multiplicación viral para eI diagnóstico etiológico de enfermedades por aislamiento directo. La inoculación: a través de la cámara cle aire hacia eI extremo achatado del huevo. titulación. Cuando se realiza la extracciõn en el tiernpo adecuado. Los huevos a ser utilizados para estudios virológicos deben ser obtenidos de aves sanas. La vía de inoculación a seleccionar dependerá de la afïnidad del virus (tropismo) por el tipo de célula constittiyente del embrión. los fluídos infectados y membranas proveen una gran cantidad de material viral. con Ia serie de alteraciones patológicas. Los virus que se inoculan en huevos embrionados multiplìcan en células de tejidos y órganos de los embriones y en la célula de las membranas extraembrionarias. produicción de antigenos diagnósticos y producción de vacunas. • Los rabdovirus y togavirus por sacovitelino (endo y mesodermo) • Los herpevinis y poxvirus por la membrana corioalantoidea (ectodermo). sus membranas endo. Ej. una tijera mediante se retira la cáscara y se inocula a cavidad o membrana elegida de acuerdo al virus a ser estudiada (membrana corioalantoidea. Ël éxito de la infección puede manisfestarse con Ia muerte del embrión. hemorragia sobre la membrana y otros. cavidad alantoidea.Para investigaciones varias (para conocer otras cepas sobre el mismo virus) Multiplicación viral en huevos embrionados Los huevos embrionados pueden ser utilizados para . los mixovirus y paramixovirus tienen afinidad por la cavidad alantoidea ( endodermo). 11 . Constituye el elemento fundamental para la multip1icacón in vitro. cavidad amniótica y saco vitelino). estudio y conservación de cepas. Estos virus inoculados en los embriones de huevos multiplican en las células de los tejidos y órganos de los embriones y en Ias células extraembrionarias. La inoculación del virus se realizará bien en el momento de sembrar la célula o una vez formada Ia monocapa. embrionados en tiempo óptimo de 10 a 12 días de incubación. detección y titulación de anticuerpos antivirales. tipo y estructura). monocapa estática o sistema roller). En la segunda el efecto citopático (ECP) donde ocurre cambios bioquímicos en las células infectadas susceptibles al virus y que en muchos casos se produce ECP y muerte de la célula. Efecto del virus sobre las células cultivadas La infección de la célula del huésped por virus. etc. Los tipos de efectos citopatogénicos básicos son: • Efecto lítico (desprendimiento celular) • Vacuolización (agujero en Ia célula: citoplasma o nuc1eo) • Agregación celular • Cuerpos de inclusión: son masas de partículas virales. Este es un detalle a tener en cuenta pues de otra manera se puede deteminar falsos negativos. En eI proceso de multiplicación viral el líquido nutritivo empleado para el crecimiento de las células se sustituye posteriormente por otro líquido nutritivo que contenga virus. causa alteraciones metabólicas y citológicas (síntesis macromolecular y cambios bioquímicos en Ias células). Aunque cada virus puede ser capaz de infectar y replicar en varios sistemas celulares. tamaño y densidad del virus. un cultivo celular en especial puede ser más sensible qtie otros (permisividad celular). como resultado del crecimiento del virus en la misma.) es procesada convenientemente y se inocula en las células elegidas por su susceptibilidad y propagadas convenientemente (cultivo de suspensión. En Ia primera se produce una inhibición de su metabilismo y corno resultado culrnina con el desprendimiento celular y muerte ( sin efectos citopáticos . químico y serológico en el estudio del virus Los métodos físico y químicos juntos han proporcionado valiosos aportes en el estudio y caracterización del virus (tamaño. La centrífuga 12 . etc. bacterias. forma. Métodos: físico. restos de células.Para aislar la mayoría de los virus (hisopado de sangre. • Sincitios: son fusiones de células entre sí debido a la infección por alteración de la membrana celular. trozo de tejido. Las principales técnicas físico-química son: U!tracentrifugación: este es el método más usado basado en la determinación de la forma. componentes químicos.sin daño celtilar). ubicados en el nuc1eo o citoplasma de Ia célula). Tras un período de incubación aparecen áreas de células necróticas. Aglutinación e inhibición: el término aglutinación se usa frecuentemente para la identificación de ciertos virus y en la comprobación de los anticuerpos correspondientes (de ese virus). y refrigerada a una temperatura de . Un antígeno reaccionará sólo con el anticuerpo estimulado por antígeno de su propia clase. Fijación de Complemento: es una técnica de diagnóstico de enfermedades para detectar anticuerpos fijadores de complementos largamente usados para detectar el virus de la fiebre aftosa. Algunos virus HA además de la hemoaglutinina contiene otra segunda enzima. Tenemos la prueba de inmunodifusión en agar para el diagnóstico de la anemia infecciosa equina. Los virus 13 .Cabe destacar además que en el suero podemos encontrar tres tipos de anticuerpos: NEUTRALJZANTES. La capacidad de hemoaglutinación refleja el hecho de que algunos eritrocitos posean receptores para ciertos componentes de ia superficies de las partículas virales que funcionan como proteinas de adherencia a ias células. Los virus hemoaglutinantes(HA) poseen en algunos casos solamente una enzima llamada hemoaglutinina mediante la cual se unen a los glóbulos rojos a través de un fenómeno conocido como hemoaglutinación ( in vitro).30 a -35°C (bajo cero) a fin de mantener la viabilidad del virus. es decir que ciertos virus aglutinados a los eritrocitos y qtie rápidamente los anticuerpos contra el virus inhiben la reación (HI).000 a 65. Ej. ortomixovirus y paramixovirus.Ej. Precipitación: consiste en la detección de anticuerpos precipitantes (precipitinas) a través de reacciones de antígenos con anticuerpos y que son muy específicas. Las reaciones de inhibición de la aglutinación (HI) son métodos adecuados para determinar Ia presencia de anticuerpos especfficos en el suero de Ios individuos enfermos o convalecientes.000 rpm. La hemoaglutinación ( HA) se refiere a la capacidad qtie presentan muchos virus de aglutinar los glóbulos rojos de distintas especies animales. FIJADOR DË COMPLEMENTO) Y PRECIPITA NTES. ésta enzima es activada a 37 oc temperatura de estufa produciendo una separación del glóbulo rojo de los virus durante el proceso de la hemoaglutinación. Este fenómeno es denominado ELUCION viral. Ia neuraminidasa.es el aparato utilizado en la técnica de ultracentrifugación a una velocidad entre los 45. al que se ánade suero problema. seguida de la inoculación con virus violento. lo que significa su aporte considerable en el estudio de los mismos. Suero problerna Virus Conocido 0. Microscopía electrónica: el uso del microscopio electrónico es importante como instrumento de investigación y no se emplea en el diagnóstico habitual de los virus. éste resulta neutralizado o pierde su poder infectante.y células tienen receptores y una afinidad entre ellos que induce a la fijación.1 mI. La seroprotecciôn: aunque no sea estrictamente serológica. Si existe en eI suero anticuerpos que se correspondan con eI virus. 1/5 1/25 1/125 1/625 1/3125 14 . se aplica al estudio e identiticación de aquellos virus que pueden emplearse para producir una vacuna satisfactoria. Puro Dìl. Mediante la utilización de productos conjugados y anticuerpos específicos Microscopía de Fluorescencia: es una técnica de Iaboratorio que sirve para detectar indirectamente la presencia del virus en células o tejidos infectados marcados con sustancias fluorescentes (ISOCIONATO DE FLUORESCEINA). Seroneutralización: las reacciones de neutralización se utilizan para el estudio del virus sea con la sero-neutralización (SN) y la virusneutralización (VN). Este procedirniento se emplea también en Ia contrastación de muchos sueros y vacunas comerciales. En la seroneutralización se ernplea virus conocido. Su valor fundamental se basa en Ia determinación del tamaiìo y forma de los virus. La prueba de protección comprende la inmunización activa o pasiva de un animal. La falta de receptor es la causa de la resistencia de algunas células a la infección por ciertos virus. ésta coloración es vista a través del rnicroscopio electrõnico con Iuz azul o ultravioleta y en donde se puede detectar la presencia del virus en la muestra. Sedimentación: consiste en la velocidad de sedimentar un virus en un medio de suspensión y conscuentemente se puede utilizar la sedimentación de un virus en la ultracentrifugación técnica consistente en centrifugar a velocidad elevada con lo que se puede determinar el tamaño y la forma del virus. INFECTIVIDAD VIRAL Los virus solo se multiplican en células vivientes. Se inocula a 10 ratones c/cada dilución de suero + virus vía intracraneal. Por lo general los anticuerpos del suero impiden la eliminación del virus dentro del organismo. Suero conocido Virus puro puro Dil. 15 .A estufa a 37°C x 30 min. aunque en ocasión coexisten en la sangre virus y anticuerpo. 1115 1/25 1/125 1/ 625 1/1325 Epidemiología La supervivencia interepidémica de los virus es un problema interesante para los epidemiólogos. contar a partir del 5° día cuántos rnueren y cuántos sobreviven y se opta por la dilución de suero que protegió al 50% PURO MUERTOS SOBREVIVIENTES °/oM %S Dil 1:5 0 10 0% 100% Dil 1:25 8 20% 80% Dil 1:125 3 5 30% 70% Dil 1:625 5 5 50% 5O% Dil 1:3125 9 1 90% 1O% En Ia Virusneutralizacìón o Titulación Viraí (lo opuesto a Ia Seronetitralización) es una técnica laboratorial que permite determinar la dilución del virus que mate al 50% de los animales inoculados (I)L50%). Se deduce que la supervivencia interepidemica de los virus depende primordialmente de las infecciones inaparentes de los animales portadores. En Ias virosis agudas generalizadas es frecuente que el virus se elimine en la fase aguda de la enfermedad o durante la convalecencia un virus vive por meses o años. luego observar x 14 días a los animales inoculados. puesto que Ios virus en general no sobreviven mucho tiempo fuera del hospedador animal. Las reacciones de neutralización viral es similar a la Seroneutralización salvo que eI suero es conocido y el virus no. sin embargo en algunos casos la eliminación cesa inmediatamente. RELACIÓN =VIRUS / CÉLULA: • Se establece desde que el virus penetra e infecta a una célula huésped hasta la eliminación de la progenie viral. INFECTIVIDAD VIRAL Por mediación de sitios receptores 16 . • Los virus han desarrollado diversas estrategias para lograr la multiplicación en las células huésped parasitadas por ellos. • A veces el virus: no se adhiere a la célula (células no permisivas).• Necesitamos conocer el mecanismo de la multiplicación viral entender como los virus entran y salen de las células. Aunque los detalles varían de un grupo a otro el patrón general de los ciclos de replicación es semejante. por lo tanto no hay cambios visibles. • O a veces el virus: penetra. El mecanismo de la replicación de los Virus tanto DNA y/o RNA difieren notablemente unos de otros Los pasos o fases de tal replicación para ambos grupos son similares. en que estadios quimioterapéuticos. • Como las matan . penetran en la célula pero ésta no permite que el virus comande su genoma. al cual nos referiremos al hablar de multiplicación viral. • Otras veces el virus: llega a dominar el genoma celular. transforman al estado son susceptibles a agentes maligno y REPLICACIÓN VIRAL: • La célula huésped debe proporcionar la energía y la maquinaria necesaria para la síntesis de las proteínas virales y del ácido nucleico. • Resumiendo. • • • • La infección de las células susceptibles de un virus en muchos casos culmina en la multiplicación con descendencia subsiguiente de dichos virus. decimos que la relación virus-célula depende tanto del virus como de la célula huésped. se integra al genoma celular dividiéndose la célula sin alteraciones visibles. sintetiza su genoma. • Otras veces el virus: se adhiere a la célula (células permisivas). sintetiza sus componentes y termina en progenie viral. por lo tanto el virus es eliminado. el poliovirus fija solo en las células del sistema nervioso central. La penetración de un virus en el interior de una célula susceptible depende de la temperatura. 17 . • La presencia o ausencia de receptores desempeña una función determinante de primer orden en el tropismo celular y la patogenia viral.es el mecanismo predominante de la penetración viral en animales. La viropexia o englobamiento del virus por fagocitosis del virus . Sin mediación de sitios receptores: Algunos tipos de células carecen del sitio de recepción y es la razón por la cual las células resisten a la infección por los virus Fases de la Replicación Viral. Fase 1 Fijación o adsorción: • Constituye la primera etapa de infección viral • Los virus poseen en su superficie los llamados sitios de adherencia • Las células poseen los llamados sitios receptores y una afinidad entre ellos inducen su fijación. la partícula viral entra en la célula. tiene en la superficie externa los llamados sitios de adherencias Ciertas células tienen espinas en su superficie considerados receptores Los sitios receptores y una afinidad entre ellos (virus y células) facilita la fijación del virus a la célula. (ejemplo. Es el primer paso para la infección viral.Penetración: Después de la fijación. Fase • • • • • • 2 .• • • • • • Ciertas células tienen espinas en su superficie considerados receptores Todos los Virus tanto desnudos o envueltos. • En virus desnudos la cápside proteica son las estructuras para la fijación • Los virus con envoltura la glucoproteína de esta cubierta participa en la fijación. Esta etapa se conoce como penetración viropexia o fagocitosis. Mientras que la fusión ocurre probablemente más a menudo en los virus provistos de envoltura. (óptima 37 °C) La estructura del Virus que penetra en el citoplasma huésped es la nucleocápside viral para ambos grupos de virus (desnudos y envueltos). Rábico).Fase 3 . • Los pequeños virus de RNA o DNA son liberados primariamente por extrusión (por empuje) • En la mayoría de los casos brota la yema desde la membrana citoplásmica INFECTIVIDAD VIRAL 18 . ensamble o unión finalmente. Hepatitis). translación. reunión y maduración de los nuevos virus.Escape o salida • Es la liberación del ac. estas nuevas partículas virales están de nuevo listos para iniciar un nuevo ciclo de replicación viral • Los génomas virales recién sintetizados y los polipéptidos de la cápside se ensamblan para formar los virus descendientes. • La liberación del ácido nucleico puede ocurrir en la membrana celular. Por el contrario los RNA Virus son de replicación citoplásmica (V. nucleico viral dentro delcitoplasma de la celula • Después de la adsorción tanto la cápside proteica y la envoltura viral se alteran y termina con disolución a su entrada en el citoplasma celular. El período o fase eclipse incluye la transcripción. Estos virus se reúnen en el interior de estructuras citoplásmicas a través de los cuales los nuevos viriones son expulsados continuamente. en el citoplasma o en el núcleo • Los virus DNA son de replicación intranúclear ( Ej. Fase 5 – Liberación • Se produce la liberación de miles de virus nuevos en el líquido extracelular. replicación o reproducción del ácido nucleico viral. Fase 4 Eclipse Viral • Esta fase es conocida como la desaparición de los viriones infecciosos que no pueden ser ya identificados en el interior de la célula Durante este período ocurre una serie compleja de acontecimientos bíosintéticos ( mensaje enzima RNA mensajeros de la célula y ataca al virus) Este período de eclipse se refiere al tiempo transcurrido entre la desaparición de los viriones infecciosos y la aparición de nuevas partículas virales de la descendencia en las células infectadas. • Lo que realmente libera al ácido nucleico dentro de la célula es la acción de enzimas celulares ( de la célula infectada). Tipos de infección • • • • • • Típicamente una infección viral produce una respuesta inmunitaria dirigida contra uno o más antígenos virales. Para establecer el diagnóstico de una infección viral se debe demostrar serológicamente por elevación del título de anticuerpos contra el virus causal. • En la mayoría de los virus ocurre una reunión escalonada de los componentes. desarrollo de anticuerpos celulares y humorales. 19 . El génoma RNA no utiliza la transcriptasa celular para su transcripción. los viriones del núcleo emigran al citoplasma como un proceso de maduración y son expulsados. O mediante la demostración del agente causal (por aislamiento e identificación) El período de incubación es el tiempo transcurrido entre la infección y la primera manifestación de signos clínicos.• Se refiere al mecanismo de infección producida o causada por los virus DNA Y RNA Virus de DNA: La transcripción de DNA viral por transcriptasa celular ocurre casi en todos los virus DNA • En todos los virus DNA la replicación o reproducción del ácido nucleico viral (NA) ocurre en el núcleo. El dosage de éstos anticuerpos pueden ser usados para diagnosticar una infección viral. Se produce como consecuencia de la infección viral. • Después de la reunión viral.(mensajero RNA) La reproducción o réplica . reunión y maduración de RNA viral ocurre en el citoplasma de la célula. • Virus de RNA: • • • • La transcripción en virus de RNA es diferente de la descripta para los virus de DNA. El génoma de los virus de RNA con estructuración en tira positiva contiene el mensaje y actúa directamente como mRNA sin necesidad de transcripción El virus RNA con génoma de estructuración en tira negativa es portador de transcriptasa asociada al virión para la transcripción de su genoma RNA a mRNA. Ej: enfermedades como AIE. • En la mayoria de los casos pasan desapercibidos • Son asintomáticos • O no hay tiempo para observar ninguna sintomatologia. • INFECCIÓN INAPARENTE • Son infecciones con cortísimo período de incubación. la leucemia. Ej. rabia. INFECCIÓN LATENTE • La infección latente es un padecimiento también persistente en el cual el virus es activado con intermitencia • Resulta en multiplicación viral rápida y manifestación recidivante de la enfermedad.Durante el mismo el virus se disemina a diversos tejidos y órganos de manera escalonada antes de alcanzar los órganos blancos. Ej: herpesvirus INFECCIÓN LENTA • Es una infección persistente con largo período de incubación. • El agente causal siempre es demostrable. aftosa.la AIE. • AGUDA • INAPARENTE • INFECCIÓN CRÓNICA • LATENTE • LENTA • CONGENITA INFECCIÓN AGUDA • Es una infección con un período de incubación corta. etc. INFECCIÓN CRÓNICA • Es una infección persistente que sigue un curso prolongado y a menudo irregular. • Seguido de una enfermedad lentamente progresiva que generalmente es mortal. que a menudo dura años. • En muchos casos comienza como infección aguda en el cual el virus también es demostrable. INFECCIÓN CONGENITA • Son infecciones que se establecen durante la preñez. 20 . Ej: AIE • En muchos casos la enfermedad clínica esta ausente o de lo contrario está asociado con disturbios inmunopatológicos.. el sida. • Se manifiesta con los síntomas clásicos de la enfermedad de que se trate. definida en días. Diarrea Viral Bovina. otros. Tumor: es un crecimiento incontrolable de células permanentes o temporales. VIRUS ONCOGENICOS RNA • Los virus oncogénicos RNA son los agentes etiológicos de las leucemias y sarcomas en un gran número de especie animal.• • • Puede causar muerte del feto o la formación de defectos congénitos El virus es al parecer transferido al feto cuando existe viremia en la madre. Ej: IBR. los herpesvirus causan tumores malignos en su huésped natural. Estas lesiones generalmente son irreversibles. VIRUS ONCOGENICOS RNA 21 . VIRUS ONCOGENICOS • • • • • • • Aproximadamente cerca de 150 de los más de 600 virus conocidos tienen potencial de producir tumores ya sean benignos o malignos. VIRUS ONCOGENICOS DNA Y RNA Tanto los virus DNA Y RNA tienen la capacidad de causar este cambio en el funcionamiento celular VIRUS ONCOGENICOS RNA • Entre los virus RNA el potencial oncogénico está restringido a un solo grupo (retrovirus) VIRUS ONCOGENICOS DNA • Mientras que por lo menos cuatro de los seis grupos de virus DNA tienen capacidad oncogénica (papovavirus adenovirus poxvirus y herpesvirus). VIRUS ONCOGENICOS DNA • De entre los 4 grupos de virus oncogénicos DNA. Leptospira. Puede ser generalizado o metastásico culminando con la muerte del animal (tumor maligno) Puede permanecer localizado y finalmente regresar (tumor benigno) Estos virus tienen la capacidad de iniciar en los animales la proliferación de células que conduce al desarrollo del tumor. El cáncer como un fenómeno se origina en una sola célula Una vez alterada la célula poseen nuevas propiedades anormales que son trasmitidos genéticamente a sus descendientes. los únicos que causan tumor natural (papiloma) en su huésped original. Saimirí leucemia linfática mortal de mono . • Varios adenovirus son oncógenos en condiciones de laboratorio (tumor maligno in Vitro). • En resumen está claro que los herpes virus oncogénicos entran en una permanente asociación con los leucocitos de una gran variedad de animales y que resulta en una pequeña producción de virus pero sí. virus causal de la mononucleosis humana • H. • Otras posibles relaciones o conexiones entre Herpes Virus y cáncer humano. • Virus de Epstein-Barr. • Con el Cáncer de naso faríngeo: asociación serológica por Anticuerpos encontrados entre el virus Epstein-Barr y el cáncer nasofaríngeo humano. • De los 4 grupos de virus oncogénicos DNA. mientras que otros forman tumores en laboratorio. • El poxvirus suele producir tumores benignos.El grupo RNA oncogénicos virus causan tumores malignos en el huésped directamente (leucovirus) VIRUS ONCOGENICOS • El fenómeno central del sistema (tumor modelo) es la trasformación celular. VIRUS ONCOGENICOS DNA • Grupo DNA oncogénicos :Papovavirus adenovirus poxvirus y herpesvirus • Varios virus DNA inducen tumores . • Los resultados de las investigaciones realizadas sobre las transformaciones celulares in Vitro 22 . • El herpes virus tipo 2 ligado al carcinoma cervical humano (del útero). pero si maligno in Vitro (el mixoma del conejo). • PROPIEDADES GENERALES DE LOS VIRUS PRODUCTORES DE TUMORES.ardilla. los herpesvirus causan tumores malignos en su Huésped natural. • Los papilomavirus. • Hay 5 diferentes herpesvirus asociados con cánceres naturales en el hombre y animal. en una gran proliferación de células transformadas. • Con el carcinoma cervical de la mujer tiene una fuerte relación con el virus tipo 2 por los anticuerpos antivirales encontrados. • Enfermedad de Marek de las aves (osteoma). • Carcinoma: Lucke de la rana (del riñon). Las células alteradas invaden los tejidos vecinos y producen metástasis a distancia en otros órganos y tejidos. consiste en demostrar la capacidad de producir tumor cuando se inocula en el huésped animal apropiado. • Una vez alterada posee nuevas propiedades anormales que son transmitidas genéticamente a las células hijas. Investigaciones sobre cáncer mamario humano indican que puede ser de la misma etiología que el ratón. • Como consecuencia de éste fenómeno se observan 2 resultados en los animales: 1. FORMAS DE RECONOCER LA TRANSFORMACION CELULAR 1. • 23 . b) Cambios en la absorbencia celular c) Aumento de la velocidad de crecimiento d) Aumento en la movilidad celular. • Esto se basa en dos hechos: 1. El huésped controla las células alteradas a través de mecanismos inmunitarios tanto humorales como celulares (no avanza).Aumento del metabolismo y la multiplicación celular (in Vitro).La ocurrencia familiar del cáncer mamario de las mujeres sugieren que la enfermedad en sí o la susceptibilidad a ella es trasmitida genéticamente.Cambio en la apariencia celular o de su disposición en el cultivo de células. dando como resultado la muerte del huésped. TRANSFORMACION CELULAR • No todas las veces esto es posible y se deberá usar como criterios de transformación celular los siguientes factores: a) El más notable de entre estos factores es la pérdida de la capacidad de inhibición de contacto. 2.Indican que el cáncer se origina como un fenómeno que ocurre en una sola célula. 2. 2-La leche humana de la persona afectada contiene partículas virales que son morfológicamente similares a los del tumor mamario del ratón. • La prueba de más valor de la transformación oncogénica de un sistema in Vitro. VIRUS DE TUMORES HUMANOS Hay clara evidencia de que el cáncer mamario del ratón es la consecuencia de una compleja interacción entre el virus por un lado y factores genéticos por otra. el cambio se debe a la pérdida de inhibición de contacto. e) Adquisición de nuevos antígenos. Factores nutricionales Inhalación emanadas de productos químicos. • Conclusión • "No hay una causa definida” 24 .Finalmente no se sabe si los virus DNA y RNA oncogénicos inducen la formación de tumores por el mismo mecanismo de acción. y de plantas de usinas nucleares. 4. El consumo exagerado de bebidas alcohólicas (cirrosis hepática) 3. golpes.El hábito de fumar que predispone considerablemente a las vías respiratorias superiores al cáncer. • A pesar de que hay alguna evidencia que sugiere que ellos convierten células normales en malignos por un mismo mecanismo.Factores hereditarios. Asi tenemos: 1. • La biología de los dos grupos es extremadamente diferente a los posibles factores de cáncer. ect. 25 .