Validación del Método Analítico por HPLC/UV para la Determinación de Terbutil Hidroxiquinona T!H"# en Aceite Ve$etal% QFB. José Eduardo Hernández Torres; Brenda Abigail Macias Ramírez; r. Mar!ín "#mez Hernández. e$!o. de %is!emas Biol#gicos& 'ni(ersidad Au!#noma Me!ro$oli!ana )oc*imilco& Mé+ico F. Resumen. Con la finalidad de cualificar y cuantificar por medio de la adición de estándar interno la TBHQ en aceites vegetales se efectuó la validación de la metodología para la determinación de la TBHQ por cromatografía líquidos de alta resolución (HPLC) con base en el método oficial de la Association of Analytical Communities (AOAC) realizando en algunas modificaciones. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlación r=0,9974. Para la precisión del sistema se evaluó la relación de áreas bajo la curva (ABC), hallándose coeficientes de variación menores al 3%. Para la repetibilidad del método se obtuvo un valor de P de 0.9739 apoyándose en un análisis de varianza (ANOVA). Para la recuperación se obtuvo un porcentaje de 83.1%. Con los resultados obtenidos se demuestra que el método en estudio es lineal, repetible, preciso y tiene buena recuperación (aunque no ideal) para ser utilizado en el control de calidad de alimentos, específicamente en aceite vegetal para la determinación de TBHQ. Summary. In order to qualify and quantify the addition of internal standard TBHQ in vegetable oils was carried out to validate the methodology for the determination of TBHQ by high pressure liquid chromatography (HPLC) method based on official Association of Analytical Communities (AOAC) making some changes. The linearity was obtained a correlation coefficient r = 0.9974. For the accuracy of the system evaluated the relationship of areas under the curve (AUC), being coefficients of variation less than 3%. For the repeatability of the method yielded a P value of 0.9739 based on an analysis of variance (ANOVA). Recovery was obtained for a percentage of 83.1%. With the results demonstrated that the method under consideration is linear, repeatable, accurate and has good recovery (though not ideal) for use in food quality control, specifically in vegetable oil for the determination of TBHQ. INTRODUCCIÓN El término antioxidante se refiere a la capacidad de un compuesto de oponerse a la acción del oxígeno y de ciertas especies oxidantes; lo realizan liberando electrones que son captados por los radicales libres. (BALLESTER, 1996). Los conservadores son productos químicos que se adicionan para prevenir o inhibir el crecimiento de microorganismos (SATTIGERI, 2000). Los antioxidantes-conservadores detienen la degradación química de medicamentos cosméticos y de alimentos, que se provoca por la presencia del oxígeno (ANDRÉ, 2010). Los aceites vegetales son muy importantes en la preparación de cosméticos y alimentos convirtiéndose en productos de uso cotidiano, y que requieren una excelente calidad. Uno de los antioxidantes más utilizados es el terbutilhidroquinona (TBHQ) (figura 1) también conocido como antioxidante E-319, es un compuesto aromático de tipo de fenol derivada de la hidroquinona. El TBHQ es un antioxidante de calidad alimentaria, que fue desarrollado para retardar el desarrollo de la rancidez y prolongar su vida útil de almacenamiento (SUMIKO, 2004). El TBHQ también puede ser ventajoso en aceites esenciales, frutos secos y materiales de envasado (XIU-QIN, 2009). Figura 1. Estructuras químicas de TBHQ y PG respectivamente El propil galato (PG) es un antioxidante grado alimentario para grasas y aceites en general, incluido también en alimentos y cosméticos que los contengan. También es inhibidor en la auto oxidación de paraldehído y sustancias similares expuestas a peróxidos en presencia detector KNAVER UV. Repetibilidad y Precisión. 2000). es conveniente establecer un método analítico que monitoree su cualificación y cuantificación en los diversos productos que los utilizan. 5. ANDRE. La validación en este estudio considera los parámetros de: linealidad. mientras que el tipo de columna utilizada es una C18 con fase estacionaria de sílice esférica. 1994) Para que el método analítico sea confiable tiene que estar validado. en los que se encuentran: diferente extracción de acuerdo a los solventes utilizados. Para la solución estándar de As se sonicó por 5 min para su completa disolución. Se pueden analizar hasta 15 diferentes antioxidantes en un sólo análisis. Por lo tanto. disolver y diluir a volumen de aforo con acetonitrilo: 2-propanol (1:1 v/v) y homogenizar.0 mg de PG. repetibilidad y recuperación (WALPOLE. Metanol (EMD) estos últimos con grado HPLC. entre sus características más importantes de este método son la utilización de una extracción liquido-liquido acetonitrilo: hexano. pero un incremento en su concentración puede producir toxicidad o mutagénesis. (SATTIGERI.de oxigeno. tipo de columna y tipo de elución. Evaluación de Linealidad. El equipo de HPLC está conformado por una Bomba LAB ALLIANCE Serie III modelo A20164.C-18 100 X 3 mm. Preparación de disoluciones de estándar interno (IS) y disolución stock de TBHQ y Acido ascórbico (AAs). 2009). La validación proporciona un alto grado de confianza y seguridad del método analítico y se realiza para asegurar que el método propuesto cumpla con su función. en este caso de tipo isocrática. El PG puede combinarse con otros productos antioxidantes como el TBHQ y el ácido cítrico para evitar la formación de colores no deseados (XIU-QIN. Equipo. precisión. Para el proceso se ® obtuvieron dos aceites comerciales (1-2-3 y ® PAM ) el primero contiene el antioxidante de interés TBHQ mientras el segundo lo carece. así también se propone un método con estándar interno.1% y 97% respectivamente. Los reactivos utilizados fueron Ácido acético glacial y Alcohol etílico (J. contenido en aceite vegetal comercial. por otro lado dentro del análisis cromatrográfico su elución es de tipo gradiente. Se adicionaron 60µL de estándar interno a seis matraces aforados de 5 mL. un sonicador Branson 3210. Se utilizó también como compuesto de referencia Acido ascórbico (SIGMA). BAKER Grado reactivo). Se lleva al volumen de aforó con la fase móvil. Los compuestos de referencia PG y TBHQ fueron proporcionados en un kit de antioxidantes fenólicos (SUPELCO) los compuestos contaban con una pureza de 99. a matraces aforados de 5 mL. con el fin de optimizar el método. dañando la salud del consumidor (WEI. Los antioxidantes deben proteger la calidad en los productos cosméticos y alimentarios. 1987. añadieron volúmenes en un intervalo de 20 a 120µL. (AOAC Método oficial. columna KINETEX 2.6 µ X 13. Dentro de los métodos de análisis existentes para la determinación y cuantificación de antioxidantes se encuentra la cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO Reactivos. La fase móvil fue . Acetonitrilo (J.0 mg de AAs exactamente pesados.0 mg de TBHQ y 5. variando algunos aspectos de acuerdo al método oficial. El presente trabajo tuvo como objetivo la validación de un método analítico para la determinación cualitativa y cuantitativa del antioxidante TBHQ a través de HPLC. Se utilizó una balanza Mettler AE163. Actualmente se cuantifican estos antioxidantes por el método oficial de la AOAC para antioxidantes fenólicos en aceites y grasas. Alcohol isopropílico (OMNISOLV). BAKER). 2010). posteriormente se adicionó la disolución stock de TBHQ. 2010). Transferir por separado 5. ácido acético y agua en una proporción de 50:5:2:43 v/v. volumen de inyección 20 µL.6 µ X13. Las condiciones de análisis fueron: columna KINETEX. Se pesó 1 g de aceite comercial en un tubo.2 CT!H"/CP& DISCUSIÓN Y RESULTADOS Linealidad Para el estudio de la linealidad del sistema se preparó la curva de calibración por triplicado. 1..6123x + 2 0. Transcurrido el tiempo se filtro y se tomó 1 mL el cual se evaporó en una estufa al vacio. .. metanol. El Cromatograma también muestra una buena resolución por parte del sistema de HPLC utilizado. asimismo se deja en claro que la elección de PG como estándar interno cumple con los requisitos para tal asignación. temperatura de columna ~20° C. donde y es la relación de área. m la pendiente y b el intercepto (Grafica 1). Después de homogenizar la mezcla colocó en el congelador durante una hora. A!CT!H"/A!CP& 1. Evaluación del Parámetro de Recuperación.016 mg/ml. como un tiempo de retención cercano al analito de interés. utilizando PG como estándar interno.2 1 1. Análisis por HPLC. Preparación de la muestra. ABCTBHQ/ABCPG = f(CTBHQ/CPG). A seis matraces aforados de 5 mL se adiciona 120 µL respectivamente de la disolución de estándar interno y de la disolución stock de As. . . y volúmenes de 60µL de la disolución de estándar interno y 120 µL de la disolución As.propanol y Etanol en proporción 2:1:1 v/v). la muestra se redisolvió en 1mL de fase móvil y se analizó por HPLC. En donde se representa claramente los tiempos de retención 0. por lo cual no deja ver interferencia alguna por parte del equipo. La ecuación del modelo es: ABCTBHQ/ABCPG = 0. así como su parecido en su naturaleza con el analito.780 min y 1.. este tomado a una concentración de 0.0 µg/mL de TBHQ y 12µg/mL del estándar interno. 2..0 hasta 24. Hecho esto las soluciones estándar fueron analizadas por HPLC. modelo y= mx + b.una mezcla de acetonitrilo.2 -..8 mL/min y duración de análisis de 3 min.. x la concentración. 2.. La curva de calibración para TBHQ fue construida usando la relación de áreas bajo la curva del pico cromatrográfico. El cromatograma de TBHQ Y PG se muestra en la figura 2.0173 El valor de R da un resultado de 0. C-18 100 X 3 mm../ . De la disolución stock de TBHQ se añadieron a los matraces diferentes volúmenes en un intervalo de 20 a 200µL llevando al aforo con fase móvil.1 .9974 lo que representa una linealidad aceptable. flujo 0. Se preparó un blanco que contenía todo menos la TBHQ. Curva de calibración para TBHQ. Los resultados del modelo lineal describen la relación entre la relación de área y la relación de concentraciones de TBHQ. se le agregó 10mL de una mezcla de disolventes (Acetonitrilo. en un intervalo de concentración de 4. 280 nm.016 min para PG y TBHQ respectivamente. Datos utilizados para evaluar linealidad del sistema.0 . Se realizó el análisis de regresión lineal considerando el Gráfica 1. . se filtró y sonicó por 15 min. su nula interacción. 1/ CV -. En la grafica 2 se aprecia una comparación de las curvas de cada uno de los tres días. Gráfica 2. CT!H"/ CP& .973 9 Tabla 1. en el mismo intervalo de concentraciones. que demuestra .2 1 1.0 1. Datos utilizados para evaluar reproducibilidad en 3 días diferentes..0 ..022 mg/mL.. el cual es más grande en los últimos dos puntos.. Curva de calibración para TBHQ.03..2 C T!H"/P& 6 7 ..009 y 0. Se considera como criterio de aceptación un coeficiente de variación (CV) de la relación de ABC menor al 3%.00631434 6.04 A!CT!H"/ A!CP&# Media . Resultados del estudio de precisión..A!C TH!"/P& 1 .2033+ 8 . Para la evaluación del parámetro de recuperación se realizó una curva de calibración de 0..03 ValorP 0.119216 Razón-F 0.. El valor de R² para la curva de calibración del aceite adicionado con los estándares fue de 0..08 6.08632 Gl 2 51 53 Cuadrado Medio 0... . por lo que se establece que existe precisión. mostrando que la tabla ANOVA (tabla 1) descompone la varianza de los datos en dos componentes: un componente entre-grupos y un componente dentro-de-grupos. su valor e inferior al 3%.. el cual no contenía el antioxidante de interés.020 mg/ml del stock de TBHQ por triplicado adicionando los estándares a muestras de aceite comercial PAM®. Repetibilidad Se repitió tres veces la curva de calibración..) Suma de Cuadrados 0.4R9 7 . que en este caso es igual a 0.32 1./ 1. no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 3 variables con un nivel del 95. es el cociente entre el estimado entre-grupos y el estimado dentro-de-grupos.244 Tabla 2. Puesto que el valor-P de la razón-F es mayor o igual que 0. Cromatograma de la separación de TBHQ y PG utilizado como estándar interno. La razón-F. ./ ..1.2 -. Precisión Para la prueba de precisión se analizaron por sextuplicado dos concentraciones de TBHQ 0. La adición de la disolución stock de AAs tiene el objetivo de proteger la TBHQ y el PG de la oxidación puesto que son muy sensibles al oxígeno del aire. mostrando también sus barras de error típico. Fuente Entre grupos Intra grupos Total (Corr.. El criterio de aceptación fue una comparación de medias.05.32 1.. Este procedimiento compara los datos en los 3 días en donde la prueba-F en la tabla ANOVA determino si hay diferencias significativas entre las medias. Los CV obtenidos se muestran en la tabla 4. utilizando PG como estándar interno. con el mismo equipo en tres días diferentes. Las condiciones cromatográficas se mencionan en el texto. 1. Recuperación...004 a 0..555/ Figura 2.0% de confianza por lo cual el sistema es reproducible.53 De'(iación e't)ndar .9981. .11 .. por el mismo analista. Resultados del ANOVA para determinar si existe diferencias significativas en la repetibilidad..00315717 0. a una concentración de 0. ... En este caso la relación de áreas presenta coeficiente de correlación de 0.<" mues!ras .. comparando las ABC obtenidas en la curva de calibración con sólo estándares. con y sin aceite..5554 ... . Análisis de la muestra.. AB: TBHQ.111/-00 Tabla *% Resul!ados de recu$eraci#n. mientras que aceite 1-2-3 se vende en una botella de plástico transparente. Un valor en la pendiente de 1. por lo que se constató que protegía a los otros conservadores al oxidarse él preferentemente disminuyendo su concentración. el área bajo la curva del AAs disminuía. el porcentaje de recuperación a través de la extracción líquido-líquido fue del 83..0. La representación gráfica de estas ABC permite evaluar el porcentaje de recuperación de la extracción... Cromatograma obtenido de una muestra de aceite adicionado con AAs... . se deduce que la reducción de esta se debe a que quizá parte del conservador Figura 4..... PG y TBHQ. Así también..5.. Figura 3.. Una observación que se hizo de acuerdo con la presencia de AAs es que conforme pasaba el tiempo después de haber preparado la disolución a inyectar.. Comparación de áreas entre curvas de calibración. actúo antes de la adición de AAs. aplicando el método descrito para la preparación de la muestra. .. el valor del área (ABC) obtenido de la extracción al aceite comercial se interpoló en la curva de calibración y se determinó su concentración. Se puede observar los picos de PG y TBHQ. .4.. los datos obtenidos se muestran en la tabla 3. En el Cromatograma de la figura 4 se puede observar el comportamiento de la muestra. . se evalúa el porcentaje de recuperación de TBHQ...831. se aprecian los picos de AAs.0 corresponde al 100% de recuperación del compuesto. ..A!C T!H"/P& Gráfica 3..30 :oncen!raci#n calculada !e#rica de acuerdo a la cur(a de calibraci#n mg. Se utilizó una ® muestra de aceite comercial 1-2-3 que contiene TBHQ y posteriormente se analizó por triplicado... PG y el AAs. Cromatograma de la muestra problema de aceite comercial. Una diferencia entre los aceites es que el aceite ® sin conservador PAM tiene una presentación era aerosol. .3..1%./ A!C T!H"/P& en aceite 6 7 .. y el pico del AAS con tiempo de retención menor a los demás (0.041.616 min). con las ABC obtenidas en la curva de calibración en aceite y con extracción. . PG y TBHQ...9993 y un valor de pendiente 0.-..buena linealidad. 1.1.2.. Conforme a la concentración obtenida en la muestra.110 R9 7 .012mg/mL de TBHQ. . cuyo envase lo protege del aire y de la luz..0 1 1.. por lo anterior.+ > .m= . . que obviamente es menor a la teórica. ../. la cual fue similar a la del estándar mostrando el TBHQ.. . En la figura 3 se muestra el cromatograma obtenido de la extracción de una muestra de aceite adicionado con los conservadores... . Para la cuantificación.. 1994. Chao. Trends in Food Science & Technology. Yan-Yan... Myers.2. C.. Paseiro. Sumiko. Weibang. J. 47. Food Chem. 229-231. 2. 5. conforme a las condiciones cromatográficas establecidas. Jiang. refiriéndose al tamaño de partícula y longitud de columna.. Yasuhide. 2010. 2010. Hisaya. 3. Central Food Technological Research Institute. Yuxiang. T. S. L.. 2010. Hongbin. 692–700. R. repetibilidad y recuperación que se aplicaron en el estudio. V.. precisión.02. L.. en este caso en el parámetro de recuperación. Wei. Ballester.. así como el tipo de elución fue satisfactorio con base al método oficial. Mediators of Inflammation. R. 8. Walpole. I.. 7. Japan. Food additives/ Liquid Chromatography. limites de detección y especificidad. L. AOAC Método oficial 983. 357-453. T. N. 509-515.. T. Gowda. 6. Asimismo se debe tener precaución en la elección de muestras de acuerdo a su presentación puesto que puede variar de alguna forma en el análisis. W. Probabilidad y estadística para ingenieros.... Soc. Dai. Castanheira. obteniendo finalmente una buena resolución. M. 63-71.. 1996. Xiao-Gang. Jian. Jun.. 113. puesto que se gasto menos disolvente y menos tiempo de análisis (tiempo de corrida). 1. 46. 2009.. P... Xiu-Qin. Yukio. A consecuencia. Cruz. Sánchez.CONCLUSION La identificación de los compuestos se vio muy favorecida. 2833. André. W. 2004.. P. Ed. la aplicación de otros parámetros de validación para un análisis más completo como la exactitud del sistema. aunque para el parámetro de recuperación es necesario optimizar el proceso para la obtención de un mejor porcentaje de dicho parámetro.15 Phenolic antioxidants in oils. L.. J. .. Maki. 2000. Ramasarma. M. MinLi. Clin. A. J. Interamericana Pp.. por lo que el tipo de columna. Y. es igualmente necesario.Handong. BIBLIOGRAFÍA 4.. Food Hyg. En la determinación cuantitativa. J. Analytical strategies to evaluate antioxidants in food: a review. J. J. R. 107. pues se obtuvo una separación de los componentes adecuada. Por lo tanto el método establecido en este estudio resulta válido para la cuantificación de TBHQ por medio de la adición de PG como estándar interno. C. 21. Ni. Med. R. el método se valido satisfactoriamente apegado a los parámetros establecidos de linealidad.. 1987. fats and butter oil liquid Chromatographic method IUPACAOAC Method' J. Tianyu. T. AOAC Int. Sattigeri.
Report "Validación del Método Analítico por HPLC/UV para la Determinación de Terbutil Hidroxiquinona (TBHQ) en Aceite Vegetal."