INSTITUTO TECNÓLOGICO DE ACAPULCOINGENIERÍA BIOQUÍMICA ANÁLISIS INSTRUMENTAL TRABAJO FINAL: UNIDAD IV. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE UNIDAD V. ESPECTROCOPIA INFRAROJA UNIDAD VI. ESPECTROCOPIA MAGNÉTICA NUCLEAR UNIDAD VII. MOLECULARES UNIDAD VIII. SEPARACIÓN DE ESPECTROCOPIA MÉTODOS DE RESONANCIA DE AISLAMIE MASAS NTO Y PROFESORA: MÓNICA ZARATE JUAREZ ESMERALDA FIGUEROA MORENO UNIDAD IV. ESPECTROCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE FUNDAMENTO. Para que la radiación electromagnética incidente, interaccione con la materia tiene que tener una λ del mismo tamaño o menor que las dimensiones del cuerpo irradiado. Es por ello que la radiación de la región del ultravioleta (≈ 1-400 nm) nos permite obtener información de las transiciones electrónicas de las moléculas. La espectroscopia UV-Vis se basa en el análisis de la cantidad de radiación electromagnética (en el rango de longitudes de onda del ultravioleta y visible) que puede absorber o transmitir una muestra en función de la cantidad de sustancia presente. Todas las técnicas de absorción suponen que cuando una radiación incide sobre una muestra se produce una absorción parcial de esta radiación, lo que hace que se produzca una transición entre los niveles energéticos de la sustancia: Átomo, molécula o ión, X, pasando esta al estado excitado, X*, el resto de radiación es transmitida. Así analizando una u otra podemos relacionar la cantidad de especie activa presente en la muestra. La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometría ultravioleta-visible (UV/VIS) es una espectroscopia de emisión de fotones y una espectrofotometría. Utiliza radiación electromagnética (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagnético, es decir, una longitud de onda entre 380nm y 780nm. La radiación absorbida por las moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones electrónicas que pueden ser cuantificadas. 1 | Página La longitud de onda (\lambda) comprende entre 190 y 800 nm. Se utiliza extensivamente en laboratorios de química y bioquímica para determinar pequeñas cantidades de cierta sustancia. Se utiliza de manera general en la determinación cuantitativa de los componentes de soluciones de iones de metales de transición y compuestos orgánicos altamente conjugados. El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorción de radiación ultravioleta – visible por una molécula. causando la promoción de un electrón de un estado basal a un estado excitado. como los dobles. Esta fracción de radiación que ha logrado traspasar la muestra es denominada transmitancia (T) (T = I/Io). por estar relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente según la Ley de Beer-Lambert: EL ESPECTROFOTÓMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto. la intensidad incidente del haz (Io) es atenuada hasta I. Algunos enlaces. provocan coloración en las moléculas ya que absorben energía en el visible así como en el UV. liberándose el exceso de energía en forma de calor. y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. ocurre una transición desde uno de estos orbitales a un orbital vacío. y es 2 | Página . como es el caso del β-caroteno. El vidrio. La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia. Las diferencias entre energías varían entre los diversos orbitales. Al absorber radiación electromagnética de una frecuencia correcta. Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente. como las trazas de metales en aleaciones o la concentración de cierto medicamento que puede llegar a ciertas partes del cuerpo. el agua absorbe fuertemente en la región del IR. Por aspectos prácticos. y además. visibles e IR depende de la estructura de las moléculas. La absorción de las radiaciones UV. que parece ser completamente transparente. éstos son promovidos a estados excitados (de energía mayor). absorbe longitudes de onda que pertenecen al espectro visible.La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de moléculas. para determinar el contenido y fuerza de una sustancia. se utilizará la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia (A = -logT). Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. por lo que es de gran utilidad para caracterizar las soluciones en la región ultravioleta-visible del espectro.característica para cada sustancia química. principalmente de 200 a 400 nm (UV cercano) y de luz visible de 400 a 800 nm. Espectrofotómetro de haz simple: cuenta con un único compartimiento de celda con lo cual se debe realizar la medida de absorción del “blanco” para poder registrar un cero (o referencia) y luego medir la absorción de la muestra. 3 | Página . y una de W / halógeno para la región visible Se utiliza también una celda de referencia que contiene sólo solvente. Se utilizan dos lámparas: una de H o deuterio para la región UV. CARACTERISTICAS DE LAS MUESTRAS Las muestras en solución se ponen en una pequeña celda de Sí. Se rige por una ley muy importante: la ecuación de Beer-Lambert. TIPOS DE ESPECTROFOTÓMETROS Espectrofotómetro de doble haz: es aquel que cuenta con dos compartimientos para celdas de muestra que le permite medir simultáneamente la cantidad de energía radiante absorbida por una matriz (blanco) y la energía absorbida por la muestra compuesta por la matriz y la especie de interés. La luz pasa simultáneamente por la celda de muestra y la celda de referencia. El color de las sustancias se debe a que absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y sólo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. La radiación transmitida es detectada y el espectrómetro obtiene el espectro de absorción al barrer la longitud de onda de la luz. El espectrómetro compara la luz que pasa por la muestra con la que pasa por la celda de referencia. Esta espectrofotometría utiliza radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm. colorantes. transparentes y traslúcidas. 4 | Página . APLICACIONES Las áreas de aplicación van desde la caracterización superficial de sólidos hasta el análisis fotométrico de muestras turbias. coloidales. papel y vidrio. Los usos típicos abarcan desde pruebas de aseguramiento dela calidad hasta mediciones de desarrollo de producto de textiles. Estas frecuencias dependen de la forma de la superficie de energía potencial de la molécula. que corresponden a los niveles de energía de la molécula. 5 | Página . las masas atómicas y. es decir. FUNDAMENTO.45 μm y llegó a la conclusión de que la absorción de ‘ondas caloríficas’ se debe a movimientos intramoleculares. puede ser utilizada para identificar un compuesto o investigar la composición de una muestra. un usuario experimentado puede obtener información sobre la misma. Se pueden generar gráficos bien resueltos con muestras de una sola sustancia de gran pureza. y se usa mucho en química. que no se puede predecir el espectro de absorción de un compuesto a partir del conocimiento de los espectros de los átomos constituyentes (2). se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja a través de la muestra. la geometría molecular. Al examinar el gráfico de una sustancia. La espectrometría infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces químicos de las sustancias tienen frecuencias de vibración específicas. la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de mezclas complejas (1). Sin embargo.1] obtuvo el espectro infrarrojo de 20 compuestos orgánicos. el acoplamiento vibracional Con el fin de hacer medidas en una muestra. la estructura interna de la molécula determina el tipo de absorción. las cuales asociaron con la presencia de hidrógeno en las moléculas estudiadas. ESPECTROCOPIA INFRARROJA. en especial en química orgánica.UNIDAD V. El primer espectro de vibraciones moleculares fue observado en 1881 por Abney y Festing. Julius [3. 4000-400 cm-1) se puede construir un gráfico. encontrando que todos los compuestos que contienen metilo (CH3) exhiben una banda de absorción de 3. La espectrometría de infrarrojos (espectroscopia IV) es un tipo de espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético. posiblemente. La espectroscopía infrarroja tiene casi 125 años de existencia. Encontraron bandas características en estos espectros. Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes. Repitiendo esta operación en un rango de longitudes de onda de interés (por lo general. Como las demás técnicas espectroscópicas. También encontró que el efecto no es ‘aditivo’. en otras palabras. y se registra la cantidad de energía absorbida. En 1892. quienes prepararon emulsiones fotográficas sensibles al infrarrojo cercano y fotografiaron el espectro de absorción de 48 líquidos orgánicos. los espectros infrarrojos serán distintos. 5. Las muestras sólidas se preparan mezclando una cierta cantidad de muestra con una sal altamente purificada (por lo general bromuro de potasio). obtener espectros infrarrojos sin alteración de la muestra. A partir de los espectros se pueden inferir las estructuras moleculares. lo que constituye a esta espectroscopia como una herramienta de análisis no destructiva. Las características más relevantes de esta espectroscopia son las siguientes: 1. La pastilla necesita ser prensada a altas presiones para asegurar que sea translúcida. mediante el uso de dispositivos experimentales adecuados. los reactivos de lavado y el medio deben ser anhidros (es decir. son generalmente proporcionales a las concentraciones de las componentes individuales. Esta mezcla se tritura y se prensa con el fin de formar una pastilla por la que pueda pasar la luz. 7.Los espectrómetros infrarrojos son una de las herramientas más importantes para observar espectros vibracionales. 2. Por lo tanto. El tiempo necesario para obtener y almacenar un espectro infrarrojo es del orden de minutos. Una sustancia definida puede identificarse por su espectro infrarrojo. Estas placas deben ser transparentes a la luz infrarroja para no introducir ninguna línea en el espectro de la muestra. 6 | Página . Los espectros muestran bandas que son típicas de grupos funcionales particulares y que tienen localizaciones e intensidades específicas dentro de los espectros infrarrojos 4. Si dos moléculas están constituidas por átomos distintos. o se encuentran en ambientes distintos. Para ello se requiere un modelo en el cual basar los cálculos. pero esto no puede lograrse sin un equipo adecuado (por ejemplo. Estos espectros pueden ser considerados como las huellas digitales de dicha sustancia. Las intensidades en las bandas del espectro de una mezcla. o tienen distinta distribución isotópica. por lo que la muestra. 3. Las muestras líquidas pueden ser prensadas entre dos planchas de una sal de alta pureza (como el cloruro de sodio). MUESTRAS A ANALIZAR. 6. es posible determinar la concentración de una sustancia y realizar análisis de muestras con varias componentes. o configuración. Las placas obviamente son solubles en agua. Es posible. sin agua). por lo cual es posible realizar una identificación de los materiales. Después de pasar por la muestra.para el estudio de minerales y pigmentos en el intervalo espectral de 400-4000 cm-1 . Se trate de un Mid-FTIR. por lo que las únicas líneas espectrales provendrán del analito. Los espectrofotómetros FTIV son más baratos que los convencionales.una prensa hidráulica). Debido a sus múltiples ventajas. Además. La realización de una transformada de Fourier de la señal produce un espectro idéntico al de la espectrometría infrarroja convencional (dispersiva). El equipo dotado de una sonda con fibra óptica permite el análisis directo de la superficie del objeto de estudio.sin fibra óptica. lo que daría un 7 | Página . Los instrumentos actuales son pequeños y pueden ser transportados. debido a que la información de todas las frecuencias se toman al mismo tiempo. Esto permite hacer múltiples lecturas de una sola muestra y obtener un promedio. se pueden medir con precisión las muestras en una solución (el agua produce una banda larga de absorbancia en el rango de interés. Recientemente se cuenta adicionalmente con un equipo Alpha de Bruker con un módulo de reflexión . incluso para tomar medidas de campo. casi todos los modernos espectrofotómetros de infrarrojos son FTIV . porque es más simple construir un interferómetro que un monocromador. porque es una técnica rápida y fiable para medidas. Remspec con resolución de 10 cm-1 en el intervalo espectral de 900-5000 cm-1. Con los avances en tecnología de filtrado computacional y la manipulación de los resultados. la medida de un solo espectro es mucho más rápida en esta técnica. La espectrometría infrarroja se utiliza ampliamente tanto en la industria como en la investigación científica. Al igual que el cloruro de sodio. En lugar de registrar los datos variando la frecuencia de luz infrarroja monocromática. ESPECTROMETRÍA INFRARROJA CON TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR) La espectrometría infrarroja por transformada de Fourier (FTIV) es una técnica de análisis para obtener el espectro infrarrojo con mayor rapidez. lo que aumenta la sensibilidad del análisis. se guía la luz IV (con todas las longitudes de onda de pista utilizada) a través de un interferómetro. control de calidad y análisis dinámicos. APLICACIONES. el bromuro de potasio no absorbe la radiación infrarroja. Esta técnica proporciona un espectro de reflexión de las bandas de los grupos funcionales de las sustancias inorgánicas y orgánicas. la señal medida da el interferograma. espectro ilegible sin dicho tratamiento computacional). Haciendo medidas a una frecuencia específica a través del tiempo. 8 | Página . Esto se puede hacer mientras se toman medidas simultáneas con otras técnicas. se pueden seguir los cambios en la naturaleza o la cantidad de un enlace en particular. como 32 veces por segundo. Las máquinas modernas pueden medir en el rango de interés con gran frecuencia. Así las observaciones de reacciones químicas son procesadas con mayor rapidez. lo que es especialmente útil para medir el grado de polimerización en la fabricación de polímeros. y de forma más precisa y exacta. Algunas máquinas incluso dicen automáticamente qué sustancia está siendo analizada a través de miles de espectros de referencia almacenados en la memoria. el desarrollo de nuevas técnicas y mayores campos magnéticos (que incrementan tanto la sensibilidad como la resolución de las señales) permitieron estudiar moléculas cada vez más grandes. aunque se trata de un núcleo poco abundante y poco sensible. Por eso. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares. La misma tecnología también ha terminado por extenderse a otros campos. La técnica se ha empleado en química orgánica. A partir de los años setenta. La aplicación química de la RMN fue descubierta a principios de los cincuenta. Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de estos núcleos. Se prefieren los núcleos de número cuántico de espín nuclear igual a 1/2. También es importante en química orgánica el 13C. al observarse que la frecuencia de resonancia de un núcleo dependía fuertemente de su entorno químico (chemical shift). ya que la intensidad de la señal dependerá de la concentración de esos núcleos activos. ya que carecen de un momento cuadrupolar eléctrico que produce un ensanchamiento de las señales de RMN. El advenimiento de la RMN multidimensional y el uso del marcaje 13C y 15N marcaron el inicio de la RMN biológica. La primera detección de Resonancia Magnética Nuclear debida a la formación de una diferencia en las energías de ciertos núcleos en presencia de un campo magnético fue reportada por Bloch (para el agua líquida) y Purcell (para la cera de parafina) en 1946. por ejemplo en medicina. uno de los más útiles en la elucidación de estructuras es el 1H. dando lugar a la espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón. FUNDAMENTO. química inorgánica y bioquímica. se puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran éstos. Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o radiofrecuencias. También es mejor que el isótopo sea abundante en la naturaleza. 9 | Página . aunque también se puede emplear con fines cuantitativos y en estudios cinéticos y termodinámicos. en donde se obtienen imágenes por resonancia magnética.UNIDAD VI. ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. los núcleos de 1H resuenan a 300 MHz.INSTRUMENTACIÓN ESPECTRÓMETRO. por lo que un análisis detallado del espectro proporciona valiosa información acerca de la estructura del compuesto que lo origina. la intensidad. La disposición de los niveles de energía es una propiedad tanto de los núcleos de una molécula como de su entorno electrónico y de las interacciones entre ambos. esta técnica resulta ser de las mas eficientes y útiles para el estudio de la estructura y dinámica de moléculas en disolución. Generalmente se identifica cada espectrómetro por la frecuencia de resonancia del protón. EN RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR: EL Un espectrómetro de RMN consta de las siguientes partes fundamentales: Un imán que genere un campo magnético estable. definiendo la frecuencia de resonancia de cada núcleo. El campo magnético aplicado produce un desdoblamiento de los niveles degenerados de energía del spin nuclear. en la que se introduce la muestra y que consta de las bobinas responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El número de bobinas y su disposición determinan el tipo y las aplicaciones de cada sonda. 10 | P á g i n a . el cual puede ser de una intensidad variable.046 Tesla.1 Una sonda. forma y posición de las señales en el espectro de un núcleo determinado están intimamente relacionadas con su estructura molecular. que se sitúa dentro del imán. y por tanto sería un espectrómetro de 300 MHz. Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de la parte electrónica del espectrómetro Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrómetro y con el que se analiza toda la información obtenida. de 950 MHz (22. PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA La espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) estudia el comportamiento de ciertos núcleos atómicos (aquellos que poseen spin nuclear distinto de cero) en presencia de un campo magnético externo. así en un imán de 7. Así. Por ello.3 Tesla). de modo que pueden inducirse transiciones entre ellos como consecuencia de la absorción de una radiación electromagnética adecuada. Por el momento el imán de mayor campo magnético del mundo lo ha instalado Bruker en la Universidad de ciencia y tecnología Rey Abdullah en Arabia Saudita. 11 | P á g i n a . APLICACIONES Estudio de la estructura y dinámica de compuestos orgánicos. organometálicos y biomoléculas en disolución y en estado sólido. ESPECTROSCOPIA DE MASAS MOLECULARES. aunque el espectrómetro de hoy en día poco tenga que ver con su predecesor.UNIDAD VII. FUNDAMENTO. Aceleración de los iones por un campo eléctrico. La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente masa. Hoy en día. Dispersión de los iones según su masa/carga. 12 | P á g i n a . El proceso de la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas: Ionización de la muestra. esta técnica continúa teniendo los mismos fundamentos que en su origen. Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica. formato de fácil interpretación.à M+ + 2eB. La utilidad analítica de un espectrómetro de masas depende de la resolución del instrumento. “e” la carga del electrón y “m” la masa. INSTRUMENTACIÓN 13 | P á g i n a . generalmente positivos y de carga única.IONIZACIÓN DE LA MUESTRA La ionización de la muestra se consigue por bombardeo mediante electrones (e-) según el proceso: M + e. Aceleración de los iones por un campo eléctrico Convertimos una fracción significativa de los átomos formados en la etapa 1 en un flujo de iones. o capacidad del mismo para separar dos partículas de diferente masa.r2/2V Dado que la mayoría de los iones formados en la segunda etapa tienen una sola carga y que el resto de parámetros se mantienen constantes. desarrollando una fuerza centrífuga mv2/r. la relación m/e suele ser la masa del ión. De esto deducimos que el radio es igual a: r = (2Vm/H2e) ½ Dispersión de los iones según su relación masa/carga Basándonos en la ecuación anterior podemos calcular la relación m/e que es: m/e = H2. La velocidad que adquieren viene regida por la fórmula: v = [2eV/m] ½ Donde V es el potencial aplicado. la cual es igual a la fuerza de atracción del campo Hev. Cuando las partículas aceleradas se someten a la acción de un campo magnético (H) describen una trayectoria circular de radio r alrededor de este campo. Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica El ordenador al que está conectado el aparato recoge las distintas señales y las reproduce en forma de espectrograma. en el cual la muestra se volatiliza externamente y se introduce en la región de ionización que está a baja presión. Es un tipo de sistema de entrada especial. *Detector. Las sondas también se usan cuando la cantidad de muestra es limitada ya que se pierde mucha menos cantidad. el cual se inserta a través de un cierre de vacío. *Acelerador. un micromol o menos de muestra se convierten al estado gaseoso por calentamiento a unos 400ºC y se introduce lentamente en la cámara de ionización. En el sistema de entrada de muestras. *Cámara de ionización. 2006) Cámara de ionización 14 | P á g i n a . En los espectrómetros de masas más modernos encontramos diferentes tipos de sistemas de entrada: Sistemas indirectos de entrada: es el sistema más clásico y el más simple.Básicamente un espectrómetro de masas costa esencialmente de las siguientes partes: *Sistema de entrada de muestras. Entrada por sonda indirecta: los líquidos y los sólidos no volátiles se pueden introducir en la región de ionización mediante un soporte para muestra o sonda. Sistema de entrada de muestras. El sistema de cierre se utiliza para controlar la cantidad de aire que entra después de la inserción de la sonda en la región de ionización. El sistema de entrada es normalmente de vidrio para evitar posibles pérdidas por adsorción. La finalidad del sistema de entrada es permitir la introducción de una muestra representativa en la fuente de iones con la mínima perdida de vacío. *Analizadores. Sistemas de entrada cromatrográficos y de electroforesis capilar. está indicado su uso cuando al espectrómetro de masa va acoplado un sistema de cromatografía de gases o de líquidos de alta eficacia o a columnas de electroforesis capilar que permiten la separación y determinación de los componentes de mezclas complejas (Métodos. 486) Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. 486) Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. Las fuentes de iones se pueden clasificar también en fuentes duras y fuentes blandas. En todos los casos. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 100000 Daltons.Las fuentes de iones de los espectrómetros de masas. En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinados en un único componente. pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes de una muestra en iones. Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey. Estos métodos los podemos dividir endos categorías: Fuentes de fase gaseosa: en estas primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza. 212). La formación de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un análisis por espectrometría de masas. (Skoog. Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey. se obtiene un haz de iones positivos o negativos (normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas o sistema separador a través del acelerador. Su espectro da lugar a muchos picos y nos da información acerca de la naturaleza de los grupos funcionales e información estructural de los analitos. La relajación posterior. 2002. 15 | P á g i n a . En la mayoría de los casos. Hieman. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies moleculares. Están generalmente restringidas a compuestos térmicamente estables que tengan puntos de ebullición menores de unos 500ºC. Fuentes duras: comunican suficiente energía a las moléculas para que estén en un estado de energía altamente excitado. implica la rotura de las uniones produciendo iones fragmentados. 2000. se transforma directamente en iones gaseosos. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 1000 Daltons. Hiller. depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. • Fuentes de desorción. 2002. estos requerimientos limitan la utilización de las fuentes de fase gaseosa a compuestos con pesos moleculares menores de unos 103 Daltons. En estas la muestra en estado sólido o líquido. tienen todas unas características comunes. Detección e identificación de especies separadas por cromatrografía y electroforesis capilar. Determinación del peso molecular de péptidos. Determinación de residuos de pesticidas en alimentos. proteínas y oligonucleicos. Identificación de drogas de abuso y sus metabolitos en sangre. Determinación de secuencias de aminoácidos en muestras de polipéptidos y proteínas. Datación de ejemplares en arqueología. Identificación de los compuestos de cromatogramas en capa fina y papel. orina y saliva. Control de compuestos orgánicos volátiles en el agua de suministro 16 | P á g i n a . Control de gases en enfermos respiratorios durante los procesos quirúrgicos. Pruebas para confirmar la presencia de drogas en sangre de caballos de carreras y en atletas olímpicos. Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentación y el resultado es un espectro con muy pocos picos dándonos información útil ya que nos permite la determinación exacta del peso molecular de la molécula o moléculas APLICACIONES Las aplicaciones son muchas y abarcan tantos campos que resulta complicado citarlas todas. a continuación veremos las más características: Elucidación de la estructura de moléculas orgánicas y biológicas. Análisis de partículas en aerosoles. En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción C. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes. como su nombre lo indica. de exclusión: separa solutos según el peso molecular C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica Cromatografía de reparto La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la cromatografía unida químicamente. bebidas refrescantes entre otras. 17 | P á g i n a .VIII. En el segundo caso. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad C. MÉTODOS DE AISLAMIENTO Y SEPARACIÓN Los métodos cromatográficos La cromatografía líquida la podemos diferenciar en cuatro grupos: C. Esta técnica puede utilizarse en la separación de mezclas edulcorantes artificiales. antioxidantes. la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del soporte. Esta técnica actualmente es más usada debido a que la cromatografía líquido-líquido necesita de un recubrimiento periódico de las partículas del soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por disolución en la fase móvil. Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar. aflatoxinas. y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. porosas y uniformes. Cromatografía De Adsorción La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables. escalable y rápida. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar. Cromatografía De Exclusión La cromatografía de exclusión. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. aunque en algunos casos se superponen. derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. En este tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. de esto se deduce que el volúmen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. siendo la primera la preferida. 18 | P á g i n a . mecánica y químicamente. uniformidad de poro y tamaño. mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las últimas que se eluyen.Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina. Es una técnica reproducible. El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los mismos. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas. tener bajo contenido en grupos iónicos. derivados de agarosa (Sepharosa). también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro. el tamaño de la partícula y el flujo de elución. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex). Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios. como las proteínas. merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera. La electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un 19 | P á g i n a . Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. se pueden enlazar irreversiblemente a ellos.Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos. Cromatografía De Intercambio Iónico La cromatografía de intercambio iónico está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de la cual fluye una fase móvil. así como la presencia de un mecanismo de inyección de la muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados. fuertes o débiles. Los geles de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos nucleicos). Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas. etc. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad. La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius. Los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. En resumen la gran variabilidad de los métodos cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos. En el caso de intercambiadores aniónicos. Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas muy cargadas. Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores iónicos inorgánicos. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. El comportamiento de la molécula viene dado por su movilidad electroforética y ésta por la carga. en este caso. tamaño y forma de la misma. lo que origina un transporte de las partículas de interés no debido a la migración. Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo eléctrico. los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Migración Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio. si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución. Esto es lo que se denomina difusión. al moverse los solutos chocarán con las moléculas del solvente que están en su camino). a través de una matriz o soporte reticulado como resultado de la acción de un campo eléctrico. el campo eléctrico y su intensidad. Ha sido un método muy útil para la separación de proteínas (enzimas. de modo que. En un sistema electroforético pueden originarse distintos fenómenos que afectan la separación de las sustancias: Difusión Este fenómeno es provocado por la existencia de gradientes de concentación que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentaración de cada especie. Por tanto el sistema electroforético no es isotérmico. Las moléculas tienden a moverse de una forma aleatoria debido a que poseen energía cinética propia. Fricción La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir. Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la industria biotecnológica y química. En general la fase líquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura. hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución. La suma de todos estos factores provoca que las moléculas no migren de una manera uniforme. Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Flujo térmico Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada.determinado medio (solución tampón de electroforesis). Con un aumento de la temperatura aumentará la difusión por un incremento de la energía cinética. se produce calor. lo que genera una fuerza que se opone al movimiento. Para reducir esta anchura podemos reducir el 20 | P á g i n a . Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse. control de pureza.movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección. En cambio los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. Dichas muestras se depositan sobre el gel. Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas. Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. caracterización. Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. La poiliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N. que separa por la relación carga/tamaño y tamizado. La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro. se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y RNA. Esta situación nos permite diferenciar dos métodos electroforéticos: Electroforesis convencional Electroforesis capilar. lo han convertido en el soporte más común para electroforesis en el área de Biología Molecular. Las redes de polímeros no solo reprimen la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. Electroforesis Convencional La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas de elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido. que separa mayormente por tamaño. que gracias a su poder de gelificación y propiedades físico-químicas. controlando así su migración uniforme.N´ 21 | P á g i n a . De este modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis. Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida. 1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. Esta afirmación no nos permite aumentar el potencial. Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos entre otras sustancias. Electroforesis Capilar (CE) La electroforesis capilar es una técnica alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado.1 a 10 nL). A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos necesarios para realizar esta técnica de separación: Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera biotecnológica. Estas técnicas no son de aplicación tan general pero no por ello dejan de ser importantes. aun sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el campo eléctrico. Ofrece además mayor facilidad y velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). aspecto este que se ha podido comprobar a partir de los numerosos resultados que se encuentran en la literatura más actual.metilenbisacrilamida. pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy 22 | P á g i n a . Esta técnica elimina el problema de los solventes de la HPLC. en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el orden de los µL. con una elevada resolución y rapidez. Esta técnica está representada en el siguiente esquema: El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga/masa de los analitos. La concentración de ambos reactivos define el grado de reticulación del gel. Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres de cargas iónicas. Esto se debe a que el calentamiento de Joule aumenta hasta afectar la calidad de la separación. Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa. Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace por el gel cuando se active el campo eléctrico. electroforesis en campo pulsado y la electroforesis preparativa. Para solucionar esta dificultad es que se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0. la toxicidad de los mismos y su costo. Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0. Este gradiente se establece por un conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por sí mismos hasta que alcanzan sus puntos isoeléctricos. probablemente a su simplicidad y elevado poder de separación. Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis capilar: La electroforesis capilar en gel combina la técnica de electroforesis con la cromatografía de reparto. Los geles utilizados son también de agarosa y poliacrilamida. En esta técnica la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. Esto significa que el tiempo de recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforéticas es independiente de la velocidad. generando una separación isoeléctrica conocida como electroenfocado. Estos geles están contenidos en un tubo capilar.baja concentración iónica. Se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso. Permite la separación en función de la migración electroforética y también en función del peso molecular de las muestras. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. En realidad ambas técnicas son complementarias al basarse en mecanismos de separación diferentes. incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado. Como resultado se obtiene un electroferograma con picos característicos de cada compuesto separado. Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar. Cuando al gradiente de pH se le introduce una proteína. se pueden utilizar detectores cuantitativos como los empleados en HPLC. cuyos poros contienen una mezcla tampón donde ocurre la separación. aunque la reproducibilidad en el análisis cuantitativo es peor. Este método se basa en establecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel. cada zona intercambia protones con la muestra proteica. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Es una técnica de separación por desplazamiento. Su principal inconveniente es que no permite separar los compuestos neutros. La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme. Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para separarlas por el método de isoelectroenfoque. 23 | P á g i n a . Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido. Está basada en la separación de los analitos según la relación carga/tamaño. De esta manera la electrocromatografía capilar puede usarse para la separación de especies no cargadas. cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. sin necesidad de aplicar un bombeo de alta presión. Esta característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del sistema. Luego se introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola. biológica y bioquímica. en la cual un disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico a través de un capilar que contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa. Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes y aniones. En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto con la zona adyacente. Se requiere usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica. En la electrocromatografía capilar la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico. En resumen la cromatografía y la electroforesis son en la actualidad técnicas ampliamente utilizadas en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica. Esta técnica requiere la utilización de un tensoactivo en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. por lo que tiene ventajas sobre ellas. Estas micelas son capaces de alojar compuestos no polares en su interior. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno. lo que simplifica significativamente el equipo. Se diferencian dos tipos de electrocromatografía capilar: Electrocromatografía rellena. Este debe tener una gran movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. La interacción de las micelas y los solutos es la que produce la separación. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los componentes de la muestra. 24 | P á g i n a . Cromatografía capilar electrocinética micelar. dado que no hay un electrolito de soporte. el capilar se debe llenar con un electrolito líder o guía en un extremo. Proporciona una elevada eficacia en las separaciones de microvolúmenes de disolución de muestra.Antes de iniciar la corrida. Muestra de ello es el numeroso grupo de estudios realizados que se encuentra en la literatura especializada. La electrocromatografía capilar es un híbrido entre la HPLC y la CE donde se reúnen algunas de las mejores características de cada técnica por separado. Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de la electroforesis capilar. 25 | P á g i n a . Esta versión instrumental de la electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida entre las técnicas de separación. http://www.com/espectrometra_ultravioleta-visible 2. http://ocw.pdf 3.com/trabajos13/sepal/sepal.uc3m.es/ingenieria-quimica/quimica-ii/practicas-1/PR-FAnexos.espectrometria. 26 | P á g i n a . http://www.shtml#ixzz3uL4SmFDX 4.monografias.BIBLIOGRAFÍA 1.
Report "Unidad IV. Espectroscopia Ultravioleta-Visible"