Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico1 UD V. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 1. Introducción 2. Centrifugación 2.1. Descripción del equipo 2.2. Fundamento 2.3. Utilidad en el laboratorio 2.4. Control y mantenimiento 3. Filtración 4. Diálisis 5. Decantación 6. Extracción 7. Destilación 8. Cromatrografía 8.1. Fundamento 8.2. Clasificación 8.3. Mecanismos de separación 8.4. Tipos de soporte 8.5. Análisis cualitativo y cuantitativo 9. Electroforesis 9.1. Fundamento 9.2. Factores que intervienen electroforético 9.3. Desarrollo de la técnica 9.4. Isoelectroenfoque 9.5. Inmunoelectroforesis 10. Actividades UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca en el desarrollo 2 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 1. Introducción. Frecuentemente en la práctica diaria de un laboratorio de bioquímica, es necesario recurrir hacia determinadas técnicas para poder separar unas sustancias de otras. El objetivo final de dicha separación suele ser la posterior identificación de aquello que se ha conseguido separar y también su cuantificación. Las técnicas más usadas actualmente para la separación de sustancias en cualquier laboratorio están basadas en los siguientes principios: • Técnicas basadas en las diferencias de densidad: - Centrifugación - Decantación • Técnicas basadas en las diferencias de tamaño o peso molecular: - Filtración - Diálisis • Técnicas basadas en diferencias de solubilidad: - Extracción • Técnicas basadas en diferencias de carga eléctrica: - Electroforesis - Cromatografía de intercambio iónico • Técnicas basadas en diferencias de solubilidad, capacidad de absorción, adsorción: - Cromatografía de gases - Cromatografía líquido-líquido - Cromatrografia líquido-sólido (adsorción) UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 3 2. Centrifugación. Gran cantidad de determinaciones en el laboratorio comienzan con una centrifugación de la muestra que en general va a permitir separar el material más denso o pesado del resto (sobrenadante). Esta técnica se basa en el movimiento de las partículas, de tal modo que son desplazadas según sus diferentes masas. El aparato utilizado para ello denominado centrífuga genera un campo de fuerza tal que las partículas de material centrifugado de mayor densidad migrarán más rápidamente que las de menor densidad. 2.1. Descripción del equipo. Las centrífugas son instrumentos que permiten someter las muestras a intensas fuerzas, produciéndose la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. En general, las centrífugas se clasifican en función de los márgenes de aceleración a los que son sometidas las muestras: Centrífugas: de pocas “g” a aprox. 3000 xg Supercentrífugas o centrífugas de alta velocidad: rango de 2000 xg a 20000xg Ultracentrífugas: de 15000 xg a 600000 xg. Cabezal angular. OJO: esta clasificación puede variar según autores ( en cuanto a los límites de velocidad) En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra. Los elementos que componen la centrífuga son: Rotor o cabezal: en una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos de rotor: - Rotor horizontal o basculante: en este tipo de cabezal, los tubos se colocan en unos dispositivos (cestilla) UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 4 que, al girar el rotor, se disponen en posición horizontal (perpendicular al eje de giro). Cuando la centrífuga está parada adoptan la posición vertical. - Rotor angular o de ángulo fijo: los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos de tal manera que la posición siempre es fija, formando un determinado ángulo (25-40º) con el eje de rotación. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Eje de la centrífuga: es la barra o vástago que soporta el rotor y actúa como eje de rotación. Motor: acciona el vástago con el rotor o cabezal que contiene las muestras. Accesorios: el rotor está incluido en el interior de una cámara que generalmente lleva tapadera con cierre de seguridad que impide su apertura hasta que haya terminado de centrifugar. Otros accesorios que pueden llevar las centrífugas son: - Interruptor de puesta en marcha. - Temporizador. - Control de velocidad. - Freno. - Refrigeración para disminuir la temperatura de la cámara (por el calor que se produce al friccionar el rotor con el aire), etc. VIDEOS: La centrifugación como principio: http://youtu.be/LWZMmCgC5rQ Tecnología e innovación en centrífugas alta gama 2.2. Fundamento. La potencia de una centrífuga viene determinada por la fuerza centrífuga relativa (FCR), que es la fuerza requerida para que se produzca la separación, es decir, la aceleración que pueda generar la centrífuga. DEBES SABER. La FCR expresa la relación que existe entre la fuerza centrífuga y la fuerza de la gravedad, indicando el número de veces que dicha fuerza es mayor que la gravedad (g), y se calcula mediante la siguiente fórmula: FCR = K . r. n2 = X . g (se expresa en términos de gravedad, g) K = es una constante: 1,118 x 10-5 . r = radio de giro (cm). Distancia horizontal en cm desde el centro de rotación (eje de la centrífuga) hasta el fondo del tubo durante la centrifugación. n = velocidad de rotación del rotor en r.p.m. Por tanto, la potencia de una centrífuga depende de la velocidad del motor (número de r.p.m) y del radio de giro, que van a ser las variantes en función del modelo y tipo de centrífuga. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca En el nomograma la determinación de la potencia de una centrífuga se hace mediante el uso de una regla. Se une el radio (escala de la izquierda) con el número de r. (escala de la derecha) y el punto de intersección de esta recta con la escala central nos va a indicar la potencia de la centrífuga expresada en g.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 5 La potencia de una centrífuga puede calcularse también a través de un nomograma.. se obtiene el número de r. también debemos considerar que la velocidad de sedimentación (tiempo de centrifugación) y la aceleración de la UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . sabiendo la FCR necesaria y el radio de giro de la centrífuga a emplear.m. que relaciona la FCR con su radio de giro en cm.p. es decir.p.m. sin necesidad de usar las fórmulas. Además. el sedimento se deposita en el borde inferior del tubo a causa de la gravedad. de manera que si se duplica la aceleración.2 g 2) Calcula las rpm de una centrífuga cuya FCR es de 1000 g y tiene un radio de 10 cm. por ello la superficie del sedimento es plana (paralela al eje de la centrífuga). con la superficie del sedimento paralela al eje de la centrífuga.18 -5 . Utiliza ahora la fórmula para resolver estos problemas: 1) Calcula la fuerza centrífuga relativa a la que está sometido un tubo que gira a 2000 rpm con un radio de 10 cm. 10 . Cabezal angular: al actuar la FCR. Al desacelerar y parar. 10-5 . RESUELVE. acción que difiere según el tipo de rotor empleado: Cabezal oscilante: durante la centrifugación las partículas se desplazan de forma constante a lo largo del tubo.500 rpm y el radio de giro es de 12 cm? Resp: 300 g aprox (302 g) 2) ¿Cuál es la velocidad en rpm que debe llevar una centrífuga de 15 cm de radio de giro para adquirir una FCR de 450g? Resp: 160 r. Una vez definida la FCR.: N = (1. Resp: FCR = 1. el tiempo de centrifugación puede reducirse a la mitad. las partículas son conducidas hacia fuera horizontalmente pero chocan en el lado del tubo. de modo que el sedimento es distribuido uniformemente contra el fondo del mismo. resuelve las siguientes cuestiones: 1) ¿Cuál es la FCR de una centrífuga cuando la velocidad es de 1. Resp. formándose un sedimento menos compacto.m. por lo que el sedimento impacta contra el borde y el fondo de éste. 20002 = 447. 10 /1000)1/2 = 2991 rpm UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .6 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico centrífuga son inversamente proporcionales. se estudiará cómo actúa ésta sobre el tubo. Utilizando el nomograma.18 .p. ya que puede impedir la oscilación en las centrífugas de cabezal oscilante. se puede emplear una velocidad de 3500 rpm durante 5-10 minutos. por una parte. como por ejemplo en la técnica de determinación de HDL-colesterol.3. el estudio químico del sobrenadante. Concentración de células: estos componentes de los líquidos biológicos se concentran para facilitar. Separar quilomicrones del suero o fraccionar las distintas lipoproteínas: para este tipo de actividad se necesitan ultracentrífugas.Utilizar tubos resistentes a la FCR. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Separación de sustancias: previamente podemos precipitarlas químicamente. el diagnóstico microscópico del sedimento y por otra. Utilidad en el laboratorio. Aclarar líquidos orgánicos: la centrífuga actúa separando las fases líquidas de diferente densidad. La Centrifugación diferencial: ejemplo de aplicación 2. Tener cuidado de que no sobresalga el tubo del portatubos.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 7 2. La centrífuga es un aparato imprescindible en cualquier laboratorio por las distintas actividades en las que se utiliza como técnica de separación: Separación de suero o plasma: actividad primordial en el laboratorio. Control y mantenimiento.4. Para un adecuado funcionamiento de la centrífuga es necesario seguir algunas recomendaciones: . . así como para impedir la formación de aerosoles que pueden ser contaminantes.Existen papeles con diámetro de poro variable que se elegirán en función del tamaño de las sustancias a separar. evitando de este modo la posible mezcla de las dos partes ya separadas y además el peligro de accidente. Tapar los recipientes para evitar la evaporación que puede causar el aumento de la temperatura que se produce en el interior de la cámara debido al rozamiento.Existen filtros de papel endurecidos que por sus características presentan mayor resistencia al agrietamiento por la humedad y la acción química de ácidos y bases. El objetivo final de cualquier filtración es que ésta sea rápida y que la retención del sólido sea total para lo cual una elección adecuada del tamaño del poro es fundamental. PUEDES CONSULTAR. filtros.Los filtros de papel son de un solo uso y para su correcta utilización han de colocarse en un embudo adecuado. . La filtración consiste en la separación de partículas sólidas del líquido en el que se encuentran. utilizando para ello materiales permeables y porosos.iesalonsoquesada. 3. aunque para paliar estos problemas es recomendable el uso de membranas filtrantes. .Permiten llevar a cabo repetidas filtraciones aunque para ello es imprescindible realizar una correcta limpieza cada vez que se utilizan.pdf Los filtros más utilizados en el laboratorio son: Papel de filtro: . el temporizador y control de la temperatura en las centrífugas refrigeradas.Son muy resistentes a la agresión química.Se utiliza muy poco en el laboratorio químico. Membranas o placas filtrantes. Filtración.Están formadas por polvo de vidrio aglomerado y normalmente están ya montadas sobre un embudo o sobre un crisol. Limpieza periódica de la cámara y los contenedores para impedir en lo posible la propagación de agentes infecciosos. forma y tamaño en posiciones opuestas en el interior de los contenedores. . a través de cuyos poros pasa fácilmente el líquido (filtrado) quedando retenido el sólido (residuo). Chequeo de la velocidad de centrifugación.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 8 - Equilibrar correctamente la centrífuga colocando los tubos de igual peso. URL:http://www. No forzar el paro de la centrífuga con el freno de mano o con alguna maniobra manual. manteniendo una disposición geométrica simétrica. .org/inicio/fisica/departafyq/TecnicasLaboratorio/2SeparacionMezclas. . RECUERDA. Cuando este UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . o El filtro no debe llenarse nunca hasta el borde. o El filtro de pliegues aunque está comercializado puede prepararse fácilmente en el laboratorio. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . o Dicha varilla ha de estar a la suficiente altura como para que se encuentre siempre por encima del nivel de filtrado. por acción de la gravedad o por succión. o El filtro liso es el más indicado cuando se pretende recoger el sólido tras la filtración. o Cuando tras la filtración el filtrado no aparece claro hay que pensar que el filtro no tenía la porosidad adecuada. o Para evitar salpicaduras es conveniente que la varilla del embudo toque la pared interior del vaso colector. o La filtración se lleva a cabo vertiendo a un ritmo adecuado aquello que se desee filtrar en el interior del embudo.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 9 tamaño es excesivamente grande el sólido atravesará el filtro mientras que si es demasiado pequeño la filtración será muy lenta. o Siempre que sea posible se debe dejar reposar la muestra antes de mezclar para que las partículas sólidas se sedimenten y la filtración sea más rápida. Filtración por gravedad : o Utiliza papel de filtro colocado en un embudo en posición vertical por el cual desciende el líquido por acción de la gravedad. El paso del sólido a través del filtro puede realizarse por distintos métodos. youtube. o El embudo se ajusta perfectamente a la boca del recipiente de recogida mediante una junta de goma. o Es imprescindible que todas las conexiones estén bien ajustadas para evitar que entre aire en el interior del matraz. o Cuando se usa un papel de filtro.com/watch? v=MOIqOmdYbC4&feature=relmfu) 4. o La filtración se produce por succión. Diálisis. como consecuencia el líquido que se encuentra en el embudo es aspirado y la filtración se produce con cierta rapidez. para ello se conecta el matraz (kitasato) mediante una tubuladura lateral a una bomba de vacío. o Finalizada la filtración es conveniente desconectar el dispositivo antes de cerrar el grifo de lo contrario es posible que entre agua y se mezcle con el filtrado.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 10 Filtración por succión: o La filtración por succión utiliza como medio filtrante un papel de filtro colocado en un embudo especial provisto de una placa perforada (Buchner) o bien una placa filtrante montada en un embudo o crisol. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . o Al comenzar a filtrar es conveniente usar un vacío moderado para evitar que las partículas más finas puedan atravesar el filtro o bien obstruyan los poros. Ver video sobre la filtración: (http://www. debe recortarse perfectamente ajustado a la medida del embudo. las macromoléculas presentes en la misma quedan retenidas mientras que el líquido y las moléculas de menor tamaño atraviesan la membrana. Un método para acelerarlo consiste en ejercer una presión sobre la muestra o también se puede utilizar la electrodiálisis.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 11 La diálisis es una técnica que permite la separación entre macromoléculas y solutos de pequeño tamaño molecular y consiste en la difusión de moléculas pequeñas a través de una membrana semipermeable. La diálisis es un método muy antiguo de separación de sustancias. Fué utilizado por primera vez por Gram en 1861 para la purificación de coloides con el fin de eliminar impurezas de tipo iónico que acompañaban al estado coloidal y que eran nocivas para la estabilidad del coloide. El intercambio de material se produce por difusión y por tanto es un proceso lento. CURIOSIDAD. pasarán las moléculas de soluto cuyo tamaño sea inferior al tamaño de poro de la membrana desde la zona de mayor concentración de soluto a la zona de menor concentración. que debido a su tamaño de poro impide el paso de moléculas grandes. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . El paso de estas moléculas pequeñas se debe solamente al gradiente de concentración a ambos lados de la membrana. es decir. En la diálisis una bolsa o vaina con estructura de membrana semipermeable se llena con la muestra. Es un método menos eficaz que la filtración.12 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico RECUERDA. URL: http://www.jcyl.com/watch?v=mOFPsTVM_6Q 6. URL: http://iespoetaclaudio. Esta última técnica cuando es realizada después de un decantación es más rápida.educa. En el siguiente enlace puedes encontrar más información sobre la técnica de diálisis.dialisis.es/sitio/upload/06.youtube. Es un método de separación que consiste en mantener la mezcla a separar en reposo durante un cierto tiempo para que el sólido sedimente totalmente en el fondo del recipiente y posteriormente extraer cuidadosamente el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur o similar por succión. Decantación. Un método alternativo utilizado para el estudio del sedimento urinario consiste en inclinar cuidadosamente el recipiente que contiene la muestra tras la sedimentación vertiendo líquido sobrenadante y manteniendo el sólido en el fondo. Si consultas este enlace podrás ver un experimento de decantación. PUEDES CONSULTAR.centros. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .pdf 5. PUEDES CONSULTAR. Las membranas utilizadas tienen un diámetro de poro comprendido entre 15 y 0’025 μm. Extracción. o La separación de la disolución del resto del sólido: cuando interesa recuperar el soluto hay que completar el proceso con otras técnicas como la destilación y la evaporación. Para que la extracción sea efectiva el líquido extractor debe ser insoluble o muy poco soluble en la disolución. Para conseguir una buena extracción.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 13 Separación de uno o más constituyentes de una mezcla mediante un disolvente. o La capa situada en la parte inferior se extrae por la llave mientras que la superior se extrae por la parte de arriba. ser capaz de disolver perfectamente las sustancias a extraer pero sin disolver las restantes. o La forma más sencilla para efectuar una extracción en el laboratorio consiste en agitar vigorosamente durante unos minutos la mezcla en una ampolla de vidrio denominada embudo de decantación. o Finalizada la extracción se procede a separar las 2 capas de líquido.youtube. el disolvente utilizado debe tener un buen poder separador. es decir. Líquido-líquido: la sustancia que interesa extraer forma parte de una disolución líquida y se extrae mediante un disolvente líquido. El proceso puede llevarse a cabo a temperatura ambiente o en caliente. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .com/watch?v=Q3QxStCFDUo&feature=relmfu PUEDES CONSULTAR. para ello se deja reposar el embudo de decantación en posición vertical. Veamos un video resumen del proceso de extracción: http://www. Básicamente se distinguen 2 tipos de extracción: Sólido-líquido: consiste en la separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido y tiene lugar en dos etapas fundamentales: o El contacto del disolvente con el sólido: en esta etapa se produce la separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido. com/watch?v=pJ2jm2J41bw Un video que recoge los distintos tipos de destilación: fraccionada. son fraccionadas en sus distintos componentes en función de la diferente afinidad de éstos por dos fases diferentes (fase móvil y fase estacionaria). UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . es decir. 8. Si accedes al este enlace podrás observar un proceso de destilación. Estas mezclas. Las técnicas cromatográficas son técnicas de separación. Es un procedimiento que consiste en la separación (por acción del calor) de un líquido volátil de una sustancia no volátil o bien de otro líquido cuyo punto de ebullición sea distinto (cuanto más diferente sea mejor será la separación) recogiendo los vapores en un recipiente apropiado tras su condensación. URL: http://www. etc. Cromatografía.youtube. Se desarrolla en dos etapas: Durante la primera el líquido alcanza su punto de ebullición y pasa a vapor.14 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico Si accedes a este enlace podrás observar un experimento sobre la extracción: Aceite de romero URL: http://www. Un refrigerante en el que se condensan los vapores. Un destilador en general consta básicamente de: Un matraz donde hierve el líquido.youtube. En la segunda se condensa y es recogido en un recipiente diferente. Destilación. al vacío. tienen como finalidad la separación de mezclas de solutos que disueltas en un solvente.com/watch?v=p5O2X2EhJk8&feature=fvwrel 7. Un recipiente colector en el que se recoge el líquido ya condensado. PUEDES CONSULTAR. 2. Sin embargo esto se ira modificando con el paso de los años.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 15 CURIOSIDAD. Un compuesto que tenga mayor afinidad por la fase estacionaria se retrasará en su avance a través de ella. A comienzos del año 1903. 8. 8. lo que puede ser empleado con fines de identificación o cuantificación. dependiendo de sus propiedades físico-químicas y en virtud de un proceso en equilibrio. Clasificación. clorofilas). El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett. aumentando su importancia en las décadas siguientes. Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. Mikhail Tswett usó columnas de adsorción de líquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo. A su vez. Fundamento. Fase estacionaria: puede ser sólida o líquida y es el lecho a través del cual va a fluir la fase móvil. mientras que aquellos compuestos que tengan menor afinidad la atravesarán antes. 1872-1919) empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que proviene del griego χρομα y γραφω que significan a su vez respectivamente "color" y "escribir"). La cromatografía es un método de análisis en el cual el movimiento de una fase móvil que contiene una mezcla de sustancias provoca la separación de sus componentes mediante una distribución diferencial entre esta fase y una fase estacionaria. Los distintos tipos de cromatografía se han clasificado atendiendo a diversos criterios: A. salen separados unos de otros. Según las características físicas de las fases móvil y estacionaria: Naturaleza de la fase móvil: o Líquida o Gaseosa Naturaleza de la fase estacionaria: o Sólida o Líquida UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada. de forma que éstos se separaban en distintas bandas a lo largo de la columna.1. Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en función de su distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria. Las disoluciones se hacían pasar a través de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio que interaccionaba de forma diferente con los componentes de la mezcla. la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) comenzó a desarrollarse en los años 1960. Una vez que todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase estacionaria. Fase móvil: puede estar formada por un líquido o un gas en el cual están los solutos que se van a separar. 2) Exclusión molecular. Según la forma física de los sistemas utilizados: En soportes planos (papel. papel) o sobre columna.16 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico B. de tal manera que quedaría reflejada de la siguiente forma: RECUERDA. 8. capa fina) En columna Habitualmente se realiza una clasificación combinando la naturaleza de las fases y los mecanismos físicos de separación. mientras que la cromatografía líquida se puede hacer en soportes planos (capa fina. Mecanismos de separación. 5) Afinidad. Según el mecanismo físico de la separación: Cromatografía de adsorción Cromatografía de partición Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de afinidad C. 1) Cromatografía de intercambio iónico.3. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . La separación de las sustancias se puede realizar por distintos mecanismos: 1) Intercambio iónico. la cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en columna. 3) Adsorción 4) Partición o reparto. En general. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Veamos como separar el cobre disuelto Un video donde explica el mecanismo de funcionamiento del intercambio ionico ( en ingles) 2) Cromatografía de exclusión molecular. Si la carga de las resinas es positiva se denominan resinas de intercambio aniónico (separan aniones). Se realiza en columnas en las que se encuentra empaquetada la fase sólida. - Se llama también cromatografía de filtración en gel.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 17 - - Es un tipo de cromatografía líquida en la cual el sistema cromatográfico está compuesto por una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida. La función de estas resinas con carga en su superficie es la de intercambiar iones con los de la fase móvil y los de la muestra. que poseen grupos cargados positivos o negativos. Cuando se produce el paso de la fase móvil (con los iones a separar) a través de la fase estacionaria. Si la carga de las resinas es negativa se denominan resinas de intercambio catiónico (separan cationes). La fase estacionaria consiste en resinas de intercambio iónico. El fundamento de la separación se basa en las diferencias existentes entre el signo y la magnitud de las cargas eléctricas. los iones de la muestra compiten con los de la fase móvil por los sitios de unión de la fase estacionaria. de manera que los que tienen mayor fuerza de unión son los más retenidos y saldrán más tarde en la columna. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 18 - - Es una forma de cromatografía líquida en la que el sistema cromatográfico está compuesto por una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida. - La separación está basada en las interacciones que se producen entre el soluto y las moléculas de la fase móvil con una fase sólida. se produzcan atracciones de UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . La fase estacionaria consiste en un gel que presenta poros de un tamaño determinado. - Veamos un video explicativo del principio de exclusión con un ejemplo 3) Cromatografía de adsorción. La distinta polaridad de los componentes del sistema hace que. de manera que aquellas cuyo tamaño es mayor que el del poro del soporte. es un fenómeno de adsorción. El fenómeno que se produce entre solutos y solventes y la fase sólida o adsorbente. El mecanismo de separación es por exclusión molecular: la solución con las sustancias a separar se introduce en la columna atravesando la fase sólida. puentes de hidrógeno o fuerzas de van der Waals. al pasar una mezcla de sustancias disueltas en una fase móvil a través de una adsorbente. - el más conocido es el “Sephadex”. siendo eluidas más tarde (ver video) Los geles empleados como fase estacionaria son muy variados. pasan sin ser retenidas. El fundamento de la separación es la diferencia en el tamaño molecular de las sustancias a separar (también puede influir la forma y la hidratación de la molécula). y aquellas que tienen un menor tamaño que el del poro penetran en el gel y son retenidas . Se realiza en columnas en las que se encuentra empaquetada la fase sólida. Las interacciones pueden ser de tipo electrostático. - La cromatografía L/S se realiza tanto en soportes planos como en columnas.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 19 - distinta fuerza y naturaleza sobre la fase estacionaria.Los componentes más polares de la mezcla son más retenidos. de manera que los más polares son eluidos los primeros.Los solutos son separados por su carácter relativo no polar. . La fase móvil puede ser líquida (L/L) o gaseosa (G/L). La distribución de sustancias se produce sobre una fase estacionaria líquida. (video sobre distintos procesos de adsorción) - La cromatografía G/S se realiza en columnas.Los componentes de menor polaridad o apolares no son retenidos y salen eluidos en primer lugar. de manera que la fase líquida estacionaria es de naturaleza no polar. de manera que la fase móvil es apolar: . 4) Cromatografía de partición o reparto. . La fase estacionaria está constituida por una fase soporte recubierta por un líquido. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . . La fase móvil puede ser líquida o gaseosa. En la cromatografía L/L se distinguen dos tipos de métodos: o Partición en fase normal: la fase soporte está cubierta con una sustancia (líquida) polar. o Partición en fase invertida: la fase soporte tiene grupos no polares unidos en su superficie. siendo por tanto la fase móvil polar. - La fase estacionaria puede estar constituida por adsorbentes no polares o polares.Los solutos menos polares son retenidos con más fuerza y salen eluidos en último lugar. lo que conlleva la separación de las sustancias según su grado de retención (atracción) por la fase sólida o adsorbente. . - Es una técnica basada en la separación de solutos por su diferente solubilidad entre una fase móvil y una estacionaria inmiscibles. La mayor parte de las separaciones realizadas por HPLC se realizan por cromatografía de partición en fase invertida.Los componentes de polaridad intermedia son retenidos con menos fuerza. siendo eluidos posteriormente por la adición de otros metabolitos de mayor afinidad por el ligando o bien cambiando las condiciones físico-químicas de la fase móvil. - - La separación se basa en mecanismos que implican la afinidad entre dos elementos. la ejecución de la técnica se puede llevar a cabo mediante el empleo de distintas formas de soportes sobre los que actuarán las fases de separación: Cromatografía plana: integra un conjunto de técnicas en las que la fase estacionaria se encuentra extendida en una superficie plana y la fase móvil líquida. hormona-receptor. La separación de mezclas de componentes se puede conseguir jugando con la puesta en común de dos fases entre las que se van a distribuir las sustancias a estudiar en función de diferentes mecanismos. Ag-Ac.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 20 ¿Cómo se reparte un colorante entre dos fases de distinta polaridad? 5) Cromatografía de afinidad.4. se desplaza por capilaridad o adsorción. 8. por ejemplo enzimasustrato. Tipos de soporte. etc La fase estacionaria contiene unido el ligando. Ahora bien.Cromatografía en papel (PC) UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . . Cuando la fase móvil atraviesa la fase estacionaria los elementos que presenten mayor afinidad por el ligando serán retenidos en la columna. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Se obtiene así un cromatograma que se queda en el propio soporte. Esperar a que se seque. Se marca el nivel exacto alcanzado por el solvente o eluyente. es por tanto una cromatografía líquido-líquido. En los tipos de cromatografía en papel el proceso puede desarrollarse de tres formas: Ascendente: el eluyente sube por el soporte. Las sustancias separadas se detectan mediante el revelado: bien directamente si son coloreadas ó bien por algún método de detección que las haga visibles. Es esencialmente una cromatografía de reparto en donde la fase estacionaria es el agua retenida entre las fibras de celulosa de una hoja de papel y la fase móvil suele ser un disolvente orgánico o bien una mezcla de disolventes en la que irá disuelta la muestra. Cuando el solvente ya casi ha alcanzado el frente del papel se quita la tira de la cámara y se deja secar. o o o o Se deja que fluya el solvente por capilaridad a través de la tira de papel. El soporte es plano y consiste en una hoja de papel de celulosa de elevada pureza. arrastrando a su paso los componentes de la tira de la muestra.Cromatografía en capa fina (TLC = Thin Layer Chromatography) Cromatografía en columna 1) Cromatografía en papel. o Una vez seco.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 21 . La técnica general consiste en: o Aplicación de la muestra sobre el papel en un extremo con un capilar o una micropipeta. Separación: dichos componentes se irán separando en función del reparto entre las dos fases de forma que las sustancias muy solubles en el líquido de desarrollo se moverán libremente con éste mientras que las que sean muy solubles en agua quedarán retenidas y por tanto más cerca del punto de aplicación. introducción del soporte (tira de papel) en una cámara que consiste en una cubeta de vidrio bien cerrada que contiene el eluyente o líquido de desarrollo y en posición vertical. por el que fluye la fase móvil por capilaridad. es por tanto. Didimensional: consiste en ejecutar una segunda cromatografía girando el papel 90º y empleando un disolvente diferente.Poliamida . se podrían separar en el segundo proceso. La fase móvil es líquida y está formada por solventes de polaridad que va en función de la polaridad de la fase sólida estacionaria. plástico o metal. sólida. Es una cromatografía líquido/sólido. La fase estacionaria está constituida por las partículas sólidas adheridas al vidrio.Gel de silicato magnésico La aplicación de muestras y el desarrollo cromatográfico es similar a la cromatografía en papel con la salvedad de que UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 22 Descendente: el papel se mantiene colgado de la parte superior del recipiente y el eluyente va descendiendo. El material poroso puede ser: . 2) Cromatografía en capa fina. La separación de los distintos componentes se produce en virtud de los procesos de adsorción sobre la fase estacionaria. En este tipo de cromatografía el soporte es plano y consiste en una capa muy fina de un material poroso extendido sobre una placa que puede ser de vidrio.Gel de sílice o silicagel .Celulosa . de forma que sustancias que en una primera separación quedaron muy juntas.Gel de óxido de aluminio . y carbohidratos). depositándose sobre la parte superior del lecho cromatográfico: se abre la columna por el extremo opuesto y se deja que vaya fluyendo hacia el interior del lecho. de manera que la separación de los componentes de la muestra se lleva a cabo por su distribución entre las dos fases. es una técnica más rápida y sensible que la cromatografía en papel y se usa para separar sustancias de bajo peso molecular (aminoácidos. lípidos. Antes de que se seque se añade nueva fase móvil y se continúa así hasta el final del proceso. La muestra se introduce en la columna junto con la fase móvil. que llevará adsorbida la sustancia de interés. La elución de los componentes se realiza mediante raspado de las distintas manchas en el soporte y posterior disolución del polvo del soporte. El desplazamiento de los diferentes componentes de la muestra sólo puede ocurrir en la fase móvil y por tanto la velocidad de migración va a depender del tiempo que cada componente permanezca en esta fase.Adsorción (fase estacionaria sólida) . Una vez extraídos se procede a su identificación y cuantificación. con disolventes adecuados. La cromatografía en capa fina Eq-100. El eluido es fraccionado en tubos de ensayo de forma que se obtienen distintas fracciones de fase móvil que contienen concentraciones elevadas de los distintos solutos. tanto en fase estacionaria líquida como sólida. Los métodos en columna se emplean para varios tipos de cromatografía tanto en cromatografía líquida como gaseosa. este relleno denominado también lecho cromatográfico puede ser la propia fase estacionaria o ir asociada a un líquido que constituye la fase estacionaria. Esta fracción de tiempo va a ser pequeña para aquellas sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria y viceversa. En cualquier caso la diferencia de UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Las fases móvil y estacionaria se encuentran en equilibrio. Veamos un video explicativo de la cromatografía en capa fina 3) Cromatografía en columna. La fase móvil es un solvente que se hace pasar a través de la columna o bien un gas.Reparto o partición (fase estacionaria líquida) . El flujo de la fase móvil puede estar propiciado por la acción de la gravedad (cromatografía convencional) o bien por un sistema de bombeo de alta presión ( HPLC). Los mecanismos en virtud de los cuales se produce la separación son de diferentes tipos: .Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 23 siempre es ascendente. Frecuentemente se usa la técnica tridimensional combinando dos sistemas distintos de disolvente.Intercambio iónico (fase estacionaria sólida) En este método de cromatografía la fase estacionaria se dispone como el relleno de un recipiente cilíndrico abierto por varios extremos y de longitud y ancho variable que se denomina columna. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto. un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. . Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC = High performance liquid chromatography): es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. . También se le denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión o High pressure liquid chromatography (HPLC). Normalmente se mantienen refrigeradas entre 2-4ºC. La HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. La composición de la fase móvil puede ser constante o variar (mezcla de uno o más eluyentes en gradiente continuo o discontinuo). se emplean fundamentalmente dos técnicas de cromatografía en columna: cromatografía líquida de alta resolución y cromatografía de gases.La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 24 velocidad de los diferentes componentes va a permitir su separación. objetivo final de la cromatografía. Como detector debe ser utilizado aquel que sea capaz de identificar cada una de las fracciones de la muestra. sin embargo es normal realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso Método de gradiente de elución: proceso mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. se denomina isocrática. Dependiendo de la forma en que se use el solvente tendremos dos métodos de trabajo: Método isocrático: cuando durante toda la separación se utiliza siempre el mismo solvente. . En la actualidad.En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente. Para que la columna pueda ser reutilizada hay que regenerarla después de cada uso para que no queden restos de la separación anterior. Si la señal recogida por el detector es representada en función del tiempo se obtiene una gráfica (registro o cromatograma) donde aparecen una serie de picos que pueden ser utilizados tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo. se consiguen separaciones en tiempos cortos. el metanol y el acetonitrilo. sales. El agua puede contener tampones. que ayudan a la separación de los compuestos. utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua. Los disolventes más utilizados son el agua. o compuestos como el ácido trifluoroacético. En el ejemplo. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. es decir. del orden de minutos (con la cromatografía convencional se tardaba horas o días). UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 25 - - El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte.be/_dJQtQkcHmg Cromatografía de gases: - La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito. En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 26 Video: la cromatografía HPLC http://youtu. que no es lineal. y el detector. A diferencia de los otros tipos de cromatografía. Éste consta de diversos componentes como el gas portador. siendo esta última la que se utiliza más ampliamente. ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Precisamente este proceso de adsorción. y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). la columna (generalmente dentro de un horno). La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. - La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada. su única función es la de transportar el analito a través de la columna. el sistema de inyección de muestra. Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC). argón.5. como puede ser un tamiz molecular. Generalmente se emplean gases como el helio. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . nitrógeno. hidrógeno o dióxido de carbono. y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 27 - El gas portador debe ser un gas inerte. Análisis cualitativo y cuantitativo.be/e_ZAsfZ1AUo 8. Luego tenemos un sistema de manómetros y reguladores de flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratación del gas. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un generador. para prevenir su reacción con el analito o la columna. Ver video espectrofotometría de gases http://youtu. una serie de diluciones obtenidas a partir de un punto cuya composición es similar a la de la muestra problema. • En cromatografía en columna se usa la altura o área de los diferentes picos obtenidos al compararlos con determinados patrones. mayor afinidad del soluto por la fase estacionaria. La representación de los datos deben dar una línea recta que pase por el origen de coordenadas.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 28 A nivel cualitativo la cantidad de información obtenida a partir de una cromatografía es limitada comparada con otras técnicas como la espectroscopia de masas o la resonancia magnética nuclear: obtenemos datos de tiempo de retención y datos de posición de la sustancia en la fase estacionaria tras la evolución. CE concentración molar soluto en fase estacionaria Kd = --------CM concentración molar soluto en fase móvil A mayor Kd. Seguidamente se obtienen los cromatogramas de los diferentes patrones y se representan gráficamente las alturas o áreas de pico en función de la concentración. Parámetros cromatográficos 1) Coeficiente de distribución (Kd): es la relación entre la concentración molar de soluto en la fase estacionaria y la fase móvil. Las técnicas cromatográficas pueden también proporcionar información a nivel cuantitativo: • En cromatografía plana el área cubierta por las sustancias separadas sirve como parámetro para el análisis cuantitativo. 2) Relación al frente del solvente (Rf): en la cromatografía en placas (papel o capa fina) se define el valor de Rf como la relación entre la distancia desde el punto de aplicación a la mancha (dm) y la distancia desde el punto de aplicación al frente del solvente (ds). El método más sencillo es someter a una cromatografía. El Rf también conocido como factor de retención. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . expresa la afinidad relativa de la muestra por la fase estacionaria (a mayor Rf menor afinidad). dm distancia recorrida por la sustancia Rf = -----------ds distancia recorrida por el líquido de desarrollo Cada sustancia tiene un Rf característico y por ello permite su identificación por comparación con patrones. Kd (B) Sustancia B α = -----------Kd (A) Sustancia A En la separación entre dos sustancias se persigue que la selectividad sea lo mayor posible. No tiene unidades de medida. mayor Vr. Vr = Vm (1 + Kd) Vm es el volumen de solvente de la fase móvil requerido para eluir un compuesto sin afinidad por la fase estacionaria (Kd = 0) A mayor Kd. En un cromatograma la resolución se calcula midiendo las distancias a las que aparecen los picos en el cromatograma y el ancho de la base de cada pico (cromatografía en columna). En las cromatografías en soporte plano. 6) Resolución (R): es la capacidad del sistema para separar lo mejor posible las sustancias a estudiar. d2 – d1 R = ---------------------½ (a1 + a2) Si R >= 1.buena separación cromatográfica Si R < 0.25 ……………. 4) Tiempo de retención (tr ): es el tiempo en el que un soluto es eluido. Vr = tr x F F es la velocidad de flujo de la elución (ml/min) El volumen de retención y el tiempo de retención. los picos son manchas sobre el papel.4………………no se verá claramente la separación entre los solutos. Vr permite identificar sustancias.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 29 3) Volumen de retención o de elución (Vr): es el volumen de elución en el cual sale un compuesto de interés. normalmente es mayor de 1. El tiempo de referencia será aquel al que salga eluida una sustancia no retenida en la fase estacionaria. que idealmente son circulares. Es la relación entre los coeficientes de distribución de los dos solutos en estudio. trabajando en condiciones constantes y empleando patrones de referencia. pueden servirnos para identificar sustancias. 5) Selectividad (α): es el factor que describe la capacidad para separar dos solutos. La resolución depende del diámetro de las manchas (a) y de las distancias entre ellas (d). UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Para ello. ya que permite separar macromoléculas en una mezcla. diferencia de potencial del campo eléctrico aplicado. mayor será la distancia a la que aparece su pico en el cromatograma.30 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico RECUERDA. mayor será el volumen de retención necesario para eluirla y mayor será el tiempo de retención. cuando se encuentran sometidas a la acción de un campo eléctrico. La velocidad con que las diferentes sustancias se desplazan durante el transcurso de la electroforesis se denomina velocidad de migración. fuerza iónica. naturaleza de la muestra. 9. Dicha magnitud depende básicamente de la densidad de la carga y ésta a su vez está condicionada por una serie de parámetros (pH. sirviendo tanto como método analítico como preparativo para la posterior realización de otras técnicas analíticas. interacciones de la misma con el soporte elegido) que van a condicionar el desarrollo experimental de la técnica electroforética. es necesario que la sustancia se encuentre cargada de manera que al colocarla en el seno de un campo eléctrico se desplace hacia un polo u otro en función de su carga. Distancia. La electroforesis es una herramienta práctica para el análisis de mezclas de compuestos biológicos. Se define como electroforesis el proceso en el cual las especies cargadas se separan en función de su diferente velocidad de migración. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . volumen de retención y tiempo de retención son directamente proporcionales en la cromatografía en columna: a mayor retención de una sustancia por el sistema. Electroforesis. ácidos nucleicos. isoenzimas (LDH. estructura de la sustancia. La técnica electroforética está basada en el movimiento diferencial de partículas que están cargadas eléctricamente en el seno de un campo eléctrico. etc 9.Es necesario que todos los componentes de la mezcla a separar se encuentren cargados de igual forma. hemoglobina. Fundamento.Las partículas cargadas negativamente (aniones) migrarán hacia el polo positivo (ánodo). Se representa por la letra “μ” y sus unidades son cm2 / V x s UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 31 La aplicación en el laboratorio es muy amplia. CPK…). F=QxV Q= carga de la partícula V= voltaje del campo eléctrico Fuerzas de retardo: son fuerzas contrarias a la fuerza impulsora y se oponen al movimiento. la viscosidad del buffer… La diferencia entre ambas fuerzas. aunque su principal aplicación es la separación de proteínas séricas. depende básicamente de: La carga de la sustancia El voltaje del campo eléctrico El coeficiente de fricción (rozamiento entre el soporte y la sustancia) Otros: pH del medio. de manera que después de depositar la muestra sobre el soporte en uno de los polos. etc Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas ocurre lo siguiente: . El desplazamiento de los distintos componentes de la muestra durante el transcurso de la electroforesis. . proporciona una fuerza neta que impulsa a la partícula a una velocidad constante. se dirijan todos hacia el polo contrario. tamaño (Pm). La velocidad de migración de las partículas depende de varios tipos de fuerza: La fuerza impulsora: es la fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la partícula cargada y es proporcional a la carga de la partícula y al voltaje del campo eléctrico aplicado. separándose unos de otros en función de la diferente velocidad de migración.Las partículas cargadas positivamente (cationes) migrarán hacia el polo negativo (cátodo). Dependen del tamaño de la partícula. el coeficiente de fricción. siendo empleada para la determinación de numerosas sustancias. También se emplea para lipoproteínas. La velocidad de migración de los diferentes componentes de la muestra que queremos separar durante su desarrollo electroforético por unidad de tiempo recibe el nombre de movilidad electroforética. .1. la forma. 2. el ánodo. existe un pH denominado punto isoeléctrico (PI) y se define como aquel valor de pH al cual el balance de cargas positivas y negativas superficiales de una sustancia es 0 (carga neta nula). que nos va a permitir fijar el pH más adecuado en cada caso. variando de 4. Los principales parámetros que influyen o afectan en el desarrollo de una electroforesis y que condicionan su utilidad en el laboratorio son básicamente: Carga neta de la sustancia en migración Fuerza iónica del medio Tamaño y forma de la partícula Potencial del campo eléctrico 1) Carga neta de la sustancia en migración: el grado de ionización y por tanto la carga neta de las distintas sustancias de la muestra sometida a electroforesis. Al pH de su PI una sustancia no presenta carga neta alguna y por tanto al ser sometida a un proceso electroforético no migra (permanece inmóvil en el punto de aplicación).La electroforesis de proteínas séricas se realiza casi siempre a un pH de 8. intervalo en el que todas las proteínas estarán cargadas negativamente y migrarán hacia el ánodo. ya que hay sustancias que dado su carácter anfótero (como es el caso de las proteínas que son compuestos que presentan cargas positivas y negativas sobre la misma molécula siendo el número de unas u otras dependientes del pH del medio) pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente. depende del pH del medio en el que se lleva a cabo todo el proceso.El PI para la mayoria de proteínas es ácido. . la sustancia se encuentra cargada negativamente (el número de cargas negativas supera a la de positivas) y sometido a electroforesis migrarán hacia el polo positivo. .5 a 9.La influencia del pH sobre la carga neta es especialmente importante. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .Cuando el pH de medio es inferior al de su PI la sustancia cargada positivamente (se comporta como un catión). .2 para las globulinas. parámetro que queda determinado por el tampón elegido. se dirigirá hacia el cátodo que es el polo negativo. .Cuando el pH es superior al PI.Para las sustancias anfóteras. La carga neta es el balance entre las cargas positivas y negativas de una partícula en solución. .La carga neta de la sustancia en migración electroforética quedará determinada por el tampón elegido.1 y 6. . Factores que intervienen en el desarrollo electroforético. .6 para la albúmina a 5. que permite utilizar el pH más adecuado.32 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 9. I= intensidad de corriente). mayor es la proporción de corriente transportada por los iones del tampón y menor la transportada por las propias partículas de la muestra a separar. Cuanto más concentrado es el tampón. . más rápidamente se moverá la partícula (F = Q x V). tal es el caso de aquellas electroforesis que emplean soportes que permiten el paso selectivo de las moléculas.Cuando la concentración del tampón es superior a la requerida. la migración de las partículas será más lenta y la separación será peor. 3) Tamaño y forma de la partícula: estos factores no influyen por igual en todos los procesos electroforéticos y por tanto en función del tipo de electroforesis el tamaño y forma de las partículas a separar pueden tener mayor o menor importancia e incluso ser factores más definitivos que la propia carga que poseen. la fuerza iónica también depende del tampón elegido para la electroforesis. R= resistencia del medio. . la movilidad electroforética (μ) de la partícula es proporcional a su carga y al potencial del campo eléctrico: cuanto más alto sea el potencial aplicado. tanto los del tampón como los de la muestra en solución. .Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 33 Estructura básica de un aminoácido 2) Fuerza iónica del medio: al igual que el pH final. la corriente eléctrica es transportada por todos los iones presentes. la intensidad de corriente y el voltaje son proporcionales: V = R x I (V= voltaje. de manera que éstas migrarán más despacio (los iones en solución se encuentran rodeados por una nube iónica de iones del tampón y se mueven todos juntos. reteniendo las partículas más grandes impidiendo su movilidad y permitiendo el paso de las partículas más pequeñas. no sólo según su carga sino también según su tamaño. - En un campo eléctrico.En un proceso electroforético. Podría parecer que cuanto mayor sea el campo eléctrico aplicado. la concentración del tampón que se elige para un proceso electroforético debe ser la suficiente para que el tampón cumpla su doble función: mantener constante el pH del medio y transportar parte de la corriente gracias a sus iones. este fenómeno hará que las partículas que nos interesan migren más lentamente). 4) Potencial del campo eléctrico: como se ha visto anteriormente. si la concentración de iones del tampón es muy alta. mayor será la velocidad de migración.Para evitar este fenómeno. pero existe una limitación a un aumento excesivo del UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . una electroforesis puede realizarse directamente en una solución tamponada de la sustancia que se desea separar (electroforesis libre) o puede hacerse sobre un soporte de manera que una vez terminado el proceso las fracciones queden permanentemente separadas y sea fácil proceder a su cuantificación. Desarrollo de la técnica.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 34 voltaje o del amperaje ya que tiene el inconveniente de que se produce también un aumento de la temperatura ocasionando efectos indeseados como la desnaturalización de las proteínas o la evaporación del tampón. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . como consecuencia de la evaporación. de consistencia gelatinosa. el tampón queda más concentrado. En el laboratorio de diagnóstico clínico se utilizarán los distintos líquidos biológicos: suero. que incluyen el solvente en su preparación que puede ser homogénea (misma concentración de gel en todo el soporte) o heterogénea ( la concentración de gel varía a lo largo del soporte de forma continua o discontinua). 5) El soporte 9. LCR. plasma. En realidad no hay ningún tipo de soporte que sea totalmente no restrictivo. Todos los soportes son sólidos. El proceso de electroforesis consta de las siguientes fases: Preparación de la muestra -----------------------. A su vez.Selección y preparación del soporte ↓ Aplicación de la muestra ↓ Electroforesis ↓ Revelado ↓ Lectura 1) Preparación de la muestra: la muestra a emplear y el tratamiento previo. es la denominada electroforesis zonal. Los principales tipos de soporte utilizados se agrupan en dos tipos: a) NO RESTRICTIVOS: las partículas colocadas sobre ellos pueden moverse libremente de forma que se separan únicamente en función de su carga eléctrica.3. plasma. Papel: fue el primer soporte utilizado en electroforesis de zona. Este tipo de soporte es suficiente para la mayoría de los diagnósticos clínicos por lo que son los más utilizados. o En el caso de orina o LCR las muestras deben concentrarse por ultracentrifugación para aumentar el contenido proteico. etc o Si vamos a realizar una electroforesis de proteínas séricas se necesitará suero fresco (si es plasma aparecerá una banda adicional de fibrinógeno entre ß y γ ). En la actualidad prácticamente no se utiliza. sangre total. dependen de los compuestos que se pretendan analizar mediante la electroforesis. 2) Selección y preparación del soporte: en general. aumentando su fuerza iónica y dificultando el desarrollo electroforético. pues las sustancias de peso molecular elevado pueden verse frenadas en su desplazamiento o incluso no desplazarse en absoluto. orina. . Esta resistencia depende fundamentalmente de: .El tamaño del poro de la sustancia que forma el soporte. consiguiéndose mejores separaciones que con los soportes no restrictivos.Rapidez de ejecución .No captan el colorante (no dan lugar a colores de fondo no deseables) por lo que no necesitan ser transparentados.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 35 Acetato de celulosa: se obtiene a partir de la reacción de anhídrido acético con los grupos hidroxilos de la celulosa. Proporciona un mayor número de fracciones de la muestra a separar que otros soportes.Fácil manipulación . El tamaño del poro puede variarse cambiando la composición del gel. y son muy adecuados para la cuantificación de las distintas fracciones por densitometría. Presenta entre otros los siguientes inconvenientes: .Elevada reproductibilidad . En el momento de ser utilizado. Gel de agarosa: está formado por agarosa. El más utilizado son las tiras de cellogel (acetato de celulosa gelatinizado). Las partículas se separan en función de su carga y también de su tamaño. Su estructura deja gran cantidad de huecos llenos de aire. estrechas y nítidas) UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Son los que proporcionan un mayor número de fracciones y la mejor resolución de las distintas bandas utilizándose sobre todo en laboratorios de investigación. Gel de almidón: su uso es limitado debido a las dificultades derivadas de su preparación.Porosidad variable . .Fácil lectura El acetato de celulosa es un material opaco que debe ser transparentado con disolventes orgánicos antes de proceder a su determinación mediante densitometría. Presentan las siguientes ventajas: .Elevada resolución (obtención de bandas. lo que puede hacer desaparecer las bandas más débiles: inconveniente. Geles de poliacrilamida: son el resultado de la polimerización de la acrilamida con diferentes compuestos.Carece de cargas eléctricas que podrían intervenir en la migración electroforética. que penetra en los huecos de aire llenándolos. Este tampón que ocupa los huecos es el encargado de llevar la corriente eléctrica a través del soporte. Debido al elevado tamaño del poro (mayor que el de otros geles) las sustancias depositadas en él migran únicamente en función de su carga eléctrica.El tamaño y las características estructurales de las sustancias que vayan a desplazarse sobre el mismo.Químicamente inertes .Considerable dificultad para obtener un soporte de espesor y porosidad uniforme. Es un soporte de amplio uso y presenta las siguientes ventajas: .No permite la posterior lectura por densitometría. b) RESTRICTIVOS: ejercen algún tipo de resistencia al desplazamiento electroforético de las sustancias depositadas en ellos. uno de los componentes del agar (es un compuestos de agarosa y agaropectina). de manera que las sustancias depositadas en este tipo de geles se separan en función de su carga y su tamaño. las membranas de acetato se sumergen en el tampón. . Las sustancias de alto peso molecular se ven totalmente frenadas en su desplazamiento. Es un soporte muy utilizado en el laboratorio por las ventajas que ofrece: . sin olvidar la importancia en la selección del tampón por influencia que ejercerá sobre la migración de las partículas. micro o semimicro. Incluir la muestra en el gel en el proceso de polimerización o formación (ej en gel de agarosa). para incrementar la resolución. La aplicación de la muestra se realiza con unos aplicadores que pueden ser macro. En orificios o ranuras que se han practicado sobre la superficie del soporte (ej inmunoelectroforesis). 4) Proceso electroforético: la ejecución del proceso electroforético requiere una instrumentación consistente en la cubeta de electroforesis y la fuente de alimentación. la cantidad que se aplique dependerá del sistema de detección pero no se debe colocar una cantidad de muestra excesiva y la muestra debe ser lo más homogénea posible para favorecer la interpretación. En general.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 36 - Transparencia (permite cuantificación por densitometría) Pueden ser utilizados para electroforesis especiales (permiten la introducción en su estructura de diferentes compuestos) 3) Aplicación de la muestra: la muestra se puede aplicar en el soporte mediante distintas técnicas: Aplicación sobre la superficie del soporte dejando que penetre (ej suero sobre acetato de celulosa en la electroforesis de las proteínas). la aplicación debe ser lo más estrecha posible para favorecer la separación. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . hace posible que fluya la corriente de un electrodo a otro. . A este pH todas las proteínas adquieren cargas negativas y migran hacia el ánodo. . . Se debe mantener en posición horizontal y con los receptáculos llenos por igual de tampón. Las fuentes empleadas pueden trabajar tanto a corriente constante como a voltaje constante. impregnado de tampón y en contacto con el tampón de los receptáculos. La cubeta se mantendrá tapada durante el proceso para evitar la contaminación y la evaporación del tampón.6 / 0. Tampón: el tampón llena los dos receptáculos de la cubeta hasta un determinado nivel y al estar impregnada también la tira. Cubeta: la cubeta consiste en una cámara que contiene dos electrodos de carga opuesta situados en dos receptáculos que se conectan por medio de un puente salino cuya función es permitir el paso de la corriente. RECUERDA.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 37 Fuente de alimentación o voltímetro: su función consiste en aportar la energía eléctrica para que se pueda llevar a cabo el proceso.La albúmina con un pI = 4. 5) Revelado: el revelado tiene por objeto la localización para su posterior evaluación de las distintas fracciones en que ha sido separada la muestra. por ello la albúmina recorre mayor distancia que las γ cuando se someten a la acción de un campo eléctrico.Como tampón se utiliza veronal ( pH 8.2. Este puente es el mismo medio de soporte.Hay que evitar que el tampón se contamine o varíe su pH.6 tendrá mayor carga negativa que las γ-globulinas cuyo pI = 6. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .04 M ). A través de él pasará la corriente provocando la migración de partículas en función de la carga eléctrica que posean. deteniéndose el proceso de separación.Azul brillante de Coomasie . posteriormente se realiza la decoloración con sustancias adecuadas al tipo de colorante utilizado hasta que el fondo no tenga color y sólo se aprecien teñidas las bandas electroforéticas. Colorantes más utilizados: SUSTANCIA A DETERMINAR PROTEINAS LIPOPROTEINAS GLUCOPROTEINAS ENZIMAS (DESHIDROGENASAS. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . ENTERASAS) COLORANTE .Ponceau S . Para localizar las distintas fracciones se realiza una tinción de los componentes que se desea visualizar.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 38 - - - Previamente al revelado se apaga el aparato una vez transcurrido el tiempo adecuado de migración y se saca la tira de la cubeta. de manera que se unirá químicamente con dichos componentes pero no con el soporte. FOSFATASAS. de manera que se produzca una elución de las muestras → se obtiene en cada tubo una solución coloreada que se cuantifica por espectrofotometría → se miden las absorbancias de dichas soluciones para poder calcular el % de las fracciones separadas (la lectura se realizará a 620 nm si se ha usado el negro amido como colorante o a 520 nm si se ha utilizado rojo Ponceau). La tinción se realiza por inmersión de la tira de acetato de celulosa en el colorante elegido.Azul brillante de Coomasie . Las fracciones quedan así teñidas y listas para su evaluación cualitativa o cuantitativa (se pueden medir por densitometría o por elusión).PAS (ácido periódico-Schiff) - NADH Esteres de ß-naftol α-naftilfosfato 6) Lectura y cuantificación: el informe de una separación electroforética se suele dar como porcentaje de cada fracción respecto a la concentración total de las sustancias analizadas. Esta información se puede obtener de dos formas: Elución: cada zona o banda se recorta.Negro Sudán B . poniendo los trozos en tubos de ensayo → se añade a los tubos un disolvente específico según el colorante utilizado.Negro Amido . El colorante utilizado dependerá del compuesto a visualizar. Fuente de luz y filtro selector de λ ↓ Tiras electroforesis ↓ UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . La longitud de onda seleccionada será la que corresponda al color de las fracciones a leer. que será menor cuanto más densa sea la banda. Se realiza un barrido de la tira de forma que el haz de luz irá encontrándose con cada una de las fracciones. El propio aparato es capaz de calcular el área que encierra cada pico. Un detector registrará la intensidad de luz transmitida a través de cada banda. dando el porcentaje de cada banda con respecto del total. Nota: para que sea válida la densitometría el fondo de la tira debe ser transparentado antes de introducir la tira en el densitómetro.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 39 ↓ Cortar las bandas y depositar en tubos de ensayo ↓ Espectrofotometria Densitometría: consiste en la lectura directa de la tira que presenta las zonas separadas mediante un fotodensímetro. Este paso no es necesario en la lectura por elución. De esta manera el aparato es capaz de presentar una gráfica o registro denominado proteinograma donde los resultados se presentan en forma de picos. 5 % (0.54 .40 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico Detector ↓ Proteinograma RESUELVE.7 – 1. Se procede a la determinación de las proteínas séricas de un paciente por electroforesis y se cuantifican por elución.3 g/dl) γ…………………………….2 – 5 g/dl) α1 ………………………….2 ..62 % (3.6 – 1...5 g/dl) UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .1 – 0.8 – 13 % (0.7 – 10 % (0. ¿Y si se pide el cálculo en g/100 ml? VALORES NORMALES DE LAS PROTEINAS SERICAS Albúmina………………….14 – 19 % (0.6 – 1 g/dl) ß…………………………….4 g/dl) α2 …………………………. Explica cómo realizarías el cálculo de los porcentajes de cada una de las fracciones. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su punto isoeléctrico dentro del rango. Cuando una sustancia se UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . .Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 41 La alteración de estos valores nos servirá para detectar o diagnosticar algunas alteraciones o enfermedades como problemas inflamatorios agudos o crónicos. Isoelectroenfoque. de manera que éste vaya aumentando de forma gradual desde el ánodo al cátodo.Las moléculas anfotéricas.Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migrarán hacia el cátodo. se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. tendrán una carga neta nula y se detendrán. . etc Un video que explica la técnica de montaje de una electroforesis http://youtu.be/6vKLT5mQoBM 9. Esta técnica habitualmente denominada electroenfoque. procesos alérgicos y autoinmunes.Las sustancias que se encuentran en medios con pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. es un tipo de electroforesis que se emplea ampliamente en bioquímica para separar moléculas cargadas en función de su punto isoeléctrico.La migración las conducirá a una región donde el pH coincidirá con su punto isoléctrico.be/RcID2cpUZq0 Veamos un video de cómo tener una electroforesis en gel de agarosa para DNA: http://youtu. cirrosis. Fundamento .4.Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. . Sobre un soporte se establece un gradiente de pH mediante una mezcla de anfolitos. nefrosis. como los aminoácidos. . De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.La región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. . de forma que las diferentes proteínas migran según UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . que vendrá determinada por el pH de la zona donde se encuentre inicialmente: por ejemplo. Los anfólitos son mezclas homogéneas de ácidos alifáticos de pH entre 4 y 9 y cuando se someten a una corriente eléctrica migran de acuerdo con sus cargas creando zonas tamponadas con un gradiente de pH homogéneo en el cual luego se moverán las proteínas. Inmunoelectroforesis. Una proteína de pI = 7. La muesta a estudiar. es decir. lo que genera una gran cantidad de calor y hace necesario mantener un sistema de enfriamiento en la cubeta de electroforesis. migrará hacia el cátodo (polo -). donde permanecerá inmóvil. En ambos casos el movimiento se realiza hasta alcanzar el pH correspondiente al pI.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 42 introduce en este gradiente migrará según su carga neta inicial. Cuando la sustancia llegue a su pI dejará de moverse obteniéndose en ese punto una banda que identifica la sustancia. 9. por lo que la sustancia irá cambiando progresivamente su carga. La misma proteína en la zona B presenta una carga (-) y migra hacia el ánodo. empleándose para estudio de inmunoglobulinas. La principal ventaja del isoelectroenfoque es su gran poder de resolución que hace que se puedan separar moléculas con pI muy cercanos. a medida que migra hacia el polo (-) va recorriendo una zona en la que el pH varía. de hasta 2000 voltios. se dispone sobre una lámina de acetato de celulosa (o gel de agarosa) y se somete a electroforesis.5. hasta que al llegar a su pI sus cargas (+) y (-) se igualan resultando su carga neta nula. perdiendo carga (+) y ganando cargas (-). Consiste en el fraccionamiento electroforético de las proteínas séricas sobre acetato de celulosa y posterior contacto y precipitación de las proteínas separadas con antisueros monoespecíficos. normalmente suero. pH 14--------10-------7----------4-------------0 OH- X OH- OH - OH- OH CATODO (-) X X → → X X → → X X X → ZONA B X H+ X ← X ← X X ← ZONA A H+ X H+ H+ H+ ANODO (+) El voltaje empleado para crear el gradiente de pH tiene que ser muy elevado. combina la separación electroforética y la precipitación inmunitaria por reacciones Ag-Ac entre las proteínas y anticuerpos específicos frente a ellas. si la carga inicial es positiva. isoenzimas y proteínas que se puedan diferenciar en función a su pI. Su uso es más restringido. situada en la posición A se encuentra en una zona cuyo pH es más ácido que su pI y por tanto transportará una carga (+) y migrará electroforéticamente hacia el cátodo. Esta técnica resulta de la combinación de la electroforesis y la inmunodifusión. 10.La fuerza que ejerce el campo eléctrico aplicado sobre una partícula cargada: a) Es directamente proporcional a la carga de la partícula b) Es inversamente proporcional a la carga de la partícula c) Es directamente proporcional al voltaje del campo eléctrico d) A y b son correctas e) A y c son correctas 3. en concreto es de gran utilidad para el estudio de gammapatías monoclonales. 1. Esta técnica se utiliza para el estudio de inmunoglobulinas. estos arcos pueden identificarse por comparación con arcos testigo obtenidos con proteínas puras conocidas. una molécula cargada negativamente migra hacia el: a) Anodo b) Cátodo c) Polo negativo d) Polo positivo e) A y d son correctas 2..En un campo eléctrico. Después se dispone el antisuero específico frente a una o varias sustancias en ranuras o regueros paralelos al campo de migración de la sustancia antigénica (proteínas) y se deja que se produzca la inmunodifusión sobre el acetato de celulosa (durante 24 h): el encuentro entre las diferentes proteínas (sistemas antigénicos) y el antisuero correspondiente (Ac) produce diferentes arcos de precipitación en el lugar donde coinciden Ag y Ac... Actividades.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 43 su carga.La movilidad electroforética se define como: a) Velocidad de migración en un tampón determinado b) Velocidad de migración por unidad de campo eléctrico c) Los centímetros que recorre por minuto d) Los metros que recorre por segundo e) Velocidad de migración respecto a un testigo 4.¿Qué factores afectan a la movilidad de una partícula en el seno de un campo eléctrico? a) pH del tampón b) Fuerza iónica del tampón c) Tamaño y forma de la partícula d) Potencial del campo eléctrico e) Todos UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .. En la electroforesis en gel de poliacrilamida.En las técnicas de isoelectroenfoque: a) Se emplean anfolitos UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca ..44 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 5...En la electroforesis en acetato de celulosa.El método de elección para la lectura de un espectro electroforético es: a) Elución b) Elución + fotodensitometría c) Fotodensitometría d) Fluorimetría e) Nefelometría 10. son restrictivos: a) Acetato de celulosa b) Gel de poliacrilamida c) Acetato de gelatina d) Gel de agarosa e) Gel de agar 9. b y c son correctas 8.¿Cuál o cuáles de los siguientes medios de soporte se emplean en electroforesis? a) Acetato de celulosa b) Acetato de gelatina c) Gel de agarosa d) A y b son correctas e) A y c son correctas 7....El punto isoeléctrico es: a) El pH al cual una partícula no se mueve b) El pH al cual una partícula migra al ánodo c) El pH al cual la carga neta de la partícula es cero d) A y c son correctas e) A y b son correctas 6. la separación se lleva a cabo con arreglo a: a) Forma de la partícula b) Tamaño de la partícula c) Carga de la partícula d) Secuencia de aminoácidos e) B y c son correctas 12..De los siguientes medios de soporte.. la separación se lleva a cabo con arreglo a: a) Forma de la partícula b) Tamaño de la partícula c) Carga de la partícula d) Color de la partícula e) Secuencia de aminoácidos 11.De los siguientes medios de soporte. no son restrictivos: a) Acetato de celulosa b) Acetato de celulosa gelatinizado c) Gel de agarosa d) A y b son correctas e) A. ...¿Cómo actúa la FCR? ¿Qué expresa? 14.¿Cuál es la velocidad en rpm que debe llevar una centrífuga de 15 cm de radio de giro para adquirir una FCR de 450? 18. 20..¿En qué unidades se expresa la FCR? 15.Se quiere centrifugar una muestra de orina para proceder al análisis del sedimento..Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 45 b) c) d) e) Se usa un tampón de pH 8.De qué depende la FCR de una centrífuga? 16..500 rpm y el radio de giro 12 cm? 17.¿Cuál es la FCR de una centrífuga cuando la velocidad es de 1.Qué son las ultracentrífugas.6 La migración cesa cuando la proteína alcanza la zona de su pI A y b son correctas A y c son correctas 13. ¿qué precauciones se deben considerar para la centrifugación? UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca ..¿Qué diferencia hay entre las centrífugas de cabezal oscilante y las de cabezal angular? 19.. 46 Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 21.Qué es el punto isoeléctrico..¿Qué es y para qué sirve la diálisis? 22.. ¿de qué depende la velocidad de migración de las sustancias? 23.Explica lo que ocurre en la electroforesis cuando la concentración de tampón es demasiado elevada..¿Qué es la movilidad electroforética? ¿De qué depende? 25..¿Qué ocurre a valores de pH superiores al pI? ¿y a valores inferiores? 27..En la electroforesis.¿Qué tipo de fuerzas intervienen en la migración electroforética de las partículas a separar? 24. 26... UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 47 28. 33.Indica la función del tampón en la electroforesis.¿Es cierto que al aumentar el potencial del campo eléctrico más rápidamente se moverán las partículas en la electroforesis? Razona la respuesta 30..En qué consiste el isoelectroenfoque y cuál es su mayor ventaja..Cita y esquematiza las fases de que consta el proceso de electroforesis. 32. 29. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca . 31...En qué consiste la inmunoelectroforesis.Qué tipo de soportes son los que permiten una mejor separación... V2 = 15 ml. se han obtenido los siguientes datos: A 530 nm Alb (d ½) 0. calcular el coeficiente de distribución.A partir de una electroforesis en acetato de celulosa para fraccionamiento de proteínas séricas y la cuantificación por elución..De un sistema cromatográfico salen eluidos dos compuestos con los siguientes parámetros: V1= 5 ml.26 α1 0. a1 = 3 ml..¿Cuál será el coeficiente de distribución Kd de un soluto en un sistema cromatográfico en el que se encuentra en una concentración de 10 mol/l en la fase móvil y 20 mol/l en la fase estacionaria? 36.Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico 48 34. a2 = 5 ml. c) Con los mismos parámetros. calcular la selectividad del sistema para las sustancias 1 y 2.088 γ 0.051 Proteínas totales: 6.. a) Qué resolución presentará b) Con los mismos parámetros.82 g/100 ml A) Calcula el % de cada fracción frente al total B) Calcular los g/100 ml de cada fracción 35.067 ß 0.038 α2 0. Vo = 1ml. UDV Técnicas de separación Profesor: Juan Cuenca .