UNIVERSIDAD NORBERT WIENERFACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA CURSO DE FARMACOBOTÁNICA y FARMACOGNOSIA GUÍA DE PRÁCTICAS Smallanthus sonchifolius AUTORES: Q.F. Bertha Jurado Teixeira Q.F. Eva Ramos LLica Q.F. Elizabeth Consuelo Ortega Romero LIMA, 2014 F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007 INTRODUCCIÓN La farmacobotánica es la ciencia que estudia las plantas desde diversos enfoques, ya sea de la botánica pura o aplicada. La botánica pura estudia las plantas desde un enfoque teórico, desde los aspectos de taxonomía y también de la fisiología y la citogenética de los vegetales. La botánica aplicada está basada en lo anterior y también considera los usos prácticos que se le pueden dar a las plantas para lograr su adecuada utilización, que pueden ser disciplinas como la forestal la agrícola, la farmacéutica y la naturista. La Farmacognosia es una ciencia que tiene por objeto el estudio científico de las drogas naturales de origen vegetal y animal, de sus constituyentes químicos, principios activos y productos relacionados. En la presente asignatura se considera como Objetivo General; proporcionar al estudiante los conocimientos básicos, necesarios para el estudio, investigación y manejo con calidad de las plantas y de las drogas naturales utilizadas como recursos terapéuticos. Como objeto específico se tiene en primer lugar que el estudiante desarrolle habilidades y destrezas en el conocimiento de las estructuras internas y externas de las plantas que contribuyan a la identificación de las mismas y en el manejo y utilización de los diferentes Métodos y Técnicas Analíticas para la extracción, aislamiento, identificación y cuantificación de los principios activos responsables de las acciones farmacológicas que se encuentran en las drogas; y en segundo término motivar el interés del estudiante al estudio e investigación de las especies vegetales. Con esta guía se pretende contribuir a un mejor desarrollo de las prácticas. Las autoras. F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2 2007 PRÀCTICAS DE LABORATORIO Semana Práctica Tema Elaboración de diversos cortes y preparados microscópicos para la 1 1 caracterización de las drogas vegetales (Citología). 2 2 Elaboración de diversos cortes y preparados para la caracterización microscópica de las drogas vegetales (Histología). Reconocimiento de los caracteres macroscópicos en las drogas vegetales 3 3 (Morfología). Control Botánico en una especie vegetal peruana. Procedimientos de recolección, selección, secado, almacenamiento y conservación de 4 4 drogas. Análisis de drogas vegetales. Control de calidad de drogas vegetales. Ensayos botánicos, Análisis cualitativo de constituyentes químicos, tamizaje fitoquímico en extracto 5 5 acuoso. Preparación del extracto etanólico. Análisis farmacognóstico y tamizaje fitoquímico preliminar en extractos estandarizados. Método de separación y purificación de drogas vegetales. 6 6 Cromatografía en Capa Fina. Extracción e identificación de carbohidratos simples, oligósidos y 7 polisacáridos a partir de drogas naturales. Reacciones generales y 7 particulares de carbohidratos. 8 Primera evaluación de práctica Reconocimiento de Compuestos fenólicos simples y compuestos 8 9 antraquinónicos. 10 Reconocimiento de flavonoides, antocianinas y taninos. Valoración de 9 taninos en drogas vegetales. 11 10 Extracción y reconocimiento de aceites esenciales. 12 11 Drogas con alcaloides de núcleo tropánico, núcleo indólico, oxindólico y núcleo fenantreno. Extracción ácida-alcalina, identificación, obtención y valoración. Investigación Farmacognóstica de los extractos de la planta medicinal 12 estudiada (Análisis Fitoquímico: Tamizaje fitoquímico, pH, Índice de 13 Refracción, densidad y cromatografía en capa fina). 14 Lípidos, identificación y control de calidad de aceites. 13 15 14 Vitaminas liposolubles e hidrosolubles, extracción, identificación y cuantificación. 16 Segunda evaluación de práctica F-CV3-3B-2 Rev. Junio 3 2007 PRÁCTICA N ° 1 CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA DE LAS DROGAS VEGETALES. CITOLOGÍA: CÉLULA VEGETAL, PARED CELULAR, NÚCLEO Y COMPONENTES PROTOPLASMÁTICOS. MARCO TEÓRICO: El estudio de la estructura interna de las plantas requiere de adecuadas preparaciones microscópicas de muestras que nos permitan la observación detallada de los diferentes tejidos y estructuras vegetales; éstas se elaboran preparando láminas histológicas de diferentes tipos de cortes hechos en plantas. La célula vegetal presenta entre sus principales características una estructura celulósica compleja (pared celular) y diferentes componentes no protoplasmáticos primarios (substancias que se producen como consecuencia del metabolismo primario) y comprenden a los polisacáridos (almidones) así como a los lípidos y proteínas de reserva (aleurona), mientras que los denominadas inclusiones celulares (diversas formas drusas, rafidios, maclas, arenilla cristalífera) constituyen las formaciones cristalinas de oxalatos(diversas formas drusas, rafidios, maclas, arenilla cristalífera);todas estas sustancias tienen su importancia farmacognóstica en la identidad de la droga vegetal. COMPETENCIAS: Capacitar al estudiante para que adquiera habilidad en cortes histológicos en órganos vegetales. Identificar la célula y paredes celulares, los componentes de reserva, almidones y aleurona así como los cristales de oxalato presentes en la célula vegetal. MATERIAL VEGETAL: Solanum tuberosum “papa” (tubérculo) Zebrina pendula “oreja de gato” (hoja) Allium cepa “cebolla” (bulbo) Solanum tuberosum “papa” (tubérculo) Capsicum pendulum “ají amarillo” (fruto) Phaseolus vulgaris“frejol”(fruto y/o semilla) Ficus elástica “caucho” (hoja) Opuntia ficus “tuna” (tallo) Daucuscarota “zanahoria” (raíz) Muestra: raíces, tallos y hojas OTROS MATERIALES: Láminas y laminillas, Papel lente Papel higiénico, Franela limpia Placa petri, gotero, estiletes. Hoja de afeitar nueva. Reactivos: lugol, glicerina, hipoclorito de sodio, safranina, azul de toluidina y otros colorantes Microscopios Cámara Fotográfica F-CV3-3B-2 Rev. Junio 4 2007 PROCEDIMIENTO: Preparación de cortes: Los cortes se realizan a mano alzada, con una hoja de afeitar a) Cortes que comúnmente se hacen en hojas: I. Corte superficial: Se secciona paralelamente a la superficie de la hoja. II. Corte transversal: Se secciona perpendicularmente a la vena media. b) Cortes que comúnmente se hacen en tallos y raíces. - Corte transversal: se hace perpendicular al eje del cilindro del tallo o de la raíz. - Corte longitudinal: se hace Fig. 1. Tipos de corte a mano alzada paralelo al eje del cilindro. Confección de una preparación microscópica: Sobre una lámina portaobjeto se deposita una gota de agua y luego se coloca mediante una pinza o estilete el material a examinar, se recubre el material con una laminilla cubreobjeto. Observación de las preparaciones: Colocar su lámina preparada en la platina del microscopio para su observación, primero con el objetivo de menor aumento (40x) luego en (100x) y después a mayor aumento (400x). Corte transversal de tallo Corte longitudinal Corte paradermal Fig. 2. Tipos de cortes usando colorantes Células de epidermis en Célula pétrea en Cistolito en hoja de catáfilo de cebolla fruto de membrillo caucho Inclusiones celulares Sustancias de reserva: granos de almidón Drusas Rafidios A. Papa Solanum tuberosum, B. Arroz Oryza sativa C. Frijol Phaseolus vulgaris D. Maíz Zea mays E. Esferocristales de inulinaF.Granos de aleurona Fig. 3 Citología e inclusiones citoplasmáticas 2. COLORACIÓN DE LOS CORTES SELECCIONADOS Se usan los cortes más delgados realizados a mano libre o con micrótomo Una vez realizados los cortes, se recogen en una placa petri con agua destilada; se selecciona bajo la lupa los mejores cortes y se trata con hipoclorito de sodio para su clarificación. Se debe lavar varias veces. COLORACIÓN DIRECTA: SAFRANINA TÉCNICA: - Clarificar los cortes con hipoclorito de sodio al 50% hasta que se observen blancos o casi transparentes (según el material). - Lavar varias veces con agua destilada (5-6 veces). - Pasar por alcohol 70º - Colocar con safranina diluida al 15% durante 2-5 minutos según el material - Lavar con agua destilada - Montar en gelatina-glicerina Las paredes secundarias lignificadas se tiñen de color rojo intenso y también la cutícula. Los parénquimas toman color rosado. 3. CITOLOGÍA e INCLUSIONES CITOPLASMÁTICAS A. Realizar cortes transversales muy delgados de la parte carnosa del membrillo o ají. Observe a menor aumento las células pétreas. A mayor aumento, reconocer lapared secundaria lignificada, el lumen y los canalículos porales. B. Realizar un raspado del tubérculo de papa, semilla de frejol y depositarlo en una lámina con una gota de agua, cubrir con la laminilla y observar con el objetivo de mayor aumento. Identifique los diferentes tipos de granos de almidón: simples y compuestos, con sus estratificaciones e hilio excéntrico. A mayor aumento dentro de las células algo redondeadas. Se identifican amiloplastos de formas peculiarmente características luego añadir lugol y señalar lo ocurrido. C. Realizar corte transversal de hoja de sábila y colocar en un portaobjeto, realizar el montaje con una gota de agua.Observe: los rafidios. D. Realice un corte transversal del tallo modificado de tuna o en corte transversal de peciolo de begonia, realice el montaje con una gota de agua.Observe: células isodiamétricas conteniendo un agregado cristalino de aspecto asteroideo: la drusa. E. Realice el corte transversal de la raíz de “zanahoria” y montar con una gota de agua. Observar células de contorno redondeado en cuyo interior presenta pequeños corpúsculos tubulares e irregulares refringentes de color anaranjado (cromoplastos con predominio de carotenoides). F. Corte superficial del envés de las hojas de “oreja de gato” y hacer el montaje respectivo. Observe células de contorno poligonal, unos incoloros y otros de color morado púrpura; dicho color se debe a que el contenido vacuolar (vacuoma) está conformado por antocianinas. RESULTADOS: Hacer esquemas de sus observaciones en la HOJA DE OBSERVACIONES y elaborar el informe de su práctica mediante un PROTOCOLO DE ANÁLISIS BOTÁNICO según Formato. ACTIVIDAD BIBLIOGRÁFICA: 1. ¿En qué consiste la Herborización de muestras vegetales? Desarrolle un mapa conceptual con gráficos o dibujos. 2. Mencione mediante un cuadro 10 plantas medicinales endémicas o nativas del Perú, con los siguientes datos: Nombre Común Nombre Científico Familia Usos Medicinales Título, Autor y año de publicación. 1. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Libros 1. Pérez, E. 1999. Introducción a la Biología Vegetal. Impresiones David, Lima 2. Strasburger. 1994. Botánica. Ediciones Omega S.A. Barcelona. 3. Gola G.; Negri G.; Cappelletti C. 1965.Tratado de Botánica Barcelona, 6. Mostacero, J. Taxonomía de las Fanerógamas. 2002. Útiles del Perú. 1ra. Edición. Lima. 7. Greulach V.; Adams A. 1990. Las plantas: introducción a la botánica moderna. México 9. Reynaud, J. 2002. La flora del farmacéutico. España. Revistas 1. Fieldmuseum: http://fm1.fieldmuseum.org/vrrc/ 2. Flora de China: http://flora.huh.harvard.edu/china/ 3. Raintree's Tropical Plant Database: http://www.rain-tree.com/plistbot.htm#.Ux9nDD95NPI 4. Revista peruana de biología: http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb 5. The Plant List: www.theplantlist.org 6. Trópicos, Missouri Botanical Garden: www.tropicos.org HOJA DE OBSERVACIONES DE PRÁCTICA N ° 1 CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA DE LAS DROGAS VEGETALES. CITOLOGÍA: CÉLULA VEGETAL, PARED CELULAR, NÚCLEO Y COMPONENTES PROTOPLASMÁTICOS. Dibuje o esquematice sus observaciones FECHA:......./.........../........ Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Observación Observación Observación Observación FORMATO: PROTOCOLO DE ANÁLISIS BOTÁNICO Analistas: Nombre común: Nombre científico: TEMA: Fecha: / / FOTOGRAFÍAS DE CORTE ESQUEMA (DIBUJO A MANO FOTOGRAFÍAS PLANTA COMPLETA SIN COLOREAR DE LA OBSERVACIÓN DEL CORTE) Nombre científico: Familia: Tipo de corte Lugar de Origen: Coloración Habitad: Aumento Lugar de recolección: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: PRÁCTICA N° 2 HISTOLOGÍA VEGETAL: Tejidos Meristemáticos, Parenquimáticos, Mecánicos, Protectores, Conductores y Secretores MARCO TEÓRICO: Los tejidos vegetales encargados de la protección de la planta se caracterizan especialmente por carecer de espacios intercelulares y conformar una capa uni o pluricelular en la parte externa del órgano vegetal, se diferencian en su origen primario (Epidermis) o secundario (Peridermis). El tejido mecánico está conformado por elcolénquima,de células vivas y paredes primarias desigualmente engrosadas y el esclerénquima, conformado por célulasmuertas y paredes secundarias lignificadas, uniformemente engrosadas. El xilema es un tejido vascular conformado por células muertas y de paredes secundarias lignificadas con unaserie de engrosamientos característicos.Los diferentes subproductos del metabolismo celular secundario que se producen en las plantas generalmente se encuentran localizados en células y estructuras secretoras en los distintos órganos vegetales, por ejemplo los laticíferos y las cavidades secretoras. Los diferentes órganos vegetales presentan una serie de tejidos vegetales que conforman una estructura interna propia del desarrollo en las plantas, los cuales se describen como parte de la caracterización botánica de las drogas vegetales. TIPOS DE COLÉNQUIMA A Colénquima angular TEJIDO MERISTEMÁTICO B Colénquima laminar CAMBIUM MODELO DE CRECIMIENTO SECUNDARIO C Colénquima anular D Colénquima lagunar HACES CONDUCTORES TEJIDO SECRETOR A Haz conductor colateral cerrado A Bolsa oleífera esquizógena B Haz conductor colateral abierto B Bolsa oleífera lisígena C Canal secretor D Tubo laticífero no articulado ramificado E Tubo laticífero articulado no ramificado TIPOS DE TRICOMAS A Pluricelular B Cónico unicelular C Glandular largo D Glandular corto E Glandular pluricelular F Mixto G Estrellado H Urticante COMPETENCIAS: Reconocer y caracterizar los principales Tejidos Meristemáticos, Parenquimáticos, Mecánicos, Protectores, Conductores y Secretores vegetales de valor diagnóstico. MATERIALES: Material Vegetal - Raíz fresca de Allium cepa “cebolla” - Yemas del tallo de Ricinuscomunis “higuerilla” - Pelargoniumhortorum “geranio” (hoja) - Cucurbita pepo “zapallo” (tallo)o C. maxima “calabaza” - Citrus aurantium “naranja” (fruto) - Ficus elastica “caucho” (pecíolo) - Sambucus peruviana “Saúco” (tallo) - Tallo de Helianthus annus “girasol” - Tallo de Zea mays “maíz” - Tallo de Phoeniculum vulgare “hinojo” - Fruto de Pyrus sp. “pera” - Hojas de Iris florentina “lirio” - Hojas de Nicotina sp. “tabaco”, Malva sp. “malva”, Olea europea “olivo”, Urtica urens “ortiga”. Otros Materiales y Reactivos: Láminas y laminillas, gotero, estiletes Hoja de afeitar nueva, papel lente. Safranina. Lugol, Fast Green, verde Janus, Rojo de metilo, azul de toluidina. Microscopio Cámara fotográfica PROCEDIMIENTO: TEJIDO EPIDÉRMICO: 1. Realizar cortes superficiales o paradermal de la hoja de geranio y de lirio, y en cortes paradermal de hoja de olivo, ortiga, malva, geranio, tabaco hacer el montaje en una gota de agua.Observar células de contorno sinuoso y la posición desordenada de los estomas: Además diferenciar los pelos o Tricomas pluricelularescónicos y los: glandulares en geranio y células ordenadas en lirio, con estomas ordenados. TEJIDO MECÁNICO 2. Realizar cortes transversales del tallo de zapallo o calabaza o hinojo o sauco, hacer el montaje con una gota de safranina y observe: debajo de la epidermis, reconocer células de forma poliédrica, con engrosamiento en los ángulos y débilmente teñidas: Colénquima angular. En las mismas muestras, por debajo del parénquima se presentan células con paredes engrosadas y teñidas intensamente, fibras de Esclerénquima. TEJIDO CONDUCTOR O VASCULAR 3. Realizar cortes longitudinales y transversaldel tallo de girasol,el montaje en una gota de safranina con fast green o verde janus y observe: el xilema formado por las tráqueas con engrosamientos que los tipifican en anillado, espiralado, helicoidal y reticulado. Y los haces vasculares ordenados. TEJIDO SECRETOR 4. Realizar cortes longitudinales del pecíolo de la hoja de caucho, preparar el montaje con una gota de agua y observar: amayor aumento células alargadas conteniendo látex: LATICÍFERO NO ARTICULADO, reconocidos por su contenido de color gris. Y en corte paradermal de cáscara de naranja se observará las cavidades lisígenas, y en pétalo de rosa las células papilosas. ESTRUCTURA INTERNA DE TALLO Y HOJA 5. Realizar cortes transversales en sauco, hacer el montaje en una gota de safranina. A mayor aumento reconocer la estructura secundaria de tallo (dicotiledónea) y los siguientes tejidos: - Peridermis (con vestigios de epidermis) - Cambium vascular - Parénquima cortical clorofiliano - Xilema primario y secundario. - Líber primario (floema esclerosado) - Radios medulares, células de parénquima. - Floema secundario -Médula, células de parénquima incoloro RESULTADOS: Hacer esquemas de sus observaciones en la Hoja de Observaciones y elaborar el informe de su práctica mediante un Protocolo de análisis botánico según Formato. ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA 1. En qué consiste la Taxonomía vegetal, de un ejemplo. 2. Qué función realizan los diferentes tipos de tejidos vegetales, grafique y señale el uso mediante un cuadro. Tipo de Tejido Función Presentes en especies vegetales. Nombre común, científico y Familia. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 1. ALDAVE, A., MOSTACERO, J. 1998. Botánica Farmacéutica, Lima. 2. ANGULO, P., DIAZ, F. 1997. La medicina tradicional en el desarrollo de fitomedicamentos, el enfoque etnofarmacológico. Lima. 3. BRACK E., A. 1999. Diccionario enciclopédico de las plantas útiles del Perú. Edit. PNUD – CBC, Cusco – Perú. 4. CASTILLO, E. 2007. Manual de Fitoterapia. Primera Edición. Editorial Elsevier. Barcelona. 5. CULTURAL. 2005. Atlas de Botánica: El Mundo de las Plantas. USA. 6. DIAZ, T. 2004. Curso de Botánica. 7. ESAU, K. 2008. Anatomía vegetal. Tercera Edición. Editorial Omega. Barcelona. 8. FAHN, A. 1994. Anatomía vegetal. Edit. Blume, Madrid. 9. FONT QUER, Pío 1993. Diccionario Botánica, Edit. Labor, Barcelona. OBSERVACIONES DE LA PRÁCTICA N° 2 HISTOLOGÍA VEGETAL: Tejidos Meristemáticos, Parenquimáticos, Mecánicos, Protectores, Conductores y Secretores Dibuje o esquematice sus observaciones FECHA:......./.........../........ Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Tipo de corte: Observación Observación Observación Observación PRÁCTICA N° 3 MORGOLOGÍA VEGETAL (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y semilla) MARCO TEÓRICO: La morfología estudia los órganos de la planta y las partes que los forman. Estos órganos son la raíz, el tallo y las hojas que llamamos órganos vegetativos y la flor y el fruto, que son los órganos reproductivos. Las raíces se pueden clasificar de acuerdo a su origen, al medio en que viven por su forma, por su duración y por su consistencia.A diferencia de las raíces, el tallo presenta geotropismo negativo, tiene nudos (lugares donde se originan las hojas) y entrenudos (regiones entre dos nudos consecutivos), yemas (áreas del tallo situadas justo por encima del punto de inserción de la hoja apical y axilares) y por lo común hojas bien desarrolladas.Sus funciones básicas son de soporte, de conexión de hojas y yemas entre sí y con la raíz y de conducción de la savia. Las funciones primordiales de las hojas son la fotosíntesis (cloroplastos) y el intercambio gaseoso (estomas), también asume las de protección, defensa, reserva y reproductora. Las hojas se clasifican por el borde de la hoja, la forma del limbo, peciolo, vaina y nervadura. La flor es un brote de crecimiento definido con hojas que producen órganos reproductores. De estas hojas, las más apicales o internas son esporófilos y las más inferiores o externas son antófilos.Se llama inflorescencia a una ramificación terminada en flores. Cada una de las ramitas del eje primario o caquis, que sostiene una flor, se llama pedicelo. Cuando solo existe una flor en el ápice del tallo o en la axila de una hoja, no hay inflorescencia y entonces se dice que la flor es solitaria, el tipo de inflorescencia tiene importancia para la taxonomía botánica; es característico de cada familia. El fruto es el conjunto de las piezas florales que persisten después de la fecundación y acompañan a la semilla generalmente se dice que es el ovario desarrollado y maduro ya que este se engruesa acumulando materias nutritivas y se transforman en fruto y contiene la semilla. La semilla es el medio principal para perpetuar de generación en generación la mayoría de las plantas (ya que algunas se regeneran vegetativamente) y gran parte de las especies leñosas. COMPETENCIAS: Reconocer y caracterizar los principales órganos de la planta (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y semilla) MATERIALES: Diferentes tipos de (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y Semilla) Lupas Hoja de afeitar Reglas Placas Petri PROCEDIMIENTO: Identificar según las características morfológicas los tipos de raíz, tallo, hoja, flor, fruto y semilla. TALLO RAÍZ TIPOS DE RAÍZ TIPOS DE RAÍZ HOJAS FLOR INFLORESCENCIA FRUTO SEMILLA RESULTADOS: Hacer esquemas de sus observaciones en la Hoja de Observaciones y elaborar el informe de su práctica mediante un Protocolo de análisis botánico según Formato PROTOCÓLO BOTÁNICO. ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÒN BIBLIOGRÀFICA 1. De 2 ejemplos de Raíces, Hojas, Tallos, Flores, Frutos y Semillas con usos medicinales mediante un cuadro. Nombre Común Nombre Científico Órgano de la planta Uso medicinal Referencias Bibliográficas 1. The Plant List: www.theplantlist.org 2. The Plants Database: http://plants.usda.gov/java/ 3. Trópicos, Missouri Botanical Garden: www.tropicos.org 4. Asociación Latinoamericana de Botánica: http://www.botanica-alb.org/links.php 5. Real Jardín Botánico: http://www.rjb.csic.es/jardinbotanico/jardin/index.php?Cab=111&len=es OBSERVACIONES DE LA PRÁCTICA N° 3 MORGOLOGÍA VEGETAL (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y Semilla) Dibuje o esquematice sus observaciones FECHA:......./.........../....... Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de Raíz Tipo de Raíz Tipo de Raíz Tipo de Raíz Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de Tallo Tipo de Tallo Tipo de Tallo Tipo de Tallo Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de hoja Tipo de hoja Tipo de hoja Tipo de hoja Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de Flor Tipo de Flor Tipo de Flor Tipo de Flor Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de Fruto Tipo de Fruto Tipo de Fruto Tipo de Fruto Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tipo de Semilla Tipo de Semilla Tipo de Semilla Tipo de Semilla Observación Observación Observación Observación PRÁCTICA N° 4 CONTROL BOTÁNICO EN UNA ESPECIE VEGETAL PERUANA A INVESTIGAR MARCO TEÓRICO: Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en desarrollo. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos (Akerele, 1993; Sheldon et al., 1997; Shrestha y Dhillion, 2003; Katewa et al., 2004). De acuerdo a la OMS (1979) una planta medicinal es definida como cualquier especie vegetal que contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos terapéuticos o cuyos principios activos pueden servir de precursores para la síntesis de nuevos fármacos. Estas plantas también tienen importantes aplicaciones en la medicina moderna. Entre otras, son fuente directa de agentes terapéuticos, se emplean como materia prima para la fabricación de medicamentos semisintéticos más complejos, la estructura química de sus principios activos puede servir de modelo para la elaboración de drogas sintéticas y tales principios se pueden utilizar como marcadores taxonómicos en la búsqueda de nuevos medicamentos (Akerele, 1993). La investigación sobre el uso de plantas medicinales forma parte de la etnobotánica, que ha sido definida como el estudio de las interrelaciones entre los grupos humanos y las plantas (Ford, 1978; Martin, 2001; Gómez-Veloz, 2002). Por su naturaleza interdisciplinaria abarca muchas áreas, incluyendo: botánica, química, medicina, farmacología, toxicología, nutrición, agronomía, ecología, sociología, antropología, lingüística, historia y arqueología, entre otras; lo cual permite un amplio rango de enfoques y aplicaciones (Alexiades, 1996a; Martin, 2001) A pesar de todas estas innovaciones, Zent (1999) plantea que la filosofía de la etnobotánica no ha cambiado mucho, pues en la mayoría de las investigaciones sobre plantas medicinales se sigue enfatizando la documentación científica de las plantas y sus usos para beneficio casi exclusivo de grandes transnacionales, con poco interés en la dinámica de los sistemas de conocimiento local y en la compensación a las comunidades nativas. Se requiere entonces de más trabajo interdisciplinario, de una mayor preocupación por los aspectos éticos de la comercialización de medicamentos desarrollados a partir del conocimiento tradicional de ciertos grupos humanos (Prance, 1991) y por el retorno de los resultados obtenidos, en ensayos biológicos de plantas tropicales, a los países y grupos humanos que han colaborado en la colección de las plantas evaluadas (Ritcher y Carlson, 1998). COMPETENCIAS: - Realizar el análisis Botánico Macroscópico de la especie vegetal a investigar, Reconociendo morfológicamente los diferentes órganos de la especie. - Reconocer y caracterizar los principales órganos de la planta a nivel microscópico mediante cortes histológicos (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y semilla) con ayuda de la histoquímica. - Realizar el análisis organoléptico de los diferentes órganos de la especie vegetal. MATERIALES: Especie vegetal a investigar conlosórganos de Láminas y laminillas, gotero, estiletes laespecie a investigar . Hoja de afeitar nueva, papel lente. Lupas Safranina. Lugol, Fast Green, verde Janus, Rojo Hoja de afeitar de metilo, azul de toluidina, hipoclorito de Sodio, Reglas Etanol al 50% y agua destilada. Placas Petri Microscopio Cámara Fotográfica PROCEDIMIENTO: 1. Realizar el Análisis Macroscópico, organoléptico (olor, sabor, color, textura) de los diferentes órganos de la especie. Tabla Nro. 1. Análisis macroscópico, características organolépticas de Raíz, Tallo, Hoja, Flor, Fruto y Semilla Carácter Organoléptico Órgano Color Olor Sabor Textura Otras de la especie Observaciones Raíz Tallo Hoja Flor Fruto Semilla 2. Realizar el análisis microscópico de la especie vegetal a estudiar con ayuda de la histoquímica y identificar los diferentes tipos de tejido presentes en la especie. Tabla Nro. 2. Análisis microscópico, Citología e Histología de Raíz, Tallo, Hoja, Flor, Fruto y Semilla Órgano de la Tipo de Corte Histoquímica Observación Especie (Técnica de Tinción) vegetal Raíz C.T. Fresco, Safranina y Lugol Tallo C.T. Fresco, Safranina y verde Janus C.L. Fresco, Safranina y verde Janus Hoja C.P. Fresco, Safranina y Lugol C.T. Fresco, Safranina y verde Janus Flor C.L. Fresco, Safranina C.P. Lugol Fruto C.P. Fresco, C.T. Safranina y Lugol Semilla Raspado Fresco y Lugol ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÒN BIBLIOGRÀFICA 1. Desarrolle un Flujograma de las etapas para realizar un estudio Botánico en especies vegetales con uso medicinal. Referencias Bibliográficas 1. SORIA, R., CARHUAPOMA, M. 2005. Manual de prácticas de Botánica General y Sistemática. Lima 2. SOUKUP, J. 1971. Vocabulario de Nombres Vulgares de Plantas Peruanas, Ed. Salesiana, Lima. 3. STRASBURGER, E. NOLL, F. 2004. Tratado de Botánica. 35ª ed. Ediciones Omega. Barcelona. 4. THOMAS-DOMÉNECH, J.M. 1997. Atlas Temático de Botánica. Barcelona. 5. TOSCO U. 1993 Atlas de Botánica. Edit. Barcelona. 6. VALDIZAN H.; MALDONADO A. 1922. La Medicina Popular Peruana Imp. Torres Aguirre, Lima. 7. VALLA, J. 2011. Botánica. Morfología de las plantas superiores. Primera Edición. Editorial Hemisferio Sur. 8. VENTURA, O. 2010. Las Plantas Aromáticas y Medicinales. Primera Edición. Lima 9. VILLAR, U. 2004. Fitoterapia. Primera Edición. Editorial Acribia. Zaragoza 10. WEBERBAUER A. 1945. El Mundo Vegetal de los Andes Peruanos. Ministerio de Agricultura. Lima. 11. Flora de China: http://flora.huh.harvard.edu/china/ 12. Journal of Natural Products: http://www.journalofnaturalproducts.com/ 13. Nature Medicine: http://www.nature.com/nm/index.html 14. Phytochemistry: http://www.journals.elsevier.com/phytochemistry/ 15. Raintree's Tropical Plant Database: http://www.rain-tree.com/plistbot.htm#.Ux9nDD95NPI 16. Revista peruana de biología: http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/rpb 17. Revistas de investigación UNMSM: http://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/ OBSERVACIONES DE LA PRÁCTICA N° 4 CONTROL BOTÁNICO DE LA ESPECIE VEGETAL MEDICINAL MORGOLOGÍA VEGETAL CITOLOGÍA e HISTOLOGÍA, (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y Semilla), Dibuje o esquematice sus observaciones FECHA:......./.........../........ Muestra Muestra Muestra Muestra Raíz Raíz Raíz Raíz Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Tallo Tallo Tallo Tallo Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra hoja hoja hoja hoja Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Flor Flor Flor Flor Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Fruto Fruto Fruto Fruto Observación Observación Observación Observación Muestra Muestra Muestra Muestra Semilla Semilla Semilla Semilla Observación Observación Observación Observación PRÁCTICA N° 5 CONTROL DE CALIDAD DE DROGAS VEGETALES. ENSAYOS BOTÁNICOS, ANÁLISIS CUALITATIVO DE CONSTITUYENTES QUÍMICOS, TAMIZAJE FITOQUÍMICO EN EXTRACTO ACUOSO. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO. MARCO TEÓRICO: Las plantas a nivel mundial ocupan un lugar importante en el comercio de medicamentos y en los preparados fitoterapéuticos y por ende es necesario garantizar su control de calidad con aplicaciones de técnicas modernas y el uso de patrones adecuados que den seguridad y eficacia al utilizarlas. Las Farmacopeas describen métodos de ensayos generales para evaluar o valorar las drogas oficiales. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha recomendado la realización de monografías y la implantación de normas o especificaciones de calidad, basadas en la experiencia de cada país, para aquellas drogas no incluidas en las Farmacopeas y que son ampliamente utilizadas en Medicina Tradicional. Para evaluar o valorar las drogas es necesario identificarlas y determinar su calidad y pureza, lo cual se traduce en su valor intrínseco, o lo que es lo mismo, en la cantidad de principios activos presentes en ella. Los ensayos botánicos son importantes y se deben realizar al inicio de la investigación de la planta medicinal para determinar su identificación taxonómica y tener la certeza de la planta a investigar. Plantas medicinales Medicamento Materia prima (Fórmula magistral) CONTROL Seguridad y eficacia Identidad Calidad El Control de Drogas Vegetales involucra: Ensayos Botánicos: Control de identidad: Determinación de sus características macroscópicas y microscópicas. Determinación cualitativa de sus principios activos (histoquímico). Control de calidad: Determinación cualitativa de sus principios activos. Cuantificación de sus principios activos. Otras determinaciones cuantitativas Determinación de su actividad farmacológica. Estos ensayos se realizan de acuerdo a las Farmacopeas. COMPETENCIAS: -Realizar el análisis botánico macroscópico de la especie vegetal a investigar, reconociendo morfológicamente los diferentes órganos de la especie. -Reconocer y caracterizar los principales órganos de la planta a nivel microscópico mediante cortes histológicos (Raíz, Tallo, Hojas, Flor, Fruto y semilla) con ayuda de la histoquímica. -Realizar el análisis organoléptico de los diferentes órganos de la especie vegetal. -Preparar el extracto acuoso y etanólico de la especie a investigar para hacer los análisis cualitativos correspondientes. MATERIALES: Especie vegetal a investigar con los órganos de la especie a investigar. Lupas Hoja de afeitar Reglas Placas Petri Láminas y laminillas, gotero, estiletes Hoja de afeitar nueva, papel lente. Safranina. Lugol, Fast Green, verde Janus, Rojo de metilo, azul de toluidina, hipoclorito de Sodio, Etanol al 50% y agua destilada. Microscopio Reactivos para el análisis cualitativo. (tamizaje fitoquimico) PROCEDIMIENTO: 1. Realizar el Análisis macroscópico, organoléptico (olor, sabor, color, textura) de los diferentes órganos de la especie. Tabla Nro. 1. Análisis macroscópico, características organolépticas de Raíz, Tallo, Hoja, Flor, Fruto y Semilla Carácter Organoléptico Órgano Color Olor Sabor Textura Otras de la especie Observaciones Raíz Tallo Hoja Flor Fruto Semilla 2. Hacer el Análisis microscópico de los diferentes órganos de la especie y de la droga vegetal. 3. Identificar los principios activos en los cortes histológicos mediante reacciones histoquímicas. Tabla Nro. 2. Análisis microscópico, Citología e Histología de Raíz, Tallo, Hoja, Flor, Fruto y Semilla Órgano de la Tipo de Corte Histoquímica Presencia de Principios Activos Especie (Técnica de Tinción) (- Negativo, + leve, vegetal ++ moderado y +++ abundante) Raíz C.T. Fresco, Safranina y Lugol Tallo C.T. Fresco, Safranina y Tricloruro de Hierro Hoja C.P. Fresco, Safranina y Tricloruro de Hierro Fresco, Safranina y Tricloruro de C.T. Hierro Flor C.P. Fresco, Safranina Fruto C.P. Fresco, Safranina y Lugol C.T. Fresco, Safranina y Lugol Semilla Raspado Fresco y Lugol Preparación del extracto acuoso y etanólico de la especie a investigar para hacer los análisis cualitativos correspondientes: 1. Preparar el extracto acuoso de 20 g de la especie medicinal en 100 mL de agua destilada y llevar a decocción en BM por 15 minutos y realizar el tamizaje fitoquímico. 2. Preparar con 20 g de la especie medicinal el extracto etanólico en 100 mL (etanol de 96°) en maceración por 7 días para realizar el tamizaje fitoquímico. TAMIZAJE FITOQUÍMICO El tamizaje fitoquímico o “Screening fitoquímico” es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos de la planta, a partir del cual se puede orientar las extracciones y/o el fraccionamiento de los extractos eligiendo los grupos de mayor interés para el investigador. EXTRACTO ACUOSO: CARBOHIDRATOS: - Reacción de Molisch Gotas de muestra problema + gotas de S. R. de Molisch “A” (alfa naftol 2% en alcohol), agitar + H2SO4 conc. por las paredes del tubo…anillo color violeta. (+) para carbohidratos (azúcares). - Reacción de Antrona Gotas de muestra problema + gotas de S.R. de Antrona (antrona en H2SO4 conc. al 2%) …anillo verde. (+) para carbohidratos (azúcares). -Reacción de Fehling Gotas de muestra problema + gotas de S.R. Fehling A + gotas S. R. Felhing B+ calor por 5-7 minutos en baño maría…pp color rojo ladrillo. (+) para carbohidratos (azúcares reductores). -Reacción de Benedict Gotas de muestra problema + gotas de S.R. de Benedict + calor por 5-7 minutos en baño maría…pp color rojo ladrillo. (+) para carbohidratos (azúcares reductores). -Reacción de Brown Gotas de muestra problema + gotas de S.R. Hidróxido de sodio al 10% + calor hasta obtener coloración amarilla, luego agregar 1 gota de + ácido pícrico 2%, se obtendrá una coloración parda por formación de ácido picrámico. (+) para carbohidratos (azúcares reductores). Compuestos fenólicos: Gotas de muestra problema + gotas de FeCl3 (Sol. al 1% en agua o alcohol) …color verde o azul. (+) presencia de compuestos fenólicos, taninos. TANINOS: -Reacción de Gelatina Gotas de muestra problema + gotas de S.R. gelatina…pp blanco (+) Taninos -Reacción de Agua de Bromo Gotas de muestra problema + gotas de agua de bromo…pp. taninos condensados y no pp taninos hidrolizables. (+) Taninos AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS -Reacción de Ninhidrina Gotas de muestra problema + S.R. de Ninhidrina (Ninhidrina al 1% en etanol) + calor BM 10 minutos…color violáceo. (+) Para aminoácidos libres y amino grupos (calentar en algunos casos). FLAVONOIDES -Reacción de Shinoda Gotas de muestra problema + S.R. Shinoda (Mg metálico + gotas de HClconc). … color rojo. (+) presencia de flavonoides, chalconas, auronas; catequina e isoflavona no dan color. ESTEROIDES Y/O TRITERPENOIDES -Reacción de Lieberman-Burchard Gotas de muestra problema + S.R. de Lieberman-Burchard (gotas de cloroformo + gotas de anhídrido acético + gotas de H2SO4 conc)….color verde, azul, naranja, rojo. (+) presencia de esteroides y triterpenoides. QUINONAS -Reacción de Borntrager Gotas de muestra problema + S.R. Borntrager (gotas de hidróxido de sodio 5%)…color rojo. (+) quinonas ALCALOIDES -Reacción de Dragendorff Gotas de muestra problema + gotas de S.R. Dragendorff… pp naranja o rojo naranja (+) alcaloides (medio ligeramente ácido). -Reacción de Mayer Gotas de muestra problema + gotas de R. Mayer…pp. blanco.(+) alcaloides -Reacción de Sonnenschein Gotas de muestra problema (+) alcaloides -Reacción de Bertrand Gotas de muestra problema + gotas de S.R. Bertrand… pp blanco (+) alcaloides ANTOCIANINAS -Reacción de Rosenheim Gotas de muestra problema + gotas de S.R. Rosenheim (S.R. Yodo Yodurada)…rojo oscuro. (+) antocianinas y flavonoides catéquicos. GRUPO CARBONILO -Reacción de Hidroxilamina Gotas de muestra problema + gotas de S.R. hidroxilamina…pp coloreado (+) presencia de grupo carbonilo. SAPONINAS -Reacción para Saponinas 1 g de muestra problema + 10 mL de agua destilada. Agitar fuertemente por 1 minuto…producción de espuma por 15 minutos de 0.5 a 1 cm (+) presencia de saponinas. GLICÓSIDOS .-Reacción de Vainillín sulfúrico Gotas de muestra problema + gotas de S.R. Vainillín sulfúrico…color rojizo violáceo en anillo de interfase. (+) Glicósidos. **Los resultados de los tamizajes fitoquímicos nos dan una referencia de la composición química de un planta que se está investigando (no es determinante), lo cual nos ayudará a profundizar en la investigación al realizar el fraccionamiento y el aislamiento de los constituyentes químicos. ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÒN BIBLIOGRÀFICA 1. Que análisis según las Farmacopeas se realizan para el Control de Calidad de Productos Fitoterapeúticos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Libros: 1. Bruneton, J. Farmacognosia – Fitoquímica – Plantas Medicinales. 3ra. Ed. Acribia, Zaragoza, España 2001. 2. Treasse, G., Evans, W. Pharmacognosy. Ed. BailliereTindall, Londres 1994. 3. Reynaud, Joël. La flora del farmacéutico. España, 2002. 4. Lock de Ugaz O. Colorantes naturales. 1ra Edición. Lima, 1997. 5. USP, Pharmacopeia, National Formulary (USP NF).XVII, XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIX, XXX. Revistas Journal of Natural Products – USA Lloydia – Asoc. Americana de Farmacognosia de USA. Pharmacognosy Titles – Londres – Inglaterra Phytochemistry – Londres - Inglaterra Biblioteca virtual EBSCO HOST ResearchDatabases(http://search.ebscohost.com/) Journal of Analytical Chemistry Chemical Biology & Drug Desig RESULTADOS DE LA PRÁCTICA Nro. 5 A. Realice el análisis organoléptico: Color: Olor: Sabor: B. Complete el Cuadro según las Reacciones del Tamizaje fitoquímico MUESTRA PROBLEMA REACCIÓN RESULTADOS TIPO DE AZUCAR LEYENDA: (-) Nulo (-) poco (+) Leve (++) moderado (+++) abundante PRÁCTICA N° 6 ANÁLISIS FARMACOGNÓSTICO Y TAMIZAJE FITOQUÍMICO PRELIMINAR EN EXTRACTOS ESTANDARIZADOS (EXTRACTO ETANÓLICO) MÉTODO DE SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE DROGAS VEGETALES (CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA) MARCO TEÓRICO: EXTRACTO ESTANDARIZADO Y TAMIZAJE FITOQUÍMICO Muchos principios activos presentan una estructura química perfectamente definida, mientras que otros, al formar parte de mezclas complejas resulta difícil determinar cuál es el compuesto activo. La Extracción obtiene porciones medicinalmente activas a partir de los tejidos de las plantas y animales, de los componentes inertes de los mismos, mediante el uso de solventes selectivos, utilizando procedimientos establecidos y correctamente estandarizados. Para poder realizar el aislamiento de un principio natural en condiciones óptimas, se debe tener en cuenta una serie de dificultades, inherentes a la propia planta o materia prima como al tipo de compuesto a extraer. Por esta razón la planta se somete a una serie de operaciones previas que facilitan y mejoran el rendimiento de la extracción. Existen una serie de métodos que han sido desarrollados y aplicados para una detección de los diferentes constituyentes químicos en las plantas, basadas en la extracción de éstos con solventes apropiados y en la aplicación de pruebas de coloración o precipitación llamado Tamizaje Fitoquímico. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF o TLC) La cromatografía en capa fina (en inglés thinlayerchromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla que permite: • Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación. • Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia. • Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado. • La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclado (eluyente o fase móvil).A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente. Fig. 1. Preparación de la Cromatografía en Capa Fina COMPETENCIAS: - Realizar el Tamizaje Fitoquímico en el extracto etanólico de la especie a investigar. - Realizar el análisis cualitativo mediante método de separación: Cromatografía en Capa Fina. MATERIALES: Extracto etanólico de la Especie vegetal a investigar. Reactivos para el análisis cualitativo (Tamizaje Fitoquímico) Reactivos para el análisis cualitativo (Cromatografía en Capa Fina) PROCEDIMIENTO: 1. Prueba de solubilidad frente a diferentes solventes de menor a mayor polaridad. Filtrar el extracto el extracto etanólico del método de maceración de 5 a 7 días y colocar 1 mL del extracto fluido o filtrado en cada tubo de vidrio, luego llevarlo a Baño María hasta sequedad. Agregar 1 mL del solvente de menor a mayor polaridad (agua destilada, etanol, metanol, acetato de etilo, cloroformo, diclorometano y éter de petróleo) sobre cada tubo del extracto seco. Agitar por 5 minutos hasta disolver el extracto y anotar los resultados. 2. Tamizaje Fitoquímico en el extracto etanólico. Realizar el tamizaje fitoquímico haciendo uso de Reactivos de coloración y precipitación para identificar la presencia de los principios bioactivos presentes en el extracto y anotar los resultados en el Cuadro correspondiente. 3. Análisis cualitativo mediante método de separación: Cromatografía en Capa Fina. - Proceder a colocar el sistema de solvente (acetato de etilo: metanol: agua (100:13.5:10) o Cloroformo: metanol (3:1), colocar una tira de papel filtro para crear el sistema, tapar la cuba. - Sembrar el extracto etanólico con ayuda de capilares en los cromatofolios de silica gel F254 en capa de aluminio, luego colocarla placa en la cuba cromatográfica, observar en luz visible, luz ultravioleta, anotar sus observaciones y luego proceder a revelar la placa con solución etanolica de Cloruro férrico, vainillin sulfúrico o vapores de Iodo. - Calcular el Rf: La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y) Fig. Cálculo del Rf TAMIZAJE FITOQUÍMICO METABOLITO REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA Molish X gotas de MP+ III gotas de Molish agitar+ III Anillo violeta (alfa naftol 2% en alcohol) gotas de H2SO4 CC Antrona X gotas de MP + III gotas de Antrona Coloración verde CARBOHIDRATOS (antrona en H2SO4 cc al 2% ) Fehling (A: CuSO4; B: tartrato mixto X gotas de MP + III gotas de Fehling A+ III Coloración rojo ladrillo de potasio y sodio gotas de Fehling B + calentar en B.M (KNaC4H4O6·4H2O)) COMPUESTOS FeCl3 X gotas de MP + III gotas de FeCl3 10 % Coloración verde o azul FENÓLICOS TANINOS Gelatina X gotas de MP + III gotas de gelatina Precipitado denso blanco Chalconas, auronas, isoflavanonas: No hay coloración. X gotas de MP + 1-2 virutas de Mg metálico + FLAVONOIDES Shinoda Isoflavanonas: Amarillo rojizo. III gotas de HCl cc Flavanonoles: Rojo a magenta. Flavonas y flavonoles: Amarillo a rojo ANTOCIANINAS Y Rosenheim FLAVONOIDES X gotas de MP + III gotas de Rosenheim Coloraciónrojo oscuro (Sol. Yodo Yodurada) CATÉQUICOS AMINOÁCIDOS X gotas de MP + III gotas de ninhidrina + LIBRES Y GRUPOS Ninhidrina(0.1% en etanol) Coloración violácea calentar en B.M 10 min. AMINO Dragendorff X gotas de MP + evaporar el solvente B.M + V Precipitadonaranja (yoduro potásico- bismútico ) gotas de HCl 10%+ III gotas de Dragendorff Mayer (yoduro potásico X gotas de MP + evaporar el solvente B.M + V Precipitado blanco mercúrico) gotas de HCl 10%+ + III gotas de Mayer ALCALOIDES Bertrand (ácido silíco- X gotas de MP + evaporar el solvente B.M + V Precipitado blanco túngstico) gotas de HCl 10%+ + III gotas de Bertrand Sonnenschein X gotas de MP + evaporar el solvente B.M + V Precipitado amarillo-verdoso (ácido fosfomolíbdico) gotas de HCl 10%++ III gotas de Sonnenschein NAFTAQUINONAS, Borntrager ANTRAQUINONAS X gotas de MP + III gotas de Borntrager Coloraciónroja (NaOH 5%) Y ANTRANONAS X gotas de MP + llevar a sequedad en B.M + TRITERPENOIDES X gotas de cloroformo+ III gotas de anhídrido Esteroides: verde-azul Lieberman-Burchard Y ESTEROIDES acético+ H2SO4 cc en zona (por las paredes de Triterpenoides: rojo-naranja tubo) sin agitar. 1 mL de MP + 5 mL de agua destilada + agitar Formación de 0.5 a 1 cm de SAPONINAS Generación de espuma fuertemente por 1 min. espuma estable por 15 min. X gotas de MP + V gotas de ácido pícrico 1 % GLICÓSIDOS Baljet Coloración anaranjada + V gotas de NaOH al 5 %. X gotas de MP + V gotas de denitroprusiato LACTONAS Legal Coloración rojo oscuro de sodio 0.5% + V gotas de KOH 2N. X gotas de MP + papel humedecido con NH4OH cc ó CUMARINAS NH4OH cc ó NaOH 10% en boca de tubo + Fluorescencia celeste NaOH 10% calentar por 5 min a ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA 1. Que reacciones químicas se dan en el Tamizaje Fitoquímico. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Villar del Fresno, A. Farmacognosia General. Ed. Síntesis, SA. Madrid, España 1999. 2. Treasse, G., Evans, W. Pharmacognosy. Ed. BailliereTindall, Londres 1994. 3. Gattuso, Gattuso. Manual de Procedimientos para el Análisis de Drogas en Polvo. 1ra ed. Argentina: Editorial Universidad Nacional de Rosario Urquiza.1999. 4. Bruneton, J. Farmacognosia, Fitoquímica, Plantas medicinales 2ª Ed. Acribia, Zaragoza, España. 2001. 5. Kuklinski, C. Farmacognosia, Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Ed. Omega, Barcelona, España 2003. 6. Sharapin N. Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos Santa fe Bogota Colombia 2000. 7. Miranda M. Métodos de Análisis de Drogas y Extractos, Habana Cuba 2002. 8. Lock de Ugaz. Investigación Fitoquímica, Métodos en el estudio de productos naturales [en línea]. Perú: Editorial Pontificia Universidad Católica del Perú; 1994. [Fecha de acceso 27 de junio de 2013]. URL disponible en: http://books.google.com.pe/books?id=N36g2QOccXkC&pg=PA287&dq=prueba+con+dragendorff&hl= es&sa=X&ei=d7bNUazRHsjX4AS9oYBQ&ved=0CEAQ6AEwBA#v=onepage&q=prueba%20con%20d ragendorff&f=false. PROTOCOLO RESULTADOS DE LA PRÁCTICA Nro. 6 Prueba de solubilidad Solventes Extracto seco (mg) Agua destilada Etanol Metanol n-butanol Acetato de etilo Diclorometano Cloroformo Eter de petróleo LEYENDA: (-) Insoluble (+) ligeramente soluble (+++) Soluble (+++) Muy soluble Tamizaje fitoquímico CAMBIOS RESULTADOS METABOLITO REACCIÓN OBSERVADOS CARBOHIDRATOS Fehling O AZUCARES COMPUESTOS FeCl3 FENÓLICOS TANINOS Gelatina FLAVONOIDES Shinoda AMINOÁCIDOS LIBRES Y GRUPOS Ninhidrina AMINO Dragendorff ALCALOIDES Mayer Bertrand NAFTAQUINONAS, ANTRAQUINONAS Y Borntrager ANTRANONAS TRITERPENOIDES Y Lieberman-Burchard ESTEROIDES SAPONINAS Generación de espuma LEYENDA: (-) Nulo (-) poco (+) Leve (++) moderado (+++) abundante Huella Cromatográfica Preparación de muestra: Pesar 0.1 g de extracto seco y solubilizar en 5 mL de solvente (o sembrar el filtrado del extracto). Fase estacionaria: Sílica gel Fase móvil: Detección O Revelador: Esquema de resultado Calculo de Rf INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: PRÁCTICA N° 7 EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS SIMPLES Y OLIGÓSIDOS A PARTIR DE DROGAS NATURALES. REACCIONES GENERALES Y PARTICULARES DE CARBOHIDRATOS MARCO TEÓRICO: Glúcidos o azúcares, son compuestos orgánicos constituidos por carbono, hidrógeno y oxígeno. Constituyen la clase de compuestos que se encuentran en las plantas en mayor cantidad. Son aldehídos o cetonas polihidroxilados; bajo peso molecular, tienen muchas propiedades en común: son alifáticos, ópticamente activos, de sabor dulce, muy solubles en agua. Difíciles de cristalizar aún cuando estén puros. Son importantes en el metabolismo vegetal, son fuente de energía en forma de almidones, sirven para el transporte de energía en forma de sacarosa, intervienen en la formación de paredes celulares (celulosa) y destacan en el aspecto ecológico por medio de la relación planta – animal. Se pueden detectar en cantidades muy pequeñas, por medio de reactivos cromógenos. Detectados por cromatografía CCF, usando reactivos que contienen fenoles o aminas, como el resorcinol con ácido sulfúrico o el ftalato de anilina.La CCF y CP, son sustituidos de preferencia por otras técnicas de separación, la CC de baja presión, HPLC, cromatografía de gases o electroforesis. Los azúcares no reductores no funcionan con estos reactivos y generalmente se detectan por su rápida oxidación con per yodato o tetra acetato de plomo. MONOSACÁRIDOS osas simples OLIGOSACÁRIDOS menos de 10 osas HOLÓSIDOS HOMOGÉNEOS varias osas osas iguales POLISACÁRIDOS más de 10 osas HETEROGÉNEOS osas diferentes HETERÓSIDOS osa + aglicón Clasificación de Carbohidratos DROGAS QUE CONTIENEN CARBOHIDRATOS -Disacáridos: Sacarosa, lactosa. -Polisacáridos: Almidones, dextranos, celulosa, pectinas. -Gomas: Goma arábica, goma tragacanto, goma guar. -Mucílagos: Agar, carragaen, alginatos, algas marinas de la costa patagónica. -Monosacáridos y derivados: Glucosa, fructosa, manitol, sorbitol, xilitol, lactulosa. COMPETENCIAS: Capacitar al estudiante para que adquiera habilidad de realizar el análisis cualitativo y el Tamizaje Fitoquímico en el extracto etanólico de la especie a investigar y en drogas vegetales para determinar la presencia de los Carbohidratos. Identificar y diferenciar los carbohidratos. MATERIALES y REACTIVOS: Extracto etanólico de la Especie vegetal a investigar. Reactivos para el análisis cualitativo (Tamizaje Fitoquímico:Molish, Antrona, Fehling, Benedict, Tollens, Selivanoff, NaOH, Fenilhidrazina, Yodo 2.5%, H2SO4 cc, KOH 5%, Etanol absoluto, Ba(OH)2 10%, HCl diluido, Acetato de plomo neutro y básico, lugol) Otros materiales necesarios (Tubos de ensayo, gradillas, embudo, cocinilla, beackers grande y chicos, baguetas, goteros, pipetas, papel filtro, capsula de porcelana, mechero y balanza) Miel de abeja, Azúcar, Papa, Algodón, Manzana, Linaza PROCEDIMIENTO: 4. Preparación de las muestras Problema 2.1 Especie a Investigar: Filtrar el extracto hidroalcohólico al 10 o 20% P/V macerado de 7 días de hojas, tallos o semillas de la especie a investigar. Si es muy concentrado diluir 1:10 ml con el solvente donde es soluble el extracto. 2.2 Las Muestras Problemas conteniendo los diferentes tipos de Carbohidratos PROCEDIMIENTO Muestra Problema Azúcar Disolver 2 g en 20 mL de agua destilada Miel de abeja Disolver 2 g en 20 mL de agua destilada Papa (ALMIDON) Rallar el tubérculo en un beacker conteniendo agua, luego exprimir a través de la gasa, recogiendo el líquido en un beacker, dejar sedimentar y lavar por decantación varias veces. Utilizar la solución de almidón de papa para las reacciones. Algodón (CELULOSA) Sin tratamiento Manzana (PECTINAS) Pesar 2 g de manzana trozada o rallada, secar en estufa x 15 min a 150 C, luego lavar la muestra con 10 mL alcohol 3 veces, Al residuo agregar 10 mL HCl al 10% x 15 minutos. Filtrar y trabajar con la solución. Linaza (MUCÍLAGOS) Pesar 10 gramos de semillas de linaza, agregar 50 mL de agua destilada y someter a ebullición x 15 minutos, decantar y trabajar con los mucílagos de linaza. 5. Tamizaje Fitoquímico en el extracto etanólico. Realizar el tamizaje fitoquímico haciendo uso de Reactivos de coloración y precipitación para identificar la presencia de CARBOHIDRATOS presentes en el extracto y anotar los resultados en el Cuadro correspondiente. Realizar el tamizaje Fitoquímico con los extractos acuosos de las Muestras Problemas: Miel de abeja, Azúcar, Almidón de Papa, Algodón, Pectinas de Manzana y mucílagos de Linaza. TAMIZAJE FITOQUÍMICO Realizar las siguientes reacciones según el tipo de Muestra Problema REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA REACCIONES GENERALES X gotas de MP+ III gotas de Molish Anillo violeta Molish agitar+ III gotas de H2SO4 CC (alfa naftol 2% en alcohol) Antrona X gotas de MP + III gotas de Antrona Coloración verde - azulada (antrona en H2SO4 cc al 2% ) REACCIÓN DE AZUCARES REDUCTORES Fehling X gotas de MP + X gotas de solución de Precipitado rojo ladrillo (A: CuSO4; B: tartrato mixto de potasio Fehling+ calentar en B.M y sodio (KNaC4H4O6·4H2O) Benedict (Citrato de Na + CuSO4 + X gotas de MP + X gotas de Benedict+ Precipitado amarillo-verdoso NaCO3) calentar en B.M Tollens X gotas de MP + X gotas de Tollens+ Formación de espejo de plata (AgNO3 + NH4OH) calentar en B.M REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA REACCIONES DE ALDOSAS Y CETOSAS Precipitado rojo (CETOSA) X gotas de MP + III gotas de Selivanoff Selivanoff + calentar en B.M (Resorcina + HCl) REACCIONES DE SACAROSA X gotas de MP + X gotas de solución Herail Herail Color violeta -azulada (1 ml Nitrato cobaltoso + 1 ml NaOH 50%) X gotas de MP + X gotas de Reactivo+ Pozzi-scott H2SO4 cc en zona Formación anillo azul (Molibdato de Amonio 15%) X gotas de MP + X gotas NaOH 10% + Pelouze calentar Color amarillo (NaOH 10%) POLISACÁRIDOS HOMOGÉNEOS Complejo azul desaparece por X gotas de MP (ALMIDON DE PAPA) Solución de yodo 2.5% calor y reaparece por + V gotas de Yodo 2.5% enfriamiento. Fibras de ALGODÓN + V gotas lugol, Yodo en ácido sulfúrico Observar color azul secar + gotas de H2SO4 cc Fibras de ALGODÓN + V gotas de Solubilidad en H2SO4 Soluble H2SO4 cc Fibras de ALGODÓN + V gotas de Insoluble Solubilidad en KOH 5% KOH 5% POLISACÁRIDOS HETEROGÉNEOS Precipitado amarillo gelatinoso NaOH 3N X gotas de MP (PECTINAS) + X gotas NaOH 3N X gotas de MP (PECTINAS) + 2.5 mL Formación de gel de alcohol Formación de gel incoloro X gotas de MP (MUCÍLAGOS) + V Acetato de Plomo básico gotas de reactivo Precipitado gelatinoso blanco X gotas de MP (MUCÍLAGOS) + V Presencia de almidones (azul) y Lugol gotas de reactivo dextrinas (rojo) ACTIVIDAD DE INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA 1. Explique la Reacción química para la determinación de Carbohidratos mediante el Tamizaje Fitoquímico Mencione 4 2. Mediante una Tabla mencione 8 especies medicinales endémicas o nativas del Perù, que contengan Carbohidratos Nombre Común Nombre Familia Fotografía Usos y Tipo de Científico Carbohidrato presentes. 1. 2 …. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bruneton, J. Farmacognosia, Fitoquímica, Plantas medicinales 2ª Ed. Acribia, Zaragoza, España. 2001 2. Gattuso, G. Manual de Procedimientos para el Análisis de Drogas en Polvo. 1ra ed. Argentina: Editorial Universidad Nacional de Rosario Urquiza.1999. 3. Kuklinski, C. Farmacognosia, Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Ed. Omega, Barcelona, España 2003 4. Miranda M. Métodos de Análisis de Drogas y Extractos, Habana Cuba 2002. 5. Obregón, L. Maca. Planta medicinal y nutritiva del Perú. Lima 1988. 6. Sharapin N. Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos Santa fe Bogota Colombia 2000. 7. Treasse, G., Evans, W. Pharmacognosy. Ed. BailliereTindall, Londres 1994. 8. Villar del Fresno, A. Farmacognosia General. Ed. Síntesis, SA. Madrid, España 1999. 9. Wallis, T. Manual de Farmacognosia. Ed. Ceosa, México. 1991. 10. Libro rojo de plantas endémicas http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/biologia/v13n2/contenido.htm RESULTADOS DE LA PRÁCTICA Nro. 7 A. Realice el análisis organoléptico: Color: Olor: Sabor: B. Complete el Cuadro según las Reacciones del Tamizaje fitoquímico MUESTRA PROBLEMA REACCIÓN RESULTADOS TIPO DE AZUCAR LEYENDA: (-) Nulo (-) poco (+) Leve (++) moderado (+++) abundante INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: PRÁCTICA N° 8 RECONOCIMIENTO DE COMPUESTOS FENÓLICOS SIMPLES Y COMPUESTOS ANTRAQUINÓNICOS. MARCO TEÓRICO: Compuestos fenólicos simples Los fenoles simples consisten en un anillo fenólico sustituido por gruposhidroxilos,aldehídicos o carboxílicos, son relativamente raros en plantas. El fenol, catecol (fenol divalente),resorcinol (fenol divalente), floroglucinol (fenol trihidroxilado) y pirogalol han sido reportados raras veces. 1 En contraste, la hidroquinona se distribuye en muchas familias y se halla como arbutina (hidroquinona-Oβ-glucósido). Drogas con Compuestos fenólicos Sauce Uva ursi (Salix alba) (Arctostaphylos uva ursi) Árbol caducifolio Arbusto de hojas perennes, produce bayas rojas. Salicina Droga : hojas Arbutina Droga : hojas Compuestos antraquinónicos Poseen una molécula de azúcar unida a un derivado del antraceno. El constituyente químico representativo es la antraquinona o 9,10-dioxoantraceno. Se encuentra en especies como el ruibarbo, sen, cáscara sagrada, etc. Las antraquinonasse utilizan para la fabricación de colorantes, plaguicidas y aditivos para procesos químicos de la industria del papel y pulpa. Los extractos de plantas que contienen antraquinonas, son utilizados para cosméticos, alimentos y productos farmacéuticos debido a sus propiedades terapéuticas y farmacológicas. Drogas con Compuestos antraquinónicos Ruibarbo Sen Cáscara Sagrada (Rheumpalmatum) (Cassia angustifolia) (Rhamnuspurshiana) Planta herbácea perenne con Arbusto Árbol de 6-12 m, con ramas hojas basales, palmeado-partidas redondas y pubescentes. . Senósido A,B,C,D y aloe- Emodina emodina Aloínas A y B, Droga: raiz Droga : hojas Droga: corteza Sábila (Aloe vera) Planta de forma arrosetada, hojas grandes, carnosas, anchas, sésiles, con una fuerte espina en el ápice y espinas más pequeñas a lo largo de los márgenes Las hojas de color verde pálido con manchas blancas en la superficie, estriadas; a veces el verde pálido cambia a rojizo, exhalan olor característico. En el parénquima se forma un jugo viscoso y espeso de sabor amargo, denominado acíbar o aloe, cuyo principio activo es la aloína que posee propiedades terapéuticas Aloínas Aloe-emodina Droga: hojas COMPETENCIAS: Capacitar al estudiante para que adquiera habilidad de realizar el análisis cualitativo y el Tamizaje Fitoquímico en drogas vegetales para determinar la presencia decompuestos fenólicos y antraquinónicos MATERIALES y REACTIVOS: Extracto etanólico de la Especie vegetal a investigar. Reactivos para el análisis cualitativo (Tamizaje Fitoquímico) Otros materiales necesarios (Tubos de ensayo, gradillas, embudo, morteros, cocinilla, beackers grande y chicos, Baguetas, goteros, pipetas, papel filtro, capsula de porcelana, mechero y balanza) PARTE EXPERIMENTAL I. Análisis cualitativo Fenoles simples Sauce (Salix alba) OBTENCIÓN DE SALICINA Extracción: Pesar 1 g de corteza pulverizada, agregar 20 mL de agua y someter a decocción por 30 min. Filtrar y concentrar. IDENTIFICACIÓN Reacción Procedimiento Resultado Ácido sulfúrico 5 mg de salicina + V gotas de H2SO4 Coloración roja FeCl3 5 mLde extracto + V gotas de FeCl3 Coloración azul-verde Rx. Fehling 5 mL de extracto + V gotas de Fehling A y B+ Precipitado rojo ladrillo calor Uva ursi (Arctostaphylos uva ursi) OBTENCIÓN DE ARBUTINA Extracción: Pesar 1 g de corteza pulverizada, agregar 10 mL de agua y someter a decocción por 30 min. Filtrar y concentrar. IDENTIFICACIÓN Reacción Procedimiento Resultado Microsublimación Colocar en cápsula, 5 mg de droga en polvo. Cubrir con luna de reloj y calentar hasta desprendimiento gaseoso. Al residuo enfriado agregar: II gotas de NH4OH Coloración pardo rojiza FeCl3 0.5 mLde extracto + V gotas de FeCl3 Coloración azul-verde NH4OH conc. 0.5 mLde extracto + V gotas de NH4OH conc. Coloración pardo rojiza Vainillín clorhídrico 0.5 mLde extracto + V gotas de Vainillín Coloración azul clorhídrico Taninos 0.5 mLde extracto + V gotas de gelatina Precipitado blanco Compuestos antraquinónicos Identificación cáscara Procedimiento ruibarbo sen sábila sagrada Microsublimación Coloración Coloración Coloración - Colocar en cápsula, 5 mg de droga roja intensa roja pardo naranja en polvo. Cubrir con luna de reloj y calentar hasta desprendimiento gaseoso. Al residuo enfriado agregar II gotas de NH4OH. R. Borntrager Fase polar: Coloración Fase polar Fase polar: 1g MP+ 10 mL agua+III gotas de Rojo rosada rojo naranja rojo cereza NaOH. Filtrar + X gotas de HClconc. cereza rojiza Fase Agregar 2 mL de cloroformo y Fase apolar: separar la fase cloroformo y agregar apolar: amarillo X gotas de NH4OH cc. Agitar amarillo Sol. alcohólica amoniacal - Coloración - - 0.5 g de MP+ 5 mL de etanol+ roja pardo decocción por 5 min.+V gotas NH4OH cc. R. Schonteten - - - Fluorescen mL del ensayo anterior (Sol. cia a luz alcohólica amoniacal )+ borato de UV sodio saturado. R. Klunge - - - Coloración 0.5 g MP+ 5 mL de agua + BM a 40° rojo C x 15 min.+ mg de talco. Filtrar.Al grosella filtrado añadir II gotas de CuSO4 + II gotas de NaCl + 5 mL etanol. Iridoides Muestras Problemas: * Filtrado del extracto de la especie a investigar 10-20% P/V * Macerado alcohólico de Plantagomajor L. (llantén).- pesar 10 g de hojas de llantén. Colocar en un matraz y agregar 50 mL de alcohol de 70°. Macerar 48 h. * Decocción por 10 minutos (Extracto acuoso) de la droga vegetal con Iridoides. Identificación de iridoides Procedimiento Resultado Reacción con vainillin Sembrar en papel filtro 40 veces, previo Coloración grosella clorhídrico secado entre cada siembra. Secar y agregar IV gotas de reactivo Vainillínclorhídrico (secar entre gota y gota) CUESTIONARIO 1. Describa el fundamento de las reacciones de coloración para la identificación de compuestos fenólicos y antraquinónicos. 2. Mediante una Tabla mencione 10 especies nativas del Perú, que presenten compuestos fenólicos y antraquinónicos. Nombre Común Nombre Familia Fotografía Usos y Tipo de Científico compuestos fenólicos y antraquinónicos. 1. 2…. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Kuklinski, C., Farmacognosia., Ed. Omega SA, Barcelona, España (2000) 2. Bruneton, J. Farmacognosia – Fitoquímica – Plantas Medicinales. 3ra. Ed. Acribia, Zaragoza, España (2001) 3. Gibaja Oviedo S. Pigmentos naturales. Quinónicos. Lima (1998). 4. Villar Del Fresno, A. Farmacognosia general. Madrid (2010) PROTOCOLO Nº 8 COMPUESTOS FENÓLICOS SIMPLES Y ANTRAQUINÓNICOS FECHA………………………………. MESA DE TRABAJO …………………………….. MUESTRA:……………………………… RESULTADOS I. ANÁLISIS CUALITATIVO COMPUESTOS FENÓLICOS SIMPLES Y ANTRAQUINÓNICOS Nro. Reacción Muestra Problema 1: Muestra Problema 2: Observaciones 1 Ácido sulfúrico 2 FeCl3 3 NH4OH conc. 4 Vainillín clorhídrico 5 Rx. Fehling 6 Microsublimación 7 R. Borntrager 8 Alcohólica amoniacal 9 R. Schonteten 10 R. Klunge LEYENDA: (-) Nulo (-) poco (+) Leve (++) moderado (+++) abundante INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: PRÁCTICA N° 9 RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES Y TANINOS MARCO TEÓRICO: FLAVONOIDES Los flavonoides son compuestos polifenólicos ubicuos en la naturaleza, se clasifican, de acuerdo a su estructura química, en: flavonoles, flavonas, flavanonas, isoflavonas, catequinas, antocianidinas y chalconas. Más de 4 000 flavonoides han sido identificados muchos de ellos en frutas y verduras. Los flavonoides han despertado un considerable interés por sus potenciales efectos beneficiosos sobre la salud. Se ha reportado actividad antiviral, antialérgica, antiplaquetaria, antitumoral antiinflamatoria, y antioxidantes. Fig.1 Estructura general de flavonoides Los flavonoides pertenecen a un grupo de compuestos naturales dispuestos en un sistema C6-C3-C6, en el que dos anillos aromáticos A y B están unidos por una unidad de tres carbonos que pueden o no formar un tercer anillo C. Los flavonoides pueden hallarse como aglicón o bajo la forma de glicósidos con una o tres unidades de azúcar, generalmente en el carbono 3 ó 7, siendo los azúcares más comunes: glucosa, galactosa, ramnosa, xilosa y arabinosa. Estos compuestos poseen las siguientes características: solubilidad en agua y etanol, carácter fenólico e intensa absorción en la región UV-Vis del espectro por la presencia de sistemas aromáticos conjugados. Extracción de flavonoides Los flavonoides (en particular heterósidos) pueden ser degradados por la acción de enzimas, siendo necesario utilizar muestras secas, liofilizadas o congeladas. Para la extracción, el disolvente se elige en función del tipo de flavonoide a extraer. La polaridad es un factor muy importante. Flavonoides de baja polaridad (por ejemplo, las isoflavonas, flavanonas, flavonas metiladas, y flavonoles) se extraen con cloroformo, diclorometano, éter dietílico, o acetato de etilo, mientras que los heterósidos flavonoides y agliconas más polares se extraen con alcoholes o mezclas de alcohol-agua. En el caso de los heterósidos la presencia de la porción de azúcar incrementa la solubilidad en agua y alcohol, por lo que soluciones hidroalcohólicas son las más adecuadas. La mayor parte de las extracciones de especies que contiene flavonoides se realizan por extracción directa con solventes y también pueden ser extraídos en Soxhlet, primero con hexano, para eliminar lípidos seguido de acetato de etilo o etanol para extraer compuestos fenólicos, sin embargo este método no es adecuado para compuestos sensibles al calor. TANINOS Los taninos son compuestos polifenólicos de peso molecular alto que se encuentran en las plantas superiores, incluyendo muchas plantas utilizadas como alimentos, el peso molecular oscila entre 500 y 3 000, de estructura amorfa, sabor astringente y débilmente ácidos. La mayoría de ellos solubles en agua; pueden ser amarillos, rojos o marrones, y se localizan en el citoplasma o en las vacuolas de las células; conformados principalmente por restos de ácido gálico unidos a glucosa a través de enlaces glucosídicos. Los taninos ingeridos en la dieta pueden afectar la asimilación de proteínas y hierro, al formar complejos insolubles. En las especies vegetales los taninos actúan como defensas químicas que reducen el daño por insectos y mamíferos. En medicina, especialmente en Asia (Japón y China), los extractos de especies vegetales que contienen taninos se utilizan como astringentes, diuréticos, antiinflamatorios y antisépticos. Por su capacidad de precipitar metales pesados y alcaloides (excepto morfina), los taninos se pueden utilizar como antídotos de estas sustancias. Los taninos se utilizan en la industria de colorantes como colorantes catiónicos (tanino), y en la producción de tintas (galato de hierro). En la industria alimentaria los taninos se utilizan para clarificar el vino, la cerveza y jugos de frutas. Actualmente, los taninos han atraído el interés científico, debido a la mayor incidencia de enfermedades como el VIH y varios tipos de cáncer. La búsqueda de nuevos compuestos prometedores para el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos es cada vez más importante, especialmente por la acción biológica que se les atribuye. COMPETENCIAS Conoce la importancia de flavonoides y Taninos en Farmacognosia Identifica flavonoides y Taninos cualitativamente Cuantificar taninos en muestras de tara (Caesalpinia spinosa) METODOLOGÍA Cromatografía en capa fina Método volumétrico : Yodometría Reacciones de precipitación Reacciones de coloración MATERIAL Y EQUIPOS Material de vidrio Reactivos de coloración Material de vidrio Estufa Mortero pilón I. Análisis cualitativo de FLANONOIDES PARTE EXPERIMENTAL I. Análisis cualitativo de FLAVONOIDES Heterósidos flavonoides DROGA REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA Hesperidósido Naranja H2SO4 cc mg de hesperidina+ gotas Coloración Citrus sinensis de H2SO4 cc naranja Fam. HCl cc mg de hesperidina+ gotas Precipitado Rutaceae de HCl cc blanco HNO3 mg de hesperidina+ gotas Coloración de HNO3 pardo rojizo NaOH 30% mg de hesperidina+ gotas Coloración de NaOH 30% amarillo naranja Rutinósido Ruda Wilson 0.5mLWilson A + Coloración Ruta (Ác.borico+citrato 0.5mLWilson B+0.5mL de amarilla. graveolens de sodio) extracto (30 min. en Observación en Fam. oscuridad) UV: Rutaceae Fluorescencia verde Shinoda 0.5mL de extracto+ virutas Coloración de Mg +gotas HCl cc rosada FeCl3 0.5mL de extracto +gotas Coloración FeCl3 verde Quercetinósido Cebolla Pb(CH3COO)2 0.5mL de extracto +gotas Precipitado Allium cepa L. Pb(CH3COO)2 color amarillo Familia Liliaceae FeCl3 0.5mL de extracto +gotas Coloración FeCl3 verde en frio, rojo oscuro en caliente Antocianósido Maíz morado H2SO4 cc 0.5mL de extracto + gotas Coloración roja Zea Mays L H2SO4 cc Fam. Poaceae NaOH 30% 0.5mL de extracto + gotas Coloración NaOH 30% verde Preparación de extractos de Flavonoides y Taninos Pesar 5 g de droga vegetal, agregar 50 mL de agua destilada y llevar a decocción x 10 minutos, filtrar. Con el extracto de la droga vegetal que presenta Flavonoides según bibliografía realizar el Análisis Cualitativo de Flavonoides y con el extracto de Tara realizar el análisis cualitativo de Taninos. II. Análisis Cualitativo de TANINOS a) Reacción de diferenciación Reactivo Procedimiento Reacción positiva FeCl3 10% 0.5 ml MP + gotas deFeCl3 10% T. hidrolizables: azul T. condensados: verde b) Reacciones de identificación REACTIVO PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA FeCl3 0.5 mL MP+ gotas de FeCl3 coloración azul/verde K2Cr2O7 5% 0.5 mL MP+ gotas de K2Cr2O7 5% pp. pardo Pb(CH3COO)2 0.5 mL MP+ gotas de Pb(CH3COO)2 pp. blanco lechoso Agua de cal 0.5 mL MP+ gotas de agua de cal pp. amarillo pálido KCN 5% 0.5 mL MP+ gotas de KCN 5% pp. amarillo Hipoclorito de sodio 0.5 mL MP+ gotas de hipoclorito de sodio coloración naranja K4[Fe(CN)6] + NH4OH 0.5 mL MP+ gotas de K4[Fe(CN)6] + gotas de NH4OH coloración rojiza Gelatina 0.5 mL MP+ gotas de gelatina pp. blanco KMnO4 0.5 mL MP+ gotas de KMnO4 pp. pardo Alcaloide 0.5 mL MP+ gotas de alcaloide pp. lechoso blanco III. Análisis cuantitativo Pesar 1 g de tara, llevar a decocción con 20 mL de agua destilada. Filtrar, y completar el volumen de 100 mL en fiola y medir 10 mL para la titulación. Preparación de patrón Preparación del blanco GASTO: “A” GASTO: “B” Yodo 2.5% Yodo 2.5% 10 mL solución de ácido 2mL de NaHCO3 tánico 1% + 2mL de + c.s.p para 20 NaHCO3+ c.s.p para 20 mL mL con agua con agua destilada destilada Preparación de la muestra GASTO: “C” Yodo 2.5% 10 mL solución nuestra problema+ 2mL de NaHCO3+c.s.p para 20 mL con agua destilada Nota: El punto final de la valoración se determina con tiras de papel almidonado (indicador externo), vira a violeta intenso en el punto de equivalencia. a) Cálculos PATRÓN =GASTO: “A” BLANCO =GASTO: “B” MUESTRA =GASTO: “C” A-B 0.1 g C-B X X= contenido de taninos (g) en 10 mL de muestra problema Nota: expresar los resultados en porcentaje de taninos en la muestra. CUESTIONARIO 1. Explique el fundamento de la valoración de taninos realizada en práctica. 2. Mediante una Tabla mencione 10 especies nativas del Perú, que presenten flavonoides y Taninos REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Khanbabaee K, Van Ree T. Tannins: Classification and Definition. Nat. Prod. Rep., 2001; 18. p. 641–649. Disponible en: http://siba.unipv.it/farmacia/art/Marrubini/Nat%20Prod%20Rep%202001.pdf [citado 22 de marzo 2013] 2. Chung KT, Wong TY, Wei CI, Huang YW, Lin Y. Tannins and human health: a review.Crit Rev Food Sci Nutr. 1998 Aug;38(6):421-64. 3. Reed JD. Nutritional Toxicology of Tannins and Related Polyphenols in Forage Legumes. J Anim Sci 1995, 73:1516-1528. Disponible en: http://www.journalofanimalscience.org/content/73/5/1516.full.pdf [citado 22 de marzo 2013]. 4. Hartzfeld PW, Forkner R, Hunter MD, Hagerman AE. Determination of Hydrolyzable Tannins (Gallotannins and Ellagitannins) after Reaction with Potassium Iodate. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 1785−1790. Disponible en: http://mdhunter.myweb.uga.edu/publications/HAGERMAN.PDF [citado 22 de marzo 2013]. 5. Clinton C. Plant tannins: A novel approach to the treatment of ulcerative colitis. Nat Med J. 2009; 1:(3). p. 1-3. Disponible en: http://naturalmedicinejournal.net/pdf/nmj_nov09to_clinton.pdf [citado 22 de marzo2013]. 6. Tamilselvi N, Krishnamoorthy P, Dhamotharan R, Arumugam P, Sagadevan E. Analysis of total phenols,total tannins and screening of phytocomponents in Indigofera aspalathoides (Shivanar Vembu) Vahl EX DC. J. Chem. Pharm. Res., 2012, 4(6):3259-3262. Disponible en: http://jocpr.com/vol4-iss6-2012/JCPR-2012-4-6-3259-3262.pdf [citado 22 de marzo 2013]. 7. Garro G J et al. Analytical Studies on Tara Tannins. Holzforschung. 1997; 51(3). Disponible en: http://www.fpl.fs.fed.us/documnts/pdf1997/galve97a.pdf [citado 22 de marzo 2013]. 8. Cabello LI. Monografía para el cultivo de la tara Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze.Perúbiodiverso. Lima, Perú.2009 9. U.S. Department of Agriculture. USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods.March 2003. Disponible en:http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/Data/Flav/flav.pdf [citado 22 de marzo 2013] PROTOCOLO Nº 09 RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES Y TANINOS HORARIO………………………………………….. FECHA………………………………. MESA DE TRABAJO …………………………….. RESULTADOS ANÁLISIS CUALITATIVO DE FLAVONOIDES Muestras Droga Droga Estándar Estándar Vegetal con Vegetal Problemas Hesperidina Rutina Flavonoides con REACCIÓN Taninos H2SO4 cc HCl cc HNO3 NaOH 30% Wilson Shinoda FeCl3 Pb(CH3COO)2 FeCl3 K2Cr2O7 5% Agua de cal KCN 5% Hipoclorito de sodio K4[Fe(CN)6] + NH4OH Zn(CH3COO)2 Gelatina KMnO4 Braemer LEYENDA: (-) Nulo (-) poco (+) Leve (++) moderado (+++) abundante INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: PRÁCTICA Nº 10 EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE ACEITES ESENCIALES. INTRODUCCIÓN Aceites Esenciales Los aceites esenciales son compuestos formados por sustancias orgánicas volátiles, como alcoholes, cetonas, éteres y aldehídos, se producen y almacenan en los canales secretores de las plantas y normalmente son líquidos a temperatura ambiente, y por su volatilidad, son extraídos por destilación en corriente de vapor de agua. Fuentes: Coníferas (pino, abeto), Mirtáceas (eucalipto), Rutáceas (Citrus spp), Asteraceae (manzanilla), Labiadas (menta, lavanda, tomillo, espliego, romero) y umbelíferas (anís, hinojo).Pueden estar en diferentes órganos: raíz, rizoma (jengibre), leño (alcanfor), hoja (eucalipto), fruto (anís) y sumidades floridas (clavo de olor). Propiedades terapéuticas: antiséptica (conservación de alimentos), antiespasmódica, expectorante; carminativa y eupéptica. Sin embargo a dosis elevadas son tóxicos, principalmente a nivel del sistema nervioso central y pueden ocasionar alergias e irritación. Características físicas Los aceites esenciales son volátiles, líquidos a temperatura ambiente (a excepción del alcanfor y el mentol), recién destilados son incoloros o ligeramente amarillos, de densidad inferior a la del agua. Son solubles en alcohol y disolventes orgánicos (éter, cloroformo), poco solubles en agua pero arrastrables por el vapor de agua. Poseen poder rotatorio e índice de refracción característico. Características químicas Los aceites esenciales contienen compuestos: -No terpenoides: sustancias alifáticas de cadena corta, sustancias aromáticas, sustancias con azufre y sustancias nitrogenadas. -Terpenoides: derivan del isopreno (C5) unidas en cadena, principalmente monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15) y los diterpenos (C20) que pueden ser alifáticos, cíclicos o aromáticos. 1,2 COMPETENCIAS Conoce la extracción de aceites esenciales Evalúa las características físico-químicas de los aceites esenciales METODOLOGÍA Destilación por arrastre de vapor Reacciones de coloración MATERIAL Y EQUIPOS Equipo de destilación. Picnómetro Material de vidrio: matraz, beacker, tubos de ensayo, baguetas. Reactivos: cloroformo, acido acético, ácido sulfúrico. Lámpara ultravioleta Cubas cromatográficas PARTE EXPERIMENTAL Extracción de Aceites Esenciales -Expresión en frío: presenta la ventaja de no someter los aceites esenciales a temperaturas elevadas y se toma directamente la muestra problema. -Destilación: colocar la muestra problema sobre la criba ubicada a cierta distancia del fondo del alambique, el calentamiento se produce con vapor saturado proveniente de una fuente de calor que componen el equipo, fluye y a presión baja, penetrando a través del material vegetal, los componentes se volatilizan, y condensan en un refrigerante, se acumulan y se separan el agua del aceite por diferencia de densidad. I. ANÁLISIS CUALITATIVO Análisis organoléptico: Color Olor Sabor Textura Peso específico a) Pesar el picnómetro vacío y seco (P) b) Llenar el picnómetro con la MP a 20ºC por 15 min., ajustar el volumen si es necesario y pesar cuidadosamente (P1) c) Repetir la operación con agua destilada a 20 ºC (P2) El peso específico a 20º C se calcula de la siguiente manera: P.E 20 = (P1-P)/(P2-P) Índice de refracción a) Calibrar el refractómetro con I gota de agua destilada (inyectable) a 1.333 b) Secar el equipo con papel tissu c) Colocar I gota de muestra problema sobre el prisma de medición y realice la lectura. Análisis cromatográfico Fase estacionaria: Cromatofolios de silica gel 60 F254 de 6.5 cm por 2.5 cm Fase móvil: Tolueno: acetato de etilo (9 : 1) Luz UV Revelador: Vainillina – Ac. Sulfúrico REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE TERPENOS REACCIÓN PROCEDIMIENTO RESULTADO Lieberman -Buchard X gotas de MP + llevar a Esteroides: verde -azul sequedad en B.M + X gotas de Triterpenoides: rojo- cloroformo+ III gotas de naranja anhídrido acético+ H2SO4 cc en zona (por las paredes de tubo) sin agitar. CUESTIONARIO 1. Mediante un diagrama de Flujo esquematice y describa el proceso de control de calidad para aceites esenciales y describa sus análisis. 2. ¿Qué otras técnicas de extracción de aceites esenciales conoce?. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Varro, E., Tyler, L. Farmacognosia. Ed. El Ateneo, Bs. As, Argentina (1993) 2. Kuklinski, C., Farmacognosia., Ed. Omega SA, Barcelona, España (2000) 3. Bruneton, J. Farmacognosia – Fitoquímica – Plantas Medicinales. 3ra. Ed. Acribia, Zaragoza, España (2001) 4. Bravo Díaz, L. Farmacognosia. Ed. Elsevier SA. Madrid, España. (2003) 5. Marco,J. Alberto. Química de los productos naturales. Aspectos fundamentales del metabolismo secundario. 1a ed. Madrid ( 2006) 6. Gibaja Oviedo S. Pigmentos naturales. Quinónicos. Lima (1998). 7. Villar Del Fresno, A. Farmacognosia general. Madrid (2010) 8. López MT. Los aceites esenciales: Aplicaciones farmacológicas, cosméticas y alimentarias. OFFARM.2004; 23: (7). 9. Albaladejo QM. El Aceite Esencial de limón producido en España. Contribución a su evaluación por Organismos Internacionales. Universidad de Murcia. 1999. Disponible en: http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/11059/Albaladejo.pdf;jsessionid=239F1DE9B45434C34798AEEB F0F07002.tdx2?sequence=1[citado 23 de marzo de 2013] 10. Segovia B. et al. Composición química del aceite esencial de Tagetes elliptica Smith “chincho” y actividades antioxidante, antibacteriana y antifúngica. Ciencia e Investigación 2010; 13(2): 81-86. 11. UNIDO, FAO. Herbs, spices and essential oils. Austria, 2005.Disponible en http://www.unido.org/fileadmin/user_media/Publications/Pub_free/Herbs_spices_and_essential_oils.pdf [cita do 23 de marzo de 2013] PROTOCOLO Nº 10 EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE ACEITES ESENCIALES. HORARIO………………………………………….. FECHA………………………………. MESA DE TRABAJO …………………………….. I. ANÁLISIS CUALITATIVO ACEITES ESENCIALES Ensayo Resultado Análisis organoléptico Olor Color Sabor Textura Peso especifico Índice de refracción REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN REACCIÓN RESULTADO Lieberman -Buchard LEYENDA: (-) Nulo (-) poco (+) Leve (++) moderado (+++) abundante CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Descripción Rf INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: PRÁCTICA N° 11 DROGAS CON ALCALOIDES DE NÚCLEO TROPÁNICO, INDÓLICO, OXINDÓLICO, FENANTRENO. EXTRACCIÓN ÁCIDA-ALCALINA, IDENTIFICACIÓN, OBTENCIÓN Y VALORACIÓN. Los alcaloides son sustancias orgánicas nitrogenadas con carácter básico y mayoritariamente de origen vegetal. Son compuestos orgánicos. Se forman generalmente a partir de aminoácidos. De origen vegetal. Sustancias nitrogenadas. Contienen nitrógeno heterocíclico. Tienen estructura compleja. Son tóxicos. Con actividad fisiológicas incluso a dosis muy bajas. Los alcaloides son un grupo muy heterogéneo de compuestos con estructuras muy variadas y generalmente complejas, contienen C, H, N. La mayoría de los alcaloides tienen reacciones que se aprovechan para su detección. Hay reactivos generales que detectan alcaloides en general y hay otros que detentan un grupo específico. Estas reacciones se pueden clasificar en reacciones de precipitación, cristalización y de color. CLASIFICACIÓN DE ALACALOIDES Alcaloides derivados de ornitina Alcaloides derivados de lisina Alcaloides derivados del triptófano Alcaloides derivados de fenilalanina y tirosina Alcaloides de núcleo purínico o bases xánticas (Erythroxylum coca “coca”: cocaína) COMPETENCIAS Extrae los alcaloides a partir de un polvo seco pulverizado por medio ácido y alcalino. Identifica cuali-cuantitativamente los alcaloides. Reconoce el origen biológico de los alcaloides. MATERIALES Materiales de vidrios y otros Balón de 250 mL Pera de separación de 500 mL Fiola de 500 mL Tubos de ensayo de 10 mL Pipetas de 1 mL, 5 mL Reactivos Agua destilada Acetona Etanol Etilacetona Butanol Alcohol amílico Metanol Cloroformo Éter etílico Éter de petróleo Benceno n-Hexano Ácido clorhídrico Diclorometano Hidróxido de sodio Hidróxido de amonio Reactivo Dragendorff Ácido perclórico 0.02 N Ácido acético glacial Cristal violeta Ácido clorhídrico Agua destilada Hidróxido de sodio Diclorometano Metanol Cloroformo Hidróxido de amonio. Equipo Molino manual Agitador con magneto Centrífuga Rotavapor Pera de bromo Balanza analítica PROCEDIMIENTO 1. Sensorial Se verifica el aspecto, color y olor del polvo fino de acuerdo a las partes de la planta. 2. Fisicoquímico 2.1. Prueba de solubilidad Se pesan 10 mg del extracto seco y se introduce en un tubo al cual se le adiciona 1 mL de solvente en orden de polaridad decreciente (agua destilada, metanol, etanol, n-propanol, acetona, acetato de etilo, cloroformo, tolueno, éter) La finalidad del ensayo de solubilidad es determinar el comportamiento del extracto en soluciones de diferente polaridad, permitiendo encontrar el sistema apropiado para el análisis cromatográfico. 3. Extracción y Aislamiento Muestra en estudio Drogas vegetales que contienen alta cantidad de alcaloides Proceso de Extracción Fundamento La extracción se realiza previamente en un medio ácido formando sales de clorhidrato, y posteriormente se alcaliniza con la finalidad de convertir los alcaloides en bases libres y poder extraerlos con un solvente no polar. Método alcalino: la droga se humedece con agua y se mezcla con cal y amoniaco. Los alcaloides se extraen con solventes orgánicos (éter de petróleo, cloroformo, benceno). La fase orgánica se separa y evapora. El residuo de la droga también se puede agitar con agua acidulada, se añade solvente orgánico, luego dejar reposar para su separación en capas. Las sales de alcaloides están en la fase acuosa y en la fase orgánica las impurezas. Método ácido, la droga se extrae con agua o alcohol, en medio ácido. Se agrega un solvente orgánico, otros productos indeseables se eliminan en la agitación con cloroformo u otros solventes orgánicos. Luego los alcaloides libres son precipitados por adición en exceso de bicarbonato de sódico o amoniaco, separándose por filtración o extracción con disolventes orgánicos. Procedimiento: Pesar 5 g de la droga vegetal en un matraz y añadir 50 mL de HCl 10%, someter a BM por 30’ agitar, enfriar y filtrar. Transvasar a pera de decantación y alcalinizar con NH 4OH, extraer con cloroformo 3 veces y separar las fases. Concentrar la fase clorofórmica a casi sequedad añadir HCl 10% y reconocer con reacciones generales y específicas. Cromatografía en capa fina Sistema de solventes: A. Cloroformo: metanol: ácido acético glacial (47.5:47.5:5) Cloroformo: metanol: amoniaco (9:10:1) Detección: Revelador Dragendorff modificado A. 17 g de subnitrato de bismuto, 200 g de ácido tartárico csp 800 mL agua. B. 160 g de Yoduro de potasio csp 400 mL de agua. Se mezclan solución A + Sol B (1:1) Cromatografía en capa fina de Bases Xánticas Muestra Extracto clorofórmico Estándar Sol. Cafeína: 0.1% en cloroformo Sol. Teofilina: 0.2 % en amoniaco Sol. Teobromina: 0.2 % en hidróxido de sodio Solventes tetracloruro de carbono: cloroformo: metanol (10:90:40) Revelador vapores de yodo (antes de revelar, calentar la placa) I. REACCIONES GENERALES Realizar las reacciones generales y particulares REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA Yodados poliyodatos complejos Dragendorff (yoduro potásico- bismútico ) 0.5 mL del extracto Precipitado naranja Mayer (yoduro potásico mercúrico) llevar a sequedad a Precipitado blanco Bouchardat o Wagner (yodo en yoduro potásico) BM, luego agregar Precipitado pardo oscuro Poliácidos minerales complejos 1mL de HCl 1%, Bertrand (ácido silíco-túngstico) disolver + III gotas Precipitado blanco Sonnenschein (ácido fosfomolíbdico) de reactivo. Precipitado amarillo-verdoso Reactivo orgánicos Popoff (ácido pícrico ) Cristales característicos Taninos Precipitado blanco II. REACCIONES PARTICULARES ATROPINA (Datura stramonium L, Brugmansia arborea L.) REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA Reacción de Vitali mg de MP + HNO3 conc.+ calentar en coloración violeta B.M hasta residuo amarillo, enfriar y agregar gotas de KOH alcohólico 10% Reacción de Wasicky mg de MP + gotas de Rvo. Wasicky + coloración violeta (p-dimetilaminobenzaldehido+ calentamiento suave rojiza brillante H2SO4cc) Reacción de Arnold mg de MP+ gotas de H2SO4 + NaNO2 + violeta rojizo (fugaz). KOH al 10% COCAÍNA (Erythroxylum coca L.) REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA Cloruro de bario Disolver mg de muestra en agua destilada, medir Precipitado blanco 10% el pH y acidificar con gotas de HCl 10% Agregar I- II gotas del reactivo BaCl2 10% Reacción de mg de extracto desecado + II gotas de tiocianato de Coloración turquesa Young cobalto. (tiocianato de cocaína) Nitrato de Disolver mg de muestra en agua destilada, medir Precipitado blanco plata 10% pH y acidificar (si es necesario) con gotas de ácido nítrico. Agregar I-II gotas de AgNO3 KMnO4 mg de extracto desecado + II gotas de KMnO4 Cristales característicos NÚCLEO INDÓLICO Y OXINDÓLICO Reacción Procedimiento Reacción positiva Van Urk mg de MP+ III gotas de reactivo de coloración azul (dimetilaminobenzaldehido + ácido sulfúrico) Van Urk BASES XANTICAS REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA Ácido Solución saturada de cafeína + V gotas de Formación de precipitado, soluble tánico ácido tánico 5% en exceso de reactivo Solución saturada de cafeína + V gotas de Precipitado café rojizo que en Yodo reactivo de yodo (no precipita), se añade III exceso de NaOH desaparece. gotas de HCl 10% mg de muestra + HNO3 fumante. Calentar a Cambio de amarillo a violeta y al sequedad en baño maría y observar la agregar NaOH la coloración violeta Murexida formación de un residuo amarillo. Someter el desaparece. residuo a vapores de amoniaco. mg de muestra + mg de KClO3 (clorato de Formación de residuo amarillo. potasio) + agregar HCl conc, calentar hasta Someter el residuo a vapores de Weidel sequedad en baño maría amoniaco y observar el cambio de amarillo a violeta. mg de muestra + gotas de NaOH 10% + gotas Formación de precipitado. Gerard de amoníaco conc. + gotas de AgNO3 10% REACCIÓN DE DIFERENCIACIÓN RESIDUO DE LA REACCIÓN DE Cafeína: azul violeta MUREXIDA O WEIDEL, someter a completa Teobromina: rojo violeta Ekkert evaporación el amoniaco + mg de codeína+ Teofilina: violeta H2SO4 conc. CUESTIONARIO 1. Mencione las especies en que se distribuyen los alcaloides REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Andújar I, Recio MC, Giner RM, Ríos JL. Cocoa polyphenols and their potential benefits for human health. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:906252. 2. Ashihara H, Kato M, Crozier A. Distribution, biosynthesis and catabolism of methylxanthines in plants. 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Obregón Vilchez L.Uña de Gato "Cat's Claw": género uncaria, estudios botánicos, químicos y farmacológicos de Uncaria tomentosa y Uncaria guianensis. Ed. Inst. de Fitoterapia Americano. Lima 1997 10. Selecciones del Reader's Digest. Secretos y virtudes de las plantas medicinales. Madrid, 1982. 11. Varro, E., Tyler, L. Farmacognosia. Ed. El Ateneo, Bs. As, Argentina 1993. 12. Wink M, Meibner C, Witte L. Patterns of quinolizidina alkaloids in 56 species of the genus Lupinus. Phytochemistry 1995; 38:139-153. DROGAS CON ALCALOIDES HORARIO………………………………………….. FECHA………………………………. MESA DE TRABAJO …………………………….. I.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN: II. ANÁLISIS CUALITATIVO: REACCIONES GENERALES REACCIÓN RESULTADO DRAGENDORFF BERTRAND BOUCHARDAT O WAGNER MAYER SONNENSCHEIN POPOFF TANINOS REACCIONES PARTICULARES ATROPINA REACCIÓN RESULTADO VITALI WASICKY ARNOLD COCAÍNA REACCIÓN RESULTADO CLORURO DE BARIO REACCIÓN DE YOUNG NITRATO DE PLATA 10% KMnO4 NÚCLEO INDÓLICO Y OXINDÓLICO REACCIÓN RESULTADO VAN URK BASES XÁNTICAS Reacción Cafeína Teofilina Teobromina R. Murexida R. Weidel R. Gerard R. Yodo R. ácido tánico ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Rf: INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: PRÁCTICA N° 12 INVESTIGACIÓN FARMACOGNÓSTICA DE LOS EXTRACTOS DE LA PLANTA MEDICINAL ESTUDIADA (ANÁLISIS FITOQUÍMICO: TAMIZAJE FITOQUÍMICO, PH, ÍNDICE DE REFRACCIÓN, DENSIDAD Y CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA). La investigación de plantas medicinales es muy importante porque se utilizan en la elaboración de medicamentos y también y como materia prima para formulaciones magistrales. Por esta razón se deben trabajar con extractos estandarizados que tengan un control de calidad en cuanto al control de identidad mediante una certificación taxonómica y de calidad mediante ensayos microbiológicos, fisicoquímicos y farmacológicas que aseguren su calidad, seguridad y eficacia. FASE I: Recolección, conservación de drogas y elaboración de extractos EXTRACCIÓN Recolección, estabilización Certificación taxonómica Selección Desecación Molienda Preparación del extracto acuoso Prueba de Screening Análisis cromatográfico Ensayos en solubilidad fitoquímico laboratorio Cromatografía Cromatografía en Aislamiento y Cristalización En capa fina columna purificación Análisis espectroscópico uv/visible Análisis espectroscópico IR FASE II: Elaboración de extractos estandarizados Parámetros físico-químicos Propiedad Extracto Olor Color Análisis organoléptico Sabor pH Papel Indicador Densidad relativa Picnómetro Índice de refracción Refractómetro Prueba de solubilidad LEYENDA: (-) Insoluble (+) ligeramente soluble (++) soluble (+++) Muy soluble Solventes Extracto seco (mg) Agua destilada Distribuir equitativamente mg de Etanol extracto seco en cada tubo de Metanol ensayo y agregar X gotas de n-butanol cada solvente, agitar por 1 min y Acetato de etilo evaluar solubilidad. Diclorometano Cloroformo Huella Cromatográfica 1. Preparación de muestra: Pesar 0.1 g de extracto seco y solubilizar en 5 mL de solvente. 2. Fase estacionaria: Sílica gel F 254 (cromatofolios) 3. Fase móvil: Solventes polares y apolares 4. Detección: Vapores de yodo / Luz UV Muestra Extracto clorofórmico Solventes Tolueno: acetato de etilo: dietilamina (7:2:1) Revelador Dragendorff Tamizaje fitoquímico LEYENDA: (-) Nulo (+) Leve (++) moderado (+++) abundante METABOLITO REACCIÓN PROCEDIMIENTO REACCIÓN POSITIVA CARBOHIDRATOS Molish X gotas de MP+ III gotas de Molish Anillo violeta (alfa naftol 2% en alcohol) agitar+ III gotas de H2SO4 CC Antrona X gotas de MP + III gotas de Antrona Coloración verde (antrona en H2SO4 cc al 2% ) Fehling X gotas de MP + III gotas de Fehling (A: CuSO4; B: tartrato mixto A+ III gotas de Fehling B + calentar Coloración rojo ladrillo de potasio y sodio en B.M (KNaC4H4O6·4H2O)) COMPUESTOS X gotas de MP + III gotas de FeCl3 FeCl3 Coloración verde o azul FENÓLICOS 10 % TANINOS Gelatina X gotas de MP + III gotas de gelatina Precipitado denso blanco Chalconas, auronas, isoflavanonas: No hay coloración. X gotas de MP + 1-2 virutas de Mg Isoflavanonas: Amarillo rojizo. FLAVONOIDES Shinoda metálico + III gotas de HCl cc Flavanonoles: Rojo a magenta. Flavonas y flavonoles: Amarillo a rojo ANTOCIANINAS Y Rosenheim X gotas de MP + III gotas de FLAVONOIDES Coloraciónrojo oscuro (Sol. Yodo Yodurada) Rosenheim CATÉQUICOS AMINOÁCIDOS X gotas de MP + III gotas de LIBRES Y GRUPOS Ninhidrina(0.1% en etanol) Coloración violácea ninhidrina + calentar en B.M 10 min. AMINO X gotas de MP + evaporar el solvente Dragendorff B.M + V gotas de HCl 10%+ III Precipitado naranja (yoduro potásico- bismútico ) gotas de Dragendorff X gotas de MP + evaporar el solvente Mayer (yoduro potásico B.M + V gotas de HCl 10%+ + III Precipitado blanco mercúrico) gotas de Mayer ALCALOIDES X gotas de MP + evaporar el solvente Bertrand (ácido silíco- Precipitado blanco B.M + V gotas de HCl 10%+ + III túngstico) gotas de Bertrand X gotas de MP + evaporar el solvente Sonnenschein Precipitado amarillo-verdoso B.M + V gotas de HCl 10%++ III (ácido fosfomolíbdico) gotas de Sonnenschein NAFTAQUINONAS, Borntrager X gotas de MP + III gotas de ANTRAQUINONAS Coloración roja (NaOH 5%) Borntrager Y ANTRANONAS X gotas de MP + llevar a sequedad en B.M + X gotas de cloroformo+ III TRITERPENOIDES Esteroides: verde-azul Lieberman - Bourchard gotas de anhídrido acético+ H2SO4 cc Y ESTEROIDES Triterpenoides: rojo-naranja en zona (por las paredes de tubo) sin agitar. 1 mL de MP + 5 mL de agua Formación de 0.5 a 1 cm de espuma SAPONINAS Generación de espuma destilada + agitar fuertemente por 1 estable por 15 min. min. X gotas de MP + V gotas de ácido GLICÓSIDOS Baljet pícrico 1 % + V gotas de NaOH al 5 Coloración anaranjada %. X gotas de MP + V gotas de de LACTONAS Legal nitroprusiato de sodio 0.5% + V gotas Coloración rojo oscuro de KOH 2N. X gotas de MP + papel humedecido NH4OH cc ó CUMARINAS con NH4OH cc ó NaOH 10% en Fluorescencia celeste NaOH 10% boca de tubo + calentar por 5 min a REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Villar del Fresno, A. Farmacognosia General. Ed. Síntesis, SA. Madrid, España (1999). 2. Treasse, G., Evans, W. Pharmacognosy. Ed. BailliereTindall, Londres 1994. 3. Wallis, T. Manual de Farmacognosia. Ed. Ceosa, México. 1991. 4. Bruneton, J. Farmacognosia – Fitoquímica – Plantas Medicinales. 3ra. Ed. Acribia, Zaragoza, España 2001. 5. Obregón, L.Maca. Planta medicinal y nutritiva del Perú.Lima 1988. PROTOCOLO TRABAJO DE INVESTIGACIÓN RESULTADOS MESA DE TRABAJO: ………………….. DIA DE LABORATORIO:………………. FASE I: Conservación de drogas y elaboración de extractos Obtención y conservación de la droga (Diagrama de Flujo) FASE II: Elaboración de extractos estandarizados Parámetros Propiedad Extracto etanólico Olor Color pH Densidad relativa Índice de refracción Prueba de solubilidad Solventes Extracto seco (mg) Agua destilada Etanol Metanol n-butanol Acetato de etilo Diclorometano Cloroformo Leyenda: (-) Insoluble (+) ligeramente soluble (++) soluble (+++) Muy soluble Tamizaje fitoquímico METABOLITO REACCIÓN CAMBIOS OBSERVADOS INTERPRETACIÓN RESULTADOS CARBOHIDRATO Molish S Antrona Fehling COMPUESTOS FeCl3 FENÓLICOS TANINOS Gelatina FLAVONOIDES Shinoda ANTOCIANINAS Rosenheim Y FLAVONOIDES CATÉQUICOS AMINOÁCIDOS Ninhidrina LIBRES Y GRUPOS AMINO Dragendorff Mayer ALCALOIDES Bertrand Sonnenschein NAFTAQUINONA S, ANTRAQUINONA SY Borntrager ANTRANONAS TRITERPENOIDE Lieberman-Burchard S Y ESTEROIDES SAPONINAS Generación de espuma GLICÓSIDOS Baljet LACTONAS Legal CUMARINAS NH4OH cc ó NaOH 10% LEYENDA:(-) Nul o(+) Leve (++) moderado (+++) abundante Huella Cromatográfica Preparación de muestra: Pesar 0.1 g de extracto seco y solubilizar en 5 mL de solvente. Fase estacionaria: Sílica gel Fase móvil: Detección: Análisis HPLC Calculo de Rf Esquema de resultado PRÁCTICA N° 13 LÍPIDOS, IDENTIFICACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE ACEITES El aceite vegetal es un compuesto orgánico obtenido a partir de semillas u otras partes de las plantas en cuyos tejidos se acumulan como fuente de energía. Están conformados por lípidos definidos como grupo heterogéneo de compuestos insolubles en agua, y solubles en solventes apolares como: éter, cloroformo, benceno o acetona. Las grasas y aceites son ésteres formados por la condensación de ácidos grasos con glicerol.1-5 Métodos de extracción de aceites Usualmente en la extracción de aceites se aplican procesos mixtos y se elige según la naturaleza de la materia prima. Tabla 1. Procesos de extracción de aceites.1 Refinación, Proceso de Ventajas Desventajas deodorización Ejemplos extracción y blanqueo Prensado en Retiene compuestos Bajo rendimiento de aceite NO Aceite de oliva frio o menores virgen, aceite centrifugación como volátiles, de palta, compuestos aceite de fenólicos y clorofila. cáñamo Extracción Proceso no tóxico y más Los rendimientos opcional Aceite de mediante seguro que la extracción pueden ser menores a los avena fluidos con hexano. No requiere obtenidos con hexano supercríticos eliminar (CO2) solventes de la miscela o harina residual. Extracción con Solvente menos tóxico y Difícil de remover SI Aceite de Etanol más seguro que el extractos no lipídicos de la grano de maíz hexano miscela y la harina Prensado Tecnológicamente Menor rendimiento que la SI Aceites estándar simple y extracción con hexano, las comunes económico para altas temperaturas causan producción a algunos cambios químicos en gran escala industrial el aceite y la harina. Extracción con Bajo costo, altos Problemas para la salud y de SI Aceites hexano rendimientos Seguridad. comunes Pre-prensado Bueno para semillas con Requiere más equipamiento SI Aceites + >20% aceite. comunes extracción con hexano Extracción Técnica suave, Altos costos de las enzimas, Opcional En desarrollo acuosa ambientalmente limpia rendimiento menor a la enzimática extracción con hexano. Extracción de aceites Extracción por solventes orgánicos La extracción con solventes, principalmente hexano, es uno de los procesos más tradicionales empleados en la obtención de aceites de semillas oleaginosas. El principio de extracción con solvente se basa en el hecho que un componente (soluto) se distribuye entre dos fases según la relación de equilibrio determinada por la naturaleza del componente y las dos fases. A fin de facilitar el proceso de extracción, es necesario reducir el tamaño de la semilla o grano mediante el quebrado e inclusive el laminado. La aplicación de un tratamiento térmico antes o durante la extracción produce la rotura de la emulsión celular, reduce la viscosidad del aceite facilitando su fluidez y desplazamiento así como disminuye la tensión superficial del aceite. No obstante, dicho tratamiento puede afectar negativamente la calidad química del mismo incrementando los parámetros de oxidación. 1,3 Extracción por prensado en frio 1-3 En el prensado en frío la materia prima no se somete a calentamiento previo o durante la extracción, que permite la retención de una mayor cantidad de compuestos fitoquímicos de interés como algunos antioxidantes naturales. La prensa utilizada comúnmente es la de tornillo helicoidal, aplicando una presión de molienda a las semillas. Otro tipo de técnica es la de aplicar presión directamente sobre las semillas ubicadas en un barril con orificios a los costados lo cual permite el escurrimiento del aceite. La extracción por prensado mecánico, no aplica calor y se recomienda como método de extracción de aceites vírgenes y extra vírgenes ya que conservan las propiedades químicas y constituyentes del aceite. Clasificación de aceites Según el codex alimentarius 2 los aceites vegetales se pueden clasificar como: Los aceites vegetales comestibles: productos alimenticios constituidos principalmente por glicéridos de ácidos grasos obtenidos únicamente de fuentes vegetales. Podrán contener pequeñas cantidades de otros lípidos, tales como fosfátidos, de constituyentes insaponificables y de ácidos grasos libres naturalmente presentes en la grasa o el aceite. Los aceites vírgenes: se obtienen, sin modificar el aceite, por procedimientos mecánicos y por aplicar sólo calor. Se puede purificar por lavado, sedimentación, filtración y centrifugación únicamente. Los aceites prensados en frío: se obtienen por procedimientos mecánicos únicamente, sin la aplicación de calor. Podrán haber sido purificados por lavado, sedimentación, filtración y centrifugación únicamente. COMPETENCIAS Conoce los métodos de extracción de aceites Identifica cualitativamente los aceites vegetales Analiza la calidad de los aceites METODOLOGÍA Extracción por prensado en frio Extracción por solventes orgánicos Análisis cualitativo Índice de acidez MATERIALES Y EQUIPOS Materiales de vidrio Solventes orgánicos Reactivos de precipitación PARTE EXPERIMENTAL I. Reacciones generales de caracterización REACCIÓN PROCEDIMIENTO RESULTADOS Heidenreich Tomar V gotas de H2SO4 concentrado en tubo Observar coloración parda- de ensayo y verter por las paredes gotas del rojiza. aceite. Hauchercorne Colocar V gotas de aceite y añadir reactivo Observar color, luego someter de Hauchercorne, agitar por 2 min. a baño maría por 20 minutos. Observar coloración parda- rojiza. Bellier Colocar V gotas de aceite en un tubo de Los aceites vegetales dan ensayo, V gotas de HNO3 concentrado y V coloraciones rojas, verdes o gotas de solución saturada de resorcina en violetas. benzol, agitar por 10 segundos, Elaidínica Colocar en un tubo de ensayo seco 1 mL de Observar. aceite más X gotas de HNO3 concentrado, agitar por 2 minutos, añadir mg de mercurio metálico, agitar y dejar en reposo. PARTE EXPERIMENTAL ACEITE PROCEDIMIENTO RESULTADO POSITIVO MANÍ Reacción de Blarez o araquidato de Formación de precipitado potasio: tomar 1.5 mL de aceite de maní en un matraz de 250 mL, adicionar 15 mL de potasa alcohólica al 5%, adaptarle un refrigerante de reflujo, colocar a baño maría por 20 min, enfriar el matraz. OLIVA Reacción de Hauchercorne: tomar 1 mL de Luego someter a baño maría aceite y agregar 1mL de HNO3 y V gotas por 20 min. Observar la de agua, agitar por 2 minutos y después de coloración: el aceite de oliva 15 minutos en reposo, observar el color. puro permanece inalterable mientras que los demás aceites varían del amarillo al pardo. Reacción de Fluorescencia: tomar V gotas Observar fluorescencia azulada de aceite y diluir en 1mL de cloroformo ALMENDRA Reacción de Bieber: mezclar V gotas de Si el aceite de almendras es H2SO4 concentrado, V gotas de HNO3 puro, se forma una emulsión concentrado y V gotas de agua con 1 mL de amarilla que al cabo de algún aceite de almendras. tiempo pasa a color rojizo. AJONJOLÍ O Reacción de Behrens: mezclar en un tubo Coloración verde. SÉSAMO de ensayo V gotas de H2SO4 concentrado y V gotas de HNO3 concentrado, luego añadir V gotas de aceite. Reacción de Bellier: colocar V gotas de Coloración verde que persiste aceite en un tubo de ensayo, V gotas de algunos minutos. HNO3 concentrado y V gotas de solución saturada de resorcina en benzol, agitar por 10 min y observar. Reacción Baudovin: Colocar V gotas de Coloración rojiza. aceite en un tubo de ensayo, miligramos de sacarosa y V gotas de H2SO4 concentrado, agitar y dejar en reposo por 5 a 10 minutos. R. Villavecchia y Fabris (detecta hasta Coloración del rosado al rojo. 0.25-0.5% de aceite): colocar II a III gotas de una solución alcohólica de furfurol, V gotas de aceite y V gotas de H2SO4 concentrado, agitar y dejar en reposo. LINAZA R. Heidenreich: colocar en una cápsula de Coloración anaranjada y luego porcelana, V gotas de H2SO4 concentrado y se forma una película negra. verter por las paredes gotas del aceite. R. Hauchercorne: colocar 1 mLde aceite y Coloración rojo castaño. añadir HNO3: agua (3:1), agitar y después de 2 minutos observar el color, luego someter a baño maría por 20 minutos. RICINO R. Brulle: colocar 10mL de aceite de ricino, Coloración amarilla. 3 mL de HNO3 diluido más 0.1 g de albúmina en polvo, someter a calentamiento, al llegar a ebullición agitar, calentar nuevamente y dejar en reposo 30 min. Solubilidad: colocar V gotasde aceite y Observar solubilidad de aceites añadir alcohol 96° y agitar. colocar V gotasde aceite y añadir ácido acético y agitar. Fusión potásica: tomar 2 mL de aceite y Observar precipitado de ácido agregar 2 pastillas de KOH, calentar (se sebásico. percibe olor característico), hasta no percibir olor, enfriar y disolver en agua, adicionar MgCl210%, observar precipitado de ácidos grasos, filtrar y tratar el líquido filtrado con HCl 10%. BACALAO Disolver III gotas del aceite en el cloroformo, Coloración violeta que pasa a añadir III gotas de H2SO4 cc pardo. I. Índice de yodo - Método de Hanus Es el peso de yodo absorbido por la muestra, se expresa en gramos de yodo por 100 g de muestra. El índice de yodo indica la proporción de dobles enlaces en los ácidos grasos que constituyen la grasa o aceite y se expresa como miligramos de yodo que se fijan por adición en 100 g de aceite. Reactivos Solvente: cloroformo Yoduro de potasio al 30% Reactivo de Hanus: solución reactivo de yodo bromuro Titulante: tiosulfato de sodio Na2S2O3 0.1N Indicador: S. R. engrudo de almidón Técnica operatoria 1. Pesar 0.2 – 0.3 g de la muestra problema en un matraz con tapa esmerilada. 2. Añadir 10 mL del solvente y agitar hasta completa disolución y agregar exactamente 25 mL del reactivo de Hanus; tapar, agitar y colocar el matraz al abrigo de la luz 30 min. 3. Agregar 10 mL de solución de yoduro de potasio al 30% y 100 mL de agua. 4. Valorar con la disolución de tiosulfato sódico 0.1 N hasta la decoloración del color amarillo producido por el yodo, añadir gotas de S.R engrudo de almidón y continuar la valoración con agitación intensa hasta que desaparezca la coloración azul. 5. Se efectúa paralelamente el ensayo en blanco El índice de yodo se expresa: II = II. Determinación de la acidez La acidez de un producto natural se considera como su contenido en sustancias ácidas. Habitualmente se determina mediante técnicas de valoración ácido-base y se puede expresar como la cantidad equivalente de un ácido característico de ese producto natural. En el caso de aceites fijos y grasas el índice de acidez puede expresar como el número de mL de álcali 0.1N requerido para neutralizar los ácidos libres en 10 gramos de sustancia R-COOH + KOH 3R-COOK + H2O Índice de acidez (ácidos grasos libres) Definición: mg de hidróxido de potasio necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres contenidos en 1.0 gramos de aceite o grasa. Dónde: Reactivos V1: mililitros de la solución Titulante : KOHde0,1tiosulfato N sódico utilizada para el Indicador: fenolftaleína al 0,1% en etanol. ensayo en blanco. Mezcla disolvente: alcohol : cloroformo (1:1) V2: mililitros de la solución de tiosulfato Técnica Operatoria sódico utilizada para la 1. Pesar de 2 ó 3 g de aceite en un matraz Erlenmeyer, previamente tarado. determinación. 2. Tomar 30 mL mezcla disolvente (alcohol-cloroformo 2:1) y neutralizar con KOH 0,01 hasta P: peso en gramos de coloración rosada persistente del indicador. la muestra problema. 3. Cargar la bureta con la disolución de KOH 0,1 N, enrasar e iniciar la valoración, agitando continuamente, hasta viraje del indicador. Anotar los mL de KOH gastados. 1.27 (V1 - P: peso de la muestra V: volumen en mL de hidróxido de sodio gastado CUESTIONARIO 1. ¿Qué recursos naturales son fuente promisoria de aceites vegetales? 2. Describa otros métodos para el análisis en aceites. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Azócar L, Ciudad G, Heipieper HJ, Navia R. Biotechnological processes for biodiesel production using alternative oils. Appl Microbiol Biotechnol. octubre de 2010;88(3):621-36. 2. 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Extracción y Caracterización Fisicoquímica del Aceite de la Semilla (Almendra) del Marañón (Anacardium occidentale L). Información tecnológica. 2011;22(1):51- 8. 8. Li Q, Du W, Liu D. Perspectives of microbial oils for biodiesel production. Appl Microbiol Biotechnol. octubre de 2008;80(5):749-56. 9. Lu C, Napier JA, Clemente TE, Cahoon EB. New frontiers in oilseed biotechnology: meeting the global demand for vegetable oils for food, feed, biofuel, and industrial applications. Curr Opin Biotechnol. abril de 2011;22(2):252-9. 10. Panreac Química SA. Métodos Analíticos en Alimentarias. Métodos Oficiales de Análisis Aceites y Grasas. 1999;15. PROTOCOLO N° 13 LÍPIDOS, IDENTIFICACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE ACEITES HORARIO………………………………………….. FECHA………………………………. MESA DE TRABAJO …………………………….. DROGAS CON LIPIDOS I. RESULTADOS MUESTRAS:…………………. REACCIONES GENERALES REACCIÓN RESULTADOS R. Heidenreich R. Hauchercorne R. Bellier R. Elaidínica ÍNDICE DE YODO CÁLCULOS RESULTADOS ÍNDICE DE ACIDEZ CÁLCULOS RESULTADOS INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS IDENTIFICACIÓN DE ACEITES 1.Aceite de maní: 5. Aceite de linaza Reacción Observación Reacción de Blarez Reacción Observación 2. Aceite de oliva R. Heidenreich Reacción Observación R. R. Hauchercorne Hauchercorne 6. Aceite de ricino 3. Aceite de almendras Reacción Observación Reacción Observación Solubilidad R. Bieber R. fusión potásica 1. Aceite de sésamo R. Brulle REACCIÓN OBSERVACIÓN 7. Aceite de bacalao R. Villavecchia y Fabris Reacción Observación R. Behrens cloroformo R. Baudovin R. Bellier INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS PRÁCTICA Nº 14 ANÁLISIS DE VITAMINAS INTRODUCCIÓN Las vitaminas son compuestos orgánicos que cumplen funciones vitales relacionadas con el metabolismo y con la fabricación de hormonas, neurotransmisores, células sanguíneas o material genético. Poseen función enzimática acelerando reacciones químicas. Según su solubilidad se clasifican en: Vitaminas hidrosolubles. Vitamina B1 Vitamina B2 Vitamina B3 Vitamina B6 Ácido fólico Vitamina B12. Vitamina C. Ácido pantoténico Biotina Vitaminas liposolubles. Vitamina A Vitamina D Vitamina E Vitamina K COMPETENCIA Analiza cualitativamente vitaminas liposolubles e hidrosolubles METODOLOGÍA Reacciones de coloración MATERIALES Y EQUIPOS Materiales de vidrio Solventes orgánicos Reactivos de precipitación PARTE EXPERIMENTAL I. Análisis cualitativo VITAMINA LIPOSOLUBLES procedimiento Reacción positiva vitamina A R. de Carr-Price: evaporar 3 mL del Coloración azul fugaz. extracto etéreo, disolver en cloroformo y adicionar gotas de S.R SbCl3. vitamina D R. de Liebermann: evaporar 0.5 mL del Coloración roja que extracto etéreo, adicionar 1 mL de pasa al violeta, azul y cloroformo, 1 mL de anhidro acético y finalmente al verde. gotas de H2SO4 cc en zona. VITAMINAS HIDROSOLUBLES Vitamina C Tratar V gotas de filtrado con V gotas mL de Precipitado rojo de óxido S.R Fehling o Benedict, calentar. cuproso Diluir 1 mL de ácido ascórbico al 2% con Decoloración del reactivo pocos mL de 2,6 diclorofenolindofenol. Tratar V gotas del filtrado con S.R. Yodo. Decoloración del reactivo Complejo B R. del tiocromo: disolver mg de la muestra en Da fluorescencia azul que VIII gotas de NaOH 0.5 N adicionar 1 mL de se observa en la luz Vitamina B 1 o Tiamina Ferrocianuro de potasio al 10%, 1 mL de ultravioleta que alcohol isobutílico y agitar por 2 min. desaparece al adicionar gotas de ácidos diluidos y se regenera al adicionar gotas de soluciones alcalinas. Precipitación con el ácido silicotúngstico: Precipitado característico. Tratar mg de muestra con agua, adicionar HCl diluido y calentar ligeramente, adicionar gotas de S.R ácido silicotúngstico. Tratando una solución de vitamina B1 con Precipitado blanco. HgCl2. Tratando una solución de vitamina B1.con Precipitado rojo pardo S.R. Yodo. Vitamina B2 o Riboflavina Disolver mg de muestra con agua, da una Fluorescencia verde. coloración amarilla. Vitamina B6 o Piridoxina Tratar 1 mL de solución de vitamina B6 con Coloración rosada que S.R FeCl3. pasa al rojo CUESTIONARIO 1. Mencione especies que presentan vitaminas 2. Describa otros métodos de cuantificación de vitamina C. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Alonso P, Salucci M, Lázaro R, Malani G, Ferro-Luzzi A. Capacidad antioxidante y potencial de sinergismo entre los principales constituyentes antioxidantes de algunos alimentos. Rev Cubana Alim Nutric. 1999;13(2):104-11. 2. Flórez J. Vitaminas liposolubles e hidrosolubles. Farmacología humana (3rd ed), Editorial Masson, SA, Barcelona. 1999;991-1005. 3. Benítez Zequeira DE. Vitaminas y oxidorreductasas antioxidantes: defensa ante el estrés oxidativo. Revista cubana de investigaciones biomédicas. 2006;25(2):0-0. PROTOCOLO Nº 14 ANÁLISIS DE VITAMINAS HORARIO………………………………………….. FECHA………………………………. MESA DE TRABAJO …………………………….. I. RESULTADOS ANÁLISIS CUALITATIVO REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN REACCIÓN vitamina A vitamina D vitamina C vitamina B MUESTRA PROBLEMA INTERPRETE SUS RESULTADOS
Report "UD Farmacobotanica y Farmacognosia 2.docx"