BIOLOGÍA MOLECULARMÉTODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES EN PLANTAS Integrantes: Valeria Flores. Cristina Guevara. Gabriel Navarrete. Christian Pérez. Ana Tello. Semestre: Octavo. Fecha: 05 de Julio del 2016. Producción de animales transgénicos ADN es microinyectado en pronúcleos de células embrionarias después de la fertilización. Esto es debido a la disponibilidad de tecnología especializada en fertilización in vitro, que permite manipulación del óvulo, cigoto o embrión prematuro. Producción de plantas transgénicas Protoplastos o meristemos que pueden ser cultivados y utilizados para regeneración de plantas enteras. Son utilizados para la transferencia de genes seguido por regeneración. También se utilizan polen o cigotos para la transferencia de genes en plantas. Células diana para transformación El primer paso en la tecnología de transferencia de genes es seleccionar células que sean capaces de dar lugar a plantas completas transformadas. Tipo de célula diana Cultivos celulares o protoplastos Células meristematicas de embrión inmaduro u órgano Células en embriones inmaduros, brote y meristemos florales Polen Método utilizado para la regeneración Organogénesis o embriogénesis vía fase de callo Regeneración de plantas in vitro a partir de células transformadas Desarrollo normal (in vivo) de embrión, brote o flor seguido por el uso de polen (transformado) de la planta quimérica para producir semillas transformadas. Polen utilizado para polinización que conduce a la producción de plantas Transferencia de genes en polen Puede dar lugar a gametos genéticamente transformados, que si se utilizan para la fertilización (in vivo) puede dar lugar a plantas enteras transformadas. Inserción de ADN en el cigoto (in vivo o in vitro), seguido por la liberación de embriones, pueden también ser utilizados para producir plantas transgénicas. Enfoque alternativo Es el uso de células individuales en embriones o meristemos, que pueden ser cultivadas in vitro para la producción de plantas transgénicas. el más común es el nptII. proporcionando resistencia a la kanamicina.Vectores para transferencia de genes Características generales La mayoría de vectores llevan marcadores genéticos. ColEI). Otras características incluyen: (I) único sitio de restricción múltiple. que permiten el reconocimiento de células transformadas (otras células mueren debido a la acción de un antibiótico o herbicida) y se describen como marcadores de selección. (II) orígenes de replicación bacterianos (por ejemplo. Entre los marcadores genéticos. . rhizogenes causa la enfermedad “raíces en cabellera”.Vectores basados en plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium Mecanismo de inducción de tumores de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens. . Una especie relacionada A. El segmento se llama T-ADN y es parte de un plásmido grande Ti (inductor de tumores) encontrado en cepas virulentas de Agrobacterium tumefaciens. rhizogenes. Esta enfermedad es causada debido a la transferencia de un segmento de ADN de la bacteria al genoma nuclear de la planta. que es el organismo causal de la enfermedad “corona de agallas”. Megaplasmido Ri (inductor de raíz) se encuentra en cepas virulentas de A. Esta región se llama región de virulencia (vir) .Región A Región B Comprende el T-ADN Responsabl (ADN e de la transferido) replicación responsable de la inducción de tumores Región C Región D Responsabl e de la Responsabl conjugación e de la virulencia. . El ADN-T esta localizado en el plásmido Ti que además contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de ADN en el genoma de la planta.COMPONENTES DEL Proceso de infección: A. la síntesis de unos derivados de aminoácidos llamados opinas (como octopina o nopalina) y de síntesis de fitohormonas. Expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores. PLÁSMIDO TI tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de su ADN (ADN de transferencia) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los genes del ADN-T. PONENTES DEL PLÁSMIDO TI . transferencia e integración del T-DNA sean efectivas Una corresponde a ambos extremos del TDNA (LB: borde izquierdo y RB: borde derecho) que consisten en una repetición directa casi perfecta de 25 pb (5'TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC3') PONENTES DEL PLÁSMIDO TI . La otra es la llamada región Vir que se requiere para que la escisión.Plásmidos Ti presentan dos regiones esenciales para la movilización e integración del TDNA en las células vegetales. virE virulencia. Esta organizado en 6 operones • Genes vir A. virD.ONENTES DEL PLÁSMIDO TI La región vir Aproximadamente 35 Kbp La separación física de T-ADN Mientras las secuencias de y la región vir en dos borde funcionan en plásmidos diferentes no orientación cis con respecto a afecta a la transferencia de TT-ADN. .B D y G son necesarios para la virB. de Agrobacterium. =Policistrónico • Genes vir C y E son virA. virC. vir G necesarios para la formación de tumores . la región es capaz de ADN siempre y cuando estén funcionar en la orientación presentes en la misma Célula trans. acetosiringona .VirA membrana interna de las células de Agrobacterium y es un quimiorreceptor de compuestos fenólicos producidos por las La proteína citoplasmática VirG plantas como la es fosforilada por VirA que pasa a su forma activa y estimula la transcripción del resto de genes vir.ONENTES DEL PLÁSMIDO TI Vir A y Vir G reaccionan con la presencia de exudados de plantas heridas y promueven la activación se encuentra en la transicional de los genes vir. . .•Los productos resultantes de la activación del gen virD. •En el transporte a través de la membrana bacteriana están implicados los productos del operón virB. VirD1 (topoisomerasa) y VirD2 (endonucleasa). •El DNA de simple cadena que se libera se recubre por proteínas VIRE2. VirD2 permanece covalentemente unida al extremo 5’ de la hebra de DNA impidiendo la delección de este extremo y que este extremo sea el primero en entrar en el núcleo de la célula vegetal. que protegen al DNA de la degradación por nucleasas a la vez que lo dirigen hacia el genoma de la célula vegetal. •El T-DNA es convertido a su forma bicatenaria y la parte monocatenaria en el plásmido Ti es reparado por sistemas celulares. realizan dos cortes en la cadena de DNA en la zona comprendida entre los bordes del T-DNA. •Tras el corte. . Diseño De Vectores Plásmidos Ti Y Ri Los plásmidos Ti no • • • permiten su uso directo debió a: Su gran tamaño La ausencia de sitios únicos de enzimas de restricción La propiedad de inducción de tumores. Elementos esenciales para el diseño de vectores de transformación: • T-ADN (desarmado) • Genes vir . El desarme de los plásmidos Ti se logro mediante la sustitución de tumor inducido de genes en T-ADN por los marcadores seleccionables tales como nptll que proporciona recistencia contra antibióticos como la kanamicina. Las células tumorales no pueden desarrollarse en brotes normales. La recombinación se lleva a cabo por un evento de entrecruzamiento de .Dos tipos de vectores Agrobacterium • Vectores co-integrados • Vectores Binarios Vectores co-integrados Estos vectores son construidos por la recombinación entre un plásmido Ti desarmado que contiene el borde izquierdo y un pequeño vector que contiene el gen de interés flanqueado por el borde derecho y una región homóloga al borde izquierdo. un vector de clonación común pequeña de E. El vector intermedio (por ejemplo PGV 1103) basado en pBR322 se conjuga en pGV3850 en la región de pBR322 homología. que también se transfiere al huésped de la planta junto con el gen destinado a ser transferido . pGV3850:: 1103 T-ADN contiene la totalidad de vector intermedio que incluye el DNA no deseado. coli.Uno de los co-integrados primeros vectores Vectores cointegrative. D espués de cointegración. donde casi todo el ADN-T ha sido borrada y reemplazada por pBR322. pGV3850 fue desarrollado a partir de un plásmido Ti tipo nopalina (C58). Vectores co-integrados . coli y Agrobacterium y capaz de realizar transferencia entre estas dos especies -Gen de resistencia a kanamicina (APH-1) para la selección en bacterias -Límites de T-ADN derivado de pTiT37 -Plantación marcador de transformación seleccionable CNNT-U aislado del transposón -TNS (Este marcador se asocia con el promotor y señal de poliadenilación derivada del gen de la síntesis de la nopalina o nos) -Sitio de clonación múltiple deriva de PUCL 9 y alojado dentro de la región lacZ (~ gen galactosidasa) .VECTORES BINARIOS Basado en que el gen VIR VECTOR pBin 19 localizado en un plásmido "ayudante" Ti que tiene el conjunto de T-DNA eliminado -Diseñado en 1984 -Popular aún en la actualidad -Basado en una amplia gama de huéspedes vector pRK252 T-DNA Está en un vector separado (vector binario) diseñado para replicare tanto en E. . VECTORES DE VIRUS Genomas aislados son capaces de infectar el tejido vegetal intacta • Empleados como vectores de transformación de plantas • Genomas viral no pueden INTEGRARE con el genoma de la planta • Usan solamente para un estudio de la expresión de transferencia de genes transitorios • Vectores de virus no se pueden utilizar para la producción de plantas transformadas de forma estable (plantas . TRANSFORMACIÓN MEDIANTE AGROBACTERIUM Dicotiledón eas - Monocotiledó neas Usado para la transferenc ia de ADN extraño en angiosperm as Utiliza sus plásmidos como vectores . las células deben replicar su ADN o bien realizar mitosis (iii) Los tejidos o explantes transformadas a menudo no se regeneran.REQUISITOS PARA LA PRODUCCIÓN DE (i) Los explantes de plantas deben producir compuestos PLANTAS TRANSGÉNICAS activos con el fin de inducir los genes vir para la virulencia (ii) Las agrobacterias inducidas deben tener acceso a las células que son competentes para transformación. y es difícil de combinar competencia transformación con totipotencia . para que se produzca la transferencia de genes. LOS EXPLANTES USADOS PARA LA TRANSFORMACION Protoplastos Células cultivadas en suspensió n Cortes de tejido Secciones de órganos enteros Epidermis Heridas e inoculació n de plantas enteras Células de callo (no diferenciadas y proembriogénic as). . LOS GENES MARCADORES DE SELECCIÓN Y PUNTUACIÓN DE LAS CÉLULAS TRANSFORMADAS / CALLOS O BROTES Explantes inoculados con Agrobacterium Ejemplo: tabaco emplea El antibiótico kanamicina Portan del vector requisito que tiene el gen de interés Permiten que las células transformadas puedan sobrevivir en medios que contienen niveles tóxicos del agente de selección. Seleccionan las células / tejidos transformados Genes marcadores seleccionables disponibles en el vector . que suele ser un antibiótico o un herbicida. . Gen de la enzima NPT II se utiliza a menudo con el promotor nos Imparte resistencia a la kanamicina Gen se utiliza como marcador legibles en experimentos que implican la transferencia de genes que conducen a la producción de aviones transgénicos. .GEN DE NEOMICINA FOSFOTRANSFERASA (NPTII). Se usa también para detectar su presencia en el tejido transformado o planos transgénicos. el gen nptII tenía efectos adversos sobre la expresión del gen introducido deseable de manera que otros medios de mejorar su expresión tuvieron que ser utilizados. • Se utiliza tanto como un marcador de selecciónen los experimentos que implican la transferencia de genes que conducen a la producción de plantas transgénicas. • Imparte resistencia a la kanamicina • En algunos casos. .GEN DE NEOMICINA FOSFOTRANSFERASA (NPTII). que se utiliza para cubrir el gel que contiene la enzima. la enzima a partir de plantas transgénicas se fracciona primero usando electroforesis en gel no desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE). . Puesto que la enzima desintoxica kanamicina por fosforilación. ATP marcado radiactivamente (32P) se usa con kanamicina en una capa de agar.Para un ensayo enzimático de NPT II. Todo el conjunto se incuba al 35°C dando lugar a la incorporación de 32P en la kanamicina pueden ser detectados por autorradiografía. existen graves problemas en el uso de este método para obtener plantas transgénicas debido a los problemas de regeneración de plantas a partir de protoplastos .la captación directa de ADN por protoplastos puede ser estimulada por productos químicos como el polietilen glicol (PEG). El cúal se usa también para estimular la captación de liposomas y mejorar la eficiencia de la electroporación PEG en una concentración elevada ( 15-25 % ) se precipitará macromoléculas iónicas como el ADN y estimular su absorción por endocitosis Sin embargo . La enzima usa acetil CoA + cloranfenicol (32P) como sustratos y ayuda en la transferencia de un grupo acetilo hacia el cloranfenicol. La presencia de acetil chloramfenicol se detecta como una banda separada mediante autorradiografía. su presencia puede ser detectada mediante un ensayo de enzima. de modo que cada vez transferido en una construcción génica. .GEN CLORANFENICOL ACETIL TRANSFERASA • Este gen se utiliza principalmente como un gen reportero (CAT) • El primer gen aislado de E. coli cofifica para una enzima cat la cual • está ausente en los mamíferos y plantas superiores. por lo que su presencia se puede detectar in situ . que no requiere la extracción de ADN . electroforesis o autorradiografía . coli . • La enzima GUS es codificada por un gen gus . que pueden utilizarse como sustratos . descompone glucurónidos que dan una reacción de color .nitro fenilo glucurónido ( PNPG ).GLUCURONIDASA (GUS) GEN (GUS). glucurónido resorufina ( REG ) . incluyen p . La principal ventaja de utilizar este gen reportero radica en su ensayo . • La enzima glucoronidasa . popularmente descrita como GUS. 3 . es decir en el interior del tejido de la planta . .aislada por primera vez de E. • Varios glucurónidos .indol glucurónido ( BCJG ). GEN DE LUCIFERASA (LUX). que se suministra exógenamente. en luciérnaga consiste en un único polipéptido codificado por un gen lux. cuando la fuente es luciérnaga. consta de dos subunidades peptídicas codificadas por genes lux A lux B y. Mientras que en las bacterias. • La enzima luciferasa en estos dos sistemas utiliza diferentes sustratos para la luminiscencia. luciferina (un . el sustrato utilizado es un aldehído (decanal). • Se diferencia en bacterias y luciérnagas. • En presencia de un sustrato adecuado. • Cuando la fuente del gen es una bacteria. la enzima luciferasa confiere al organismo la capacidad de brillar en la oscuridad. Alternativamente. los cereales que comprenden los cultivos alimentarios más importantes. • La entrega física de ADN o transferencia de ADN mediada (DMGT). las técnicas de cultivo de tejidos para la regeneración no tuvieron mucho éxito. en muchos cultivos. Estas dos limitaciones obligó a la intensa búsqueda de métodos alternativos para la transferencia de genes. emplea métodos. la endocitosis de plásmidos o liposomas cargadas con ADN y la electroporación se emplean para la administración de ADN a . Por ejemplo. estimulada químicamente . que pueden agruparse de acuerdo con el tipo de célula diana. como se describe a menudo. incluyendo cereales y legumbres. no eran susceptibles de este método de transferencia de genes (transferencia de genes mediada por Agrobacterium) Además. pero en el pasado.Transferencia mediada de ADN (DMGT) • La transferencia de genes mediada por Agrobacterium ha sido el método más comúnmente usado de la transferencia de genes en las plantas. debido a la regeneración de plantas transformadas a partir de tejidos derivados de protoplastos fue difícil en muchas especies particularmente en los cereales Sin embargo. macroinyección y tiro con microproyectiles. cigotos. Estas técnicas alcanzaron significación en el pasado.). Se pueden utilizar con una variedad (por ejemplo. ya que la transferencia mediada por Agrobacterium por ahora se ha hecho posible en amplio espectro de especies de plantas. etc. MACROINYECCIÓN Y TIRO CON MICROPROYECTILES Entre otras técnicas se tiene la microinyección. estos métodos ya no se consideran importantes. embriones inmaduros. .MICROINYECCIÓN. gametos. meristemas de órganos. Estas células pueden ahora ser sembradas en placas a baja densidad en medio de selección . PEG también se usa para estimular la captación de liposomas y para mejorar la eficiencia de la electroporación En una concentración elevada ( 15-25 % ) puede precipitar macromoléculas iónicas como el ADN y estimular su absorción por endocitosis sin ningún daño del protoplasma.CAPTACIÓN DE ADN POR PROTOPLASTOS ESTIMULADA QUÍMICAMENTE la captación de ADN directa por protoplastos puede ser estimulada por productos químicos como el polietilen glicol (PEG). existen graves problemas en el uso de este método para obtener plantas transgénicas debido a los problemas de regeneración de plantas a partir de protoplastos . Sin embargo . seguido de la formación de la pared celular y la iniciación de la división celular. todavía sigue siendo un problema . que fomentan el desarrollo continuo de las estructuras inmaduras .LA MICROINYECCIÓN DE ADN La regeneración de plantas a partir de protoplastos transformados . proporcionan dianas celulares alternativos para la transformación. plantas transformadas de origen unicelular se pueden obtener posteriormente . a partir de esta planta quimérica . Estas estructuras inmaduras pueden incluir embriones inmaduros . etc. polen inmaduro . Por lo tanto tejidos cultivados . óvulos aisladas. . La principal desventaja de esta técnica es la producción de plantas quiméricas con sólo una parte de la planta transformada Sin embargo . meristemos . células cultivadas en suspensión embriogénicos . polen en germinación . Las células receptoras se inmovilizan sobre un soporte sólido o unido artificialmente a un sustrato o en poder de una pipeta bajo succión. A menudo se emplea un micromanipulador especialmente diseñado para la microinyección de ADN . el proceso es lento .Cuando se utilizan células o protoplastos como objetivos en la técnica de microinjecrion . se utilizan micropipetas de vidrio con punta de diámetro 0. esta técnica proporciona una alta tasa de éxito. caro y requiere de personal altamente calificado y . Aunque .5 – 10 μm para la transferencia de macromoléculas en el citoplasma o el núcleo de una célula receptora o protoplasto . Estos microproyectiles. La aceleración se consigue. las células en los tejidos y meristemas diferenciados). de modo que puedan penetrar las paredes celulares de tejido intacto. ya sea por una carga explosiva (explosión de la pólvora) o mediante el uso de ondas de choque producida por una descarga eléctrica de alto voltaje. normalmente 1-3μm de diámetro. son llevadas por un 'Macroproyectil' o 'bala' y se aceleran en células de plantas (células diana que pueden ser de polen.MICROPROYECTILES (PISTOLA DE PARTÍCULAS) PARA LA TRANSFERENCIA GÉNICA En los últimos años. . células cultivadas. se ha demostrado que la administración de ADN a células de la planta también es posible. cuando micropartículas pesadas (de tungsteno u oro) recubiertos con el ADN de interés se aceleran a una velocidad muy alta inicial (1400 pies por segundo). tamaño y forma o la presencia/ausencia de paredes celulares no altera significativamente su eficacia. causando múltiples golpes que resultan en la transferencia de genes en muchas células simultáneamente. . pero dado del éxito posterior con la transferencia de genes mediada por Agrobacteriutn en los cereales y otros materiales difíciles . En vista de esto. el método es universal en su aplicación de manera que el tipo de células . el método de bombardeo de partículas usando microproyectiles se convirtió en uno de los métodos más prometedores para la transferencia de genes . este método apenas se usa ahora.Las ventajas de este método incluyen : miles de partículas son aceleradas al mismo tiempo . Método de Electroporación . Pero en ciertos casos no es posible la . aumentado la permeabilidad del protoplasmas de la célula. Prueba de Transformación El ADN esta en contacto directo con la membrana.Método de electroporación para la transferencia de genes Basado Impulsos eléctricos cortos de alta integridad. lo tanto es considerada como una técnica eficiente. 5 Kv de pulso de onda rectangular de corta duración o de 350 v pulso de larga duración A B . Se da una tensión de 1.Método de electroporación para la transferencia de genes La electroporación se genera mediante descargas de un condensador a través de electrodos especialmente diseñados. Pueden fusionarse mediante dispositivos como PEG OCURRE EN 3 pasos .posomas (transferencia de gene Liposomas. Pequeñas bolsas del lípidos.Fusión de los liposomas.Adherencia de los liposomas . Liberación de plásmidos . Transformación mediante el polen o el tubo polínico.Otros Métodos Método de precipitación de fosfato de calcio. Investigaciones en el centro de investigación en biotecnología de Beijing . Germinación por de polen y puede integrarse en núcleos de espermatozoides a través del tubo polínico. embriones. células o tejidos en el ADN. El ADN es liberado en el interior de la célula mediante la precipitación de Ca. AND viral. Transformación por ultrasonicación ADN plasmidicos sonicado. Incubación de grano seco. Ha sido probado en muchos casos y e expresión de genes.