UNIVERSIDADE SALGADO DE OLIVEIRA – UNIVERSO Campus de NiteróiControle de Qualidade Cromatografia Liquida de alta eficiência Professora: Roberta Katlen Fusco Alunos: Ana Maria Motta Janine Simeão Dayane Marins Kariny Santos Evelyn Castro Ricardo José Fabiane Barros Silvânia Almeida Iasminy Barros Viviana Soares Junho/2012 Cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) Pode ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de analise, vem tendo destaque devido a facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação de espécies químicas. Trata-se de um método físico-químico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis (fase móvel e estacionária). Utiliza colunas fechadas que contêm partículas muito finas que proporcionam separações muito eficientes, são utilizadas altas pressões para forçar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da análise. Tipos de Cromatografia A classificação dos métodos cromatográficos pode ser quanto ao mecanismo de separação, quanto a técnica empregada e em relação ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificação mais popular é a que leva em consideração o tipo de superfície na qual ocorre a separação, sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. pois parte da amostra pode se adsorver de forma irreversível. . o analista deve ser experiente. a eluição é feita pela ação da gravidade tornando o processo demorado. a coluna deve ser cheia a cada separação acarretando desperdício de material e de mão-de-obra. espectrofotometria.Diferenças entre a CLAE e a cromatografia líquida clássica (CLC) A cromatografia líquida clássica utiliza-se de um equipamento barato no qual o empacotamento da coluna é descartado. o que requer muito tempo devido ao grande número de frações coletadas. análise química ou registro gravimétrico e os resultados são registrados em forma de cromatograma. como. também pode ser usada alguma técnica que auxilie neste processo. um gráfico da concentração da amostra versus o número da fração. a quantificação e detecção são feitas pela análise manual das frações individuais. . As análises são mais precisas.Na cromatografia líquida de alta eficiência a coluna é fechada. sensibilidade e reprodutibilidade. mas oferecem resistência à vazão da fase móvel necessitando aplicação de sistemas de bombas de alta pressão. tem alta resolução. podendo ser utilizada inúmeras vezes. A injeção é feita com microsseringas ou através de válvulas de injeção e diversos tipos de detectores podem ser utilizados. mas dispõe de equipamentos caros e de alto custo de manutenção e operação. Este método não necessita tanta experiência do operador. as colunas utilizadas são bastante eficientes. isso faz com que a velocidade da eluição aumente. pois a vazão da fase móvel é facilmente controlada. . . e termicamente estáveis. por este motivo que a fase móvel é um gás inerte tendo como função somente carregar a amostra volatilizada. basta que sejam solúveis na fase móvel. . Este método possui maior versatilidade.Comparação da CLAE com a cromatografia gasosa (CG) Na cromatografia gasosa as amostras devem ser voláteis. pois pode ocorrer a variação tanto na fase móvel como na fase estacionária. o que ocorre não na CG. Neste método os equipamentos são mais baratos e o tempo de análise é reduzido. por isso tem uma maior aplicação. pois a fase móvel é sempre um gás inerte. para que possam passar pela coluna na forma de vapor. A amostra não deve interagir com a fase móvel. Na CLAE as amostras não precisam ser voláteis nem termicamente estáveis. . Vantagens e desvantagens . As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos: 1) Forças de dispersão de London ou Forças de Van der Waals. . 2) Interações de dipolo induzido. A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos individuais. 3) Ligações de hidrogênio. a qual é atravessada pela fase móvel.O Processo Cromatográfico Na cromatografia líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. 4) Interações dielétricas. não deve dissolver a fase estacionária. pois isso irá interferir diretamente na eficiência da separação. não ser tóxico e deve ter baixa viscosidade. para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificação. deve dissolver a fase móvel sem decompor seus componentes. também influenciarem na intensidade da vazão. deve ser compatível com o detector. devido ao fato de solventes viscosos além de dificultarem a transferência de massa entre a fase móvel e a fase estacionária.Fases – Fases Móveis (FM) Para que um solvente possa ser utilizado como fase móvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fácil purificação. . o poder de eluição diminui com o aumento da polaridade. Se a separação for com fase normal. a compatibilidade com o detector e a toxidez. a viscosidade. que determina seu poder de eluição juntamente com a polaridade da fase estacionária e com a natureza dos componentes da amostra. . por isso é necessário examinar fatores que determinam sua escolha. o poder de eluição aumenta com o aumento da polaridade. Uma fase móvel adequada é indispensável para a HPLC. Outros fatores que também devem ser considerados são o ponto de ebulição. como a polaridade desta. se a separação for em fase reversa. quando tem entre 20 e 10μm. intermediárias.Fases Estacionárias (FE) Devem ter alta resolução entre os componentes da amostra. quando apresentam diâmetro entre 20 e 40μm. As partículas da fase estacionárias podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: macropartículas. Elas podem ser de formato esférico. Quanto menor for a partícula. melhorando assim o processo de difusão das moléculas da amostra dentro e fora das partículas. devem ser de fácil introdução na coluna. sendo que as regulares são mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutível da coluna e por esse motivo são mais caras. micropartículas. e de formato irregular.Fases . de 3 a 10μm. também chamado de regular. semirígidos ou não rígidos. partículas porosas ou peliculares e serem sólidos rígidos. ter diâmetro uniforme. . maior será a eficiência da separação. . em relação à eluição. os solutos mais apolares são eluídos primeiramente. enquanto que os polares são retidos pela fase estacionária e são eluídos depois.De acordo com a natureza das fases móvel e estacionária pode-se classificar o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa. portanto os compostos polares são eluídos primeiro e os mais apolares eluídos posteriormente. Cromatografia em fase normal: a fase estacionária utilizada é polar e a fase móvel é apolar. Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar. também líquida. Esse mecanismo de separação baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra da fase móvel e estacionária. Este processo é baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases líquidas O método consiste de uma fase líquida (estacionária) que por adsorção física é retida na superfície da coluna empacotada geralmente com sílica e de uma fase móvel. que passa sobre esta fase estacionária sendo uma destas polares e a outra apolar.Principais técnicas de CLAE Cromatografia de partição Nesta fase a fase estacionária é líquida. . Os componentes da amostra que são mais solúveis na fase móvel são eluidos primeiro enquanto os que têm maior afinidade com a fase estacionária são seletivamente retidos por ela. Pode ser resolvido de duas maneiras: 1° Saturando a fase móvel com a fase estacionaria por meio de uma pré-coluna. 2° Utilizado materiais que contenham a fase estacionaria quimicamente ligada a um suporte solido. colocada antes do injetor que tenha uma alta percentagem de fase estacionaria. Desvantagens: O inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionaria e móvel que pode acarretar a deterioração da coluna. levando a não reprodutibilidade nas separações repetidas. . O equilíbrio estabelecido é : . O mecanismo de separação se baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária).Cromatografia de absorção A forma mais clássica da cromatografia líquida e devido a recentes adaptações tornou-se o mais importante membro dos métodos de HPLC. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e serão fortemente retidos. por isso. primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície.. . grupos apolares (por ex. não serão retidos. hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel. Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária. Se assumir que o adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina). Cuidados a serem tomados Antes de ser iniciar o processo cromatográfico. De preferência até uns 2 a 3 cm do bordo superior. já deve estar saturada de seus vapores. . contendo a mistura de solvente. a câmara. O solvente não deve correr até o bordo superior do papel (cuidado com o número de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distância. . etc. b) Rapidez: Para se conseguir análises rápidas.Equipamentos As principais características que devem ser levadas em consideração na escolha de um equipamento para CLAE são: a) Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos. bomba de alta pressão e colunas com partículas de pequeno diâmetro (grande área de superfície. reciclagem de frações. coleta das frações. tais como. servir a distintas técnicas cromatográficas e realizar o máximo de operações. gradiente de fase móvel. fase móvel de baixa viscosidade.. que ajuda os processos de separação). deve-se obter as melhores condições de CLAE. isto é. necessárias às análises sofisticadas. como vazão. d) Sensibilidade: Um bom equipamento. c) Reprodutibilidade e Estabilidade: características essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. pressão e composição da fase móvel. deve gerar sinais de intensidade apreciável. mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra. temperatura. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parâmetros de operação. . . . . sendo assim os componentes são identificados pelo tempo de retenção. Os cromatogramas são gráficos do tempo em minutos pela resposta do detector. . tendo a formação de um pico em um determinado tempo chamado de tempo de retenção.Aplicações A identificação dos componentes de uma amostra é feita através da comparação dos cromatogramas obtidos com padrões. nestes padrões o componente em questão é eluído nas mesmas condições da amostra a ser analisada. . Tupy.Cromatograma típico da separação dos tocoferóis em amora-preta (Rubus sp) cv. por HPLC. com coluna de fase reversa e detector de fluorescência a 290nm de excitação e de 330nm de emissão. antocianinas. Os padrões são obtidos comercialmente e são analisados em diferentes concentrações. Através desta pode-se quantificar os componentes da amostra quando se obtém a área dos picos. . A cromatografia líquida de alta eficiência tem uma ampla aplicação na análise de alimentos na quantificação de compostos. compostos fenólicos. formando assim uma curva de calibração. esta trata-se de um gráfico da concentração do componente pela área do pico obtido. Alguns exemplos mais comuns são: Vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis. carotenóides. hidrolisados protéicos. lipídios. açúcares. . 34. Carol H.engenhariaearquitetura.Editora Nova Técnica Editorial (www.19-25. Avanços na cromatografia líquida. p. et al. Trabalho acadêmico (Seminário em Alimentos) . COLLINS.br/farmaceutico-industrial/130-cromatografialiquida-de-alta-eficiencia) . Revista Controle de Contaminação . Juiz de Fora. n.1.Referências Bibliográficas RUTZ. Unicamp. Fundamentos de cromatografia. Cromatografia líquida de alta eficiência aplicada ao controle da qualidade de cis-permetrina em loção capilar. Nádia Rezende. 2008. Universidade Federal de Pelotas. A importância da cromatografia. et al. 2009. Pelotas.Bacharelado em Química de Alimentos. Josiane Kuhn. 2007.com. v.com. BARBOSA. 41f. Ed. HU Revista.br) Cromatografia liquida de alta eficiência – HPLC (http://pfarma. FIM .
Report "Trabalho de Controle de Qualidade - Cromatografia liquida de alta eficiência - Aluna: Kariny Santos"