LA TOXICOLOGIE EXPERIMENTALEI. Introduction Les médicaments à usage humain ou vétérinaire doivent présenter une sécurité pour les sujets auxquels ils sont destinés. Cette sécurité est appréciée par les investigations de toxicité expérimentale chez l’animal. En effet après la mise en évidence d’une propriété pharmacologique intéressante pouvant être exploitée en thérapeutique, la substance est soumise à des études toxicologiques pour apprécier les risques qu’elle présente. Les essais de toxicité expérimentale se divisent en deux groupes : Ceux dont la réalisation est indispensable avant toute tentative d’administration à l’homme (essais pré-requis) : Essais de toxicité par administration unique (toxicité aiguë). Essais de toxicité par administration réitérée à court terme (toxicité subaiguë). Essais de mutagenèse. Ceux pour lesquels on prend le risque de les réaliser conjointement avec les études cliniques chez l’homme : Essais de la toxicité par administration réitérée à long terme (toxicité chronique). Essais de cancérogenèse. Essais sur la reproduction. Les études de toxicité expérimentale doivent être effectuées selon des protocoles biens établis et réalisées dans des conditions de bonnes pratiques de laboratoire. L’évaluation expérimentale de la toxicité globale d’un médicament permet de déterminer : la dose maximale tolérée, les organes, tissus et cellules cibles, les fonctions physiologiques altérées, les risques d’altération génétique et de concerogénèse, les risques de malformation congénitale. Cette évaluation permet, après étude clinique chez l’homme, l’appréciation du bénéfice attendu par rapport aux risques encourus. I. Essais de toxicité par administration unique (toxicité aiguë) 1. Détermination de la dose létale 50 (DL50) a. souche ou origine. et leur apparition dans le temps suite à l’administration d’une dose unique d’une substance pharmacologique. la mort est appréciée par arrêt cardiaque. Définition La DL 50 correspond à la dose capable de tuer. une qui est celle de l’exposition humaine et l’autre assurant une biodisponibilité totale. Chaque lot d’animaux recevra une dose de la substance à tester. B. la durée d’observation est indéterminée. Le rapport entre deux doses successives doit être compris entre 1. pouvant entraîner la mort de l’animal de laboratoire ainsi que les symptômes de l’intoxication aiguë. a.5.La détermination de la toxicité aiguë permet l’évaluation qualitative et quantitative des phénomènes toxiques. Sélection de l’espèce animale Généralement. on détermine la dose minimale mortelle (DMM) et la dose létale 50 (DL50). ce sont le rat et la souris qui sont sélectionnés pour déterminer la DL 50. une espèce autre qu’un rongeur est utilisée lorsque le schémas métabolique chez la souris et le rat est différent de celui de l’homme. Protocole expérimental 1. Les lots sont constitués de 10 animaux identiques sur les plans espèce. dans des conditions déterminées. Généralement. Cette détermination permet de connaître le niveau de dose. Détermination de la dose minimale mortelle (DMM) C’est la dose minimale de substance capable de tuer un animal par administration intraveineuse lente. S’il y a apparition des signes de toxicité. Durée d’observation Après administration les animaux sont mis en observation pendant 14 jours. sexe. la moitié des animaux mis en expérience dans une même espèce animale. Cette dose permet à l’expérimentateur de choisir les doses à utiliser pour déterminer la DL50. jeunes et âgés. Quelquefois. 1. Voies d’administration La substance est administrée par deux voies. . La détermination de la DL 50 se fait sur des animaux des deux sexes. L’essai de toxicité aiguë est la première étude toxicologique à effectuer pour une molécule dont on ignore la nature de sa toxicité. A. âge et poids. 1.2 et 1. Dose et constitution des lots Une gamme de six doses ou plus est sélectionnée pour la détermination de la DL 50. à cause de leurs différences de sensibilité. Examens L’heure de la mort et le nombre de morts doivent être notés ainsi que les symptômes. 1. % de mortalité 100 50 . Evaluation L’étude de la toxicité aiguë d’un produit permet d’établir la relation entre la dose administrée et l’intensité des effets observés ainsi que le calcul de la DL50 avec ses limites de confiance. a.a. L’autopsie est en mesure de fournir des informations sur l’organe cible. Des examens macroscopiques doivent être faits sur tous les animaux morts et au moins quelques survivants(ceux qui présentent des signes de morbidité). Calcul de la DL50 Méthode de Karber et Behrens DL50= DL100 – ab / n DL50 : dose létale 50 DL100 : dose létale 100 a : différence entre deux doses successives b : moyenne de mort entre deux doses successives n : nombre moyen d’animaux par lot Méthode de Miller et Tainter C’est une méthode graphique qui consiste à porter sur le papier semi log les pourcentages de mortalité en fonction du logarithme décimal des doses utilisées. ceux ci sont remplacés par des valeurs corriges. DL50 Log dose Fig. Probits 84 50 16 Log dose DL16 DL50 DL84 Fig. Graphe montrant la relation dose/mortalité (papier log-probit). Comme les produits des pourcentages 0 et 100% tendent vers l’infini. L’écart type de la DL50 : . Pour rendre linéaire la courbe il faut porter sur le papier log-probit le pourcentage de mortalité en fonction du log de la dose. Correction de 0% : Y0 = 50 / n Correction de 100% : Y100 = (100n – 50) / n n est le nombre d’animaux des lots qui ont donné 0% et 100%de mortalité. 27. Graphe montrant la relation dose/mortalité(échelle semi-logarithmique). 28. DL16)/ 2 L’écart à la moyenne : = 2 S / 2n’ n’ est le nombre total d’animaux dans les lots ayant donnés des pourcentages de mortalité entre et 93% 1. Définition Pour chaque médicament. Index thérapeutique 1. de prédire les effets probables d’une exposition massive chez l’homme . S = ( DL84 . il est définit un index thérapeutique appelé aussi marge de sécurité qui une valeur représentant le rapport entre la dose létale 50 et la dose efficace 50 (DL50 / DE50). de déterminer l’index thérapeutique. % Efficacité Létalité Marge de sécurité 50 . d’orienter les essais ultérieurs de toxicologie expérimentale .2.1) Résultat DL50 = DL50 graphique plus ou moins l’écart à la moyenne a. Exploitation des résultats Les résultats de l’essai de la toxicité aiguë permettent : de déterminer la nature des effets toxiques aiguës . dont la durée de réalisation sera en fonction de l’utilisation préconisée chez l’être humain et la durée d’exposition humaine. Ces substances nécessitent un suivi thérapeutique au cours de leur administration (les cardiotoniques. et leurs effets sont d’apparition immédiate. . D’après la directive 75/318 de la communauté économique européenne. la toxicité est très faible (l’acide ascorbique). des effets tardifs d’intoxication peuvent apparaître à cause de l’accumulation du médicament et/ou de ses métabolites dans les tissus. les épreuves de toxicité par administration réitérée ont pour objet de mettre en évidence les altercations fonctionnelles et/ou anatomopathologiques consécutives aux administrations répétées de la substance active. Donc. il est donc évitable d’utiliser un lot témoin recevant de l’eau physiologique. la mise en évidence d’effets réversibles ou irréversibles . Log dose DE50 DL50 Fig. 29. l’existence ou non de phénomènes cumulatifs et d’effets retards. le médicament destiné à une administration prolongée doit être soumis à ce genre d’essai. Essais de toxicité par administration réitérée Les intoxications médicamenteuses aiguës sont obtenues à des doses élevées. et d’établir les conditions de l’apparition de ces altérations en fonction de la posologie. de connaître les organes cibles . I. la théophylline). Dans le cas des expositions répétées de l’homme à des doses non toxiques (thérapeutiques). ou l’association de substances actives. L’étude de la toxicité par administration réitérée permet : d’avoir des informations sur les effets toxiques potentiels après exposition répétée . Dans ce genre d’étude. Graphe montrant la relation dose/effet (échelle semi-logarithmique). Pour les médicaments à index thérapeutique très large. En ce qui concerne les médicaments à index thérapeutique moyen la toxicité es t significative (les antibiotiques). afin de minimiser les risques d’interprétation des phénomènes pathologiques indépendants de l’administration du produit. et l’évaluation de survenue de ce germe de manifestations se fait par les études de toxicité par administration réitérée. Signification Les médicaments à faible index thérapeutique sont hautement toxiques car la dose létale se rapproche de la dose efficace. 1. le contrôle de l’évolution pondérale . la voie habituelle est la voie orale. Espèce et nombre d’animaux Les espèces animales choisies et l’homme doivent présenter des similitudes sur le plan pharmacocinétique. Dose et Durée Il est recommandé d’utiliser une dose forte pouvant produire des signes caractéristiques de toxicité. Ophtalmologie. Les doses sont sélectionnées sur la base des résultats des études de toxicité aiguë (dl50 et pente de la droite dose – réponse ). s’il y a risque de réaction avec les constituants alimentaires. Examens On effectue: le contrôle de la consommation de la nourriture et de l’eau . La durée de ses études est en général de 90 jours chez le rat. et jusqu’à 6 mois voir une ou deux années chez le chien. mais insuffisante pour tuer les animaux . etc. ) . mais active sur le plan pharmacodynamique . Pour obtenir des données exploitables statistiquement. Une dose intermédiaire. il est administré par gavage ou dans une capsule. moyenne géométrique des deux doses précédentes. Une dose faible sans effet toxique. a. Voie d’administration Pour la plus part des substances. Si le produit est d’un goût désagréable. (voir tableau) 1. les organes prélevés sont pesés et les examens histopathologiques appropriés sont effectués. l’étude est effectuée sur les deux sexes de deux espèces de mammifère dont l’une est différente des rongeurs (rat et chien). Essai de la toxicité à court terme a. 1. les examens hématologiques et biochimiques . les examens fonctionnels (ECG. Résultats . Les animaux morts au cours de l’étude et les survivants sacrifiés au terme de l’essai sont autopsiés. on doit utiliser un nombre égal d’animaux de chaque sexe pour chaque lot. les observations minutieuses du comportement . 1. par incorporation dans la nourriture ou dans l’eau potable.A. Protocole expérimental 1. a. est abaissé. Cette dose sera utilisée ultérieurement en clinique et en toxicologie expérimentale. soit entre 40 et 100 individus pour les rats. a. 1. et des résultats des études antérieures de toxicologie. la présence ou l’absence des anomalies comportementales et biologiques ainsi que l’identification des organes ciblés et leurs lésions. Exploitation des résultats L’étude de la toxicité subaiguë nous permet de connaître la dose « sans effet observé » de la substance testée chez l’animal. I. Exploitation des résultats L’objectif des études de toxicité à long terme est de définir la nature de la toxicité et de déterminer la dose sans effet observé. tout en appliquant le facteur de sécurité qui est égale à 100. a. Chaque lot expérimental et le lot témoin comprennent un nombre identique de mâles et de femelles. Les doses utilisées ne doivent pas compromettre la vie des animaux pendant ¼ du temps de l’essai. Etude de la toxicité à long terme ( toxicité chronique ) a. suivi du chien et des primates. Protocole expérimental 1. A. Si les données toxicologiques dérivées de travaux scientifiques chez l’homme sont insuffisantes. Essai de la cancérogenèse à long terme . dans le cas contraire. 1. le facteur de sécurité. Si la toxicité n’est pas trop grave et qu’une dose sans effet observé était définie. Voie d’administration. La durée des études est généralement de 2 ans chez le rat. un nombre plus faible de chiens et de primates est admis. une dose journalière peut être extrapolée à partir des données animales. Espèce et nombre d’animaux Le rat est l’animal de choix. Résultats Ils sont identiques a ceux de l’étude de la toxicité subaiguë. dose et durée La voie d’administration est la même que dans les études à court terme.L’évaluation des résultats doit prendre en considération la mortalité. Examens Ce sont les mêmes examens que ceux de l’étude de la toxicité subaiguë. les chiens et les primates peuvent être maintenus sept ans ou plus. Les doses utilisées tiennent compte à la fois de l’usage thérapeutique envisagé pour la nouvelle molécule. rein.) Des échantillons de tous les tissus seront conservés pour des examens histologiques et tous les tissus présentant des signes de tumeurs ou d’anomalies morphologiques seront examinés. ainsi que les métastases touchant tous les tissus et organes. Les survivants à la fin de l’étude doivent être sacrifiés. Voie d’administration et dose La substance à tester doit être donnée à l’animal par la voie de l’exposition chez l’homme. Tous les animaux morts ou mourants doivent être autopsiés. Examens Les examens cliniques. des similitudes métaboliques vis à vis de la substance à tester. transmettent leurs propriétés à leur descendance. Espèce. les antidiabétiques oraux). ont provoqué des manifestations suspectes et les produits destinés à une administration à vie (les antihypertenseurs. Le principe des essais de la cancérogenèse est de traiter par une voie d’administration. Le traitement est de 24 mois pour la souris et l’hamster . Elle est dérivée à partir des études de la toxicité à 90 jours. et de 30 mois pour le rat. examinés et les organes pesés (foie. a. etc. . cerveau. y compris les lots témoins (un lot témoin par sexe) qui reçoit uniquement le véhicule c’est à dire l’excipient. un nombre important d’animaux dès le sevrage et pendant la majeure partie de leur vie. avec l’homme. nombre d’animaux. Les deux lots témoins recevront. poumons. Indications Les essais de cancérogenèse sont indiqués pour les produits qui présentent une analogie structurale étroite avec les composés cancérogènes . Une dose forte qui produit des signes de toxicité sans réduire significativement la durée de vie des animaux. des tumeurs bénignes et malignes. on commence les tests avec des lots de 50 animaux de chaque sexe par dose. Protocole expérimental a. par la même voie d’administration. lors de l’étude toxicologique à long terme. A. les produits qui. a. Evaluation La molécule testée doit être depourvue de tout pouvoir cancérigène. durée du traitement Les espèces animales choisies doivent présenter. Les deux doses inférieures sont des fractions de la dose la plus forte (sur ½ et ou ¼). Ces cellules. biologiques et anatomo-pathologiques permettront la détection et la description d’hyperplasie. a. Les espèces utilisées sont la souris. devenues malignes. le rat et l’hamster. uniquement l’excipient. Les essais sont effectués à trois niveaux posologiques.La cancérogenèse est un processus pathologique caractérisé par l’apparition de cellules différentes des cellules normales dans l'organisme. A. Généralement. Essais relatifs aux aberrations chromosomiques Par ces tests on recherche si le produit est capable d’endommager les chromosomes de mammifères. on se réfère aux études de crossing-over mitotique chez saccharomyces cervisiae. Escherichia coli). Essai de la mutagenèse A. In vivo les tests sont réalisés sur les cellules de la moelle osseuse d’un rongeur. après administration du produit à tester. Pour évaluer une lésion primaire de l’ADN. au sens strict. Essais relatifs aux effets sur l’ADN La cellule répond aux agressions de l’ADN par les substances chimiques. des levures(Saccharomyces cervisiae). Toute atteinte qualitative ou quantitative de l’ADN peut induire une mutation. chez lequel. Principes des essais de la mutagenèse Les essais de la mutagenèse sont basés sur trois principes : Les agents mutagènes augmentent la fréquence des mutations spontanées. a. Définition On appelle mutation. Le test d’Ames utilise une souche de Salmonella typhimurium porteuse d’une mutation His (-) qui inhibe leur croissance dans un milieu dépourvu d’histidine(acide aminé essentiel). Essais relatifs aux mutations géniques Ces essais utilisent des bactéries(Salmonella typhimurium. B. B. par analyse des chromosomes en métaphase. toute modification brusque et permanente de caractères.En contact d’une substance mutagène ces bactéries deviennent His (+) capables de se développer en l’absence d’histidine. par changement dans le nombre ou la qualité des gènes. a. Description du protocole expérimental a.I. Evaluation . In vitro ces essais sont réalisés sur des cellules de mammifères en culture. Tout agent affectant l’ADN d’un organisme(uni ou pluricellulaire) peut affecter l’ADN des cellules humaines. on compte le nombre de micronucléus dans les érythrocytes polychromatiques ou on analyse les chromosomes des cellules en métaphase. des insectes (Drosophila melanogaster) et des rongeurs (souris). A. par des réparations enzymatiques pour éliminer la partie endommagée et la remplacer par un fragment nouvellement synthétisé. des cellules de mammifères en cultur (Cellules CHO d’hamster chinois). Segment III : Etude de péri et post natalité Les femelles sont traitées par le produit à tester de la fin de la gestation jusqu’à la fin de la lactation. conception. a. on peut conclure que le produit testé possède des propriétés mutagènes. accouplement de mâles non traités avec des femelles traitées et accouplement de mâles traités avec des femelles traitées. Par contre si les résultats des essais effectués sont positifs. I. entraîne leur stérilité ou des malformations chez la descendance. les essais sur la reproduction sont inclus dans le protocole d’évaluation expérimentale toxicologique de toutes les substances médicamenteuses A. 3. Segment II : Etude d’embryotoxicité et de foetotoxicité Les femelles gestantes sont traitées par le produit à tester pendant la période de l’organogenèse embryonnaire . Dans cette étude. la food and drug administration (FDA) a proposé en 1987 une série de règlement pour de bonnes pratiques de laboratoire. . de résorption. 2. ces règlements renferment des directives détaillées sur les points suivants : 1. Description du protocole expérimental a. les conditions d’élevage et de manipulation des animaux . on réalise trois combinaisons : accouplement de mâles traités avec des femelles non traitées . par le produit à tester. de technicien responsable de l’élaboration et de la mise en œuvre des procédures opératoires au niveau des différentes unités et de responsable** de l’assurance qualité . Pour chaque femelle.Si les résultats des essais effectués sont négatifs. de la parturition et de la lactation. les femelles sont sacrifiées et les utérus prélevés. les procédures opératoires *** . le personnel assurant les fonctions respectives de directeur* de l ‘étude. Segment I : Etude de fertilité Cette étude a pour but de déterminer si le traitement des animaux mâles et femelles. Cette étude a pour but de déceler les perturbations de la croissance du fœtus. 4. le contrôle des équipements. suite à l’altération des gamètes mâles ou des gamètes femelles. le poids et le sexe du fœtus. on peut conclure que le risque de la mutagenicité est suffisamment faible chez l’homme. Les bonnes pratiques du laboratoire Pour améliorer la fiabilité d’une étude toxicologique. maintenance et calibration . Essais sur la reproduction Depuis le drame de thalidomide (1962/1963). on note les sites d’implantation. a. I. deux jours avant la mise bas. *** Les procédures opératoires constituent un travail original du laboratoire. Lors de la rédaction. le nom et la signature du responsable de son écriture . les produits cliniques (produits à tester et autres réactifs) : caractéristiques. le texte doit être structuré en chapitre. les enregistrements : acquisition. l’élimination des matériaux des tests après usage. * Le directeur d’étude doit être un toxicologue expérimenté. rédigé en phrases courtes et en termes simples. ** Le responsable de l’assurance qualité est indépendant. la date Tableau XXXV : Les différents essais toxicologiques réalisés en phase préclinique Type Espèces animales Sexe Age Nombre / Dose (s) Voie (s) d’essai lot Toxicité aiguë Souris / rat M+F A/J 10 01 02 Toxicité à court Rat+++ M+F A/J 10-30 03 celle(s) d’exposition chez terme Chien++ 04-08 03 l’homme Toxicité à long Rat+++ M+F A/J 40-100 03 celle(s) terme d’exposition chez Chien++ M+F 04-08 03 l’homme Singe+ M+F 04-08 03 Souris+++ M+F A/J 50 03 celle(s) d’exposition chez Cancérogenèse long terme Hamsters M+F 50 03 l’homme Rat+++ M+F 50 03 Reproduction : Souris+++ M+F A 08 01 celle(s) d’exposition chez . 8. 6. préparation et teneur des comptes rendus . archivage. Il est tenu de vérifier la conformité entre les écrits et les faits. un numéro . manipulation . 7. Pour une meilleure compréhension. il est non impliqué dans la réalisation de l’étude.5. une procédure opératoire doit comprendre : un titre . elles peuvent être élaborées dans un premier temps à partir de certains ouvrages. du début jusqu’à la fin de l’étude. Segment 1 Singe++ M+F l’homme Rat++ M+F celle(s) Rat / Souris M+F A 08 01 d’exposition chez Segment 2 l’homme celle(s) Rat / Souris M+F A 08 01 d’exposition chez Segment 3 l’homme .