UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA FACULTAD DE INGENIERÍA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIÓN DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA“EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA (Botryococcus braunii)” LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA 2012 UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA FACULTAD DE INGENIERÍA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIÓN DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA “EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA (Botryococcus braunii)” TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS Profesor Guía: Dr.Edgar Uquiche Carrasco LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA 2012 “EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA (Botryococcus braunii)” LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA 2012 COMISIÓN EXAMINADORA EDGAR UQUICHE CARRASCO Profesor guía CAROLINA SHENE DE VIDTS Profesor examinador XIMENA INOSTROZA HOFFMANN Profesor examinador Nota trabajo escrito : Nota examen Nota final : : La mayor concentración de carotenoides se obtuvo a 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3 y fue 17. esteroles y tocoferoles presentes en el extracto. Se agradece al Proyecto Corfo Desert Bioenergy 09CTEI-6860 por el financiamiento para la realización de este trabajo. etc. En carotenoides el mayor rendimiento fue 1550.0 mg car/kg SS obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3. Actualmente.RESUMEN Las microalgas son una fuente importante de componentes naturales de alto valor biológico como proteínas. 2 axiales y 1 punto central. entre otros. aminoácidos. se realizaron extracciones basadas en un diseño central compuesto rotatorio con 5 niveles de cada variable independiente (temperatura de extracción y densidad SC-CO2). el mayor rendimiento de extracción de aceite fue 87. ácidos grasos. la mayor concentración fue 23. temperatura. De acuerdo a los resultados obtenidos. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y la densidad del SCCO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extracción de aceite de microalga Botryococcus braunii junto con evaluar el rendimiento y concentración de carotenoides. ofreciendo una alta calidad del producto final en comparación a los extractos obtenidos a través de técnicas convencionales. En tocoferoles se observó la mayor concentración a 41 °C y 957 kg CO2/m3 siendo ésta 18.0 g aceite/kg SS. cosmética y alimentaria. En cuanto a la concentración de esteroles. por ser más seguro que el hexano (sin dejar restos de solvente). ser una tecnología amigable con el medio ambiente y limpia.0 g esteroles/ kg aceite obtenida a 41°C y 957 kg CO2/m3 Las variables densidad SC-CO2 y temperatura de extracción afectaron significativamente (p≤0. Estos componentes pueden ser aislados y empleados como ingredientes funcionales en la industria farmacéutica. con 2 factoriales. la tecnología de extracción con CO2 supercrítico (SC-CO2) se perfila como una técnica innovadora para extraer y aislar estas sustancias.36% de contribución a la respuesta. pigmentos carotenoides. presión. Dentro de los factores que se deben considerar para este tipo de extracción se encuentran la densidad del fluido.0 g car/kg aceite. Para ello.05) el rendimiento de extracción de aceite explicando su comportamiento en un 89% siendo la temperatura el factor que más afectó el rendimiento con un 46. obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3.0 g tocoferoles/ kg aceite. . ...............................1 Extracción de aceites esenciales ............................2 Lípidos ............................................................................................................11 2.............................1.............................................5 2....................2 Fraccionamiento de la grasa láctea. 13 2....1......1.. 4 2................8 Aplicación industrial de FSC.. 6 2....................................................................3 Desalcoholización de bebidas alcohólicas ......................1 Microalga (Botryococcus braunii)......................................................9 2........... Objetivo general ..............................................................................................4....1..........................4 Obtención de sustancias antioxidantes a partir de microalgas........................................................................ Equipos e instrumentos ...................................................................................... 15 3...............8........................4...................................................................... esteroles y tocoferoles en la nutrición............... ANTECEDENTES GENERALES ................................... .................................... 13 2............................4 Importancia de los carotenoides...2 Esteroles ..............................................................................................................................2..............5 Fluidos Supercríticos y sus propiedades ...........................................8............................3 1...........................................8............................................. .......................................... 8 2...............................11 2.................................. 15 3.......................1 Carotenoides ................INDICE DE CONTENIDOS Página CAPÍTULO 1...8....................................1 Materia prima .................................................................................. 1 1..................................................... Materiales....1....... INTRODUCCIÓN ....................................................................... 3 CAPÍTULO 2.......................3 Tocoferoles .......................................................................................................................................6 Extracción con FSC ..............10 2..............5 2............................................4 2.......15 3......... .................. 3 1.........................................1........................3 Antioxidantes naturales..............4.. .... ............................................................................... 15 ..................................1....................................................................... Objetivos .............................2...................6 2.................................................................................... 14 CAPÍTULO 3: MATERIALES Y MÉTODOS .........................7 Antecedentes de extracción con SC-CO2 en microalgas................. 7 2........ Objetivos específicos......... 12 2.......................... ..................4.....................24 4.......1................................... 42 .........................................................................2 Contenido de esteroles .................. 28 4....................................................................................................3....................... 19 3................................................1 Contenido de humedad de la muestra inicial ........................................................... 32 4.......................................3 Análisis de concentración de esteroles .................................................... 31 4..........37 CAPÍTULO 5....................................................1 Contenido de carotenoides totales .........1...................................................................................................................3 Análisis estadístico ........4.......................................................................................................................... Análisis del aceite ... 16 3...............................................................3..................... 29 4....22 4.4 Análisis de concentración de tocoferoles ............................................................................. 35 4.............6 Rendimiento de extracción de esteroles ........................4 Discusión General .........1................................17 3..... 39 BIBLIOGRAFÍA ...................... 22 4.. 20 CAPÍTULO 4..........3..... 34 4................................................22 4...............................................................................1................3. Reactivos ..................2...................................3...... 16 3.................3......................................3 Contenido de tocoferoles ..........................................................................................3................... Material de vidrio y otros .......................................2........................................4 Diseño de experimentos ...2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de las respuestas........................... Extracción de aceites utilizando SC-CO2 .........................................................5 Análisis de rendimiento de extracción de carotenoides .......................................................................... 18 3.........................3...................................2........... 26 4....16 3...........................................3......... 17 3...................3.......20 3..................................................................1 Análisis estadístico ....................................3............................................ Determinación de humedad ...................................................................... 15 3.... Análisis del rendimiento de extracción de aceite ......................................................3.................................................. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .....................7 Rendimiento de extracción de tocoferoles ............. CONCLUSIONES .......2 Análisis de concentración de carotenoides......................................... 17 3..3.....................2 Métodos de análisis ........................................................................................ .......... .....................58 Anexo................. braunii.....................................51 Anexo B..................67 ... Determinación de la cinética de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Determinación del rendimiento de extracción de aceite de microalga B..........52 Anexo C.................... ..... ¡Error! Marcador no definido.......... 51 Anexo A....... D Análisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii)................……………………….................... Determinación de la humedad del sustrato .....……………………………………………........64 Anexo E Análisis Estadístico….........ANEXOS . ...¡Error! Marcador no definido... ............ Extracción de aceite de microalga B.... Extracción de aceite de microalga B..…………………………………………………………………..........................56 .. Extracción de aceite de microalga B...... Tabla de análisis de varianza para el modelo cuadrático .... 23 Tabla 4...............1.................55 Tabla B-8.....2..Extracción de aceite de microalga B.......... 24 Tabla 4.......…………………………………………………………….. braunii a 55 °C y 843 kg CO2/m3 (Punto de diseño 7)………….53 Tabla B-5..………………………………………………………………...........……………………………………………………………….. braunii a 45 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 1……………………………………………………………………………. braunii a 45 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 3)………….... ................... Diseño experimental Central Compuesto Rotatorio.1 Rendimiento de extracción y concentración de carotenoides.. braunii a 65 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 2).........…………………………………………………………………………..54 Tabla B-7.............. braunii a 69 °C y 900 kg CO2/m3 (punto de diseño 6)……………..........55 Tabla B-9.... Indicadores estadísticos para el modelo de superficie de respuesta .. braunii a 41 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 5)……….................. 26 Tabla A-1..52 Tabla B-3...........52 Tabla B-2.... Extracción de aceite de microalga B......………………………………………………………........3......... Extracción de aceite de microalga B............. Determinación de la humedad del sustrato………………………………............. Extracción de aceite de microalga B..………... .......... braunii a 55 °C y 957 kg CO2/m3 (Punto de diseño 8)………..…………………………………………………………………................ braunii a 65 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 4)…………………....1..54 Tabla B-6..... Extracción de aceite de microalga B.....INDIDE DE TABLAS Página Tabla 2....………………………………………………………………….... 12 Tabla 3..... Extracción de aceite de microalga B.... esteroles y tocoferoles con CO2 supercrítico.......... braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 9)………...Condiciones de extracción con CO2 supercrítico utilizadas en algunas especies de algas y microalgas............51 Tabla B-1....53 Tabla B-4................ 22 Tabla 4. ..73 ...70 Tabla E-2. Análisis del rendimiento de tocoferoles…………………………………………….56 Tabla B-11 Extracción de aceite de microalga B.………………….64 Tabla D-2 Datos curva de calibración para la concentración de esteroles en el aceite de microalga B..Tabla B-10.……57 Tabla B-12 Extracción de aceite de microalga B.….……………………………………………………….. Análisis del rendimiento de carotenoides……………………………………………72 Tabla E-6.. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 11)……………..65 Tabla D-3 Datos curva de calibración para la concentración de tocoferoles en aceite de microalga (Botryococcus braunii)………..72 Tabla E-5.……………………………………………………. Análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite……………….. Análisis de varianza para el rendimiento de extracción de aceite…………………. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño (10)…. Extracción de aceite de microalga B.....…………………………….57 Tabla D-1 Datos curva de calibración para la concentración de carotenoides en el aceite de microalga B...……………………………………………………………………. Análisis del rendimiento de esteroles………………………………………………... Análisis de varianza para la concentración de carotenoides en el aceite...………………...……………….…………. braunii……………………………………………. Análisis de varianza para la concentración de tocoferoles en el aceite…………….71 Tabla E-4.73 Tabla E-7. ………………………….....………………. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 12)………….……66 Tabla E-1. ………….71 Tabla E-3..……. braunii. ....... 36 Figura C-1...... Superficie de respuesta de la rendimiento de extracción esteroles (Y6) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3)...…. Superficie de respuesta de la concentración de esteroles (Y3) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).......INDICE DE FIGURAS Página Figura 2.............................58 Figura C-3........………………………………………......7... ... Superficie de respuesta de la concentración de tocoferoles (Y4) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3)........ 32 Figura 4.... Superficie de respuesta del rendimiento de tocoferoles (Y7) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3)...... ........ Curva cinética de extracción a 41 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 5)….60 Figura C-7.................2... Curva cinética de extracción a 45 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 3)…….......................................... 29 Figura 4..... Curva cinética de extracción a 65 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 2)…….............. Diagrama de fases que muestra la región de un fluido supercrítico…………………......59 Figura C-4............ 35 Figura 4...........………..................4..... .......... 30 Figura 4...61 ..... ..4 Figura 2.................... Forma estructural B....2............................…........ Curva cinética de extracción a 69 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño)..........................9 Figura 4......1................ .5... Superficie de respuesta de la concentración de carotenoides (Y2) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).............1 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de aceite (Y1) como función de la temperatura (ºC) y densidad (kg CO2/m3)....... 33 Figura 4............. Curva cinética de extracción a 65 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 4)…..58 Figura C-2...............60 Figura C-6.. 27 Figura 4.6...........59 Figura C-5......….. braunii………………............ Curva cinética de extracción a 55 °C y 843 kg CO2/m3 (Punto de diseño).......……... Curva cinética de extracción a 45 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 1)……...3.............. Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3) ... ...... ....... ¡Error! Marcador no definido.....68 Figura E-5....... Curva de calibración para tocoferoles totales………………………………………66 Figura E-1... Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 12)….... ¡Error! Marcador no definido........ Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5).................................................... 69 Figura E-6......67 Figura E-2. ................62 Figura C-10....................... Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4).........63 Figura C-12......... ..................................... Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6) ................ ......... Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extracción de aceite (Y1)………………………………………………………………………………………………...........70 ...................................... ...........64 Figura D-2.............. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 9)…….......Figura C-8.............. Curva calibración carotenoides totales……………………………………………...... ¡Error! Marcador no definido.................... Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 10)……62 Figura C-11..............................68 Figura E-4.67 Figura E-3.....…...... Curva cinética de extracción a 55 °C y 957 kg CO2/m3 (Punto de diseño 8)………61 Figura C-9.. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de carotenoides (Y2). 69 Figura E-7...... ................... ¡Error! Marcador no definido.. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 11).63 Figura D-1.............. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de esteroles (Y3)....... Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7)................. Curva de calibración esteroles totales………………………………………………65 Figura D-3... CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN . ya que. contribuyendo a mantener y/o mejorar el estado de salud y reducir el riesgo de sufrir determinadas enfermedades o alteraciones (Palou et al. Introducción CAPÍTULO 1. polisacáridos sulfatados (antivirales) y esteroles) (Herrero et al. Para la extracción de aceite a partir de microalgas. la cual puede ajustarse fácilmente combinando las variables presión y temperatura. 2006).9 MPa).. lo cual es una señal de alerta en la industria alimentaria que día a día busca la forma de satisfacer las demandas del mercado.. INTRODUCCIÓN Actualmente existe una tendencia del consumidor por cambiar continuamente de gustos y escoger productos innovadores. entre otros a partir de sustancias naturales. están ligados a la solubilidad y de este modo. ofreciendo un tiempo de extracción corto y alta calidad del producto final (Andrich et al. de modo específico y positivo. las cuales están recibiendo mucha atención. carotenoides. debido a su capacidad de realizar fotosíntesis y a su adaptación a la vida en medios marinos o en aguas continentales (Mendiola.1 °C y 7. Tiene las características tanto de un gas como de un líquido. por ser más seguro que el hexano. La extracción con fluido supercrítico (EFS) es una operación unitaria que aprovecha el poder solvente de los fluidos supercríticos en condiciones por encima de su temperatura y presión crítica (31. que resulta necesario buscar nuevas metodologías para desarrollar y extraer compuestos altamente beneficiosos. por ejemplo: esteroles. 2005). tocoferoles. la tecnología con CO2 supercrítico (SC-CO2) se mira con interés. 2005). ya que son reconocidas como una importante fuente renovable de lípidos bioactivos con una alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA. β-caroteno y otros pigmentos (antioxidantes). tales como plantas.. ser una tecnología amigable con el medio ambiente y limpia.Capítulo 1. saludables y atractivos a la vista. Estos ingredientes son preferidos por los consumidores debido a su origen natural. Es por ello. 2008). su poder solvente depende sólo de su densidad. Las algas en general han desarrollado compuestos de gran interés para la industria alimentaria. Estos compuestos actúan en una o varias funciones del organismo. pueden ser empleadas como fuente de ingredientes funcionales. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades solventes de un fluido supercrítico. subproductos de alimentos o incluso algas y microalgas. la selectividad del fluido puede ser modificada de acuerdo a los componentes que se requieran Efecto de la densidad y temperatura deCO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 1 . El presente trabajo de título tiene como objetivo estudiar el efecto de la temperatura de extracción y densidad del CO2 supercrítico. esteroles y tocoferoles. Se empleará un diseño central compuesto rotatorio para la realización de los ensayos de extracción y obtención de resultados experimentales.Capítulo 1. Introducción extraer y para ello es necesario realizar pequeños cambios en las variables de presión y temperatura del flujo solvente. sobre el rendimiento de extracción de aceite y velocidad de extracción de microalga (Botryococcus braunii) incluyendo las características químicas del extracto obtenido mediante la determinación del contenido de carotenoides.. Por otra parte. Además. se ha señalado que la solubilidad de los carotenoides. los que serán analizados con la Metodología Superficie de Respuesta. se aumente la presión de vapor del soluto y de esta forma se mejore la transferencia del soluto a la fase supercrítica. esteroles y tocoferoles en el SC-CO2 aumenta con la densidad a temperatura constante y viceversa (Saldaña et al. Se espera que a mayor temperatura. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 2 . 2010). la temperatura tiene un efecto positivo sobre la volatilidad del soluto. Efecto de la densidad y temperatura de CO2sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Objetivos 1. Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extracción de carotenoides.Capítulo 1. Introducción 1.1. Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la concentración de carotenoides. Objetivo general Estudiar el efecto de la temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de la velocidad y rendimiento de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii) usando CO2 supercrítico. Caracterizar el aceite de microalga obtenido bajo condiciones de extracción seleccionadas.1. 3 .2. Objetivos específicos Estudiar el efecto de la temperatura de extracción y densidad de CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). esteroles y tocoferoles.1. 1. esteroles y tocoferoles.1. CAPÍTULO 2 ANTECEDENTES GENERALES . ya que dentro de sus ventajas se encuentra su cultivo. Chaetoceros etc. Haematococcus. se distribuye en oligotróficos y eutróficos y según Fang et al. pero sólo unas cuantas son de importancia comercial donde se incluyen: Chlorella. Botryococcus.. algunas especies marinas como Isochrysis. 2010). El número de especies de color azul-verde es muy grande y se caracteriza por tener un alto contenido de lípidos (Loera-Quezada y Olguín. Nannochloropsis. minerales. además. vitaminas. Forma estructural B. 2010). creciendo en una amplia variedad de climas no compitiendo por el agua dulce ni suelos requeridos para la producción de alimentos (Loera-Quezada y Olguín. Existen al menos 30. Dunaliella.1. Skeletonema.000 especies conocidas de microalgas.. Spirulina. en agua salobre o en aguas residuales. (2004).braunii (Barker et al. tanto de agua dulce como salada. posee niveles inusualmente altos de ácidos grasos libres. a partir de las cuales se extraen componentes de alto valor biológico como proteínas. 2009). 2012). entre otras. Figura 2. pigmentos. y se ha propuesto como una fuente renovable para las necesidades futuras de energía en beneficio de la protección del medio ambiente.. Antecedentes generales CAPÍTULO 2. 4 . también se utilizan para la alimentación de moluscos u otros propósitos de acuicultura (Bruton et al. La microalga verde Botryococcus braunii es una especie de agua dulce perteneciente a la familia Chlorophyceae. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). El verde alga colonial de esta microalga (Figura 2. que puede ser en agua de mar.1 Microalga (Botryococcus braunii). enzimas y ácidos grasos. ANTECEDENTES GENERALES 2.1) es bien conocido por su alto contenido de hidrocarburos.Capítulo 2. y el correcto funcionamiento del sistema cardiovascular (Sahena et al.. Se han determinado los principales ácidos grasos que constituyen los lípidos de la microalga verde B. de una amplia variedad de plantas (Valenzuela et al. especialmente del tipo ω-3. Encontraron altas cantidades de ácidos grasos de 18 carbonos de la familia ω-3 y ω-6. El contenido de lípidos. (2004) ya que ambas informan que el ácido palmítico y ácido oleico son los principales ácidos grasos presentes en la microalga Botryococcus braunii. (1992) analizaron los ácidos grasos en 24 muestras de microalgas de un grupo verde-azul (por ejemplo.2 Lípidos El contenido de lípidos en las microalgas oleaginosas se encuentra dentro de un 20 a 50%. 2000) presentándose como compuestos fenólicos. 14.5% ácido linoleico (C18:2). Oscillatoria y Microcystis) procedentes de diferentes lotes de cultivos continuos y en diversas fases de crecimiento. concentración de nitrógeno. etc. braunii estos son: 2.. 2008.6% de ácido palmítico (C16:0) (Dayananda et al. 13. 2009). frutos.. 4. fósforo y la intensidad de la radiación UV-B (Mansour et al. 22.. 2009). Dorval et al. La investigación realizada por Dayananda et al. compuestos nitrogenados. tocoferoles. llegando a alcanzar un 70% de la biomasa seca cuando las células están sometidas a condiciones de estrés fisiológico o un medio ambiente desfavorable en cuanto a la limitación de nutrientes (Li et al. en el grupo de flagelados (grupo taxonómicamente diverso) encontraron altas cantidades de ácidos grasos poliinsaturado de cadena larga (20-22 carbonos). Las familias ω-6 y ω-3 destacan por sus importantes funciones fisiológicas. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). raíces. Se determinó una relación ω3/ω6 más alta en las algas en la fase de crecimiento exponencial. concentración de dióxido de carbono. temperatura.87% ácido mirístico (C14:0). así como también. como por ejemplo. Ahlgren et al.2% ácido linolénico (C18:3). flavonoides.3% ácido oleico (C18:1) y finalmente 40.3% ácido láurico (C12:0). son necesarios para el crecimiento y desarrollo del sistema nervioso central y la retina. 2003). Antecedentes generales 2...32% ácido esteárico (C18:0). 2. hojas. 5 . 2007). 2.Capítulo 2. ya que éstos pueden ser afectados por una serie de variables ambientales como: intensidad de luz y fotoperiodo. (2007) fue similar a las observaciones realizadas por Fang et al. salinidad. su composición y las proporción de los diversos ácidos grasos en una microalga puede variar.3 Antioxidantes naturales Los antioxidantes naturales están ampliamente distribuidos en la naturaleza formando parte de semillas. o carotenoides. hidroxilos y peróxidos. Una fuente inagotable de exploración es el mar y su biodiversidad.). siendo las algas marinas uno de los recursos potenciales de dichos compuestos. entre otros (Martínez. mientras que las xantofilas contienen además oxígeno (por ejemplo la luteína). el calor también favorece reacciones térmicas de degradación y finalmente el aire debido al oxígeno favorece la oxigenación de los enlaces dobles a funciones epóxido. Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de carbono. para evitar la degradación por la acción conjunta de estos factores adversos. 6 . nutracéutica y alimentaria. amarillo y naranjo en muchos vegetales son originados por la presencia de carotenoides.Capítulo 2. Los carotenos solo contienen carbono e hidrógeno (por ejemplo el ß-caroteno. realizándose a partir de tejidos frescos. pigmentos de origen vegetal que se clasifican dentro de los pigmentos liposolubles. polifenoles. 2003). a temperatura ambiente o menor. la temperatura y el aire. tocoferoles y vitamina C (Díaz. 2. (Yeverino. principalmente en la industria farmacéutica. el licopeno. ya que se ha informado que la actividad antioxidante de los extractos de algas depende de los componentes químicos de los extractos que principalmente consisten en carotenoides. 1997). Los carotenoides son muy utilizados como pigmentos y antioxidantes en diversos sectores industriales. 2012). esteroles y tocoferoles en la nutrición. en su mayoría son solubles en solventes apolares. En los últimos años se ha conducido a estimular la producción de carotenoides procedentes de microalgas para su uso como colorantes y aditivos naturales (Mendiola 2008). etc. La luz favorece reacciones fotoquímicas que cambian la estructura original del carotenoide (por ejemplo isomerismo cis y trans). y en ausencia de oxígeno.4 Importancia de los carotenoides.4. Es debido a estas razones que la extracción de carotenoides se debe realizar preferentemente en condiciones de ausencia de luz. Los carotenoides debido a la alta conjugación de enlaces dobles presentes en sus moléculas se descomponen por efecto de la luz. Antecedentes generales aminas. Entre las Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).1 Carotenoides Los colores rojo. se clasifican en dos grupos: carotenos y xantofilas. 2. y provasolii Pycnococcus) las cuales se analizaron por cromatografía de gases y Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). mixoxantina y zeaxantina (Marquez et al. 1998). 1991). Los carotenoides que se encuentran frecuentemente en las microalgas incluyen: astaxantina. a que disminuyen las concentraciones sanguíneas de colesterol. β caroteno. Tetraselmis chui. cantaxantina.) estudiaron el contenido de esteroles en cinco especies de algas y microalgas (viz. (Abrahamsson et al. pusilla Micromonas. 2005). Dunaliella salina.4. cordata Pyramimonas. El gran interés despertado por los alimentos enriquecidos con esteroles vegetales se debe. luteína.53 mg/g de carotenoides totales dentro de los cuales se identificaron cantaxantina. se caracterizan por ser sustancias esteroideas en cuya estructura química aparece una agrupación de cuatro anillos. Por lo tanto. causa principal de la mortalidad en las sociedades más desarrolladas (Palou et al. como ésteres o como glicósidos.2 Esteroles Los esteroles se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal... 2000). La mayoría de esteroles naturales poseen una cadena lateral de 8 a 10 átomos de carbono y un enlace doble en el C-5. hormona que reduce la inflamación. (1994. Micromonas aff pusilla.. el aumento de la cantidad de esteroles vegetales en una variedad de alimentos puede ser una ayuda importante en la protección de las personas con hipercolesterolemia frente a la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares relacionadas. Entre las principales fuentes naturales de astaxantina está la microalga Haematococcus pluvialis que tiene la capacidad de acumularla en altas concentraciones (2 a 5% en base seca) (Borowitzka et al. 7 . 2012). equinenona. violaxantina y zeaxantina.. específica del sistema fenantreno. 1995). portador del grupo OH en posición C-3 que le permite estar enlazado a moléculas de ácidos grasos (Bello. Haematococcus y Chlorococcum (García. sin efectos adversos colaterales. principalmente. neoxantina. 2008). equinenona. Otro estudio realizado en Spirulina platensis informa que contiene 5.. En cuanto a las microalgas existen estudios que señalan que a partir de las especies Scenedesmus obliquus y Navicula pelliculosa se obtienen esteroles precursores de la hormona cortisona. y se les encuentra en forma libre. evitando que los glóbulos blancos (leucocitos polimorfonucleares) viajen a la zona de inflamación del cuerpo (Molina y Morales. Volkman et al. 2.Capítulo 2. Dunaliella viridis. Antecedentes generales microalgas con mayor potencial para la producción de carotenoides se encuentran. . Los tocoferoles tienen una estructura química que consiste en dos anillos. (2007) evaluó el contenido de α-tocoferol en la microalga Nannochloropsis oculata registrando una concentración de 2326 ± 39 mg g-1 (peso seco). estos compuestos se denominan como α-.011 hasta 0.γ y σ. presenta un gran interés debido a que es una vitamina liposoluble que actúa como antioxidante. 24-methylcholest-5-en-3β-ol y 24-ethylcholesta-5 y 24 Methylcholest-5-en-3β-ol entre otros. Durmaz. defiende las células reduciendo el estrés oxidativo. 1997). 2011). 8 . con valores que van desde 0.4. Otra investigación realizada por Mendiola et al. La vitamina E o α -tocoferol. Además. β. 2. uno fenólico y otro heterocíclico y una cadena lateral de 16 átomos de carbono saturada. además pudo predecir un aumento de la producción de α-tocoferol durante el ciclo de vida debido a la necesidad de la microalga por obtener antioxidantes durante el proceso de envejecimiento. Los principales esteroles encontrados fueron: 24-methylcholesta-5. con carácter esencial reconocido hace más de 40 años. hojas y otras partes de plantas verdes de plantas superiores. Dependiendo del número y la posición de los grupos metilo en el anillo fenólico. El contenido de α-tocoferol en microalgas se ve afectado tanto por la fuente de nitrógeno de la cual se alimenta y el tiempo de cosecha. es decir. Antecedentes generales espectrometría de masa. donde.tocoferoles (Calvo et al.014 mg de tocoferol/g Spirulina seca. 24 (28)-dien-3β-ol. La “vitamina E” es un término genérico que describe un grupo de antioxidantes que incluye los tocoferoles y tocotrienoles. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). ayuda a reducir los niveles de colesterol en la prevención de trombos en las arterias es aún discutible (Belitz y Grosch. estimula el sistema inmunológico y se ha comprobado que detiene el desarrollo del Alzheimer. encontrándose presentes en semillas oleaginosas.Capítulo 2. (2008) determinaron el contenido de α-tocoferol en Spirulina platensis.3 Tocoferoles Solamente los organismos fotosintéticos sintetizan tocoferoles. Los tocoferoles y tocotrienoles engloban un grupo de 8 compuestos liposolubles que reciben el nombre genérico de vitamina E. El α-tocoferol es el más abundante en la dieta y el que presenta mayor actividad antioxidante in vivo. pueden obtener mejores rendimientos de extracción. Antecedentes generales 2. una de las principales características de un FSC es la posibilidad de modificar la densidad del fluido. es debido a su baja viscosidad. La pc es la presión por encima de la cual el gas no condensa al disminuir la temperatura isobáricamente y la Tc es la temperatura por encima de la cual el gas no condensa al aumentar la presión isotérmicamente (del Valle y Aguilera.Capítulo 2.2). Los FSC poseen diferentes propiedades físico-químicas. ya que la densidad está directamente relacionada con la solubilidad (del Valle y Aguilera. 1999). por lo tanto. mediante la alteración de la presión de extracción. Figura 2.5 Fluidos Supercríticos (FSC) y sus propiedades Un FSC es un material que se encuentra en condiciones de presión y temperatura por encima de sus valores correspondientes de presión crítica (pc) y temperatura crítica (Tc). viscosidad y difusividad. 9 . cambiando la presión y/o temperatura. entre las que destaca: densidad. la fuerza disolvente del fluido puede ser modificada. 1999). las que se encuentran en rangos de valores intermedios entre líquidos y gases (Figura 2.2. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). difusividad relativamente alta y poder solvente que los líquidos supercríticos tienen mejores propiedades de transporte y penetrabilidad que los líquidos y. por lo tanto. Diagrama de fases que muestra la región de un FSC. no corrosivo. debido a que un cambio en estas variables modifica su magnitud. la selectividad del fluido puede ser modificada de acuerdo a los componentes que se requieran extraer. 2. El efecto significativo de la presión sobre el rendimiento de extracción (g soluto/g sustrato seco) se debe al aumento de la solubilidad de aceites y pigmentos carotenoides como también al incremento del poder solvente del SC-CO2 (Li et al. no deja residuos.1 °C y 7. está estrechamente relacionada con los cambios de presión y temperatura. son el uso de disolventes generalmente reconocido como seguro (GRAS). la EFS en lugar de extracciones tipo Sohxlet es justificada por la reducción de los tiempos de extracción. 2008). 2010). sus condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza. en comparación a otras técnicas de extracción. Esta propiedad hace que los FSC sean solventes muy versátiles y que se pueden aplicar en la extracción de diversos componentes naturales de materiales biológicos (Luque de Castro et al. En la EFS. 2006).... tamaño de partícula. Las principales variables a tener en cuenta son: presión y temperatura que determinan la densidad del fluido. La densidad del fluido por sobre sus condiciones supercríticas (31. En general. además de seleccionar el solvente (fluido supercrítico). la eliminación de posibles compuestos que puedan intervenir en el análisis (Mendiola.9 MPa). y alta eficiencia del proceso de extracción (en términos de aumento de los rendimientos y la posibilidad de acoplamiento directo con técnicas de análisis cromatográficas tales como cromatografía de gases (GC) o cromatografía de FSC) (Herrero et al. 10 . no inflamable. se deben considerar diversas variables que influyen significativamente en la operación de extracción. no es costoso. entre otros. 1999). por tanto. velocidad del fluido. se pueden separar compuestos termo-sensibles (del Valle y Aguilera. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades solventes del FSC ya que. se elimina fácilmente.6 Extracción con FSC El CO2 es el FSC más utilizado en EFS debido a que es no tóxico. humedad de la muestra. incoloro. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Antecedentes generales Otras ventajas. se puede trabajar a baja temperatura. 1993). la densidad está ligada a la solubilidad y de este modo. por la selectividad que se puede llegar a obtener de acuerdo a las condiciones de extracción y además.Capítulo 2. 2. por ende. aumentando la velocidad de extracción (del Valle et al. en el caso de Mendes et al. Se ha recomendado que los sustratos posean una baja humedad. químico. lo cual se debe a los componentes que se desean extraer.. 2001). temperatura y densidad de CO2 que se han utilizado para extraer y analizar el aceite de diferentes microalgas. en cambio.8 Aplicación industrial de FSC. (2005) utiliza un rango de presión 550-700 bar para la extracción de lípidos.Capítulo 2..7 Antecedentes de extracción con SC-CO2 en microalgas. En la Tabla 2. farmacéutico. Entre otras aplicaciones se dirigen a la obtención de Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Los FSC se están utilizando a escala industrial principalmente en los sectores agroalimentario. por ejemplo. y cosmético. Las muestras sólidas de diferente granulometría deben ser molturadas para homogeneizar el tamaño de partícula. 1993). ya que. Otras variables que influyen son la humedad y el tamaño de partícula del sustrato. los cuales tienen un alto peso molecular.1 se observan algunas condiciones de las variables presión. 2. Para conseguir una mejor velocidad de extracción y más completa posible del sustrato sólido. (2003) utilizan presiones entre 125 y 300 bar para la extracción de hidrocarburos los cuales son altamente volátiles y por lo tanto de menor peso molecular. Andrich et al. la velocidad de flujo de solvente. evitar la variabilidad originada por la frecuente diferencia en composición de las porciones que tienen distinto tamaño (Luque de Castro et al. puesto que el agua reduce el poder solvente del CO2 a condiciones supercríticas inhibiendo el contacto entre el SC-CO2 y el sustrato (Li et al. el consumo específico de solvente. Se observa que las temperaturas utilizadas están dentro de un rango de 40-85 ºC siendo las temperaturas cercanas a 40 ºC las más utilizadas.. en la gran mayoría se necesitan extraer componentes termolábiles y a esta temperatura no van a ser perjudicados. aumenta la solubilidad permitiendo una mejor transferencia desde el sustrato hacia la fase supercrítica. 2010). 11 . Esto se puede lograr a través de la molienda de la matriz. y. Las investigaciones expuestas utilizan diferentes rangos de presión. se tiene que ofrecer al disolvente superficies de intercambio grandes y recorridos de difusión cortos. Antecedentes generales Al aumentar la temperatura permite aumentar el rendimiento de extracción debido al incremento en la presión de vapor del soluto. produciéndose más de 60. Antecedentes generales extractos herbales a partir de plantas aromáticas. (Tornero. 12 . EEUU. aceites esenciales.8. existiendo plantas industriales en Europa. de extractos de especias para colorantes alimentarios. Entre los extractos obtenidos destacan: extracto de jengibre (40% aceites Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). la empresa Solutex construyó. Flavex. en el año 2004. el Sudeste Asiático y Nueva Zelanda (Cocero. otra destacada compañía ubicada en Rehlingen (Alemania) produce ingredientes botánicos activos desde 1986 y en la actualidad produce más de 50 extractos obtenidos con SCCO2 operando con una presión máxima de diseño de 500 bar y logrando una producción anual de 1000 toneladas. una instalación para la producción de alimentos funcionales mediante SC-CO2 en Mallén (Zaragoza). Esta planta dispone de instalaciones de extracción y cromatografía en SC-CO2 produciendo 50 toneladas anuales de EPA y DHA mediante cromatografía supercrítica a partir de aceite de pescado.Capítulo 2. 2. 2006). En España.000 ton/año por esta tecnología. etc. Canadá.1 Extracción de aceites esenciales La extracción de aceites esenciales y especias con SC-CO2 es la aplicación industrial más extendida. 2011). 2009 . 2011 Andrich et al.1009.911. Antecedentes generales Mendes et al.9-934.897.7-911..5.1.1 625.4 Carotenoides y clorofila Macías-Sánchez et al.4 731. 2005 Sargassum hemiphyllum Arthrospira maxima Nannochloropsis oculata Dunaliella salina 40-50 50-60 40 40-60 241-379 250-350 250-300 100-500 874. 1998 Capítulo 2. Condiciones de extracción con CO2 supercrítico utilizadas en algunas especies de algas y microalgas.1 911.4-914.1. 2008 Nannoclhoropsis gaditana 40-60 100-500 625.1 1007. 12 Tabla 2.5. Tipo de microalga Temperatura (°C) Haematococcus pluvialis Botryococcus braunii Chlorella vulgaris Nannochloropsis sp Spirulina platensis 40-80 40 40 40-55 83.7 835.6 Componentes de interés extraídos Astaxantina Hidrocarburos Carotenoides Lípidos Vitamina E Fuente Machmudah et al...3 Presión (bar) 200−550 125-300 300 550-700 361 Densidad (KgCO2/m3) 841..9-934.2-863. 2006 Mendes et al.4 Ácidos grasos poliinsaturados ácido γ-linolénico Zeaxantina Carotenoides y clorofilas Cheung et al.Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).. 2005 Mendiola et al.3 785.8 880... 2003 Palavra et al.... 2006 Liau et al. 2011 Macías-Sánchez et al. extracto de vainilla (10 veces más concentrado que mediante técnicas convencionales) y otros extractos como: cúrcuma. 2011). 2. 2005). orégano y pimienta con una producción de una tonelada al año aproximadamente (Tornero. bombeados continuamente. El proceso de extracción del etanol de una bebida con este método se realiza normalmente en continuo. extracto de romero rico en ácido carnosílico. La bebida fluye descendiendo y se pone en contacto con la corriente ascendente del CO2. pero generalmente los valores oscilan entre los 80 y 120 bar a temperaturas de 15 y 40 ºC (Carretero.5 y un 1% en volumen y ha tenido éxito en bebidas de bajo contenido alcohólico como cerveza.Capítulo 2. Resulta ser muy apreciado en leches funcionales enriquecidas. sin tiempos muertos y con menos costes que el sistema discontinuo.8. mantequillas. vino y licores de aromas. De este modo se obtiene un producto lácteo refinado que contiene menos colesterol. Las condiciones de fraccionamiento se realizan después de mezclarlos en el extractor (en 3 o 4 separadores). el SC-CO2 y la bebida alcohólica. helados y quesos (Raventós. Los puntos de fusión están entre -40 y 40 °C y esto hace que su utilización sea muy reducida.2 Fraccionamiento de la grasa láctea La grasa láctea es una mezcla de triglicéridos saturados (70%) e insaturados (30%) y contiene también un pequeño porcentaje de colesterol. reduciendo progresivamente la presión de 240 a 34 bar y aumentando gradualmente la temperatura de 40 a 70 °C. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 13 .3 Desalcoholización de bebidas alcohólicas El contenido final de alcohol con EFS en estos productos oscila entre un 0. 2012). es rico en triglicéridos insaturados y antioxidantes como β-caroteno. En el fraccionamiento de la grasa de leche con SC-CO2 generalmente se obtienen 3 fracciones de triglicéridos de peso molecular elevado (C54-42). Las condiciones óptimas para la extracción del etanol dependen del tipo de bebida. Antecedentes generales esenciales y 30% gingeroles). Se realiza en columnas extractoras de etapas de contacto múltiple donde se introducen. sidra.8. medio (C40-36) y bajo (C34-24). 2. En Chile más específicamente en la Región de Tarapacá se encuentra la empresa biotecnológica Atacama Bio Natural products S.8.. 2012).4 Obtención de sustancias antioxidantes a partir de microalgas. Esta empresa elabora dos productos: Supreme Asta Oil y Products.A.Capítulo 2. Antecedentes generales 2. la cual utiliza SC-CO2 para extraer complejo de Astaxantina natural a partir de oleorresinas de biomasa de microalga Haematococcus pluvialis. Supreme Asta Powder (Atacama Bio Natural Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 14 . CAPÍTULO 3 MATERIALES Y MÉTODOS . modelo DHG-9037A. China) Cronómetro digital (Q&Q HS45. Italia).1. Fue secada por convección con aire caliente y molida hasta obtener un diámetro de partícula menor a 1 mm. modelo AUX 220. modelo FRD22. Estados Unidos) Espectrofotómetro (Bausch & Lomb Spectronic. Japón) Balanza analítica.3. Estados Unidos) Estufa rango 30-220 ºC (Electron Thermostatic Oven. modelo SP-2000 UV. se almacenó bajo refrigeración (5 °C) hasta su posterior uso en ensayos de extracción y análisis. modelo ELB600S. MATERIALES Y MÉTODOS 3. Equipos e instrumentos Extractor supercrítico (Applied Separation Spe-ed SFE-2.Capítulo 3. Finalmente. sensibilidad ± 0. modelo 7071.0001 g (Shimadzu. Ésta viene en suspensión acuosa con 20% de sólidos totales. INC Allentown. China) Agitador tubos vortex (VELP Scientifica.1.1. Materiales y Métodos CAPÍTULO 3. Materiales 3.2. 3.1. Japón) Refrigerador (Frigidaire. 15 . La muestra fue tamizada para trabajar con el mismo diámetro de partícula en todas las extracciones. 3. la cual fue proporcionada por la Universidad de Antofagasta. Material de vidrio y otros Desecador con sílica gel Frascos de vidrio (viales) 15 mL Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).1 Materia prima Se utilizó como sustrato microalga Botryococcus braunii. Japón) Balanza granataria (Shimadzu. Capítulo 3. Alemania Etanol p.2’-bipiridina. Argentina Tolueno p. A.1.C..a. México Estigmasterol. 16 . AGA. San Lorenzo. Este análisis se realizó en duplicado tanto al sustrato inicial como al agotado obtenido luego de la extracción. Merck Chemicals. A.S.. el cual se basa en la deshidratación de la muestra hasta peso constante mediante el secado en estufa a 105 °C. Chile Cloroformo p. Sigma. JT. 95%.S. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 3. 250 mL Mortero y pistilo 3. 3. Merck Chemicals. Determinación de humedad La humedad del sustrato se determinó a través del método gravimétrico (AOAC. 1990). Merck Chemicals. Cicarelli.C. New Jersey.4.S. AcrosOrganics. Reactivos CO2 99 % de pureza.a. Estados Unidos.C..C. 5 y10 mL Micropipeta 10:100 μL y 100:1000 μL Probeta de 50 mL y 100 mL Vasos precipitados de 50. Materiales y Métodos Matraz aforado de 10 mL y 25 mL Cubetas de cuarzo y vidrio Matraz Erlenmeyer 250 mL Pipeta total de 1. 100. A. Baker. Estados Unidos.2.a. A.a.1.a.. Alemania Ácido sulfúrico p.S.2 Métodos de análisis 3. Alemania Anhídrido acético p. 2. Capítulo 3. rendimiento de carotenoides (mg car/kg sólido seco). Extracción de aceites utilizando SC-CO2 Los ensayos de extracción de aceite se realizaron cargando 7 g de sustrato seco de B.3. basado en la metodología informada por Malaysian Palm oil Board.1. ( ) Donde: mH: masa muestra húmeda (g) mS: masa muestra seca (g) (m -mS ) m 100 (3. braunii en un extractor supercrítico de capacidad de 50 mL y un diámetro interno de 14 mm. Los extractos obtenidos se recuperaron en viales de vidrio de 60 mL de capacidad previamente pesados para obtener la cantidad de aceite extraído por diferencia de masa entre el vial con aceite y el vial vacío.3. El rendimiento de extracción de aceite se expresó como g aceite/kg sustrato seco (Anexo B. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). presentadas en la Tabla 3. En el Anexo D.2. 17 . Las extracciones se realizaron bajo condiciones de extracción que combinan distintos niveles de temperatura (41-69 °C) y densidad de CO2 (843-957 kg CO2/m3). (2005). 3. Las muestras de aceite obtenidas fueron disueltas en cloroformo y a continuación fueron llevadas al espectrofotómetro UV donde se estableció la absorbancia a una longitud de onda de 452 nm.1) 3. Análisis del aceite 3. concentración de esteroles (g est/kg aceite).1 Contenido de carotenoides totales El contenido de carotenoides totales se determinó por espectrofotometría UV.2. concentración de tocoferoles (g toc/kg aceite). Materiales y Métodos Se expresó el peso perdido por la muestra como el porcentaje de humedad en base húmeda (bh) mediante la Ecuación (3. rendimiento de esteroles (mg est/kg sólido seco) y rendimiento de tocoferoles (mg toc/kg sólido seco). Tabla B-1 a B-12) y el análisis del extracto consta de: concentración de carotenoides (g car/kg aceite).1). Figura D-1 se observa la curva de calibración del método de carotenoides totales. Capítulo 3. Materiales y Métodos Cd Donde: (mA) FD V g 100 (3.2) Cd: Concentración de carotenoides totales (mg carotenoides/kg aceite) m: pendiente de la curva patrón β-caroteno A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 452 nm FD: factor de dilución de la muestra V: volumen del solvente utilizado en la preparación del extracto (mL) g: masa de aceite analizado (g) 3.3.2 Contenido de esteroles La concentración de esteroles se determinó a través del método espectrofotométrico informado por Sabir et al. (2003). Para este análisis se prepararon los siguientes reactivos: Solución patrón de estigmasterol: Se disolvieron 10 mg de patrón estigmasterol en 10 mL de cloroformo y luego se agitó. Reactivo Liberman-Burchard: Se disolvieron 0,5 mL de ácido sulfúrico en 10 mL de anhídrido acético. La solución se cubrió con papel aluminio para protegerla de la luz. En primer lugar, se preparó una curva de calibración, adicionando a seis matraces de aforo de 10 mL la solución patrón (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 mL a cada matraz, el primero se considera como blanco). A continuación, 2 mL del reactivo Liberman-Burchard fueron añadidos a cada matraz y se aforaron con cloroformo a un volumen final de 10 mL. Los matraces fueron cubiertos por papel aluminio y mantenidos en la oscuridad durante 15 min. Luego se estableció el cero de la absorbancia del blanco a 640 nm y se midió la absorbancia de las demás soluciones, obteniéndose de esta forma el gráfico de la curva patrón. En el Anexo D, Figura D-2 se observa la curva de calibración de los esteroles totales. Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 18 Capítulo 3. Materiales y Métodos Para el análisis de aceites se pesaron 100 mg de éste utilizando cloroformo como solvente. Se tomaron 3 mL de la solución diluida y se determinó su absorbancia luego de añadir el reactivo Liberman-Burchard mas cloroformo. La Ecuación (3.3) se utilizó para determinar el contenido de esteroles totales presentes en el aceite. C Donde: (mA) FD V g 1000 (3.3) C: concentración de esteroles totales (mg esterol/kg de aceite) m: pendiente de la curva patrón estigmasterol A: absorbancia del aceite analizado en longitud 640 nm FD: factor de dilución V: volumen del solvente utilizado en la preparación de aceite (mL) g: masa de aceite analizado (g) 3.3.3 Contenido de tocoferoles La concentración de tocoferoles totales se determinó a través de espectrofotometría UV-VIS, usando el método colorimétrico Emmerie-Engel informado por Wong et al. (1988). Para este análisis fue necesario preparar los siguientes reactivos: Reactivo α- tocoferol: disolver 0,0150 g de α- tocoferol en 30 mL de tolueno y agitar. Solución 2,2’-bipiridina: disolver 0,0700g de 2,2’-bipiridina en 100 mL de etanolagua (95%). Solución FeCl3x 6H2O: disolver 0,0400 g de FeCl3*6H2O en 20 mL de etanol-agua (95%). En primer lugar se preparó una curva de calibración. A continuación, 3,5 mL de 2,2 fueron añadidos a cada matraz más 0,5 mL la solución de Fe y se aforó con tolueno a volumen final de Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 19 Capítulo 3. Materiales y Métodos 10 mL. Se estableció el cero de la absorbancia del blanco a 520 nm y luego se procedió a medir la absorbancia de las siguientes soluciones, para obtener de esta forma el gráfico de la curva patrón observado en el Anexo D, Figura D-3. Para el análisis de las muestras se disolvieron 0,2 g de aceite en 5 mL tolueno y se adicionaron 3,5 mL de 2,2’-bipiridina y 0,5 mL de Fe. La solución se aforó con tolueno a 10 mL y luego se leyó a una absorbancia de 520 nm. La Ecuación (3.4) se utilizó para determinar la concentración de trolox equivalente presente en la muestra extraída. C Donde: (mA) V FD 1000 g (3.4) C: concentración de Tocoferoles totales (mg tocoferoles/kg de aceite) m: pendiente de la curva de patrón de α-tocoferol A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 520 nm V: volumen del solvente utilizado en la preparación de aceite (mL) g: masa de aceite analizado (g) 3.4 Diseño de experimentos 3.4.1 Análisis estadístico Se utilizó la metodología Superficie de Respuesta (MSR) que permitió evaluar el efecto de las variables independientes temperatura codificada (X1) y densidad de CO2 codificada (X2) (Ecuación 3.5 y 3.6 respectivamente) sobre las variables dependientes; rendimiento de extracción de aceite (Y1), concentración de carotenoides (Y2), concentración de esteroles (Y3), concentración de tocoferoles (Y4), rendimiento de extracción de carotenoides (Y5), rendimiento de extracción de esteroles (Y6) y rendimiento de extracción de tocoferoles (Y7). Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 20 Capítulo 3. Materiales y Métodos X1 T 55 10 (3.5) Donde: T: temperatura ° C X2 D 900 40 (3.6) Donde: D: densidad (kg/m3) Se utilizó un polinomio de segundo orden para expresar la variables respuestas como una función de las variables independientes como sigue: 2 Y A0 A1 X 1 A2 X 2 A12 X 1 X 2 A11 X 12 A22 X 2 (3.7) Donde: A0: es una constante A1 y A2: coeficientes lineales A12: coeficiente de interacción A11 y A22: los coeficientes cuadráticos. El diseño experimetal (Tabla 3.1) está basado en un diseño central compuesto rotatorio; el cual consiste de un diseño factorial de 2 factores independientes con niveles de trabajo (-1,+1). El diseño tiene 4 (2n) puntos experimentales y 4 (2n) puntos axiales con una distancia axial de 1,41 ( = 2n/4), y 4 replicas en el punto central (total 12 puntos de diseño). El ajuste del modelo fue evaluado por el coeficiente de determinación R2 y mediante un análisis de varianza (ANOVA), para estimar el efecto y significancia de las variables independientes (temperatura y densidad de CO2) sobre las variables respuestas; rendimiento de extracción de aceite, concentración de carotenoides, concentración de esteroles, concentración de tocoferoles, rendimiento de extracción de carotenoides, rendimiento de extracción de esteroles y rendimiento de extracción de Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 21 Capítulo 3. Materiales y Métodos tocoferoles en el aceite. Los coeficientes de la ecuación de segundo orden fueron estimados usando el programa Design-Expert Versión 6.0.1 (Stat-Easy, Inc. Minneapolis, MN). La significación estadística se basó en los criterios de error total con un nivel de confianza del 95%. Tabla 3.1. Diseño experimental Central Compuesto Rotatorio. Puntos de diseño 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temperatura (T) °C 45 65 45 65 41 69 55 55 55 55 55 55 Densidad (D) kg CO2/m3 860 860 940 940 900 900 843 957 900 900 900 900 X1 (-) -1 1 -1 1 -1,41 1,41 0 0 0 0 0 0 X2 (-) -1 -1 1 1 0 0 -1,41 1,41 0 0 0 0 Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 22 CAPÍTULO 4 RESULTADOS Y DISCUSION . de esta forma. 1990) (Anexo A. de actuar como anti-solvente y reducir la solubilidad de carotenoides (Sun y Temelli. observar cuales son las mejores condiciones de extracción en los rangos establecidos en el diseño estadístico utilizando el programa Design Expert.8 (mg toc/kg SS). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4. se estudió el efecto de éstas sobre las respuestas: rendimiento de extracción de aceite (Y1).41 ± 0.7) que describe la respuesta Y en función de las variables independientes temperatura y densidad. la respuesta Y2 presenta una concentración de carotenoides que varía en un rango de 8. concentración de carotenoides (Y2).21% (b.1 (g car/kg aceite).4 y 1676.6 (g toc/kg aceite). Utilizando un diseño central compuesto rotatorio con dos variables independientes: temperatura (X1) y densidad de CO2 (X2). rendimiento de carotenoides (Y5). rendimiento de esteroles (Y6) y rendimiento de tocoferoles (Y7) para.8 (mg car/ kg SS). En la Tabla 4.4 y 1276. donde Y1 presenta valores de rendimiento que varían entre 60. 22 .2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO 2 sobre el comportamiento de las respuestas. El efecto de las variables se evaluará a continuación mediante la metodología de superficie de respuesta usando la ecuación cuadrática (Ecuación 3.9 y 84. 2006) En este ensayo la humedad inicial del sustrato es baja y favorable para la extracción de aceite como de carotenoides con SC-CO2.1 se puede observar los valores de las respuestas antes citadas.h) obtenido según el método gravimétrico (AOAC. concentración de tocoferoles (Y4). Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Tabla A-1). la concentración de tocoferoles (Y4) se encuentra entre 16 y 17.22.9 (mg est/kg SS) y finalmente. 4. además. Resultados y discusión CAPÍTULO 4. el agua interfiere en la eficiencia de la extracción.Capítulo 4. concentración de esteroles (Y3). inhibiendo el contacto entre el SC-CO2 y el sustrato. (2010).1 a 16.1 Contenido de humedad de la muestra inicial El contenido de humedad de la muestra inicial de microalga (Botryococcus braunii) fue 3. el rendimiento de tocoferoles (Y7) presenta valores que varían desde 974.5 a 1386.2 (g aceite/kg SS).9.0 (g est/kg aceite). mientras que el rendimiento de carotenoides (Y5) presenta valores comprendidos entre 497. Según Li et al. en la respuesta Y6 se observan rendimientos entre 972. en cuanto a la concentración de esteroles (Y3) presenta concentraciones comprendidas entre 15. 2 67.8 18.41 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 1 0 0 -1.0 16. kg / m3) X1 () X2 ( ) Y1 (g aceite/ kg SS) Y2 (g car/ kg aceite) Y3 (g est/ kg aceite) Y4 (g toc/ kg aceite) Y5 (mg car/ kg SS) Y6 (mg est/ kg SS) Y7 (mg toc/ kg SS) 45 65 45 65 41 69 55 55 55 55 55 55 860 860 940 940 900 900 843 957 900 900 900 900 -1 1 -1 1 -1. 23 Tabla 4.8 1340.2 17.1 73.7 497. Y6: rendimiento de extracción de esteroles.3 1087.6 16.5 16.9 76.8 73.5 1421.1 1270. °C) Densidad (D.2 12. Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.4 72.3 6 60.5 18.0 22.0 18.7 1330.0 1250.5 1331.5 19. esteroles y tocoferoles con SC-CO2.5 21.6 1160.2 16.2 60.2 977.5 16.2 533.4 1337.3 19.0 61.0 1481.6 14.9 1386.9 1353. Temperatura (T.2 1193.6 16.6 16.4 1282.7 17.1 12.8 16. Y3: concentración de esteroles. Y4: concentración tocoferoles.Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).4 13.7 828.3 1216.41 1. Capítulo 3.8 589.6 15.1 84.8 1009.1 1228.Resultados y discusión .5 993.6 8.1 972.1 18.1 825.2 890.4 769.6 1044.0 17.0 896. Y5: rendimiento de extracción de carotenoides.4 1676.4 1228.9 60 80.0 16. Y2: concentración de carotenoides.9 16.1 Rendimiento de extracción y concentración de carotenoides.5 828.8 974.6 1070.7 1207.1 17.5 62.0 17.7 923.41 0 0 0 0 61.2 12. 1276.0 9.41 1.5 17.9 8.0 Y1: rendimiento de extracción de aceite.5 16.2 12.1 12. 2E5 Residuo 25982.12 0.24 5 6 11 0.3 Análisis estadístico La evaluación estadística del modelo se efectuó mediante el análisis de varianza (ANOVA) el cual permite determinar de forma analítica el comportamiento de los datos obtenidos a partir de los ensayos de extracción.4E+5 5 6 11 44650.62 5 6 11 14.37 10.10 5.0066 3.7).5E+5 2900.97 < 0. 24 .05 < 0. Y2: concentración de carotenoides.53E+5 12156.2 se presentan los resultados del análisis de varianza entregado por el programa Design Expert.70 4330.23 6409.86 12.0.14 51. En la Tabla 4.72 < 0. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).0051 72. Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.51 72.81 747.1.Capítulo 4.13 4.30 < 0.86E+5 38459.2E+5 5 6 11 77253.7E+5 5 6 11 1.6 11.24 3.42 0.36 < 0.62 37. Tabla de análisis de varianza para el modelo cuadrático Modelo Y1 Regresión Residuo Total Y2 Regresión Residuo Total Y3 Regresión Residuo Total Y4 Regresión Residuo Total Y5 Regresión Residuo Total Y6 Regresión Residuo Total Y7 Regresión 2. Y6: rendimiento de extracción de esteroles. Resultados y discusión 4. Y3: concentración de esteroles.21 Total 2.0001 663. Y5: rendimiento de extracción de carotenoides.31 < 0. Mediante este análisis se podrá evaluar la significación y la adecuación del modelo cuadrático propuesto (Ecuación 3.7 13.0001 2.0044 7.97 9.94 7.85 5 6 11 6.85 0. versión 6. Tabla 4.2.0330 34.53 0.29 5 6 11 132.0081 Suma de cuadrados gl Cuadrado medio F Valor p Y1: rendimiento de extracción de aceite. Y4: concentración de tocoferoles.5 < 0.48 83.60 3.084 170.64 0. esto debido a que no existen grandes diferencias entre el valor experimental y el valor predicho como se puede observar en el Anexo E. en este caso H0 indica que el modelo utilizado no es apropiado para predecir el comportamiento de la respuesta en función de las variables en estudio. el indicador R2 se encuentra alrededor de 0.01. le confiere validez al modelo obtenido. La respuesta Y4 (concentración de tocoferoles). El coeficiente de determinación R2. coeficiente de variación.05 que el modelo pueda fallar debido a perturbaciones experimentales. Este valor. Resultados y discusión En la Tabla 4. siendo consistentes en el tiempo sin importar las fuentes de ruido que pueden comprometer su calidad. El valor p es el nivel de significancia observado en el modelo. rechazar una hipótesis nula cuando es cierta.Capítulo 4. por lo tanto.3 se observan los indicadores estadísticos para cada una de las respuestas. al ser alto. razón señal/ruido. no se observa una alta dispersión de los datos. para Y1 es de 0. En la Tabla 4. En cuanto a la razón señal/ruido estas presentan un valor mayor a 4 lo que indica que las respuestas obtenidas tienen robustez y son de calidad. lo que quiere decir que el 89% del rendimiento de extracción de aceite está explicado por el modelo representado en la ecuación. Y3.3 es la falta de ajuste. 25 . lo cual indica que el modelo es significativo para predecir el comportamiento de estas respuestas en función de las variables no codificadas temperatura de extracción y densidad de CO2. Para la respuesta Y1 el valor de F es 9. la cual no resultó significativa (p≥0. es decir. Para las demás respuestas. coeficiente de determinación (R2) y falta de ajuste. cuanto más pequeño sea su valor mayor será la evidencia para rechazar la hipótesis nula (H0).05) para ninguna de las respuestas. Para la respuesta Y1 existe menos del 1 % de cometer un error tipo I.2 se puede observar los valores F para cada modelo de regresión. Y7. presenta un valor p<0. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). (Figura E-1 a E-7).033 lo que indica que existe una probabilidad menor 0. Y6.89.5 lo que indica que el modelo utilizado es significativo ya que presenta un valor p≤0. se rechaza H0. Esta situación se repite para las respuestas Y2. y se establece que el modelo es adecuado. en esta ocasión es improbable. el 11% restante es la contribución del error a la respuesta. donde se encuentran los valores del modelo (F). indica la contribución de todos los componentes de la ecuación a la respuesta. Y5.90 lo cual señala que el comportamiento de éstas está explicado adecuadamente por las variables independientes involucradas en la ecuación cuadrática. Otro de los indicadores estadísticos que pueden observarse en la Tabla 4. 05) se indican con (*). Tabla E-1).99 0.5 22. Análisis del rendimiento de extracción de aceite Para la respuesta rendimiento de extracción de aceite de microalga B.97* 0.19 1.50* 0. respectivamente.1.97 12156. Y2: concentración de carotenoides.4 9.91 26980. Resultados y discusión Tabla 4.1 y el análisis de varianza para la contribución de cada término presente en la ecuación polinómica (Anexo E.71 ( ) 10 40 10 -2. donde el efecto positivo de la temperatura se ve a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se observa a Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).34ns 9. el modelo cuadrático resulta adecuado y permite utilizar las superficies de respuesta para analizar el efecto de las variables independientes temperatura de extracción y densidad del CO2 sobre cada una de las respuestas en estudio.3.83 ( ) -0.72* 0. 24.30* 0. Y6: rendimiento de extracción de esteroles. Y3: concentración de esteroles.2% de contribución en la respuesta.3.2 9.89 6. En base a los resultados estadísticos obtenidos.0ns 10.35ns 51.56 ( ) + *4.8 5. Y5: rendimiento de extracción de carotenoides.05).1) A partir de la Ecuación 4. 1 T-55 D-900 T-55 2 71.36* 0.91 21821.6ns Y1 (g / kg SS) 9.05* 0.05* Significante (p≤0.05) por los componentes lineales de temperatura y densidad y la interacción de ambos componentes con un 45. Y4: concentración de tocoferoles.57 ( 2 T-55 10 ) ( D-900 40 ) (4. 4. se puede observar que el rendimiento de extracción de aceite fue afectado significativamente (p≤0.93ns Y2 (g car / kg aceite) 170.* significativo p≤0. Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.6 10. 26 .01).89 61.90 2.21 5.78ns 5.76 ( D-900 40 ) + *4.38 2.82 0. se obtuvo la Ecuación 4.1 que indica la relación causa/efecto que existe con las variables independientes (temperatura de extracción y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos (p≤0.82+ *6. Indicadores estadísticos para el modelo de superficie de respuesta Indicadores estadísticos F R2 Falta de ajuste Señal/ruido CV Variable respuesta Y3(g est / Y4 (g toc/ Y5(mg car/ Y6 (mg est/ Y7 (mg toc/ kg aceite) kg aceite) kg SS) kg SS) kg SS) 11.4 40. braunii (Y1).9ns 12.05).9%. CV: coeficiente de variación.1.35 4.8% y 11. ** Significante (p≤0.68 Y1: rendimiento de extracción de aceite.31* 0.16 6. Esto se observa en la Figura 4.Capítulo 4. y ns No-significante (p≥0.6 7. el mejor rendimiento de extracción de aceite fue 90.0 kg aceite/kg SS. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Los coeficientes de las variables lineales y la interacción de éstas fueron significativos y positivos existiendo una relación directamente proporcional a condiciones de densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 °C) aproximadamente.Capítulo 4. representando gráficamente el mayor % de contribución a la respuesta. ya que. 27 .1. muestra que el menor rendimiento de extracción se encuentra a temperaturas entre 41 y 48°C en el rango de densidades de 843 a 872 kg CO2/m3. 90 81 72 63 53 957 69 929 62 900 55 872 843 41 48 Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C) Figura 4. se observa una mayor pendiente para la variable temperatura.0 g aceite/kg SS.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de aceite (Y1) como función de la temperatura (ºC) y densidad (kg CO2/m3). Finalmente. obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3. de acuerdo al modelo cuadrático. En la Figura 4. Resultados y discusión alta temperatura.1 se observa que el mayor rendimiento de extracción se encuentra en la zona de alta temperatura de extracción y alta densidad de CO2. la Figura 4. Además. de acuerdo al modelo cuadrático el valor fue 53. 2) Del análisis de varianza (Anexo E. es decir.05) se indican con (*). a medida que aumenta la densidad a temperatura constante.2% la respuesta Y2. De acuerdo a los valores entregados por el modelo cuadrático la mayor concentración de carotenoides es 17. Tabla E-2) se establece que la concentración de carotenoides (Y2) fue afectada principalmente por el componente lineal densidad de CO2 con un 65.2 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo. 28 .2 se obtuvo la superficie de respuesta observada en la Figura 4.47 ( 2 T-55 10 )( D-900 40 ) (4.0% y finalmente la interacción de los componentes temperatura y densidad de CO2 influyó un 1.2.3. a su vez la menor concentración de carotenoides presenta un valor de 6. presentando una mayor pendiente la variable densidad de CO2. Se puede decir entonces. se produce un aumento en la concentración de carotenoides (Y2).0.30+ 1.9% de contribución en la respuesta. donde se ve un comportamiento lineal de la respuesta. 2 T-55 D-900 T-55 2 12.7 ( ) + 2. la superficie sigue esta tendencia presentando una mayor concentración en condiciones sobre el punto central (55°C y 900 kg CO2/m3).05) el componente lineal temperatura con un 32. la cual indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes temperatura de extracción y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p≤0.0 g car/kg aceite a una temperatura de 42 °C y densidad de 843 kg CO2/m3. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).2.45 ( ) -0. Resultados y discusión 4. también influyó significativamente (p≤0.2% en la concentración de carotenoides en el aceite extraído.13 ( D-900 40 ) . lo que indica una relación directamente proporcional de la temperatura de extracción y densidad de CO 2 sobre la concentración de carotenoides (Y2). A partir de la Ecuación 4.Capítulo 4.2).2 Análisis de concentración de carotenoides Para la respuesta concentración de carotenoides (Y2) se obtuvo la ecuación polinómica (4. como se observa en la Figura 4. que estos tres componentes explican en un 99. En la Ecuación 4. lo que gráficamente representa la contribución que realiza esta variable a la respuesta.036 ( ) 10 40 10 +0.0 g car/kg aceite encontrada a una temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3. 48 ( ) 10 40 10 D-900 40 +0. presentando un coeficiente de signo positivo lo que indica una relación directamente proporcional a la respuesta (Y3) a bajas temperaturas.16 ( ) .3) A partir del análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite (Anexo E.3 que indica la relación causa/efecto que existe con las variables independientes (temperatura y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos (p≤0.05) en la respuesta contribuyendo un 62.76 ( 2 T-55 10 )( D-900 40 ) (4. Tabla E-3) y al analizar la Ecuación 4.Capítulo 4.76 .3.3 Análisis de concentración de esteroles Los valores experimentales de la concentración de esteroles se ajustaron a un modelo cuadrático con la finalidad de generar la Ecuación 4. 4. Resultados y discusión 17 14 12 9 6 957 69 929 62 900 55 872 843 41 48 3 Densidad (kg CO2/m ) Temperatura (°C) Figura 4.71 ( ) .0.90 ( T-55 D-900 T-55 2 ) + 1.0.0.2 Superficie de respuesta de la concentración de carotenoides (Y2) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). 3 18.05) se indican con (*). 29 .6%.3. se observa que la variable lineal densidad de CO2 influye significativamente (p≤0. Otro de los factores que influyó significativamente en la respuesta (Y3) es la Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 0 g esteroles/ kg aceite. este comportamiento se observa en la Figura 4. En la Figura 4. 23 21 19 17 15 957 69 929 62 900 55 872 843 41 48 Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C) Figura 4. a su vez la menor concentración de esteroles presenta un valor de 15. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Resultados y discusión variable lineal temperatura aportando un 17.0 g esteroles /kg aceite a una temperatura de 69 °C y densidad de 860 kg CO2/m3. a medida que aumenta la temperatura a densidad de CO2 constante.3 se observa una mayor concentración de esteroles a temperaturas entre 41 a 48 °C y densidad de CO2 entre 929 y 957 kg CO2/m3 y de acuerdo al valor entregado por el modelo cuadrático la mayor concentración es 23.3 Superficie de respuesta de la concentración de esteroles (Y3) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).4% a la respuesta.Capítulo 4. su coeficiente es negativo lo que indica una relación indirecta entre temperatura y concentración de esteroles.3 donde. 30 . la concentración de esteroles disminuye. 4% y 12. Este comportamiento explica porque el componente cuadrático de la variable temperatura es negativo y significativo (p≤0.83-0.05). Mientras que el signo negativo que acompaña el coeficiente de la variable cuadrática temperatura indica que dentro de un rango de trabajo. presentando una contribución de 60. 31 .4).49 ( ) .4 Análisis de concentración de tocoferoles Para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4) se obtuvo la ecuación polinómica (4.0 g tocoferoles/ kg aceite a una temperatura de 41 °C y densidad de 843 kg CO2/m3 Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Tabla E-4) y la Ecuación 4.7% respectivamente.03 ( T-55 D-900 T-55 2 ) + 0.4 indican que la respuesta fue afectada significativamente (p≤0.4. En la Figura 4. mientras que a valores altos de densidad de CO2. 4 16.4 donde a valores de temperatura bajo el punto central (55 °C) se observa un comportamiento directamente proporcional a la respuesta (Y4). la cual indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes temperatura de extracción y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p≤0.3.*0. Al observar los signos que acompañan los coeficientes.Capítulo 4.25 ( ) 10 40 10 D-900 40 -3.0 g tocoferoles/ kg aceite observada a condiciones de 41 °C y 957 kg CO2/m3.25 ( 2 T-55 10 )( D-900 40 ) (4. De acuerdo al valor entregado por el modelo cuadrático. a su vez la menor concentración de tocoferoles presenta un valor de 15.12 10-3 ( ) -0.4 se observa que a valores bajos de densidad de CO2 la concentración de tocoferoles aumenta a medida que aumenta la temperatura.05) se indican con (*). la mayor concentración de tocoferoles es 18. Resultados y discusión 4.05) por la variable lineal densidad de CO2 y la variable cuadrática temperatura de extracción. en el caso de la variable lineal densidad es positivo y su comportamiento se puede observar en la Figura 4.4) El análisis de varianza para la concentración de tocoferoles (Anexo E. presentándose un máximo en la respuesta lo que se observa en la Figura 4. la concentración de tocoferoles disminuye con el aumento de la temperatura. desde una determinada temperatura la concentración de tocoferoles disminuye al aumentar esta variable. La Ecuación 4.5 Análisis de rendimiento de extracción de carotenoides Del análisis estadístico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de extracción de carotenoides en el aceite.5) Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).Capítulo 4. 5 T-55 D-900 T-55 2 883.3.5 indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) y las variables independientes temperatura y densidad de CO2. 4.99 ( 2 T-55 10 )( D-900 40 ) (4.85+ *202.99 ( ) + *227.4 Superficie de respuesta de la concentración de tocoferoles (Y4) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). donde los coeficientes significativos (p≤0.53 ( D-900 40 ) +43. 32 . Resultados y discusión 18 17 16 16 15 957 69 929 62 900 872 48 843 41 55 Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C) Figura 4.05) se indican con (*).40 ( ) 10 40 10 -14.71 ( ) -0. Tabla E-5) y la ecuación polinómica (4.8% y 42. encontrado a 41 °C y 843 kg CO2/m3. a medida que aumenta la densidad a temperatura constante.Capítulo 4. En la Figura 4. Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3) Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).0 mg car/kg SS obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3. En la Ecuación 4.05) por los componentes lineales densidad de CO2 y temperatura de extracción presentando una contribución a la respuesta de 53.5) indican que la respuesta (Y5) fue afectada significativamente (p≤0.8% respectivamente.5.0 mg car/kg SS.5.5 se observa un comportamiento lineal de la superficie de respuesta y según los valores entregados por el modelo cuadrático el mejor rendimiento es 1550. se produce un aumento en el rendimiento de extracción de carotenoides (Y5).5 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo. a su vez. la superficie sigue esta tendencia presentando un mayor rendimiento en condiciones sobre el punto central (55 °C y 900 kg CO2/m3). como se observa en la Figura 4. 1550 1246 941 637 333 957 69 929 62 900 55 872 843 41 48 Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C) Figura 4. lo que indica una relación directamente proporcional de la temperatura de extracción y densidad de CO 2 sobre el rendimiento de extracción de carotenoides (Y5). Resultados y discusión El análisis de varianza realizado para el rendimiento de extracción de carotenoides en el aceite (Anexo E. 33 . el menor rendimiento de extracción de carotenoides es 333. es decir. esta situación se puede observar en la Figura 4.6.Capítulo 4.6 Rendimiento de extracción de esteroles Del análisis estadístico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de extracción de esteroles en el aceite. presentando un coeficiente positivo el cual indica un comportamiento directamente proporcional a la respuesta. Resultados y discusión 4.0 mg est/ kg SS. además.68 ( ) + 203.48 ( ) -58.09 ( D-900 40 ) +39. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).81 ( ) 10 40 10 -29.0 mg est/ kg SS observado a 41°C y 843 kg CO2/m3.6 se observa que el mayor rendimiento de extracción se encuentra en condiciones sobre el punto central (55 °C y 900 kg CO2/m3) presentando un valor de 1631.6 se establece que el rendimiento de extracción de esteroles (Y6) fue afectado mayoritariamente por el componente lineal densidad de CO2 con un 77.6 tanto a bajas como a altas temperaturas de extracción. 6 T-55 D-900 T-55 2 1347. Los coeficientes significativos (p≤0. lo que quiere decir que a medida que la densidad de CO2 aumenta a temperatura constante el rendimiento de extracción de esteroles aumenta.6) Del análisis de varianza (Anexo E. En la Figura 4. el modelo cuadrático señala que el menor rendimiento de esteroles es 883.03 ( 2 T-55 10 )( D-900 40 ) (4. ecuación polinómica que indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta rendimiento de extracción de esteroles (Y6) y las variables independientes temperatura y densidad de CO2.05) indicados con (*) se observan en la Ecuación 4.22+55.3. 34 . Tabla E-6) y al observar la Ecuación 4.4% de contribución. Capítulo 4. Los valores experimentales del rendimiento de extracción de tocoferoles. T-55 D-900 T-55 2 1208.83 ( ) -29. 35 .47+ *106. Superficie de respuesta de la rendimiento de extracción esteroles (Y6) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).2% y un 40.7 que indica la relación causa/efecto que existe con las variables independientes (temperatura de extracción y densidad de CO2).74 ( ) 10 40 10 7 -44.4% respectivamente. Resultados y discusión 1631 1444 1257 1070 883 957 69 929 62 900 55 872 843 41 48 Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C) Figura 4. se ajustaron a un modelo cuadrático con la finalidad de generar la Ecuación 4.94 ( 2 T-55 10 )( D-900 40 ) (4.70 ( ) + *112. 4.3.34 ( D-900 40 ) +60.6.7) Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Tabla E-7) se observa que las variables de los componentes lineales temperatura de extracción y densidad de CO2 influyen significativamente (p<0.7 Rendimiento de extracción de tocoferoles A partir del análisis de varianza (ANOVA) desarrollado para el rendimiento de extracción de tocoferoles (Anexo E.05) en la respuesta Y7 aportando un 36. donde el efecto positivo de la temperatura se observa a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se observa a alta temperatura existiendo una relación directamente proporcional que se observa solo a condiciones de densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 °C) aproximadamente.Capítulo 4.7 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de tocoferoles (Y7) como función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). Resultados y discusión En la Ecuación 4. ya que.0 mg toc/kg SS.7. 36 . obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3. de acuerdo a los valores entregados por el modelo cuadrático el mejor rendimiento de extracción fue 1492. también se puede ver que el menor rendimiento de extracción se encuentra a temperaturas de 41 a 48 °C en Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).7 se observa el signo positivo que acompaña los coeficientes lineales temperatura de extracción y densidad de CO2 lo que se ve en la Figura 4. En la Figura 4. a partir de la Figura 4. 1492 1337 1182 1027 872 957 69 929 62 900 55 872 843 41 48 Densidad (kgCO2/m3) Temperatura (°C) Figura 4.7.7 se observa que el mayor rendimiento de extracción de tocoferoles se encuentra en la zona de alta temperatura de extracción y alta densidad de CO2. Finalmente. 4 Discusión general Existen muchos factores que pueden influenciar el rendimiento de extracción supercrítica. aumentando la presión de vapor de los compuestos extractables y mejorando el rendimiento de extracción. la solubilidad de los solutos cambiará de acuerdo al factor más predominante. Como se puede observar la densidad es mayor a la utilizada en esta investigación y por ende el rendimiento de extracción también es mayor. Maróstica et al. Antilaf (2011). Este hecho se debe a la alta presión del solvente lo que genera una menor distancia entre Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). donde. indican que la solubilidad de los solutos está influenciada claramente por dos factores: la densidad del SC-CO2. de acuerdo a los resultados presentados en la Tabla 4. tamaño de partícula. temperatura de extracción. lograron el mayor rendimiento de extracción de aceite de microalga Chlorella protothecoides a condiciones de 50 °C y 900 kg CO2/m3. rendimiento similar al obtenido en esta investigación. (2010).0 mg toc/kg SS. Andrich et al. Por otro lado. (2005). se estudia el efecto de la temperatura de extracción y densidad del CO2 sobre el rendimiento de extracción de aceite de la microalga (Botryococcus braunii). densidad del CO2 entre otras. estos pueden ser: humedad del sustrato. y la presión de vapor de los solutos. mientras que. condiciones de extracción dentro de nuestro rango de estudio. la cual aumenta por el incremento de la temperatura. obteniendo el mayor rendimiento (118. extrajo aceite a condiciones de 40 °C y 911.1 existe relación entre estas variables y cada una de las respuestas en estudio. presión de CO2. extrajo aceite a partir de la microalga Nannochloropsis sp. 4. En este caso.3 g aceite/ kg SS. observando un efecto significativo de la temperatura sobre el rendimiento de extracción encontrando el mayor a una temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3 lo cual concuerda con Maróstica et al. Resultados y discusión un rango de densidades de 843 a 872 kg CO2/m3 y de acuerdo al modelo cuadrático fue 872.Capítulo 4. que aumenta con la presión trabajando a temperaturas constantes. En cuanto al contenido de aceite de microalga Botryococcus braunii. (2010) que señalan que el aumento de la temperatura acelera la transferencia de masa..04 g aceite/kg SS) a 55 ºC de temperatura y una densidad de 1000 kg CO2/m3. es decir. 37 .1 kg CO2/m3 logrando un rendimiento de 86. estudios realizados por Chen y Walker (2012). quienes utilizaron extracción con SCCO2. pigmentos. 890 kg CO2/m3.. se obtuvieron trabajando con las densidades de CO2 más altas (sobre 900 kg CO2/m3). braunii. esto puede ser debido a que la extracción de carotenoides está favorecida por el empleo de elevadas densidades del CO2 cuando se trabaja en intervalos supercríticos (Favati et al. 38 . Resultados y discusión las moléculas provocando un aumento en la solubilidad del aceite como también un incremento del poder solvente del SC-CO2 (Li et al. Por otro lado... Esto puede ser debido a que la extracción de carotenoides está favorecida por el empleo de elevadas densidades de CO2 cuando se trabaja en intervalos supercríticos (Ibañez et al. a partir de biomasa de microalgas” (Careri et al. Mendiola (2008) señala que a pesar de que en el rendimiento de extracción de carotenoides se debe tener en cuenta la presencia de otros compuestos en el extracto. 2001). Debido a la baja polaridad de estos compuestos y a la alta selectividad de este método se ha llegado a calificar la extracción con fluidos supercríticos como “el método más apropiado para la obtención de ácidos grasos. 2010). el rendimiento de Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). (2004) determinó que un 55. linoleico entre otros. En el proceso de extracción de carotenoides tanto la densidad de SC-CO2 como la temperatura de extracción influyeron significativamente en el rendimiento de carotenoides. 1998). resultados similares a la investigación realizada por Macías-Sánchez et al. Cabe mencionar que el aceite obtenido de microalgas y de otros sustratos en general se extrae como mezcla de varias fracciones de lípidos. los resultados obtenidos por Macias-Sánchez et al. 1998). logrando el mayor rendimiento por sobre los 55 ºC y densidades sobre los 900 kg CO2/m3. (2005).Capítulo 4.. en Nannoclhoropsis gaditana utilizando SC-CO2 indican que a temperaturas de 60 ºC y densidad de 890 kg CO2/m3 se obtiene el mayor rendimiento en la extracción de carotenoides. en el caso de B. Los mejores resultados. con valores superiores a 1500 mg car/ kgSS. obteniendo los mejores rendimientos de carotenoides a condiciones de trabajo de 60 ºC. en la microalga S. Fang et al. almeriensis trabajando a temperaturas entre 32 y 60 ºC. (2010). densidades de 882 a 957 kg CO2/m3. en términos de rendimiento de extracción de carotenoides. palmítico. Los carotenoides son pigmentos termolábiles y fotodegradables cuyas propiedades antioxidantes están ampliamente estudiadas y para los que la extracción con CO2 supercrítico ha sido ampliamente utilizada..4% del extracto corresponde a ácidos grasos como ácido oleico. etc. Estos resultados coinciden con la aseveración de que los tocoferoles son compuestos fácilmente extraíbles. el mayor rendimiento de carotenoides y el mayor rendimiento de aceite se obtuvieron a las mismas condiciones (69 °C y 957 kg CO2/m3). a condiciones de 69 °C y 900 kg CO2/m3 (finalizada la extracción) se obtuvo el mayor rendimiento. Esta relación se refleja en los resultados obtenidos en esta investigación. esto ocurre debido a que en esta fase se encuentra todo el aceite disponible para la extracción. ya que. una gran proporción del aceite ha sido extraído lo que gráficamente se representa por una asíntota. Resultados y discusión carotenoides tiene una relación directa con el total del aceite extraído. Otro estudio realizado por Mendiola (2008) en extractos de Spirulina también concuerda con lo anteriormente descrito.. La velocidad de extracción de aceite de microalga Botryococcus braunii se puede observar en el Anexo C. 1996). por tanto. durante esta fase. dado que la temperatura afecta positivamente su extracción (King et al. Este comportamiento indica que el proceso sería controlado por la transferencia de masa (difusión del CO2 al interior de la matriz vegetal y difusión del CO2 mas el aceite desde el interior de las partículas hacia la superficie) (MacíasSánchez et al. En cuanto al rendimiento de extracción de tocoferoles tanto la densidad de CO2 como la temperatura de extracción influyeron significativamente p≥ 0. (Figua C-1 a C-12) donde se ven claramente dos fases predominantes en las curvas del modelo de extracción. obteniendo el mayor rendimiento a condiciones máximas de temperatura (83 °C). luego se observa que la tasa de extracción va disminuyendo (fase de transición). En la primera fase se observa una velocidad de extracción rápida durante los primeros 10 minutos. 39 . en este estudio el mayor rendimiento de extracción de tocoferoles se obtuvo a la máxima temperatura del rango de trabajo (69 °C). es lógico pensar que el rendimiento estará favorecido a elevadas temperaturas.. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). .Capítulo 4. 2009) Finalmente.05 sobre el rendimiento. Finalmente. CAPÍTULO 5 CONCLUSIONES . 0%. La densidad del CO2 afectó significativamente (p≤0.05) la concentración de carotenoides en el extracto con un 66.05) por las 2 variables en estudio. El mayor rendimiento de extracción de aceite se obtuvo a 69 °C.2 g car/kg aceite y un contenido de tocoferoles totales de 16. El aceite obtenido bajo condiciones seleccionadas (55 °C.0% por las variables en estudio. siendo la densidad de CO2 la variable que más afectó con un 53.0 g car/kg aceite registrada a una temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3. un contenido de carotenoides de 12.8 g esterol/kg aceite.0% de influencia de temperatura. CONCLUSIONES La temperatura y la densidad de CO2 afectaron significativamente (p≤0. Conclusiones CAPÍTULO 5. La mayor concentración de carotenoides fue 17. 41 . El comportamiento del rendimiento de extracción de carotenoides fue explicado en un 82. siendo la densidad del CO2 la variable que más contribuyó a la respuesta con un 62.4% respectivamente. seguido por la temperatura con un 42. braunii). Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).8%. explicando su comportamiento en un 89. con una densidad de 957 kg CO2/m3. 900 kg CO2/m3) presentó un contenido de esteroles totales de 18.1% de contribución seguido por el 32.Capítulo 5.9%.4%.8 g toc/kg aceite. La concentración de esteroles y tocoferoles en el extracto fueron afectadas significativamente (p≤0.05) el rendimiento de extracción de aceite de microalga (B.6% y un 60. siendo la temperatura de extracción la variable que más afectó con un 46. BIBLIOGRAFÍA . edu/phycokey/phycokey.. Chile. “Oficial Methods of Analysis of the Association of Official analytical Chemists”. T. J. “Determination of carotenoids in microalgae using supercritical fluid extraction and chromatography”. “Supercritical fluid extraction of bioactive lipids from the microalga Nannochloropsis sp”. European Journal of. http://cfb. I... (2005). A..htm. 1era Ed. Journal of Applied Phycology. AOAC (1990).unh. Temuco.. Atacama Bio Natural Products S. (1992). (2012).com/spanish/index. Marine. http://www. Huisman. Visitada el 10 de Marzo de 2013. R. Rodríguez-Meizoso.. W. Belitz. Washington DC. Lipid Science and Technology.. 15 th edition. G. Madrid.A. G.. M. A... Universidad de La Frontera. J. Freshwater. Ahlgren. (1997). “Estudio de ruptura celular de microalga (Botryococcus braunii) usando CO2 supercrítico”. F. Editorial Acribia S. Venturi. Balker. 1250: 63-68.Bibliografía BIBLIOGRAFÍA Abrahamsson. Estuarine. A... I.A. Trabajo para optar al título de Ingeniero en Alimentos. I. Turner. Culture of the astaxantin-producing green alga Haematococcus pluvialis. U. H. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Gustafsson.. Effects of nutrients on growth and cell type. Antilaf. EE. Andrich. I. Journal of Chromatography A.. Borowitzka.atacamabionatural. (1991). 43 . 3: 295-304. V. Grosch. “Química de los Alimentos”. (2000).UU. Fiorentini. Nesti. Zinnai.. Ediciones Días de Santos S. Zaragoza. 28: 37-50. Bello. Osborn. Journal of Phycology. M. Boberg. A. USA. Visitada el 20 de Julio de 2012. (2011).. “Ciencia bromatológica”. 107: 381-386.2da Ed.html. “Fatty acid content and chemical composition of freshwater microalgae”. M. Bioresource Technonogy. Anklam. A. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii).. 5: 124. Food Science and Technology International. C.Bibliografía Bruton. Y. “A Review of the Potential of Marine Algae as a Source of Biofuel in Ireland”. Calvo. A. Visitada el 22 de Agosto de 2012. “Supercritical fluid extraction for liquid chromatographic determination of carotenoids in Spirulina Pacifica algae: a chemometric approach”. Leung. Ingeniería Química y Tecnología del Medio Ambiente.. G. “Comparison of supercritical carbon dioxide and Soxhlet extraction of lipids from a brown seaweed. L. “Fed-batch fermentation and supercritical fluid extraction of heterotrophic microalgal Chlorella protothecoides lipids”. Musci. J. Lerat. R.... 114: 512-517. (2001). M. Dayananda..com/doc/95692320/93/Extraccion-del-lupulo.. (2006). “Revisión: Extracción con CO2 a alta presión. 1era Ed. T. 46:4228-4232.. C... Theobald. M. Universidad Nacional de Educación a Distancia. López. V. H. C. A. “Procesos comerciales de extracción con fluidos supercríticos”.. Universidad de Valladolid. Rasmussen. T.. Dpto.. (2011). J. Electronic Journal of Biotechnology. Gómez. del Valle. (2007). E. (1998). Kumar. (1999). Sargassum hemiphyllum (Turn)”. S. Mangia. M. (2012). Carretero. Proceso de fabricación de bebidas alcohólicas. M. 44 . 10: 78-91. Royo. Furlattini. (2009). Sarada... Cheung. Y. Ravishancar. Von Holst. Cocero..... Cheng. C. M. Fundamentos y aplicaciones en la industria de alimentos”. Lyons.. “Isolation and characterization of hydrocarbon producing green alga Botryococcus braunii from Indian freshwater bodies”.scribd. 912: 61-71. Journal of Agricultural and Food Chemistry. y Aguilera. Madrid. http://es. Sustainable Energy Ireland. Walker. salud y alimentos funcionales”.. Stanley. Careri. F. “Nutrición. Journal of Chromatography A. P.. P. Ang. “Enhancement of lipid production using biochemical.. Eskins. J. Hsu. E. “Fatty acids in Botryococcus braunii accelerate topical delivery of flurbiprofen into and across skin”.. Friedrich. S.. K. (2004). A. Journal of Chromatography A. 272: 717722. “Biotecnología de microalgas como fuente de diversos compuestos de interés para la industria farmacéutica y alimentaria”. Journal of Food Science. genetic and transcription factor engineering approaches”. J. S. C. J.and supercritical fluid extraction of functional ingredients from different natural sources: Plants... Universidad de Santiago de Compostela. S. Ibañez E. food-by-products. 45 .. K. (2007). N. “Production of tocopherol concentrates by supercritical fluid extraction and chromatography”. G. algae and microalgae”. 19: s76-s77.. A. Journal of Supercritical Fluids. Germain. F. J.. López-Sebastián. “Microstructural effects on internal mass transfer of lipids in prepressed and flaked vegetable substrates”. Ibañez. (1998). (2001). 823: 313-319. Fang. . J. Durmaz. D. (2012). (1996). Vitae. García. “Supercritical CO2 extraction of carotene and lutein from leaf protein concentrates”. F. Tabera.. H. Food Chemitry. E. Wang. C. 98: 136-148. Favati.. Trabajo para optar al grado de doctor en acuicultura. Chiang Y... King. B. (2009).. M. Galicia. 31: 1843-1857. (1998)... “Productos biotecnológicos de microalgas marinas. “Sub. 37: 178-190. King. Díaz. Parisien. Dorval. International Journal of Pharmaceutics. Brunner.. Herrero. Separation Science. Lan. and Technology. “Vitamin E (α-tocopherol) production by the marine microalgae Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae) in nitrogen limitation”. Y. packed capillary columns and neat carbon dioxide”. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 276: 163-173. Wu. J. (2006). Aquaculture. Favati. G. 141: 31-41. Uquiche.. & Reglero.. Taylor. (1998). Zetzl. J. “Separation of carotenoids by subcritical fluid chromatography with coated.. 53: 1532. Cifuentes.Bibliografía del Valle. Journal of Biotechnology..1536. Chiu.. (2010).. M... Machmudah. Chang. Montero. M... Fernandez-Sevilla. M. Li. Editorial Reverte S. “Comparison of supercritical fluid and ultrasound-assisted extraction of carotenoids and chlorophyll a from Dunaliella salina”... Molina... S. L. H.. Tena. Cerón.. S. T. M. Rodríguez. O. “Perspectives of microbial oils for biodiesel production”. (2010). Martínez. Talanta. Sasaki.. M. M.Bibliografía Li. Applied Microbiology and Biotechnology. Journal of the American Oil Chemistry Society. Olguín. 87: 1081-1089. Wu.. 78: 1-8. Q. 1: 91-116. Madrid.. A. Mantell. 46 . (2009). “Extraction of carotenoids and chlorophyll from microalgae with supercritical carbón dioxide and ethanol as co-solvent”. Martínez.A. “Las microalgas oleaginosas como fuente de biodiesel: retos y oportunidades”. B.. C. “Extracción con fluidos supercríticos en el proceso analítico”. M... U. Industrial Engineering Chemistry Reserch. “Supercritical fluid extraction of carotenoids from Scenedesmus almerensis”.. C. Rempel. (2011). Loera-Quezada. F. Li. Du. Goto.. Acién. 31: 1352-1362. “Extraction of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis using supercritical CO2 and ethanol as entrainer”.. Food Chemistry. W. Macías-Sánchez. (1993).. Separation and Purification Technology. C. Lubián. E... Chang. E. O. E. L. Lubián. Shotipruk. Mantell. Rodríguez. S. A. Macías-Sánchez. (2005). M. 80: 749-756. Montero. (2006). J. (2008). Liau. Latinoamericana Biotechnology Ambienta Algal.. Hsu. Shen... “Effect of operating parameters on oil and phenolic extraction using supercritical CO2”. M. “Separation of sight-protecting zeaxanthin from Nannochloropsis oculata by using supercritical fluids extraction coupled with elution chromatography”. 45: 3652-3657. Hong. Y. T.. 77: 948-952.. Journal of Separation Science.. E. M. (2010). Macías-Sánchez. M. Jong. Valcarcel. Liu. C. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Rev. D. 123: 928-935. Luque de Castro... Shieh. L. Hirose. Thiyam. J.. C... M.. Wu.. C. 47 . “Enhancement of biomass and pigment production during growth of Spirulina platensis in mixotrophic culture”. Gymnodinium sp.. M. Nishio. J. The Open Chemical Engineering Journal. P. N. Babas.. Phytochemistry. A.. Nagai. Dragano. 43: 484-489. “Determination of Carotene Content. Palavra. (2006). Medellin. M. B.. S. R. Pereira. A.. Martín-Álvarez. R. 62: 159-164. (2005). España.. Romanelli. 99: 57-63. fatty acid and sterol composition in the marine dinoflagellete. Sasaki.. Universidad Autónoma de Barcelona. G. García-Martínez.6. “Carotenoides”. C. Mendiola. A.. Cardoso. A.. D. Nobre. Mansour. 63: 145-153. J... Inorganica Chimica.. Selangor. F. “Enrichment of vitamin E from Spirulina platensis microalga by SFE”. (2003). Vieira.. Volkman.. Marquez. A. K. p. Reglero. V. “Supercritical carbon dioxide extraction of compounds with pharmaceutical importance from microalgae”. Maróstica. 356: 328-334. A. J. Malaysia.. Blackburn. Reis. Cifuentes.... Journal of Supercritical Fluids.Review (Supercritical Extraction and Stabilization of Phenolic Compounds)”. Bandar Baru Bangi. S. Acta. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Mendes. Martínez. (2003). “The effect of growth phase on the lipid class.. (2008). (2008) “Extracción de compuestos bioactivos de microalgas mediante fluidos supercríticos”. In batch culture”. (1995). p 2. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. Food Chemistry. M. Mendes. Method No. Trabajo para optar al grado de doctor en ciencias y tecnología de los alimentos. “Supercritical CO2 extraction of γ-linolenic acid and other lipids from Arthrospira (Spirulina) maxima: Comparison with organic solvent extraction”.. J. 4: 51-60. (2003).Bibliografía Malaysian Palm Oil Board. D. Universidad de Antioquia.194-197. (2010). Palavra. Rupérez. “Supercritical fluid extraction and stabilization of Phenolic compounds from natural sources . Mendiola. F. España. A.. Zaidul. irradiancia y concentración de nutrientes sobre el crecimiento de la microalga Rhodosorus marinus: caracterización de su flora bacteriana asociada”. J. Sun.. Urieta. 99: 1-8. J. S. C. I. Ediciones UPC.A review”. Ed.. (2010). 397408.1era ed. B. L. Tecnologías emergentes”. Ahmed.. Universidad de Zulia. Cabral. Pakistan Journal of Nutrition. E. 3: 178-181. Journal of Food Engineering. C. F. CO2 + ethanol and CO2+ canola oil using dynamic extraction of tomatoes”. (2011). Trabajo para optar al grado de magister Scientiarum en Microbiología. (2003). Nobre. M. A.. I. A. Tornero. 48 . (2005). Picó.. R. Maracaibo. S. B.. Ribot. Serra. Mendes. Abbas. J. Centro Tecnológico Ainia. Tomberli.... A.. Barcelona Sabir. J. Norulaini. Rauter. A. Bonet. “Industria alimentaria. Journal of Supercritical Fluids.. Oliver. A. “El libro blanco de los esteroles vegetales”. M. K. N. “Supercritical carbon dioxide extraction of carotenoids from carrot using canola oil as a continuous co-solvent”. 60: 21-27.. 37. (2006). Omar..Bibliografía Molina.. S. Hayat. “Apparent solubility of lycopene and b-carotene in supercritical CO2. Mainar. Karim.. Raventós. F. 2da Ed. Gouveia. Temelli. “Influencia de la salinidad.. Gray. M. Unilever Foods S. Palavra.. S. L. Jinap. A. Fareleira.. Palou. Journal of Supercritical Fluids. (2009)..A.. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii)... (2008). Valencia.... M. A. J. Rodríguez.. “Aplicaciones de la tecnología de Fluidos Supercríticos (FSC) en la industria alimentaria”. Coelho. S.. J. Novais... “Estimation of sterols in edible fast and oils”. Guigard. “Supercritical carbon dioxide extraction of bioactive compounds from microalgae and volatile oils from aromatic plants ”. Saldaña. F... 95: 240-253. Journal of Food Engineering. Morales. Sahena. P. A. Temelli. “Application of supercritical CO2 in lipid extraction . (2011). F. Barroso. (2005). 200: 547-546. Grasas y aceites. “Colorimetric determination of total tocopherols in palm oil. Jeffrey.. S. J. Universidad Autónoma de Nueva León. Organic geochemistry. M. E. S. M. Timms. (2000). J. 49 . Journal of the American Oil Chemistry Society. (1988). 65: 258-261. “Determinación cuantitativa de carotenoides en hojas de cinco especies del genero leucaena”. Volkman. (1997). “Rancidez oxidativa en la industria de nutrición animal: el uso racional de los antioxidantes”. Yeverino. S. Goh. Sanhueza. (1994)... 21: 1211-1218. Dunstan. Nieto. Wong. R. olein and stearin”. A. Barrett. Trabajo para optar al título de maestro en ciencias con especialidad en alimentos...Bibliografía Valenzuela. Monterrey. G. “Sterol biomarkers for microalgae from the green algal class Prasinophyceae”.. Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii).. ANEXOS . 4508 3.Anexos ANEXOS ANEXO A.3357 3.7952 Promedio % humedad (b.5072 28.6246 4.8300 Peso muestra húmeda (g) 28.205 % humedad (b.4737 28. N° de réplica 1 2 Peso placa (g) 27.606±0. 51 .5029 27.s) 3.220 Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Determinación de la humedad del sustrato Tabla A-1: Determinación de la humedad inicial de la microalga (Botryococcus braunii).480±0.8315 Peso placa + Muestra seca (g) 28.7609 3.h) 3. 5784 30.6289 30.6 Peso Inicial 30.79 26.1068 0.9 31.8 4.4585 30.5 35 70 136.70 61.5457 30.547 30.49 Tabla B-2. braunii a 65°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 2). Extracción de aceite de microalga B.31 48.6 36.5 17.5 63. braunii.0 126.0437 Peso acumulado recuperado 0.566 Peso extracto (g) 0.2101 corregido 0.5 35 70 136.45 38.0819 0.5872 30.5223 vial (g) Final 30.5709 vial (g) Final 30.59 41.5 63.0337 0.0069 30.0972 0.5 17.4165 kg CO2 / kg SS 2.3459 0.0856 0.6312 Peso extracto (g) 0.20 28.3374 corregido 0.6 Peso Inicial 30.5 CO2 g 18.0 245.0856 0.3 g aceite / kg MP 15.25 1 2 3 4 5 Anexos .6 9.5 CO2 g 18.7 9.70 51.6 36. braunii a 45°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 1) Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 39 Consumo L NPT 10.4212 kg CO2 / kg SS 2.3 18.1309 0.8 4.0 126.0355 0.13 62.3828 30.2595 0.9924 30.9 31.1927 0.0145 0. Vial Tiempo (min) 3 5 10 20 39 Consumo L NPT 10.0 245.3 18.3473 30.0603 Peso acumulado recuperado 0.6728 30.3299 0.2821 0.0585 0.6284 31.0827 0.1799 0.0511 0.0827 0.6369 30.226 0.1441 0. Tabla B-1.2771 0.3 g aceite / kg MP 24.4248 30.7289 30.78 30.Efecto de la densidad y temperatura sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 52 ANEXO B. Extracción de aceite de microalga B. Determinación del rendimiento de extracción de aceite de microalga B.1664 0.1639 0. 7 41.5708 33.1182 0. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.7 19.0658 0.1766 0.2 140. braunii a 65°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 4).3526 corregido 0.2324 0.91 Tabla B-4.4510 0.1451 0.3359 0.0558 0. braunii a 45°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 3).8261 34.20 49.3936 33.0592 Peso extracto (g) 0.3 280.67 60.4 20.0586 Peso acumulado recuperado 0.2292 corregido 0.0423 Peso acumulado recuperado 0.1 5.2 10.05 52.643 34.1 70.0229 34.1 5.4 20.1914 0.Efecto de la densidad y temperatura sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 53 Tabla B-3.30 39.5409 kg CO2 / kg SS 3.5 39 78 156 CO2 g 21.3565 0.2 10.2651 0.1 35.3 280.1451 0.1065 0.91 40.7 Peso Inicial 33.4119 kg CO2 / kg SS 3.0394 0.49 28.0407 0.0315 0.684 34.0658 0.7 Peso Inicial 33.0616 0.5 g aceite / kg MP 17.6488 33.0623 34.1826 33. Extracción de aceite de microalga B.2 140.5871 33.2442 33.5 39 78 156 CO2 g 21.6186 33.0169 vial (g) Final 33.96 Anexos Anexos .67 79.5 g aceite / kg MP 32.1 35.2226 0.6366 33.8335 vial (g) Final 33.7 19.8 41.1869 0. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.294 0.1475 0.041 0.1 70.70 66. Extracción de aceite de microalga B.8819 34.4343 33.8921 Peso extracto (g) 0.7939 33.2709 0. 17 Anexos .1 18.6063 30.5694 kg CO2 / kg SS 3.3527 corregido 0.7071 30.3322 0.3 66.635 30.3254 0. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 38 Consumo L NPT 11.7845 30. braunii a 41°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 5).0318 0.6121 vial (g) Final 30.2676 0.0414 Peso acumulado recuperado 0.5671 30.0703 0.1706 0. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 38 Consumo L NPT 11.Efecto de la densidad y temperatura sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 54 Tabla B-5.9 9.0481 0.5292 vial (g) Final 30.0945 0.3 66.6616 30.0481 0.7 37.0 33.059 0.0 4.12 61.6479 30.5 37 74 140.3695 30.2016 0.2788 0.0739 Peso acumulado recuperado 0.11 66.6739 30.53 84.6031 Peso extracto (g) 0.24 30.0353 0.7255 30.0 33.6 133.8 19.1 18.7652 30.1369 0.0 Peso Inicial 30.4 g aceite / kg MP 20.6 CO2 g 20.6 CO2 g 20.4 g aceite / kg MP 11.0 Peso Inicial 30.48 25.7299 30. braunii a 69°C y 900kg CO2/m3 (punto de diseño 6) .1374 0. Extracción de aceite de microalga B.2 253. Extracción de aceite de microalga B.41 39.1071 0.6535 Peso extracto (g) 0.1729 0.2 253.4501 0.6835 30.6 133.696 30.0772 0.1056 0.0703 0.4398 30.56 48.05 Tabla B-6.2056 0.9 9.2120 corregido 0.7 37.8 19.6032 30.4128 kg CO2 / kg SS 3.56 49.0776 0.0332 0.0 4.5 37 74 140. 1235 0.0995 Peso extracto (g) 0.2963 0.4535 0.7292 30.57 52.151 0.2466 0.9 31.6095 34.1 35.4 20.0392 0.9 Peso Inicial 30.6681 30.3 18.6183 30. Extracción de aceite de microalga B.1881 0.8 41.2339 0.17 42.2434 34. braunii a 55°C y 957kg CO2/m3 (Punto de diseño 8).5147 kg CO2 / kg SS 3.731 30. Extracción de aceite de microalga B.1318 34.0229 33.4121 kg CO2 / kg SS 2.2064 corregido 0.2311 0.3 280.0629 0.10 Anexos .6725 vial (g) Final 30.0629 0.0211 0.084 0.5 63.6 37.3363 corregido 0.1 70. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.01 60.151 0.91 Tabla B-8.0924 34.0624 0.2879 0.5532 30.0 126.7 19.5 17.7 Peso Inicial 34.0687 33.1677 0.5791 30.7162 Peso extracto (g) 0.2 g aceite / kg MP 18.05 76.1627 0.04 Peso acumulado recuperado 0.79 36.0 251. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 10.2 140.0458 0.7081 30.1256 0.5 g aceite / kg MP 34.3580 0.6719 34.1 5.0395 0.5 39 78 156 CO2 g 21.1689 34.56 24.93 67.0371 0.3249 0.5137 30. braunii a 55°C y 843kg CO2/m3 (Punto de diseño 7).Efecto de la densidad y temperatura sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 55 Tabla B-7.7 9.8 4.0595 vial (g) Final 34.0437 Peso acumulado recuperado 0.45 48.2 10.5 35 70 140 CO2 g 18. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.3068 33.87 73.6 133.7 39.16 Tabla B-10.1 18.9 9.1007 0.6449 33.Efecto de la densidad y temperatura sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 56 Tabla B-9.0638 0.5 37 74 148 CO2 g 20.3696 34.78 Anexos .40 9.57 67.3 66.43 64.0642 0. Extracción de aceite de microalga B.3826 0.7 39.0452 0.0 4.0365 0.7717 0.8792 33.49 34.0765 33.1122 0. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 10).4 g aceite / kg MP 25.89 68.1559 33. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.1357 0.4122 34.6374 vial (g) Final 33.8 19.1724 0.1783 0.3 Peso Inicial 34.2 266.2323 0.2678 corregido 0.8631 vial (g) Final 34.0313 33.2235 0.116 33.4949 kg CO2 / kg SS 3.9074 Peso extracto (g) 0.7102 34.8 19.0443 Peso acumulado recuperado 0.051 Peso acumulado recuperado 0.0642 0. Extracción de aceite de microalga B.4 g aceite / kg MP 5.0 33.2167 33.9 9.8701 corregido 0.4659 0.5 37 74 148 CO2 g 20.3052 0.3 66.035 0.6884 Peso extracto (g) 0.0426 0.8312 33.6595 0.1007 0.6 133. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 9).4585 kg CO2 / kg SS 3.0474 0.13 56.6799 33.0507 34.1 18.0 33.0 4.048 0.34 45.371 33.8191 0.2 266.3 Peso Inicial 33.1085 33.4390 0. 9505 34.4 g aceite / kg MP 19.0587 0.1753 0.22 60.2153 0.0 4.9593 33. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 11).2318 33.8495 33.95 61.8 19.5 37 74 148 CO2 g 20.19 73. Extracción de aceite de microalga B.18 0.0726 0.93 Anexos .Efecto de la densidad y temperatura sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 57 Tabla B-11.82 47.8984 33.0834 0.0834 0.81 34. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.2809 33.2684 corregido 0.7 39.4 g aceite / kg MP 22.6 133.44 47.6931 33.2780 corregido 0.2 266.3 66.9 9.0 33.8559 33.9 9.0484 0.41 Tabla B-12.1543 0. Extracción de aceite de microalga B.9992 34.7 39.4139 0.4966 kg CO2 / kg SS 3.6832 33.0494 0.3195 0.0489 Peso acumulado recuperado 0.2291 0.2237 0.0 33. Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11.0 4.0447 Peso acumulado recuperado 0.0491 0.8989 33.4934 kg CO2 / kg SS 3.6106 33.9157 Peso extracto (g) 0.6368 Peso extracto (g) 0.0425 0.6447 33.1289 0.0487 0.2330 0.1 18.091 34.3 66.1259 0.4066 0.5 37 74 148 CO2 g 20. braunii a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 12).8759 33.5921 vial (g) Final 33.0323 34.3 Peso Inicial 33.05 31.2 266.8 19.6 133.0726 0.3 Peso Inicial 33.8668 vial (g) Final 33.10 72.1213 0.1 18.3244 0. Determinación de la cinética de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 70 Rendimiento (g aceite/kg SS) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 tiempo (min) Figura C-1. Curva cinética de extracción de aceite a 45°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 1). 58 . 70 Rendimiento (g aceite/kg SS) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 tiempo (min) Figura C-2 Curva cinética de extracción de aceite a 65°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 2).Anexos ANEXO C. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Curva cinética de extracción de aceite a 45°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 3). 59 . Figura C-4 Curva cinética de extracción de aceite a 65°C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseño 4). Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 90 Rendimiento (g aceite/kg SS 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) .Anexos 70 Rendimiento (g aceite/kg SS 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Tiempo (min) 40 50 . Figura C-3. 60 . Curva cinética de extracción de aceite a 69°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 6). 90 Rendimiento (g aceite/kg SS 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tiempo (min) Figura C-6. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).Anexos 70 Rendimiento (g aceite/kg SS) 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 tiempo (min) Figura C-5 Curva cinética de extracción de aceite a 41°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 5). 61 .Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 843kg CO2/m3 (Punto de diseño 7). Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 957kg CO2/m3 (Punto de diseño 8). Figura C-8.Anexos 70 Rendimiento (g aceite/kg SS) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) Figura C-7. 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) . Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Figura C-10. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 10). Figura C.Anexos 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) . Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 62 . 9 Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 9). 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) . Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 11) 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) . Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 12) Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Figura C-11. 63 .Anexos 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min) . Figura C-12. 03 0.02 0.2 0.03 0.4 0.184 0.9998 Absorbancia Figura D-1.02 0. 64 .545 0. Curva calibración carotenoides totales. Tabla D-1.04 0.0556x R² = 0.8 1 y = 0.366 0. Datos curva de calibración para la concentración de carotenoides en el aceite de microalga B.04 0.Anexos ANEXO. braunii Diluciones 1 2 3 4 5 6 β-caroteno (mg/mL) 0 0.05 β-caroteno (mg/mL) 0. D Análisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii).01 0 0 0. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).06 0.05 0.6 0.01 Absorbancia 0 0.895 0.716 0. 65 .00 0.25 0.357 0.200 0.05 0.951 0.425x + 0. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).800 1.40 0.102 0.0039 R² = 0.9979 absorbancia a 15mn Figura D-2.442 0.40 0.600 0.574 0.400 0.35 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 0.000 0. Diluciones Absorbancia a 15mn 0.Curva de calibración esteroles totales.678 0.25 0.45 0.20 0. Datos curva de calibración para la concentración de esteroles en el aceite de microalga B.Anexos Tabla D-2.20 0.30 0.10 0.000 Estigmasterol (mg /mL) 0.000 mg estigmasterol/ml y = 0.30 0.15 0. braunii.15 0.10 0.05 0.234 0. Diluciones 1 2 3 4 5 α-Tocoferol (mg/mL) Absorbancia 0. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).0497x R² = 0.9976 α-tocoferol (mg/mL) Absorbancia Figura D-3.01 0.2 0.212 0.979 0.813 0.02 0.6 0.4 0.03 0. Curva de calibración para tocoferoles totales.05 0. 66 . Datos curva de calibración para la concentración de tocoferoles en aceite de microalga (Botryococcus braunii).04 0.8 1 y = 0.06 0.04 0.Anexos Tabla D-3.428 0.02 0.01 0 0 0.616 0.03 0.05 0. Anexos ANEXO E Análisis Estadístico 90 85 Y Predicho 80 75 70 65 60 60 70 80 90 Yac Experimental Figura E-1 Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extracción de aceite (Y1). 17 16 15 Y Predicho 14 13 12 11 10 9 8 8 10 12 14 16 18 Y Ac Experimental Figura E-2. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de carotenoides (Y2). 67 . 18.0 17.0 16. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).5 Y Ac Experimental Figura E-4.0 15.5 15. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4).5 16. 68 .Anexos 23 22 21 Y Predicho 20 19 18 17 16 15 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Y Ac Experimental Figura E-3.5 Y Predicho 17. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de esteroles (Y3).5 18.5 17.5 16. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5).Anexos 1480 1380 1280 1180 Y Predicho 1080 980 880 780 680 580 480 490 690 890 1090 1290 1490 Y Ac Experimental Figura E-5. 1700 1600 1500 Y Predicho 1400 1300 1200 1100 1000 960 1060 1160 1260 1360 1460 1560 1660 1760 Y Ac Experimental Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6) Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 69 . Tabla E-1. X2: Densidad [kg CO2/m3].63 Valor F exp 24.93 24.34 0.05).67 13.1111 0.0107* 0.49 11.43 6.63 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 344.23 3.6495 0.62 186.19 48.99 Probabilidad 0.2 186.36 3.84 0.Anexos 1470 1420 1370 1320 Y Predicho 1270 1220 1170 1120 1070 1020 970 990 1090 1190 1290 1390 1490 Y Ac Experimental Figura E-7.36 3. Análisis de varianza para el rendimiento de extracción de aceite.71 83.19 48. Fuente X1 X2 X12 X22 X1X2 Suma de cuadrados 344. 70 . Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).71 83.0500* R2 % 45. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7).0025* 0.15 X1: Temperatura [°C]. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0.49 5. 94 0.9 Valor F exp 274.99 0. Fuente X1 X2 X1 2 Suma de cuadrados 6.69 0.88 -0.28 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 6.21 47.0171* R2 % 31. X2: Densidad [kg CO2/m3]. Fuente X1 X2 X12 X2 2 Suma de cuadrados 23.57 3.0008* 0.0001* 0.0001* 0.52 1.14 1.1 0. Análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite.04 2. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0.0997 R2 % 17.Anexos Tabla E-2.8 39. Análisis de varianza para la concentración de carotenoides en el aceite.22 10.16 2.43 6.05).49 0.5 0.096 1.24 X1X2 X1: Temperatura [°C].32 62. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0.0167* 0.05).07 X22 X1X2 X1: Temperatura [°C].28 3 Valor F exp 10. Tabla E-3.88 0. 71 .16 2.166 0.52 1.26 3.68 Probabilidad 0.1 0. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).5 0.97 65.3118 0. X2: Densidad [kg CO2/m ].767 0.9 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 23.0081 0.51 23.7 566.6288 0.01 0.51 23.78 Probabilidad 0.0081 0.21 47. 03 0. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0.072 19.66 143.06 X1: Temperatura [°C].05 1350. Análisis del rendimiento de carotenoides.47 2.00062 2.26 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 0.000062 0.0071 1.981 0. X2: Densidad [kg CO2/m ].004* 0.42 12.9854 0.41 0.0001* 0. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0.0071 1.71 7739.00 X1: Temperatura [°C].95 0.00 8.71 7739. 72 .00 0.797 0.05).67 Probabilidad 0.6 3 Valor F exp 113.18 1.76 53.41 0.22 60.12 0.95 0.6 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 329600 414800 1.000062 0.70 0. Análisis de varianza para la concentración de tocoferoles en el aceite.26 3 Valor F exp 0.61 4. Fuente X1 X2 X12 X22 X1X2 Suma de cuadrados 329600 414800 1. X2: Densidad [kg CO2/m ].81 0.089* 0.0001* 0. Fuente X1 X2 X12 X22 X1X2 Suma de cuadrados 0.5204 0.Anexos Tabla E-4.00036 0.05).05 1350.161 R2 % 0.1535 R2 % 42. Tabla E-5. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).56 Probabilidad 0. 1135 R2 % 36.12 12580.63 6093.55 5415.52 3 Valor F exp 21.27 1.0004* 0.5 14853. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0.1125 0. GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0. X2: Densidad [kg CO2/m ]. Análisis del rendimiento de tocoferoles Fuente X1 X2 X1 X2 2 2 Suma de cuadrados 91071.99 5.79 77.51 101800 5660.03 23.15 40.15 331200 22136.41 2.05).68 3.5 14853. X2: Densidad [kg CO2/m ].0968 0.45 0. Análisis del rendimiento de esteroles Fuente X1 X2 X1 X2 2 2 Suma de cuadrados 24800.05).36 3 Valor F exp 3.0037* 0.42 X1X2 X1: Temperatura [°C].15 331200 22136.95 Probabilidad 0.17 1.2965 0. Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).0029* 0.3935 0.36 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 24800.52 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 91071.87 51. 73 .51 101800 5660. Tabla E-7.Anexos Tabla E-6.36 5.3672 R2 % 5.90 X1X2 X1: Temperatura [°C].1392 0.63 6093.31 2.52 1.84 0.25 4.91 3.55 5415.43 Probabilidad 0.12 12580.