1ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PROPAGACIÓN “in vitro” DE LA ESPECIE PLÁTANO HARTÓN (Musa AAB Subgrupo plátano cv. Hartón) EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER CLAUDIA ACOSTA SOLANO YULIETH MONTAÑO YARURO UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA SAN JOSÉ DE CÚCUTA 2003 2 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PROPAGACIÓN in vitro DE LA ESPECIE PLÁTANO HARTÓN (Musa AAB Subgrupo plátano cv. Hartón) EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER CLAUDIA ACOSTA SOLANO YULIETH MONTAÑO YARURO Proyecto de Grado presentado como requisito para optar al título de Ingeniero de Producción Biotecnológica Directora ALINA K. SIGARROA RIECHE Ingeniera Agrónoma UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA SAN JOSÉ DE CÚCUTA 2003 3 4 A Dios, por darme la vida, la familia que tengo, la salud y la fortaleza de haber alcanzado un logro más en mi vida. A quienes me han enseñado a luchar, a no rendirme y a seguir adelante actuando siempre con honestidad y principios, a mis amados padres: Betty y Juan José, porque desde antes de nacer me ofrecieron sus vidas, cobijándome con amor y comprensión, brindándome fortaleza y sabiduría en los momentos más difíciles de mi vida. Gracias, porque con el apoyo y amor de ustedes, logré cristalizar un sueño por el que tanto luche y hoy pongo en sus manos. A mis hermanos, Juan Carlos y Oscar Iván, quienes con sus juegos, conversaciones, cariño y momentos vividos, se han convertido en mi fuente de energía para seguir hacia adelante y volver un sueño realidad. Los quiero, Claudia. 5 A Dios, por ser la fuente inagotable en la cristalización de todos mis sueños. A mis padres, Berta Yaruro y Jorge Omar Montaño, que han sido mi constante ejemplo de perseverancia y dedicación a lo largo de mi vida, para el logro de esta meta. A mis hermanas, Yolanda, Carmen Rosa y Sofia Paola, que con su cariño y respaldo fortalecieron constantemente en esta, mi gran ilusión. A mi hermano Javier, que a pesar de las circunstancias de la vida, que hoy nos separa, ha dejado en mí gratos recuerdos de alegrías, ternura y risas, de un ser que se convirtió en un ejemplo de fé y esperanza, de ilusiones y empeño, para lograr un mejor mañana. A mi tía Sofía, Nohelia Pérez y demás familiares que con su confianza y orientación creyeron y promovieron el logro de una meta más en mi vida. Con cariño, Yulieth. 6 TABLA DE CONTENIDO Pág. INTRODUCCIÓN 1. PROBLEMA 16 1.1. TÍTULO 16 1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 16 1.3.FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 16 1.4 JUSTIFICACIÓN 16 1.5. OBJETIVOS 17 1.5.1. Objetivo General 17 1.5.2. Objetivos Específicos 17 1.6. ALCANCES Y LIMITACIONES 18 1.6.1. Alcances 18 1.6.2 Limitaciones 18 2. MARCO REFERENCIAL 19 2.1. ANTECEDENTES 19 2.2. MARCO CONCEPTUAL 21 2.3. MARCO CONTEXTUAL 24 2.4. MARCO LEGAL 25 3. MARCO TEÓRICO 30 3.1 EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 30 3.1.2 Historia del cultivo de tejidos vegetales 40 7 3.1.3. Métodos de regeneración de plantas 42 3.1.4 Aplicaciones prácticas de cultivo de tejidos vegetales 43 3.2. LA MICROPROPAGACIÓN DE ESPECIES 45 3.2.1. Ventajas y limitantes 46 3.2.2 Fases de un esquema de micropropagación 47 3.2.3. Factores que afectan el crecimiento y desarrollo de los explantes 51 3.3 EL CULTIVO DEL PLÁTANO 54 3.3.1. Botánica y ciclo vegetativo 54 3.3.2. Sistemas de clasificación y genética 58 3.3.3. Clasificación taxonómica 60 3.3.4 Características edafoclimatológicas. 60 3.3.5. Importancia económica y productividad del cultivo del plátano 61 3.3.6. Enfermedades y plagas del cultivo 63 3.3.7. Factores limitantes en la productividad del plátano 66 3.4. PROPAGACIÓN CLONAL DEL PLÁTANO 67 3.4.1 Generalidades 67 3.4.2.Método de cultivos de tejidos para multiplicación clonal del plátano 68 4. MATERIALES Y MÉTODOS 70 4.1 MATERIALES 70 4.2 MÉTODOS 72 4.2.1. Fase 0: Preparación de la planta madre 72 4.2.2 Fase I: Establecimiento 73 8 4.2.3. Fase II: Multiplicación 75 4.2.4. Fase III: Enraizamineto 76 4.2.5. Fase IV: aclimatación 76 4.2.6. Metodo de diagnostico utilizado para detección de cmv en plantas de plátano hartón 77 5. ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN 79 5.1 FASE DE ESTABLECIMIENTO 79 5.2 FASE DE MULTIPLICACIÓN 85 5.3 FASE DE ENRAIZAMIENTO 92 5.4. FASE DE ACLIMATACIÓN 94 5.5. DIAGNOSTICO SEROLÓGICO MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA. 96 6. CONCLUSIONES 7. RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA 9 LISTA DE CUADROS Pág. Cuadro 1. Sales MS 100% Cuadro 2. Caracteres utilizados en la calificación de los cultivares de plátano 59 Cuadro 3. Formulación de los medios de cultivo para cada fase de la micropropagación 74 Cuadro 4. Comparación de los porcentajes de contaminación endógena para las tres siembras. 79 Cuadro 5. Variables evaluadas para la primera siembra en medio líquido. 81 Cuadro 6. Variables evaluadas para la segunda siembra en medio sólido. 81 Cuadro 7 Variables evaluadas para la tercera siembra en medio líquido. 82 Cuadro 8. Porcentaje de fenolización para la primera, segunda y tercera siembra. 84 Cuadro 9. Variables evaluadas para los medios 3 y 4 para la primera siembra. 86 Cuadro 10. Variables evaluadas para los medios 3 y 4 para la segunda siembra. 86 Cuadro 11. Variables evaluadas para los medios 3 y 4 para la tercera siembra. 87 Cuadro 12. Numero promedio de brotes para la primera, segunda y tercera siembra. 87 Cuadro 13. Variables evaluadas para la primera, segunda y tercera siembra 93 Cuadro 14. Variables evaluadas durante la fase de aclimatación 95 Cuadro 15. Distribución de las muestras de plantas diagnosticadas en la placa microtitulada. 97 10 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Principales métodos de micropropagación representados esquemáticamente de distintos materiales de partida y de los métodos que se pueden utilizar en la micropropagación (adaptado: george y sherrington, 1984) 32 Figura 2. Estructuras químicas de las auxinas 35 Figura 3. Estructura química de citoquinina (6-BAP y Zeatina) 36 Figura 4. Estructura química de las giberelinas (GA 3 ,GA 12 , GA 10 ) 37 Figura 5. selección del material vegetal inicial del proceso 48 Figura 6. Establecimiento del material vegetal 49 Figura 7. Multiplicación del material vegetal 50 Figura 8. Plantas enraizadas durante el proceso de micropropagación. 50 Figura 9. Aclimatación de material vegetal proveniente de laboratorio con abono y abono – escoria 51 Figura 10. Soluciones madres para la preparación de medios de cultivos 53 Figura 11. Botánica del genero musa 55 Figura 12. Planta de plátano hartón (Musa AAB subgrupo plátano cv. Hartón) 56 Figura 13. Ciclo vegetativo del género Musa 57 Figura 14. Acercamiento de la superficie de una hoja de banano atacada por la sigatoka negra. Bajo condiciones de alta humedad y precipitación. 63 Figura 15. Planta del clon dominico – harton afectada por elvirus del mosaico del pepino (CMV). 1350 msnm. 64 Figura 16. Ubicación geográfica de las zonas seleccionadas para la recolección del material vegetal inicial 71 Figura 17. Tamaño final del explante en la fase preparativa (tamaño: 5 cm) 72 11 Figura 18. Desinfección de explante con hipoclorito de sodio al 5% 73 Figura 19. Cortes transversales y longitudinales a los explantes en cámara de flujo laminar 73 Figura 20. Tamaño final del explante 73 Figura 21. Medio líquido para el establecimiento de explantes 75 Figura 22. Vitroplanta con brotes 75 Figura 23. Medio de cultivo 5 76 Figura 24 Medio de cultivo 6 76 Figura 25 Medio de cultivo 6 76 Figura 26. Explantes aclimatados gradualmente antes de siembra en el sustrato 77 Figura 27. Sustratos utilizados en la aclimatación de las plantas: escoria y abono 77 Figura 28. Adición del conjugado enzimático 78 Figura 29. Comparación de los porcentajes de contaminación endógena para la primera, segunda y tercera siembra. 79 Figura 30. Crecimiento promedio de los explantes para la primera siembra. 82 Figura 31. Crecimiento promedio de los explantes para la segunda siembra. 82 Figura 32. Crecimiento promedio de los explantes para la tercera siembra. 83 Figura 33. Grados de fenolización para la primera siembra. 84 Figura 34. Grados de fenolización para la tercera siembra 85 Figura 35. Grados de fenolización para la segunda siembra 85 Figura 36. Número promedio de brotes para los medios 3 y 4 de la primera siembra. 88 Figura 37. Número promedio de brotes para los medios 3 y 4 para la segunda siembra. 88 12 Figura 38. Número promedio de brotes para los medios 3 y 4 para la tercera siembra. 89 Figura 39. Número promedio de raíces para la primera siembra. 90 Figura 40. Número promedio de raíces para la segunda siembra. 90 Figura 41. Número promedio de raíces para la tercera siembra. 90 Figura 42. Numero promedio de hojas para los medios 3 y 4 de la primera siembra. 91 Figura 43. Número promedio de hojas para los medios 3 y 4 de la segunda siembra. 91 Figura 44. Número de hojas para los medios 3 y 4 de la tercera siembra. 92 Figura 45. Comparación de variables evaluadas para las tres siembras en la fase de enraizamiento. 94 Figura 46. Comparación de los sustratos utilizados (abono y abono –escoria). 95 Figura 47. Plantas aclimatadas a las condiciones naturales provenientes del laboratorio 96 13 LISTA DE ANEXOS Pag. Anexo A. Esquema de la micropropagación de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. Hartón) 104 Anexo B. Costos para la producción de plantas in vitro de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 105 Anexo C. Resultados de la fase de establecimiento para las tres siembras de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 109 Anexo D. Resultados de la fase de multiplicación de la primera siembra de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 111 Anexo E. Resultados de la fase de multiplicación de la segunda siembra de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 113 Anexo F. Resultados de la fase de multiplicación de la tercera siembra de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 115 Anexo G. Resultados de la fase de enraizamiento para las tres siembras de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 117 Anexo H. Resultados de la fase de aclimatación para las tres siembras de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 117 Anexo I. Resultados de los análisis estadísticos. 118 14 INTRODUCCIÓN El plátano, que pertenece a la familia de las Musáceas, ha sido uno de los pilares del sector agrícola y se ha constituido en un renglón de gran importancia socioeconómica a nivel mundial. Sus frutos son ampliamente utilizados en la dieta de la población humana por sus cualidades organolépticas y nutritivas, adquiriendo así importancia en la agroindustria nacional e internacional. El cultivo de plátano tiene gran relevancia en los sistemas de producción de la región, contando con un área sembrada de 13.116 hectáreas, una producción de 86.882 toneladas y un rendimiento de 7.044 Kg/ha (División de Planeación URPA. Secretaría de Agricultura de Norte de Santander, 2001). Actualmente, el cultivo afronta a nivel regional problemas de carácter fitosanitarios que han limitado su competitividad. Debido a la poca disponibilidad de material vegetal de alta calidad para establecer plantaciones, se hace necesaria la utilización de semilla asexual obtenidas por métodos tradicionales, convirtiéndose en el principal factor de diseminación de plagas y enfermedades ocasionando una disminución del rendimiento y producción e incrementando los costos del cultivo por medidas de manejo y control. La biotecnología vegetal ofrece nuevas alternativas de solución a esta problemática regional, permitiendo cultivar bajo condiciones de asépsia y ambientales controladas fragmentos de una planta completa que se pueda adaptar a las condiciones de campo. Técnicas como la micropropagación de especies de importancia agronómica permite obtener un alto número de material vegetal con excelente características genéticas y sanitarias. Mediante la realización de éste trabajo, se logra estandarizar una tecnología propia para la Micropropagación de materiales comerciales y promisorios del plátano hartón que facilite llevar a cabo producciones masivas de esta especie vegetal, brindando la posibilidad de suministrar material vegetal de alta calidad a los agricultores, contribuyendo así, al desarrollo de éste renglón socioeconómico de la región. 15 1. PROBLEMA 1.1. TÍTULO ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PROPAGACIÓN in vitro DE LA ESPECIE PLÁTANO HARTÓN (Musa AAB subgrupo plátano cv. hartón) EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL DE LA UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER 1.2.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La incidencia de plagas y enfermedades que afectan al cultivo del plátano en el Departamento, son transmitidas a través de semillas contaminadas que reducen significativamente el área sembrada y por tanto bajos rendimientos en la producción. Es por ello, que la implementación de la técnica de micropropagación de cultivos in vitro se hace necesaria para la obtención de material vegetativo, adaptando una tecnología aplicada a la micropropagación de plantas de buena calidad genética y fitosanitaria para establecer plantaciones de plátano hartón (Musa AAB Subgrupo c.v. hartón). 1.3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Cuál es la principal causa de diseminación de plagas y enfermedades en el cultivo de plátano hartón en el departamento Norte de Santander? 1.4. JUSTIFICACIÓN La importancia de este proyecto, radica en la necesidad de implementar nuevas técnicas de propagación, que permitan mejorar la calidad genética y fitosanitaria del género Musa AAB subgrupo cv. hartón, cultivado en la región, lo cual permitirá obtener, en corto tiempo, grandes volúmenes de plantas élites, acordes con tecnologías eficientes que se ajusten a la situación existente en la región. El cultivo del plátano se ha constituido en un renglón de gran importancia desde el punto de vista de seguridad alimentaría y generación de empleo; según experiencias en la zona central cafetera colombiana, se estima que el cultivo genera aproximadamente 136.000 jornales y aporta el 7% del producto interno bruto agrícola. Las enfermedades ocasionadas por microorganismos patógenos en el plátano hartón, además de ocasionar reducción en la producción, afectan la calidad y como 16 consecuencia, incrementa los problemas sociales y económicos, ya que el producto, debido a su costo, se vuelve inaccesible a las clases menos favorecidas, ocasionando la eliminación del cultivo o incrementando los costos de producción requeridos. La siembra de las semillas de plátano, obtenidas por métodos tradicionales, se hace necesaria cuando no se cuenta con un sistema de producción masiva para satisfacer las necesidades agrícolas de la región. Esta práctica es importante en las primeras etapas del cultivo, pero lo mejor es evitarla. Las razones que existen son las siguientes: La adquisición y transporte son costosos, ayudando a incrementar el valor de la producción. Se corre el riesgo de recibir y multiplicar plantas erróneamente identificadas. Existe peligro de introducir plagas y enfermedades con el material de siembra. Al utilizar semilla sana se crea un método importante de control para muchas enfermedades, donde la principal ruta de transmisión del patógeno se hace a través de los órganos vegetativos empleados en la propagación convencional, como lo son: los cormos, pedazos de cormos con retoños y retoños (López, 1989). Se recomienda impulsar en la región, la aplicación de técnicas biotecnológicas modernas, para buscar alternativas en la producción de material vegetal, manejando y controlando enfermedades propias del cultivo. Se propone, por tanto, desarrollar un protocolo no existente en el departamento, para la propagación masiva del plátano Hartón (Musa AAB subgrupo plátano cv. hartón). Adaptando estos métodos, se pueden abrir nuevas posibilidades para incrementar la producción, rendimiento y el área sembrada con este cultivo, ya que en otras regiones del país, productoras de plátano, se cuenta con éstas técnicas para propagar material de plátano y contar así con semilla de calidad. 1.5. OBJETIVOS 1.5.1. Objetivo General Desarrollar una tecnología eficiente y rentable, para la micropropagación del plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón) en el laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Francisco de Paula Santander. 1.5.2. Objetivos Específicos Lograr el procedimiento de desinfección más adecuado para el establecimiento de yemas apicales del plátano hartón, en condiciones in vitro. Determinar los medios de cultivo y condiciones ambientales más adecuadas para el óptimo desarrollo de cada una de las fases de la propagación masiva del plátano 17 hartón. Obtener un elevado coeficiente de multiplicación para las especies en estudio y determinar el número máximo de subcultivos, que permitan aumentar el número final de vitroplantas. 1.6. ALCANCES Y LIMITACIONES 1.6.1. Alcances Se pretende desarrollar a nivel de laboratorio y aplicando técnicas de cultivo in vitro en tejidos vegetales, una tecnología propia de la propagación del plátano hartón (Musa sp. AAB Simmonds). 1.6.2 Limitaciones No se cuenta con el equipo para realizar el diagnóstico de enfermedades virales propias de éste cultivo, sin embargo, las muestras se enviarán a un laboratorio de Diagnóstico para garantizar su calidad fitosanitaria. El Laboratorio de Biotecnología Vegetal, no posee invernadero para la adaptación de las vitroplantas a campo, por lo cual el proceso de aclimatación se llevará a cabo en un área adecuada para tal fin, lo que podría tener algunas incidencias en el desarrollo óptimo de las plantas. 2. MARCO REFERENCIAL 18 2.1. ANTECEDENTES El cultivo de plátano es importante en el país, ya que es una actividad tradicional y es una fuente generadora de trabajo y divisas para el país. Se cultiva en diferentes zonas agroecológicas, desde 0 a 2000 m.s.n.m. con temperaturas que oscilan entre 17 y 35 ºC. En el Departamento parte de los agricultores son productores de éste cultivo, existiendo otros que lo usan para sombrío a otros cultivos y como alimento para su subsistencia. Este cultivo en los últimos años se ha visto afectado por enfermedades y plagas del plátano como la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis), Sigatoka amarilla (Mycosphaerella musicola) y el picudo negro (Cosmopolites sordidus) principalmente, los cuales han reducido los rendimientos y la calidad del producto para el mercado, provocando una disminución de cultivo en la zona y ocasionando un alto uso en plaguicidas provocando altos costos para la producción y posterior venta. Una alternativa para lograr una producción con mayor calidad y alto rendimiento es la obtención de plantas libres de patógenos utilizando técnicas biotecnológicas a través de cultivos de tejidos vegetales, ya que se logra la eliminación de microorganismos que se encuentran en contacto con el material vegetal. Las técnicas de cultivos vegetales se han venido desarrollando desde hace más de 120 años, constituyéndose dentro de las biotecnologías, la técnica que mayor aporte práctico ha brindado. Puede definirse como un conjunto de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y protoplastos, empleando medios nutritivos artificiales y condiciones ambientales controladas. Dentro de estas técnicas la micropropagación convencional, es una tecnología conocida y manejada con mas de dos décadas de experiencia práctica en muchos países. En la actualidad se conoce que ha sido aplicada, con diversos objetivos, en más de 50.000 variedades de más de 1000 especies de uso industrial. La micropropagación de especies ha alcanzado niveles de producción en el ámbito mundial de 600 millones de vitroplantas por año en unas 660 empresas dedicadas a tal fin, concentradas en Europa, Estados Unidos, Israel y algunos países de Europa del este. En 1993 en Europa Occidental existían un total de 172 laboratorios comerciales con una producción total de 125 millones de plantas. En 1990, Holanda fue el mayor productor con 602 millones y contaban con 5 laboratorios con capacidad productiva superior a 5 millones de vitroplantas, Francia con más de 40 millones, Italia 30 millones, Bélgica 24 y el Reino Unido con 21 millones. 19 En Cuba, el número de plantas producidas hasta 1997 supera los 110 millones de los cuales, el 81.7% corresponde a plátano y banano, seguido por caña de azúcar con el 12.3%, Papa con el 4% y otras especies como piña, fresa y ornamentales el 2%. El promedio de los últimos cuatro años ha sido superior a los 20 millones de vitroplantas por año”(Perez,1998). En Colombia existen 33 laboratorios de cultivos in vitro y de ellos 10 laboratorios pertenecen al sector académico. Las principales especies micropropagadas son: plátano y banano (Musa spp.), papa criolla (Solanum phureja), lulo (Solanum quitoense), pompón (Chrysantemun morifolium), clavel (Dianthus cariophyllus), Orquídeas (Dendrobium spp.), Crisantemo, yuca, cítricos, entre otros. Estas especies se han visto beneficiadas utilizando la técnica de propagación masiva, ofreciendo elevados rendimientos y una alta calidad genética y fitosanitaria. El plátano es una de las especies que más utilidad a nivel mundial y nacional le ha prestado ésta técnica. Reportándose en el país experiencias desde 1983 donde se iniciaron investigaciones con el plátano a raíz de un acuerdo firmado entre el ICA y el Comité de Cafeteros del Quindío. Los principales laboratorios productores de vitroplantas de Musáceas son: BIOTECOL LTDA (Cali) con 500.000 plántulas in vitro por año; Semillas Tropicales S.A. Filiar de AGREVO (Bogotá) con Musáceas, ornamentales y tuberosas; Laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá) con 10.000 plantas / año entre Musáceas y Mora; Centro Internacional de Agricultura Tropical – CIAT (Cali); la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria – CORPOICA en Bogotá y Bello (Antioquia) y la Universidad del Magdalena (Santa Marta) trabajan además en cítricos. Debido a la gran demanda y a las grandes expectativas que presentaban los mercados internacionales de bananos y plátanos, en “1990 se firma un convenio con la comercializadora internacional BANACOL con el fin de adoptar técnicas de micropropagación a escala comercial de bananos y plátanos de las variedades Hartón y “Dominico Hartón”, como resultado, se obtuvo a finales de 1991 600.000 plántulas de las anteriores con alta calidad genética y fitosanitaria (Restrepo, 2001). En 1998, se presentó al Centro Internacional de Investigaciones para el desarrollo (CIID)-Canadá, una propuesta de investigación la cual fue aprobada. Paralelamente, se han desarrollado acuerdos con otras entidades tanto del nivel nacional como internacional, entre las que se encuentran: CIRAD – FHLOR, Universidad Católica de Lovaina, INPOFOS, Fundación para el Desarrollo Agropecuario (FDA) - Santo Domingo, Fundación Hondureña para la Investigación Agrícola (FHIA), CIAT, Monómeros Colombo-Venezolanos, Biotecnología de Colombia (BIOTECOL), Universidad del Quindío, Servicio Nacional de Aprendizaje (SENA), entre otros. En el nororiente colombiano, específicamente en el municipio de San Gil 20 (Santander), existe el Centro Biotecnológico de Peñaflor, que en musáceas trabajan con las siguientes variedades: Dominico, Dominico Hartón, Hartón, Banano y Bocadillo. El Laboratorio posee una capacidad de producción de 150.000 plántulas / año, actualmente producen 60.000 plántulas / año sin satisfacer las necesidades agrícolas del Nororiente colombiano. Asimismo, trabajan con Piña, Fique (12.000 plántulas / año), Orquídeas, Rosas y en investigación con Mora. Actualmente, en el Norte de Santander no existen referencias sobre trabajos en cultivos de tejidos vegetales en plátano Hartón, aunque en la Universidad de Pamplona está el Laboratorio de Tejidos Vegetales, donde se adelanta un trabajo de grado con Piñuela. Entidades agropecuarias del Departamento como SENA, FEDERACIÓN DE CAFETEROS DE NORTE DE SANTANDER, ICA. CORPOICA, FEDECACAO, UMATAS, han insistido en la necesidad de adoptar éste tipo de técnicas, las cuales permitirían contar con semillas de calidad para el Departamento. La Universidad Francisco de Paula Santander y su Plan de Estudio de Ingeniería de Producción Biotecnológica, cuentan con el Laboratorio de Biotecnología Vegetal, el cual está en capacidad de adelantar éste tipo de estudios, buscando dar respuesta a las necesidades del Departamento. 2.2. MARCO CONCEPTUAL Plátano hartón. Pertenece al género Musa es una planta herbácea, con un falso tallo de forma cilíndrica que está formado por las vainas de las hojas superpuestas, un cormo y un sistema radical fibroso. Nutricionalmente, se considera un fruto altamente energético y sus carbohidratos son fácilmente asimilables. En términos generales, se compone principalmente de agua, carbohidratos y contiene cantidades casi insignificantes de proteínas y grasa; es rico en vitaminas A 1 , B 1 , C y E y en minerales. Picudo negro. (Cosmopolites sordidus Germar, coleóptera: Curculionidae) es considerada la plaga más importante de la musáceas cultivada en la mayoría de los países tropicales que ataca mas severamente al plátano. Se encontró por primera vez en el Departamento de Antioquia en 1947, en Caldas el primer registro fue en 1976, en el Valle del Cauca en 1979, en Risaralda en 1981 y en el Quindío en 1982. En la actualidad la plaga se encuentra distribuida en todo el país y su dispersión ha ocurrido, muy probablemente, por medio de semilla infestada. Moko del plátano. Causada por la bacteria Ralstonia solanacearum, fue observada por primera vez en Colombia en 1954 en los municipios de Prado y Purificación (Tolima), diseminándose luego a las zonas bananeras y plataneras . La enfermedad puede tener consecuencias devastadoras si no se aplican medidas efectivas de manejo 21 y control una vez se ha comprobado su presencia dentro de las plantaciones. Sigatoka negra. Causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis, la cual se ha diseminado rápidamente a la mayoría de los países productores. Esta enfermedad es considerada como una de las más destructivas y costosas para las Musáceas comerciales, debido a que no es posible una producción rentable si no se dispone de un programa de manejo integrado eficiente. El impacto económico de la Sigatoka Negra por la reducción del área de producción ha sido mas critico en plátano que en banano, ya que los productores, por lo general, no cuentan con los recursos y las tecnologías necesarias para hacerle frente a la enfermedad. Sigatoka amarilla. Causada por el Hongo Mycosphaerella musicola, a medida que la enfermedad se manifiesta, las hojas presentan manchas amarillo verdosas de forma parecida al ojo de una aguja, a lo largo de la nervadura secundaria. Estos se caracterizan por ser de tipo ascomiceto, presentan una fase conidial de procedencia asexual conocida como Cercospora musae, parásito específico del género Musa. Cultivo de tejidos. Se define como un conjunto de técnicas que permiten utilizar órganos, células, tejidos de una planta que posteriormente se cultivan en medios nutritivos bajo condiciones controladas de asepsia y medioambientales, con el propósito de regenerar plantas que se adapten a condiciones de campo, brindando la posibilidad de: Obtener plantas libres de patógenos. Micropropagación. Conservación de germoplasma. Mejora por mutagénesis y selección in vitro. Obtención de metabolitos secundarios. Micropropagar. Es el Proceso de multiplicar plantas in vitro. A través de la micropropagación, a partir de un fragmento (explante de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme en condiciones de asepsia. La propagación masiva de especies vegetales es la mas utilizada en las aplicaciones del cultivo in vitro, ofreciendo las siguientes ventajas: Altos coeficientes de multiplicación que permiten manipular volúmenes elevados de plantas en cortos periodos de tiempo. Tiempo rápido de nuevas variedades o clones. Producción independiente de las condiciones ambientales. Incremento en los rendimientos debido al rejuvenecimiento y al saneamiento. Uniformidad en las plantas producidas. Mayor facilidad en la comercialización. Estabilidad genética. 22 Fase 0: preparación de la planta madre. Esta Fase es importante e indispensable para el desarrollo de un esquema de micropropagación eficiente y repetible. Tiene una marcada influencia sobre la calidad posterior de las plantas resultantes del proceso tanto desde el punto de vista sanitario, fisiológico como genético. Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Fase I: establecimiento. El objetivo de esta fase es lograr el establecimiento de cultivos axénicos y fisiológicamente vigorosos con los cuales iniciar el proceso de multiplicación. Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cámara de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se sembraran en un medio de establecimiento en frascos de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes. Fase II: multiplicación. El objetivo de esta fase es la producción del mayor número posible de propágulos (plantas, microtubérculos, microbulbillos) a partir de explantes (meristemos apicales o axilares, yemas axilares o adventicias), ya establecidos in vitro. El proceso se inicia desde plantas donantes seleccionadas sin afectar las características y estabilidad genética de la variedad o clon. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en frascos con medio de cultivo. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar. Fase III: enraizamiento de los explantes. Se caracteriza por ser la Fase más luminosa de todo el proceso, pues en ella cada brote, esqueje o yema de forma individual que se ha formado durante la fase de multiplicación, debe ser cultivada y manipulada in vitro para que, además de crecer y desarrollar un seudotallo o tallo con las primeras hojas, forme y desarrolle varias raíces que le permitan comenzar la absorción de nutrientes. Para enraizar los explantes se utilizan principalmente dos métodos: Enraizamiento in vitro. Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser más flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis. Enraizamiento ex vitro. Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio (suelo estéril). Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre 23 de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse. Fase IV: Aclimatación. Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz (fotoperiodo). Clon. Grupo de células, tejidos o plantas que son en principio genéticamente idénticas. Un clon no tiene por qué ser necesariamente homogéneo. Meristemo. Conjunto de células en división en el ápice de la raíz o vástago (meristemo apical), en el cambium intercalar de las yemas, hojas y flores. Meristemo Apical. Grupo de células meristemáticas situadas en el ápice de la raíz o del vástago, que por división celular originan a las precursoras de los tejidos primarios de la raíz o del vástago Explante. Es una parte del tejido u órgano que se aisla del resto de la planta con fines de cultivo. La selección del explante puede hacerse teniendo en cuenta el sistema de propagación de la planta. Si las plantas que se van a micropropagar tienen reproducción por semilla, las partes embrionales o de la plántula son las fuentes más comunes de explantes; las semillas pueden ser desinfectadas superficialmente y germinar en condiciones de asepsia. Medio de cultivo. Es un soporte de las vitroplantas, el cual contiene micro y macro nutrientes, todos compuestos inorgánicos, además se complementa con los compuestos orgánicos como son las vitaminas y carbohidratos. Reguladores de crecimiento. Las hormonas son, por definición, compuestos orgánicos sintetizados por las plantas superiores, que influyen sobre el crecimiento y desarrollo; actúan generalmente en lugar diferente a donde son producidas y se encuentran presentes y activas en muy pequeñas cantidades. Aparte de estos productos naturales, se han desarrollado también otros de tipo sintético, que pueden tener una actividad semejante a la de los primeros. Al conjunto de estos productos sintéticos, junto con las hormonas, se denomina reguladores, y son los responsables de la distribución de los compuestos que la planta biosintetiza. También determinan el crecimiento relativo de todos los órganos de la planta. Contaminación microbiana. Es la presencia de microorganismos como hongos, bacterias y levaduras en los medios de cultivo destinados a la producción de vitroplantas, los cuales provocan daños y se convierten en patógenos. Los microorganismos provocan perdidas cuantiosas de material vegetal en los proceso 24 productivos o de investigación. 2.3. MARCO CONTEXTUAL El presente proyecto se desarrollará en el Departamento Norte de Santander, el cual se ha caracterizado por tener una gran diversidad de flora y fauna, gracias a la existencia de cuatro pisos térmicos que son consecuencia de las diferentes alturas, de la exposición a la radiación solar y de los vientos. Geográficamente, está localizado al noreste del país, entre las cuencas del Lago Maracaibo y del Río Magdalena; es una región montañosa, con pendientes largas y diferentes grados de inclinación, con una extensión aproximada de 2.358.900 hectáreas y otra región plana ondulada, conformada por depósitos marinos y continentales que coinciden con la vertiente y valle del Catatumbo, que abarca una extensión de 362.800 hectáreas. El Departamento cuenta con 40 municipios, de los cuales Santiago y El Tarra , por ser productores de plátano hartón, fueron escogidos para la recolección del material vegetal necesario en la investigación a realizar. Este cultivo se desarrolla en una zona agroecológica Kr, de relieve ondulado a quebrado, donde las pendientes oscilan entre 7 – 12 % y 12 – 15%, características propias de estos dos municipios. Santiago se encuentra ubicado en la subregión centro y sus coordenadas geográficas son: longitud al oeste de Greenwich 72º 43’ y latitud norte 7º52’; limita al norte con el Zulia, al Sur con Durania y Salazar y Oriente con El zulia y San Cayetano. El municipio depende principalmente del renglón agropecuario, el cual se realiza de forma tradicional. El Tarra se encuentra ubicado en la Subregión Norte del Departamento y sus coordenadas geográficas son: Longitud al oeste de Greenwich 73º59’, latitud norte 8º35’. La superficie del municipio es de 675 Km 2 que representa el 3.11% del total del Departamento. Limita: al norte con Tibú, Sur con San Calixto, Oriente con Tibú y Occidente con Teorama. La agricultura es la primera actividad económica del municipio, cuyo principal producto agrícola es el plátano. San José de Cúcuta, como capital del Departamento y con una población de aproximadamente 700.000 habitantes, actúa como centro de primer orden en la distribución de bienes y servicios y de actividades económicas múltiples. Es sede de la Universidad Francisco de Paula Santander, el cual cuenta con un Plan de Estudios de Ingeniería de Producción Biotecnológica adscrita a la Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente. Actualmente se cuenta con el Laboratorio de Biotecnología Vegetal ubicado en el Municipio de los Patios, perteneciente al área metropolitana de Cúcuta, sitio donde se ejecutará la estandarización de la técnica de cultivos in vitro en plátano hartón. 2.4. MARCO LEGAL 25 Constitución Política de Colombia 1991 Art. 27. El estado garantiza las libertades de enseñanza, investigación y cátedra. Art. 67. La educación es un derecho de la persona y un servicio público que tiene una función social: con ella se busca el acceso al conocimiento, a la ciencia, a la técnica y a los demás bienes y valores de la cultura. Art. 69. Consagra la autonomía Universitaria, la cual es reglamentada por la Ley 30 del 28 de Diciembre de 1992. Ley General de Educación (Ley 30 /1992) Art. 3. El estado, de conformidad con la Constitución Política de Colombia y con la presente Ley, garantiza la autonomía universitaria, y, vela por la calidad del servicio educativo a través del ejercicio de la suprema inspección y vigilancia de la educación superior. Art. 4. La educación superior, sin perjuicio de los fines específicos de cada campo del saber, despertará en los educandos un espíritu reflexivo orientado al logro de la autonomía personal, en un marco de libertad de pensamiento y de pluralismo ideológico que tenga en cuenta la universalidad de los saberes y la particularidad de las formas culturales existentes en el país. Por ello, la educación superior se desarrollara en un marco de libertades de enseñanza, de aprendizaje, de investigación y de cátedra. Art. 6. Son objetivos de la educación superior y de sus instituciones: Profundizar en la formación integral de los colombianos, dentro de las modalidades y calidades de la educación superior, capacitándolos par cumplir las funciones profesionales, investigativas y de servicio social que requiera el país. Trabajar por la creación, el desarrollo y la transmisión del conocimiento en todas sus formas y expresiones y, promover su utilización en todos los campos para solucionar las necesidades del país. Prestar a la comunidad un servicio con calidad, el cual hace referencia a los resultados académicos, a los medios y procesos empleados, a la infraestructura institucional, a las dimensiones cualitativas y cuantitativas del mismo y a las condiciones en que se desarrolla cada institución. Ser factor de desarrollo científico, cultural, económico, político y ético a nivel nacional y regional. Promover la unidad nacional, la descentralización, la integración regional y la cooperación interinstitucional con miras a que las diversas zonas del país dispongan de los recursos humanos y de las tecnologías apropiadas que les permitan atender 26 adecuadamente sus necesidades. Promover la preservación de un ambiente sano y fomentar la educación y la cultura ecológica. Art. 19. Son universidades las reconocidas actualmente como tales y las instituciones que acrediten sus desempeños con criterios de universidad en las siguientes actividades: La investigación científica o tecnología; la formación académica en profesiones o disciplinas; la producción, desarrollo y transmisión del conocimiento y de la cultura universal y nacional. Estas instituciones igualmente están facultadas para adelantar programas de formación en ocupaciones, profesiones, disciplinas, programas de especialización, maestrías, doctorados y postdoctorados de conformidad con la presente Ley. Art. 31. De conformidad con los artículos 67 y 189 numerales 21, 22 y 26 de la Constitución Política de Colombia y de acuerdo con la presente Ley, el fomento, la inspección y la vigilancia de la enseñanza que corresponde al Presidente de la Republica estará orientado a: Promover la libertad de enseñanza, aprendizaje, investigación y cátedra. Vigilar que se cumpla e impere plena e integralmente la garantía constitucional de la autonomía universitaria. Adoptar medidas para fortalecer la investigaciones en las instituciones de educación superior y ofrecer las condiciones especiales para su desarrollo. Crear incentivos para las personas e instituciones que fomenten y desarrollen la técnica, la ciencia, la tecnología, las humanidades, la filosofía y las artes. Fomentar la producción del conocimiento y el acceso del país al dominio de la ciencia, la tecnología y la cultura. Acuerdo No. 98 del 29 de noviembre de 1995. Por el cual se establece el Plan de Desarrollo Institucional Ciencia y Tecnología de la Universidad Francisco de Paula Santander 2000. Estatuto general. Acuerdo No. 91 del 1 diciembre de 1993 Art. 4. Son principios de la Universidad: concebir la Educación Superior como un derecho de la persona, un servicio publico cultural, un proceso permanente que posibilita el desarrollo de las potencialidades del ser humano de una manera integral, con miras a configurar una sociedad más justa, equilibrada y autónoma, enmarcada dignamente en la comunidad internacional. La educación que imparte la Universidad Francisco de Paula Santander debe 27 desarrollarse dentro de un marco de claros criterios éticos y democráticos que garanticen el respeto, fortalecimiento y desarrollo de valores apropiados para enfrentar los cambios y requerimientos de la sociedad actual. La universidad como generadora de saberes entiende que la ciencia no es un quehacer abstracto ni perenne. Es principalmente, con base en la Historia y la Filosofía, una práctica social que busca una explicación racional y crítica de la realidad. Esta práctica, al hacerse más universal y sistemática, permite modificar la realidad entendida en su dimensión natural, humana y socio-política. Por lo cual interesan no solamente las estrategias y método de la ciencia, sino fundamentalmente sus fines y usos, las actitudes y valores que genera y los efectos que produce en la cultura. La Universidad dedicará sus esfuerzos en ciencia y tecnología, en forma prioritaria, al estudio del contexto de la frontera colombo venezolana, al análisis de sus fortalezas y debilidades, a la proyección de su desarrollo social, político, económico y cultural; a la propuesta y ejecución de soluciones a sus problemas y al estudio, solución y divulgación de la problemática fronteriza general de América Latina. La Universidad más que transmitir ciencia enseñará a hacer ciencia; a apropiarla, a contextualizarla y a elaborarla; a generar actitudes críticas y de creatividad para comprender la ciencia, valorarla y convertirla en práctica social. La Universidad concibe lo académico como la actitud investigativa y su práctica; como el compromiso y acción social fundamentados en la investigación y la extensión y como la formación del hombre para que asuma sus roles, sus responsabilidades sociales y su realización como persona. La Universidad Francisco de Paula Santander desarrollará la investigación de los problemas sociales como una contribución a la solución de los mismos, sin menoscabo de su naturaleza académica y el rigor científico que le son inherentes. Su papel va más allá del simple conocimiento de la realidad y deberá realizar una crítica social acorde con el grado de desarrollo de su entorno. Art. 5. Son objetivos del Universidad dentro del marco de la Constitución y las Leyes: Profundizar en la formación integral de los colombianos, dentro de las modalidades y calidades de la Educación Superior, capacitándolos para cumplir las funciones profesionales, investigativas y de servicio social que requieren la región y el país. Trabajar por la creación, el desarrollo y la transmisión del conocimiento en todas sus formas y expresiones y promover su utilización en todos los campos para solucionar las necesidades regionales y del país. Ser factor de desarrollo científico, cultural, económico, político y ético a nivel regional, nacional e internacional. 28 Fomentar el desarrollo de las distintas formas del saber mediante la generación de nuevos conocimientos, la extensión académica y la formación integral del ser humano. Generar y fomentar la producción del conocimiento científico, mediante el desarrollo y apoyo efectivo y permanente a las actividades de investigación básica y aplicada que propendan en forma prioritaria por el desarrollo y atención a los problemas regionales. Art. 102. La Universidad Francisco de Paula Santander, a la par con la actividad docente, adelantará actividades de investigación científica y de servicios a la comunidad, para lo cual establecerá una estructura administrativa para su organización y apoyo. Acuerdo No. 065 26 de agosto de 1996 Art. 1. El presente Estatuto Estudiantil se enmarcará dentro de los siguientes principios: Los estudiantes de la Universidad Francisco de Paula Santander tienen el derecho a recibir una formación integral que conlleve al descubrimiento de sus potencialidades de apreciar, conocer, analizar, sintetizar, evaluar, innovar, producir, hacer, transformar, administrar y comunicar para lograr su realización personal, su proyección profesional y su actitud positiva ante la sociedad. El desarrollo del Estatuto Estudiantil propicia la activa participación del estudiante en los procesos de investigación, de apropiación y recontextualización de la ciencia y la tecnología y en el conocimiento y aprecio de la cultura propia, contando para ello con el apoyo de sus maestros como facilitadores del proceso de aprendizaje. Art. 139. El trabajo de grado es un componente del plan de estudios y tiene como objetivos: Brindar al estudiante la oportunidad de manifestar de manera especial su capacidad investigativa, su creatividad y disciplina de trabajo mediante la aplicación integral de los conocimiento y métodos requeridos. Servir de instrumento de extensión a la comunidad y medio de generación del conocimiento. Facilitar al estudiante su participación y concurso en la solución de problemas comunitarios. Facilitar al estudiante una mayor autonomía en el desarrollo de trabajos científicos, científico-tecnológicos y profesionales propios de su formación. Ley 299 de 1996 (julio 26) 29 Por la cual se protege la flora colombiana. El Congreso de Colombia DECRETA: Art. 1. La flora colombiana, La conservación, la protección, la propagación, la investigación, el conocimiento y el uso sostenible de los recursos de la flora colombiana son estratégicos para el país y constituyen prioridad dentro de la política ambiental. Son de interés público y beneficio social y tendrán prelación en la asignación de recursos en los planes y programas de desarrollo y en el presupuesto general de la Nación y en los presupuesto de las entidades territoriales y de las corporaciones autónomas regionales. Decisión 345 de 1993 del pacto andino Art. 26. Derechos de obtentor en Colombia. Establece que no lesiona el derecho de obtentor quien reserve y siembre para su propio uso, o vendo como materia prima o alimento el producto obtenido del cultivo de la variedad obtenida. Programa de producción vegetal – FAO. Es un componente básico del trabajo de la Oficina Regional de la FAO en el área de la seguridad alimentaria. Las actividades están dirigidas al logro de los objetivos estratégicos de la Cumbre Mundial sobre la Alimentación con relación a la mejora de las tecnologías de producción sostenible de alimentos a nivel rural y suburbano y a las prioridades del Plan de Acción Mundial para la Conservación y Utilización Sostenible de los Recursos Genéticos que fuera aprobado en Leipzig en 1996. Estas acciones promueven también investigaciones innovadoras y apropiadas sobre cultivos alimenticios incluyendo los últimos adelantos de la biotecnología vegetal. 3. MARCO TEÓRICO 3.1 EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Pérez Ponce (1998), define el cultivo de tejidos como un conjunto de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y protoplastos, empleando medios nutritivos artificiales. Sin embargo, existe un término muy genérico que se refiere más bien a la metodología usada que al propio objetivo de ésta técnica: cultivo in vitro, que quiere decir, “dentro de vidrio”, es decir, el cultivo de plantas o de algunas de sus partes dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. Constituye dentro de las biotecnologías, la técnica que mayor aporte práctico ha brindado. Se originó inicialmente para investigaciones de carácter nutricional y morfológico, pero actualmente se ha extendido a otras ramas como la fisiología, bioquímica, genética y fitopatología. 30 En las últimas décadas, el cultivo de tejidos vegetales ha tenido gran aplicabilidad en el sector agrícola, particularmente en la obtención de plantas libres de patógenos, micropropagación, mejoramiento genético, obtención de metabolitos secundarios y establecimiento de bancos de germoplasma. Los principio del cultivo de tejidos vegetales son simples: primero, es necesario aislar una parte de la planta (explante); segundo, proveer al explante de un medio ambiental y nutricional adecuado para cada especie y, tercero, el trabajo se realiza en condiciones asépticas, es decir, libre de bacterias, hongos, levaduras y de otros microorganismos contaminantes (Mejía y Vittorelli, 1988) 3.1.1 El entorno del cultivo de tejidos vegetales. El estudio de cualquier fenómeno biológico en condiciones de laboratorio, exige reproducir de la forma más aproximada posible, todos los factores que puedan incidir en el fenómeno estudiado, cuando este sucede en la naturaleza. Este principio general se aplica también al cultivo in vitro de plantas. Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el biotipo de la planta en la naturaleza, es técnicamente muy complejo. Por esta razón, se realiza una simplificación de la realidad, escogiendo aquellos factores que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser vivo, sino con sólo una parte de él (explante), a la dificultad de reproducir las condiciones naturales se debe añadir la dificultad de suministrar a la parte, todo aquello que antes obtenía del sistema completo. 31 Figura 1. Principales métodos de micropropagación representados esquemáticamente de distintos materiales de partida y de los métodos que se pueden utilizar en la micropropagación (adaptado: george y sherrington, 1984) Fuente: GEORGE E.F. and SHERRINGTON, P.D. Plant propagation by tissue culture. Handbook and Directory of commercial Laboratory. U.K: Exegetics limited Eversley, 1990. p. 307 32 En resumen, el cultivo de tejidos vegetales es una técnica que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como químico, en el que se sitúa al explante, por tanto, es importante conocer cuáles son los principales factores que conforman el ambiente del explante y que deberán ser controlados. Se pueden clasificar los principales factores no biológicos que afectarán al desarrollo del cultivo de tejidos vegetales, como: Ambiente químico: Composición del medio de cultivo y pH Ambiente físico: Temperatura, luz y fotoperíodo Dentro de los factores biológicos que afecta el cultivo de Tejidos Vegetales está: influencia del material vegetal Ambiente químico: Composición del medio de cultivo. De acuerdo con Camborg et al (1976), el éxito en el cultivo de tejidos depende de la selección del medio de cultivo, incluyendo su composición química y su forma física. Un adecuado medio de cultivo debe contener sales minerales, vitaminas, reguladores de crecimiento, aminoácidos y otros compuestos orgánicos que varían de acuerdo a su composición y concentración (Mejía y Vittorelli, 1988), fuente de carbono y agente solidificante. Sales minerales: Constituyen el grupo más importante de sustancias nutritivas en el medio de cultivo in vitro. Para un rápido y vigoroso crecimiento y desarrollo, las plantas deben tomar del medio algunos iones inorgánicos y pequeñas cantidades o trazos de otros compuestos. Los macronutrientes son indispensables para el crecimiento de la planta y están constituidos por Nitrógeno (N), Fósforo (P), Calcio (Ca), Potasio (K), Magnesio (Mg) y Azufre (S). Los micronutrientes generalmente se usan como sales de Yodo (I), Hierro (Fe), Manganeso (Mn), Zinc (Zn), Boro (B), Cobre (Cu), Molibdeno (Mo) y Cobalto (Co). Son componentes de la célula de la planta e importantes para el metabolismo y fisiología. Vitaminas: son necesarias para ciertas funciones catalíticas en el metabolismo celular de las plantas, sin embargo, no son necesarias por las cultivadas in vivo ya que éstas las sintetizan según su requerimiento, mientras que en las plantas sembradas in vitro, algunas de las vitaminas se hacen necesarios. Las vitaminas usadas con frecuencia en el cultivo in vitro son: Tiamina o vitamina B 1 ó clorhidrato de tiamina. Se obtiene de cereales enriquecidos, de cereales de grano entero, leche, legumbres, carnes y levadura. La mayor parte de tiamina (Thiame hidrochloride) comercial que se utiliza es sintética. 33 Ácido nicotínico, niacina o vitamina B 5 (nicoticin acid or niocin). Se obtiene en forma natural de carne, pescado, leche, todos los cereales y levadura. En forma comercial, la niacina se obtiene por oxidación de la nicotina y la quinoleina. Piridoxina o piridoxina – HC1 o vitamina B 6 (Pyridoxina hidrochloric). En forma natural, se encuentra en grasas vegetales, granos completos de cereales, legumbres, levadura, hígado y pescado. En forma comercial se puede producir piridoxina, pridoxal y piridoxamina en forma sintética, por medio de una compleja serie de reacciones, a partir de la isoquinolina. Fuente de carbono: El azúcar es un componente muy importante en cualquier medio nutritivo y es esencial para el crecimiento y desarrollo in vitro, ya que el crecimiento tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad. Los tejidos verdes no son suficientemente autotróficos in vitro. (Pierik, 1990). La mejor fuente de carbono y energía universalmente usada, es la sucrosa, llamada también sacarosa. Otras, como la glucosa, maltosa y rafinosa, también son preferidas después de la sacarosa, en orden de importancia. Otros carbohidratos, como fructosa, lactosa, dextrosa, galactosa y almidón, pueden usarse, pero sus efectos son inferiores como fuente de carbono y energía (Mejía y Vittorelli, 1988). Reguladores de crecimiento: Went y Timan definieron a las hormonas del crecimiento, como “sustancias que siendo producidas en una parte de un organismo son transferidas a otra y en ésta influencian un proceso fisiológico específico”. En sentido estricto, las sustancias de crecimiento extraídas de los tejidos vegetales y las sustancias sintéticas con efectos reguladores, no pueden ser llamadas hormonas (Bidwell, 1979). Por lo anterior, fue creado el término “regulador del crecimiento vegetal”, que define a los compuestos orgánicos distintos de los nutrientes que en pequeñas cantidades estimulan, inhiben o modifican de algún modo cualquier proceso fisiológico en las plantas. Actualmente, se reconocen 5 tipos básicos de sistemas químicos de reguladores de crecimiento vegetal (Leopold y Kriedemann, 1975), divididos en tres grupos principales: Promotores del crecimiento: auxinas, citoquininas y giberelinas. Inhibidores del crecimiento: ácido abscísico. Etileno. De los 5 sistemas químicos incluidos en este grupo, las auxinas y las giberelinas estimulan principalmente la elongación celular y las citoquininas estimulan la división celular (Leopold y Kriedemann, 1975). Auxinas: El nombre auxina (del griego auxein, crecer) fue dado a la sustancia reguladora del crecimiento producida en el ápice del coleóptilo de avena. Sin embargo, se sabe que las auxinas están universalmente presentes en las plantas superiores 34 (Salisbury, F. 1992). Figura 2. Estructuras químicas de las auxinas Fuente: PIERIK, R.L.M. cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid: mundi- prensa, 1999. p. 325 Desde que se descubrió que el ácido indol – 3 – acético (AIA) es una auxina , se le ha encontrado en varias especies vegetales, considerándose que es la auxina principal de las plantas superiores, aunque existen otras sustancias que también poseen actividad auxínica (Wareing y Phillips, 1973). En muchos casos, estas otras sustancias son índoles, relacionados químicamente con el AIA (Bidwell, R. 1990). También se utilizan ampliamente un buen número de sustancias que provocan un efecto fisiológico similar y que se han producido sintéticamente; son las llamadas “auxinas sintéticas”, entre las cuales, el ácido 2, 4 – diclorofenoxiacético (2,4D), el ácido naftalenacético (ANA) y el ácido indolbutírico (AIB), se encuentran disponibles. Existen muchos compuestos que son derivados de los ácidos fenilacético o fenoxiacético (clorosustituidos) con actividad auxínica. En la práctica, el uso de las auxinas es un arte. No es posible establecer una concentración particular de la auxina que se debe utilizar en un solo caso. Sin embargo, en general se utiliza el AIA en concentraciones que varían de 0.001 a 10 mg/lt., con un óptimo alrededor de 0.1 a 1 mg/lt; el 2,4-D se utiliza en concentraciones que varían de 0.1 a 10 mg/lt., con un óptimo que frecuentemente se encuentra alrededor de 1 a 5 mg/lt., el ANA generalmente se utiliza en concentraciones levemente mayores (1 a 10 mg/lt.), con un óptimo cerca de 2 mg/lt (Ammirato, 1984). Las concentraciones más altas de auxinas se encuentran en los ápices de crecimiento (coleóptilo, yemas y de crecimiento de las hojas); sin embargo, también se encuentran auxinas ampliamente distribuidas por la planta, sin duda provenientes de las regiones meristemáticas (Devlin, 1980). Citoquininas. Skoog et al. (1955), propusieron el término cinina, como un nombre 35 genérico para sustancias naturales y sintéticas que presentaban los mismos tipos de actividad biológica que la KINETINA (6 – furfuril – aminopurina). Con el fin de evitar confusión con el término cicina, utilizado en los sistemas animales, un poco más tarde se adoptó la palabra Citoquinina, para designar las sustancias de división celular o citocinesis (Miller et al., 1956). Figura 3. Estructura química de citoquinina (6-BAP y Zeatina) Fuente: PIERIK, R.L.M. cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid: mundi- prensa, 1999. p. 325 Existe evidencia inequívoca, de que las citoquininas se concentran en tejidos con crecimiento activo, ya que los niveles citoquinicos son muy altos en frutos jóvenes en desarrollo, semilla, embriones, hojas y predominantemente en las raíces, que parecen ser la fuente principal de este regulador de crecimiento en las plantas, desde las cuales son enviadas hacia los brotes. En general, las citoquininas están ampliamente difundidas en las plantas, no solamente ligadas al Ácido Ribonucleico (RNA), sino también en forma libre, aunque hasta la fecha es muy escasa la información sobre la cantidad de citoquininas que se presenta normalmente en las plantas y de la dinámica de éstas durante el crecimiento, desarrollo, senescencia y muerte vegetal (Leopold y Kriedeman, 1975). Giberelinas. Son un grupo de reguladores del crecimiento, formadas por diterpenos constituidos por cuatro unidades de isopreno, por lo común formando tres anillos, además de presentar un puente de lactona. En la naturaleza existen muchas giberilinas, a las que se les designa como giberelina GA 1 , GA 2 , GA 3 y así sucesivamente, llegando más allá de la GA 70 . 36 Figura 4. Estructura química de las giberelinas (GA3,GA12, GA10) Fuente: PIERIK, R.L.M. cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid: mundi- prensa, 1999. p. 325 La primera giberelina purificada y estructuralmente identificada fue, el ácido giberélico (GA 3 ); posteriormente se han aislado todas las demás, tanto de plantas superiores como de hongos, estando más ampliamente difundidas en la naturaleza, GA 1 , GA 3 y GA 4 . Las giberelinas han sido detectadas en gran variedad de partes vegetales, por lo que parecen estar sintetizadas en muchas partes de las plantas, pero más específicamente en áreas de crecimiento activo como embriones o tejidos en desarrollo o meristemáticos. Existen experimentos que indican que la cantidad de GA presente en la planta es mucho mayor en la proximidad del ápice del tallo, lo que señala que las giberelinas son suministradas por el ápice (hojas jóvenes, embriones, etc.). Las giberelinas son transportadas rápidamente dentro de la planta; este transporte parece no ser direccional, pues se mueve con la misma facilidad tanto acropétala como basipétalamente. Esta traslocación es llevada a cabo tanto en floema como xilema, puesto que se han encontrado giberelinas trasladándose a una velocidad de 35 mm/h en la savia floemática y xilemática (Devlin, 1980). Las giberelinas presentan un espectro de actividad biológica muy variado pues pueden producir una elongación extraordinaria en enanos genéticos, fenómenos que pueden ser atribuibles a la estimulación de la división y al alargamiento celular, como también diversos efectos reguladores en el desarrollo vegetal ya que son las responsables de la hidrólisis de las reservas de almidón en el endospermo durante la germinación de la semilla; además, la expresión sexual de las flores también es asociada al control de las giberelinas (Bidwell, 1979). La elongación celular causada por las giberelinas podría ser confundida con el mismo efecto auxínico, pero ambos resultados no son idénticos, puesto que algunos sitios de acción de las giberelinas pueden no responder a la aplicación de auxinas y, más aún, es posible que éstas ejerzan un efecto inhibitorio. Sin embargo, si se aplican giberelinas y auxinas consecutivamente en el tejido, éste presenta una fuerte respuesta de elongación; si el orden de aplicación se invierte, el fenómeno no ocurre, indicando una parcial dependencia y un efecto sinérgico de las auxinas con las giberelinas (Hess, 1980). 37 El ácido absícico (ABA) es otra sustancia de actividad regulatoria en el crecimiento de las plantas y es sintetizado en plastidios o cloroplastos. El ABA actúa como inhibidor de crecimiento, bloqueando los efectos de giberelinas y citoquininas, estimula la abscisión de las hojas e inhibe la síntesis del ácido ribonucleico (ARN), pero no la del ácido de desoxiribonucleico (ADN). Promueve además, el cierre de los estomas y tiene efecto sinergístico con auxinas en el enraizamiento de esquejes. Se utiliza solamente para casos especiales. En la mayor parte de los casos, el ABA produce un efecto negativo en los cultivos in vitro (Pilet y Roland, 1971) y las referencias a crecimiento del callo y embriogénesis son probablemente incidentales (Ammirato, 1983). Etileno. Se sabe que tanto el cultivo de órganos como el de callos pueden producir etileno, una hormona gaseosa (Mele et al., 1982). Teniendo en cuenta que los tubos, matraces y otros recipientes de plástico están a veces hermáticamente cerrados, se debe tener cuidado para evitar la acumulación de etileno, sobre todo en caso de utilizar recipientes de plástico, ya que ellos mismos pueden generar este gas. Aminoácidos: Los aminoácidos pueden acumularse en forma libre en los tejidos o pueden asociarse entre sí, formando proteínas. La proporción de aminoácidos libres y aminoácidos protéicos de las plantas varían con la especie y la variedad, con el tipo de órgano, con su estado fisiológico, con su estatus nutricional y con el microclima dentro del cual se desarrolla la planta. Algunos aminoácidos proporcionan a la planta disponibilidad inmediata de nitrógeno, mucho más rápido que el nitrógeno inorgánico en el mismo medio. Estos no son necesarios cuando existe en el medio un balance adecuado de sales inorgánicas. Agente solidificante. El explante debe estar en contacto con el medio de cultivo sin que éste se encuentre sumergido en el medio. Por tal razón, se le agrega al medio sustancias gelatizantes como Phytagel, Agar, gelatina o geles, para que no se sumerja el explante. Estos productos además sirven de soporte a la plántula contenida en el tubo de ensayo. Estas sustancias se encuentran disponibles, como polvo seco o en forma de fibras obtenido por extracción de secado de sustancias mucilaginosas de algas marinas de los géneros Gelidium, Gigartina, Pterocladia y Gracillaria. El solidificante más utilizado es el Agar por su característica de tolerar altas temperaturas sin descomponerse; no es asimilado por la planta y no reaccionan con los otros constituyentes del medio de cultivo. pH: El pH del medio de cultivo es un factor importante por varias razones: Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes añadidos a los medios sólidos. 38 Si la evolución del pH del medio lo hace bajar a 3.5 o menos, se puede producir su licuación. El valor del pH puede afectar la solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo. El valor del pH puede afectar la absorción de determinados nutrientes por parte del explante (p.e., la absorción de iones NO 3 – aumenta con la acidez del medio). El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia, a la actividad de muchas enzimas. Por todas estas razones, conviene optimizar el pH del medio para cada caso en concreto. En general, no obstante, la mayoría de situaciones se trabaja a pH entre 5.5 y 6. Una vez ajustado el pH del medio, este sufrirá una ligera acidificación durante el proceso de esterilización en autoclave, para, después, evolucionar nuevamente durante el curso del cultivo, de forma que habitualmente se irá acidificando progresivamente como resultando de la absorción diferencial de algunos componentes del medio de cultivo, así como de la excreción de exudados por parte del explante. Ambiente físico. Temperatura: La temperatura para el desarrollo del cultivo in vitro, se controla mediante un sistema de refrigeración – calefacción controlado por un termostato. La temperatura a la que se expone a los tejidos vegetales cultivados in vitro, afecta fundamentalmente la mayoría de los procesos fisiológicos y por lo tanto es un factor fundamental de controlar. Cada especie tiene un intervalo de temperatura en el que se produce un crecimiento óptimo. Este intervalo puede variar en función del genotipo, del órgano del que se ha obtenido el explante, de la época del año, de la edad de la planta madre, del fotoperíodo, etc. Se obtiene resultados satisfactorios con temperaturas de incubación que oscilan entre los 20 y 28ºC. El Cultivo de Tejidos Vegetales se realiza dentro de espacios diseñados para permitir el control del ambiente físico al que será expuesto el cultivo. Luz y fotoperíodo. La luz es un factor importante para la pigmentación verde de las plantas como respuesta al fotoperíodo, longitud de onda y la intensidad lumínica. Así mismo, es importante para regular ciertos procesos morfogenéticos, que son controlados por el fitocromo, pigmento vegetal en dos picos de absorción y fotoreversibles; éste puede controlar las respuestas de activación – represión diferencial de ciertos genes. Los requerimientos de luz para vitroplantas cultivadas in vitro, no son los mismos que para las 39 vitroplantas desarrolladas en condiciones autotróficas. La iluminación debe ser considerada en sus tres componentes: intensidad, duración del periodo de exposición y calidad. Los niveles de iluminación oscilan entre 1000 y 4000 lux. Esto se logra colocando tubos fluorescentes blancos (40 w) a una altura de 10 – 20 pulgadas sobre los cultivos. El fotoperíodo varía entre 12 –20 hs, siendo el más común 16 hs. Los requerimientos de luz para cada una de las fases de la micropropagación, son diferentes: para las fases de establecimiento y multiplicación se necesita baja iluminación, mientras que la fase de enraizamiento se requiere una alta intensidad de luz. Cuando se utilizan altas irradiancias (30 – 70 wm 2 ) para meristemos establecidos u otro tipo de explante, se produce el efecto invernadero dentro de los recipientes, presentando problemas de deshidratación, oxidación y por último la muerte. Por esta razón, es recomendable utilizar irradiancia de 8 – 15 wm 2 (Vittorelli, 1988) La intensidad de la luz juega un papel importante en la estimulación del enraizamiento. Se ha señalado que existen contrastes del espectro de la luz, que favorecen la organogénesis de las vitroplantas, como la luz azul propicia la iniciación de brotes y la luz roja para raíces. Influencia del material vegetal. El estado fisiológico de la planta fuente del explante o planta madre, influye significativamente en un esquema de micropropagación. Se han encontrado diferencias nutricionales y hormonales, cuando los tejidos provienen de diferentes edades fisiológicas. Generalmente se usan plantas en estado de crecimiento activo, que muestren un desarrollo vigoroso y sano (Jiménez, 1998). Mientras más joven y menos diferenciado esté el tejido que se va a sembrar, mejor será la respuesta in vitro (Villalobos et al, 1982). Por ésta razón, los meristemos apicales y axilares han sido empleados con éxito en una amplia gama de especies. La constitución genética de la planta donadora o planta madre es el primer factor relacionado con la frecuencia de variantes somoclonales resultante del proceso de propagación (Evans y Bravo, 1985). Por esta razón, es de vital importancia la selección del material de partida, asegurándose que provenga de una correcta selección individual. En la mayoría de los esquemas de propagación in vitro, el material inicial del cual se extraen los explantes, es una planta élite seleccionada por sus características fenotípicas que correspondan al clon o variedad a propagar. Por tal razón, se crean bancos de plantas donantes para el proceso de micropropagación, donde se les brinda un adecuado manejo y control sanitario. 3.1.2 Historia del cultivo de tejidos vegetales, Desde hace 120 años aproximadamente, en las investigaciones de fisiología vegetal se ha utilizado la tecnología de cultivo de tejidos, órganos y células vegetales, que consisten en cultivar en medios nutritivos adecuados y en forma aséptica, ápices de raíz y de tallo, primordios de hojas, primordios o partes inmaduras de flores, frutos inmaduros, segmento de órganos de tallo y hoja; y algunas veces ovarios, óvulos, anteras y polen (Street, 1977). La regeneración de plantas 40 mediante el cultivo de tejidos vegetales evidencia la teoría de la Totipotencia celular formulada por los científicos alemanes Scheleiden y Shwan en 1838, quienes postularon que cada célula viva de un organismo multicelular podría estar en capacidad de desarrollarse, si se le proporcionan las condiciones apropiadas, es decir, que cada célula posee la información necesaria para el funcionamiento de la planta. Los primeros intentos de cultivo in vitro de células fueron realizados en células animales, considerado que Haberlandt (1902) fue el pionero de la aplicación de la técnica en plantas, a pesar de no haber cultivado exitosamente células vegetales aisladas. En 1926, dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales, denominado giberelinas y en 1928, se descubre el regulador de crecimiento, la auxina AIA, constituyendo grandes oportunidades para el cultivo de tejidos vegetales. El primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares y levadura. Demostró además, la sustitución de la levadura por 3 vitaminas del grupo B: Tiamina, piridoxina, niacina (Montoya, 1991). En 1939, trabajando en laboratorios diferentes, Gautheret y Noberoourt en Francia y White en Estados Unidos, reportan la formación de callos a partir de tejidos de raíz en medio sólido. Morel y Martín (1952), logran obtener plantas libres de virus en dalia a partir de meristemos apicales de tallo. Muir, Hidebrandt y Riker (1954) transfieren segmentos de tejido de callo a medio líquido en agitación y tienen éxito al obtener cultivos en suspensión de células. La identificación de la kinetina, permite a Skoog y Miller en 1957, postular la hipótesis de que la iniciación de raíces y brotes en cultivos de callos, puede estar regulada por la relación auxina citoquinina en el medio de cultivo. La iniciación y desarrollo de embriones a partir de tejidos somáticos en plantas cultivadas, fue estudiado primero por Steward (1958) y Reinert (1958 – 1959) en cultivos de zanahoria (Daucus Caraota). Desde 1958, las investigaciones de la embriogénesis somática en zanahoria han sido extensas y el número de especies que han producido embriones somáticos se ha incrementado. Tisserat et al (1979) reportan embriogénesis somática en 32 familias, 81 géneros y 132 especies. En 1962, los científicos Murashige y Skoog, desarrollaron un medio nutritivo con el cual lograrán un crecimiento rápido en tejidos de tabaco. En la actualidad, las sales inorgánicas de éste medio (MS), se usan con éxito en casi todas las especies vegetales. Torrey (1966) propuso que la organogénesis se inicia con la formación de grupos celulares o células meristemáticas (menstemoides), capaces de responder bajo determinadas condiciones a la formación de un primordio vegetativo y que dependiendo de la naturaleza de los factores internos, el estímulo puede inducir el inicio de brotes aéreos, 41 raíz o un embrioide (Dodds y Roberts, 1982). En la década de los 70, se realizó un gran número de investigaciones enfocadas a estudios de embriogénesis, organogénesis, hibridación, diferenciación, fitopatología, citología, mutagénesis, producción de metabolitos secundarios, aislamiento y cultivo de protoplastos. En las últimas dos décadas, el cultivo de tejidos vegetales ha tenido grandes avances debido a la introducción de la Ingeniería Genética; la mayoría de los trabajos se han enfocado a estudios de mutagénesis, morfogénesis, embriogénesis, citogénesis e histogénesis; además, se le ha dado particular importancia a la detección, identificación, síntesis y producción de metabolitos secundarios, así como al uso de la técnica para la selección y mejoramiento de plantas. 3.1.3. Métodos de regeneración de plantas. La regeneración de plantas a partir de cultivos in vitro de tejidos vegetales ocurre como consecuencia del crecimiento y desarrollo de estructuras organizadas separadas de una planta (explante), como meristemos o yemas apicales o laterales o el resultado de un proceso de formación de “novo” a partir de células o grupos de células (callos), donde no existía organización alguna; estas células pueden derivarse de órganos vegetativos o somáticos o de estructuras sexuales o gaméticas (Leyva, 1994). La regeneración de plantas puede realizarse a través de dos vías: Embriogénesis somática o asexual: proceso mediante el cual se logra la producción de estructuras pseudoembrionarias a partir de células somáticas. (Lindsey, 1992). Organogénesis: proceso mediante el cual la diferenciación de órganos vegetativos se inicia a partir de grupos celulares (Krikorian, 1982). La embriogénesis somática o asexual es el desarrollo de embriones a partir de células que no son el producto de la fusión gamética. Este fenómeno es conocido en la naturaleza como una forma de apomixis, llamada embrionía adventicia (Pérez Ponce, 1998). Estas estructuras se caracterizan por ser bipolares, debido a la presencia de un ápice caulinar y uno radical (Ammirato, 1983) y no estar físicamente unida a su tejido de origen. Los embriones somáticos pueden desarrollarse y germinar para formar plantas de modo análogo a la germinación de los embriones cigóticos. La producción de embriones somáticos a partir de cultivo de células, tejidos y órganos, puede tener lugar bien directamente sin una fase intermedia de callo o indirectamente tras la formación de callo (Lindsey, 1992). La embriogénesis directa suele tener lugar a partir de un explante mantenido en un medio de cultivo sólido y puede utilizarse para la micropropagación de una serie limitada de especies, sin embargo, la embriogénesis indirecta a partir de suspensiones celulares líquidas, resulta particularmente atrayente para la micropropagación, ya que permite la estabilidad genética, debido a que puede producirse un número potencialmente elevado de embriones somáticos en pequeños volúmenes de medio de cultivo. Es una técnica 42 prometedora a mediano plazo, pero no utilizada a escala comercial porque aún se desconocen aspectos importantes de la biología del proceso. A escala comercial, esta técnica es poco utilizada ya que aún se desconocen aspectos importantes de la biología del proceso. La organogénesis considerada como la base fundamental de la micropropagación, se caracteriza por la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con el posterior desarrollo de éste en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre los nuevos brotes y el tejido paterno, necesitando de una secuencia de medios para formar la planta completa. La organogénesis o formación de órganos vegetativos ha sido observado desde las primeras investigaciones in vitro a través de la formación de brotes aéreos, raíces, flores y eventualmente plantas completas, directamente a partir del explante (organogénesis directa) o a partir de cultivos celulares - callos (organogénesis indirecta). En la organogénesis directa, el nuevo órgano se forma directamente del explante, es decir, la formación de brotes a partir de yemas, meristemos, ápices caulinares. Por lo general, son fenotípicamente homogéneas, lo que indica su estabilidad genética. La organogénesis indirecta, se basa en la formación de un callo obtenido a partir de meristemos preexistentes o tejido no meristemático, los cuales se originan de una o de un pequeño grupo de células cuando se cultivan los explantes en medios con concentración alta de citoquinina. Esta etapa intermedia de formación de callos, implica un proceso de desdiferenciación celular incrementando la frecuencia de inestabilidad genética. 3.1.4 Aplicaciones prácticas de cultivo de tejidos vegetales. Es posible cultivar plantas completas, pequeños fragmentos de las mismas o células aisladas bajo condiciones nutricionales y ambientales controladas. Cuando se cultivan tejidos vegetales de esta forma, su crecimiento y desarrollo pueden manipularse y explotarse con diferentes fines de aplicaciones. Estas aplicaciones son esenciales cuando lo que se pretende es conseguir objetivos con fines comerciales e investigativos en cuanto a la manipulación, que serían imposible in vivo, disminuyendo las necesidades de espacio y trabajo. Las aplicaciones prácticas más importantes del cultivo de tejidos vegetales, son las siguientes: Obtención de plantas libres de patógenos. Micropropagación. Conservación de germoplasma. Mejora por mutagénesis y selección in vitro. Obtención de metabolitos secundarios. Obtención de plantas libres de patógenos. la propagación vegetativa por métodos 43 tradicionales, es una de las causas principales para la dispersión de enfermedades sistémicas. Mediante el desarrollo de las técnicas del cultivo de tejidos vegetales, se ha demostrado que la vía más eficiente y rápida para erradicar patógenos es el aislamiento de zonas de tejidos de la planta que escapan de la infección viral. El cultivo de meristemos, que en la literatura usualmente es referido como: “shoot tip culture”, “meristem tip culture”, Tip culture”, “culture of shoot apices” y “shoot apex culture”, (Mejía y Vittorelli, 1988), abre la posibilidad de obtener plantas libre de infección viral y se convierte en el camino para solucionar problemas de obtención de material libre de enfermedades, convirtiendo esta aplicación , en la base fundamental de la propagación masiva de plantas. Sin embargo, existen otras técnicas de saneamiento del material vegetal como quimioterapia, termoterapia, electroterapia y cultivo de callos que son utilizados en la micropropagación masiva de plantas. Micropropagación. conocida también como propagación masiva de plantas, se ha convertido en la aplicación más popular del cultivo de tejidos vegetales, Consiste en la multiplicación de brotes mediante la fragmentación de ápices o yemas axilares que son manipuladas bajo condiciones asépticas y ambientales controladas y transferidas a un medio de cultivo apropiado para luego regenerar una planta completa. La micropropagación ofrece la alternativa de realizar en espacios reducidos y en corto tiempo la multiplicación a gran escala de clones seleccionados por su calidad de producción y estado fitosanitario. Conservación de Germoplasma. la destrucción de ecosistemas por sobre explotación, la contaminación, los problemas fitosanitarios, la introducción de variedades de alta productividad han ido desplazando aquellas variedades tradicionales de especies cultivadas y silvestres, modificando o destruyendo los hábitat en los que se encuentran un pool genético de vital importancia para el mundo y la agricultura. El cultivo de tejidos permite mantener gran cantidad de material vegetal, como plantas, tejidos somáticos y aun células, almacenadas en un crecimiento controlado por bajas temperaturas y en condiciones asépticas (Perea, 1990). Esta alternativa, busca mantener en grandes bancos de germoplasma, mediante técnicas de crecimiento mínimo o crioconservaciòn, este pool genético de especies ornamentales, herbáceas, frutales, etc., posibilitando, además de su conservación, el intercambio de germoplasmas entre países. Mejora por mutagénesis y selección in vitro. a través del cultivo de tejidos vegetales, es posible la obtención de individuos haploides, cuya duplicación posterior de su número de cromosomas dará origen a diploides, triploides, etc. homocigóticos. El cultivo de órganos, tejidos y células, abre nuevas perspectivas para la mejora mutacional y el aumento de la eficiencia en los métodos de selección al poder aplicarse a nivel de callos o células, lo que brinda la posibilidad de manipular millones de individuos en 44 volúmenes reducidos de espacio y poder enfrentarlos a agentes selectivos tales como toxinas de microorganismos (Carlson,1.993; Daub,1.986; Gómez, 1.996) Obtención de metabolitos secundarios. siendo la aplicación más reciente, la obtención de compuestos a partir de algunas plantas cultivadas in vitro, se ha convertido en un gran potencial para el desarrollo de esta técnica, permitiendo la obtención de sustancias de gran interés farmacéutico, alimentaría e industrial, logrando productos de mayor pureza, la conversión de sustancias precursoras baratas en compuestos de alto precio (biotransformación) actuando los cultivos celulares como catalizadores de las reacciones implicadas en dicha transformación (Alfermann y Reinhard, 1980; Berlin, 1984). Las principales limitaciones técnicas de ésta aplicación son: dificultades en los procesos de manejo y cultivo del material vegetal, en la extracción y purificación de los productos finales obtenidos, la falta de conocimientos sobre los inductores y los mecanismos genéticos y bioquímicos implicados en la regulación y control de este metabolismo secundario. En la actualidad, sólo unos pocos metabolitos secundarios (shikoninas, ácido rosmarínico) se utilizan de forma industrial, aunque el caudal de conocimientos adquiridos sobre estas metodologías ha alcanzado un elevado nivel, y muchos de los problemas planteados en las primeras épocas de aplicación industrial han sido resueltos con éxito, lo que sin duda permitirá nuevos avances. 3.2. LA MICROPROPAGACIÓN DE ESPECIES El proceso de multiplicación vegetativa in vitro, recibe el nombre de micropropagación, para diferenciarlo de los diferentes procesos que existen de propagación tradicional y se fundamenta, en la obtención a partir de una planta madre, un gran número de individuos o clones con características fenotípicas y genotípicas idénticas a las planta origen. La micropropagación de especies es considerada como la aplicación práctica que mayor aporte a nivel mundial ha brindado dentro de las diferentes técnicas del Cultivo de tejidos vegetales, Varias especies de plantas cultivadas, que son propagadas por vía asexual, están siendo multiplicadas in vitro, con el objeto de conservar ciertas características esenciales de la variedad, ya que por su esterilidad o por reproducción sexual pueden sufrir variaciones tanto en el fenotipo como el genotipo (Montoya, 1990). Desde hace un tiempo, la micropropagación se practica con éxito en especies hortícolas (Murashige, 1978), ornamentales (Hughes, 1981) y leñosas (Torpe, 1983). Sus bases fueron establecidas desde los años 50 y 60 y fue realmente en las décadas de los 70 y 80, que se estableció una verdadera industria de micropropagación (Kitto, 1987). Existen más de 1000 especies en las cuales se ha logrado establecer ésta técnica (Murashige y Huang, 1987), sin embargo, numerosos laboratorios realizan experimentos 45 para mejorar la formulación de los medios y los procedimientos requeridos para un cultivo específico, lo cual permite procesos cada vez mas eficientes. En la década de los 90 la obtención de plantas por técnicas in vitro aumentó considerablemente y se estimaba una producción de 500 millones aproximadamente en unos 500 laboratorios comerciales, concentrándose en Europa, Estados Unidos, Israel y algunos países de Europa del Este (Kilto, 1991). Sin embargo, en 1994, Polonia y la India pasan a ser los mayores productores debido a la apertura de grandes laboratorios y a la disponibilidad de mano de obra de bajo costo. Esto determina una reducción importante de los precios de venta, que pasan de un promedio de $1.40 a un promedio de $0.60 La micropropagación, debido a los avances tecnológicos y prácticos que ha venido desarrollando a través de los años se ha dividido en dos generaciones: Micropropagación de primera generación Micropropagación de segunda generación La micropropagación de primera generación o micropropagación convencional, se refiere a la multiplicación a partir de meristemos, ápices y yemas. Es la tecnología más conocida y la que mayor experiencia ha brindado. Ha sido aplicada con diferentes objetivos en más de 500 variedades de 1000 especies vegetales, tanto de uso agrícola y forestal, como especies de uso industrial. La micropropagación de segunda generación se refiere a la embriogénesis somática. A diferencia de la micropropagación convencional, ésta requiere de una serie de investigaciones antes de poner en práctica el nivel de producción. Su tecnología es mucho más compleja y se ha puesto en práctica en 200 especies de plantas en los últimos 35 años (Vasil, 1994), sin embargo, en la actualidad esta tecnología a demostrado un gran desarrollo, pero aún no se ha escalado en su producción comercial. 3.2.1. Ventajas y limitantes. La micropropagación es una tecnología bien conocida que ha mostrado desarrollo investigativo y comercial en los últimos dos décadas. Las principales ventajas y limitantes de éste sistema de propagación se describen a continuación. VENTAJAS Propagación clonal masiva. Permite obtener altos coeficientes de multiplicación dejando manipular volúmenes elevados de plantas en cortos períodos de tiempo y espacios reducidos. Introducción rápida de nuevas variedades o clones. Los clones pueden ser propagados en cualquier época, mientras que por métodos convencionales dependen de condiciones propicias. Producción de material libre de enfermedades. Mantiene el cultivo libre de enfermedades, por ser una técnica que requiere muchas asépsia. 46 Incremento en los rendimientos debido al rejuvenecimiento y al saneamiento. Permite un crecimiento vigoroso de las plantas porque pierden señales de tejido materno y pueden ser sometidos a métodos de erradicación de patógenos que limiten su productividad. Producción independiente de las condiciones ambientales. Por desarrollarse ésta técnica en condiciones de laboratorio, existen mecanismos para brindarle a las plantas factores ambientales propicios para su crecimiento y desarrollo: Luz, temperatura, humedad relativa, pueden controlarse y lograr altas tasas de propagación. LIMITANTES Costos. Dado que las instalaciones y personal requeridos para el trabajo in vitro son especializados, el costo de las plantas es relativamente alta y debe compensarse con una producción a gran escala. Contaminación. Si se produce contaminación por bacterias y hongos en las fases tempranas del esquema de micropropagación, se corre el riesgo de perder plántulas potenciales. La transferencia de las plantas desde el tubo de ensayo al suelo es muy difícil de adaptar. Se debe contar con un programa eficiente de aclimatación para evitar pérdidas importantes de material vegetal en la producción. Estabilidad genética. En algunos sistemas de propagación in vitro la estabilidad genética es débil y la técnica de micropropagación no debe inducir inestabilidad genética. 3.2.2 Fases de un esquema de micropropagación. Dentro de un esquema de micropropagación de especies, existen diferentes fases o etapas de trabajo, donde se logra determinar y aplicar técnicas y procedimientos, mediante el desarrollo de protocolos adaptados para cada especie vegetal en cada una de éstas fases, con la finalidad de: Realizar procedimientos de desinfección adecuados en el material inicial. Proporcionar las condiciones nutricionales y ambientales propicias para el objetivo de cada una de las fases. Brindar las condiciones necesarias requeridas en el paso de las plántulas del laboratorio al invernadero o campo. Según Pérez Ponce y colaboradores (1.994), la mayoría de los investigadores y micropropagadores de plantas están de acuerdo en diferenciar cinco fases críticas para lograr una exitosa multiplicación: Fase 0: Fase Preparativa 47 Fase I: Fase de Establecimiento Fase II: Fase de Multiplicación Fase III: Fase de Enraizamiento Fase IV: Fase de Aclimatación Fase 0: Fase Preparativa. Esta fase es importante e indispensable para el desarrollo de un esquema de micropropagación eficiente y repetible. Se basa en seleccionar plantas que tengan buenas condiciones fisiológicas, sanitarias y genéticas, ya que de ello depende el buen desarrollo del proceso y por tanto la calidad de la planta que se desea obtener (ver figura 5). Figura 5. selección del material vegetal inicial del proceso FUENTE: foto /ACOSTA, Claudia y MONTAÑO, Yulieth. 2002 Selección del material vegetal. Para seleccionar un material adecuado se debe tener en cuenta las siguientes condiciones: Las características fenotípicas de la planta donante. Se tiene en cuenta el vigor de la planta, niveles de producción y desarrollo morfológico de la planta (hojas, tallo, número de hijuelos, etc.). La constitución genética, que es el primer factor relacionado con la frecuencia de variantes somaclonales resultante del proceso de propagación (Evans y Bravo, 1985). Estado fitosanitario. Se hace diagnóstico de las principales enfermedades causadas por agentes patógenos como bacterias, hongos y virus. 48 En esta fase, generalmente se hace pretratamiento con el fin de reducir los problemas de contaminación que se presentan durante la Etapa I (Establecimiento). Comprende una serie de procedimientos que van desde la aplicación de desinfectantes (como el hipoclorito de sodio) o mezclas de funguicidas y bactericidas, hasta la pregerminación de estacas, secciones nodales, tubérculos, bulbos, rizomas, etc. Fase I: Fase de Establecimiento. Figura 6. Establecimiento del material vegetal Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 El objetivo de esta fase es lograr el establecimiento de cultivos axénicos y fisiológicamente vigorosos con los cuales iniciar el proceso de multiplicación. Una vez escogida la planta madre, se extraen los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Luego de esto, se someten a una serie de desinfecciones para eliminar los contaminantes externos. Posteriormente, se llevan a la cámara de siembra y se inoculan al medio del cultivo en condiciones de asépsia. Esta etapa se considera satisfactoria si un número adecuado de explantes sobreviven sin contaminación y se mantienen en crecimiento (ver figura 6). Fase II: Fase de Multiplicación. El objetivo de esta fase es la producción del mayor número posible de propágulos (plantas, microtubérculos, microbulbillos) a partir de explantes (meristemos apicales o axilares, yemas axilares o advertencias) ya establecidos in vitro, sin perder la estabilidad genética. En Musáceas, para lograr tal objetivo, se hacen cortes longitudinales para romper la dominancia apical y permitir la proliferación de yemas axilares. 49 Figura 7. Multiplicación del material vegetal Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 La proliferación de los diferentes explantes en el cultivo in vitro, pueden lograrse con el uso de sustancias reguladoras del crecimiento como componentes principales de un medio de cultivo previamente establecido y adecuado manejo del proceso in vitro (ver figura 7). Fase III: Fase de Enraizamiento. El enraizamiento in vitro consiste en transferir las plantas formadas durante la Fase II a un medio de cultivo que permita la formación de raíces y elongación de algunas plantas o brotes (ver figura 8). Figura 8. Plantas enraizadas durante el proceso de micropropagación. Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Se considera como una etapa intermedia entre las condiciones in vitro y ex vitro, donde se prepara a la planta morfológica y fisiológicamente para comenzar la absorción de nutrientes. Se caracteriza por ser la fase más voluminosa de todo el proceso, durante la rizogénesis se involucran 3 estados: la inducción, iniciación y 50 elongación. Enraizamiento ex vitro. Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio (suelo estéril). Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse. Fase IV: Fase de aclimatación. Los explantes recién enraizados, son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación (ver figura 9). Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz (fotoperíodo). Figura 9. Aclimatación de material vegetal proveniente de laboratorio con abono y abono - escoria Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 3.2.3. Factores que afectan el crecimiento y desarrollo de los explantes o El explante. El explante es una estructura activa de crecimiento que se aísla del resto de la planta con fines de cultivo. Tamaño del explante: el tamaño del explante es un factor importante que influye en la desinfección y regeneración de plantas. Entre más pequeño sea, existe menor riesgo de contaminación, pero se hace más difícil la regeneración; si por el contrario, el explante es de mayor tamaño, se corre el riesgo de contaminación, pero su regeneración es más rápida. Tipo de explante: dependiendo del objetivo de la propagación, el material de partida puede ser: meristemos, donde se ha logrado la erradicación de virus; yemas, propias para la multiplicación rápida de semillas previamente diagnosticados; ápices caulinares, utilizados por su fácil regeneración; partes embrionales, si las plantas que se van a 51 micropropagar, tienen reproducción por semillas. Posición del explante dentro de la planta: la topófisis es el fenómeno que explica la influencia de la posición del explante en el vegetal, sobre el crecimiento y desarrollo, después del aislamiento. Tipos de corte: cuando se hacen cortes sobre los explantes, se debe tener en cuenta la superficie de los tejidos. Un aumento de la superficie lesionada aumenta la posibilidad de absorción de nutrientes reguladores, aumentando la producción de etileno. Al mismo tiempo las heridas o lesiones pueden romper barreras de tipo anatómico en los explantes (por ejemplo, una capa de fibras de esclerénquima) facilitando la formación de raíces adventicias (Pierik, 1987). Método de inoculación del explantes: los explantes se pueden situar en el medio de cultivo de diferentes formas: polar, cuando su base se coloca sobre el medio y apolar, cuando se invierte el explante. La inoculación apolar permite regenerar fácilmente el explante como raíces y vástagos por lo que la oxigenación es mejor, así mismo, las sustancias acumuladas en la base del explante no llegan a difundirse sobre el agar, por falta de contacto. o Influencia de factores físicos. Aún cuando muchos factores pueden influir en los explantes, los factores físicos juegan un papel determinante; la luz, la temperatura y humedad han sido los factores físicos más extensivamente estudiados. Luz: es un factor importante para la pigmentación verde de las plantas como respuesta al fotoperíodo, longitud de onda y la intensidad lumínica, así mismo es importante para regular ciertos procesos morfogenéticos, que son controlados por el fitocromo, pigmento vegetal en dos picos de absorción y fotoreversibles. Este puede controlar las respuestas de activación – represión diferencial de ciertos genes. La iluminación debe ser considerada en sus tres componentes: intensidad, duración del período de exposición y calidad. Los requerimientos de luz para cada una de las fases de la micropropagación son diferentes: para la fase de establecimiento y multiplicación, se necesita baja iluminación, mientras que la fase de enraizamiento se requiere una alta intensidad de luz. Cuando se utilizan altas irrandiancias (30 – 79 wm 2 ) para meristemos establecidos u otro tipo de explante, se produce el efecto invernadero dentro de los recipientes, presentando problemas de deshidratación, oxidación y por último la muerte. Por esta razón es recomendable utilizar irradiancia de 8 – 15 wm 2 . La intensidad de la luz juega un papel importante en la estimulación del enraizamiento. Se ha señalado que existen contrastes del espectro de la luz que favorecen la organogénesis de la vitroplanta, como la luz azul propicia la iniciación de brotes y la luz roja para raíces. Temperatura: generalmente se utilizan temperaturas constantes durante el día y la 52 noche, siendo la más común entre 20 – 28ºC (68 – 82ºF). La temperatura óptima para el crecimiento y desarrollo in vitro, es generalmente 3 – 4 ºC más alta que la correspondiente para el crecimiento en condiciones in vivo. Se debe tener en cuenta que la temperatura interna de los recipientes es 3 – 4ºC más alta que en el de crecimiento, debido al efecto de la irradiación del cuarto. Para las especies de clima tropical, se utilizan temperaturas constantes de 26 + 2ºC para su inicio y desarrollo. Gautheret (1969) sugirió que la temperatura más alta favoreció la formación del cambium y que la más baja era necesaria para la formación del cambium en primordios radicales. Humedad: se refiere fundamentalmente a la humedad relativa de los cuartos de cultivo, la cual debe ser controlado. Aproximadamente un 70% es lo más normal. Una temperatura alta puede ser causal de pérdida de agua en los medios. La interacción temperatura – humedad, es otro factor que debe tenerse en cuenta en la micropropagación, no sólo por factores de crecimiento, sino por aspectos sanitarios, ya que en ocasiones, temperatura y humedad altas son causales de proliferación fúngica. o Medio de cultivo. El medio de cultivo se define como la combinación sólida o líquida de nutrientes esenciales para el crecimiento y desarrollo de una planta, suplementada con vitaminas, reguladores de crecimiento y fuentes de carbono que varían ampliamente de concentración de acuerdo a los requerimientos nutricionales de la especie. Figura 10. Soluciones madres para la preparación de medios de cultivos Fuente: foto /ACOSTA, Claudia y MONTAÑO, Yulieth. 2002 Los macronutrientes y micronutrientes son indispensables para el crecimiento de la planta. Sus concentraciones elevadas permiten un crecimiento acelerado, mientras que concentraciones bajas lo limita, estimulando al mismo tiempo la acumulación de metabolitos. La fuente de carbono cumple en el medio dos funciones principales: primero, es fuente de energía; segundo, tiene en el medio un potencial osmótico determinado. La fuente de carbono más utilizada es la sacarosa, sin embargo, el azúcar blanca 53 refinada de uso doméstico se puede utilizar en el medio de cultivo en su reemplazo. Se ha demostrado que la cantidad de azúcar tiene efecto sobre la morfogénesis y es fundamental para mantener el crecimiento celular. Las vitaminas actúan como coenzimas, ya que muchos de los grupos prostéticos o coenzimas son similares o idénticos a varias vitaminas. Los reguladores de crecimiento son compuestos que estimulan el crecimiento de la planta cumpliendo un rol regulatorio más que nutricional en el desarrollo (ver figura 10). 3.3 EL CULTIVO DEL PLÁTANO 3.3.1 Botánica y ciclo vegetativo. El plátano es una planta herbácea perenne gigante, con un falso tallo de forma cilíndrica, que está formado por vainas o yaguas de las hojas superpuestas, un cormo que crece dentro del suelo, de raíces cortas y que origina brotes llamados también colinos o puyones, por medio de los cuales se reproduce la planta. Clon Hartón. Pertenece al subgrupo, Musa AAB. Su nombre vulgar es “hartón” que significa “falso cuerno”. Es el más comercializado en Colombia y genéticamente más estable que el “dominico – hartón”. Pseudotallo. Es el más alto del subgrupo plátano, alcanza una altura promedio de 3.78 m y un diámetro de 18 cm, medido a un metro de la superficie del suelo en el momento de aparecer la inflorescencia. Su color es verde claro con manchas oscuras pero sin tonalidades rojizas. Sus rebrotes no son numerosos y presentan bastante ceras, tanto en las vainas como en las hojas. Se ha observado que forman hojas funcionales a mayor altura (1050 m) que la mayoría de otros rebrotes de otros clones. También, en hojas de rebrotes denominadas como “orejones”, se observan manchas rojas. 54 Figura 11. Botánica del genero musa Fuente: MONTERO ESCOBAR, Hugo. Manejo poscosecha y comercialización del plátano (Musa spp. Grupo AAB). Armenia: FUDESCO, 2000. p. 33 – 40 Hojas. En estado adulto son de color verde mate en el haz y verde claro en el envés, con presencia de cera; la nervadura central es verde amarillenta y tiene ligeras tonalidades rosadas; el pecíolo, verde amarillento, posee bordes rojizos convergentes que se encierran a lo largo y sobre el canal superior. Inflorescencia. Es péndula, con dos brácteas previas; su eje en el primer tercio es verde manchado de rojo, luego es verde mate con pubescencia corta y suave de color rojizo. El número de manos femeninas es de seis en promedio y sólo la primera presenta doble fila de flores, el número promedio de frutos es de 32. Las manos con flores masculinas, (unas 15), generalmente tiene una flor y ocasionalmente dos; las primeras manos persisten y las dos o tres últimas son decíduas. Es frecuente encontrar flores con estaminodios situados entre las femeninas y las masculinas. El ráquis produce bracteas decíduas, como todas las demás, que no subtienden ninguna flor. La bellota, que es alargada y de forma aovada acuminada, desaparece rápidamente. 55 Racimo. Es coniforme, con los frutos muy grandes y distanciados entre sí; su posición respecto al raquis, es un ángulo agudo desviado por el peso de cada dedo. El eje es corrugado longitudinalmente entre las manos sucesivas y su parte final es corta y desnuda semejando una cola de rata. La anastomosis frecuente en éste clon se conoce popularmente como “Pancha”. Frutos. Son de pedúnculo largo y delgado, con aristas pronunciadas, engruesan suavemente y terminan en un pico largo, grueso coniforme, la sección trasversal es pentagonal pero el endocarpio es cilindroide, su longitud promedia es de 35.5 cm y el diámetro mayor es de 4.77 cm para un peso promedio de 335gr. La forma general del fruto es curva, epidermis de color amarillo ligeramente rosado cuando madura y endocarpio rosado. Figura 12. Planta de plátano hartón (Musa AAB subgrupo plátano cv. Hartón) Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Utilización. Este cultivar es muy apreciado para elaborar sopas, patacones y tajadas fritas. Se considera como el más apropiado para la fabricación de harinas destinadas a la alimentación de niños, debido a su propiedad de restaurar la flora intestinal, entre otras. Ciclo vegetativo. El ciclo de desarrollo de la planta de plátano está determinado por tres fases: Fase vegetativa. Fase reproductiva. Fase productiva. 56 Figura 13. Ciclo vegetativo del género Musa Fuente: BELALCÁZAR, Silvio. El cultivo del plátano en el trópico. Manual de asistencia técnica. N° 50 ICA – INIBAB. Armenia: Feriva, 1998. p. 21 – 28, 125 – 127 Fase vegetativa: esta fase se inicia con el brote del colino, en campo hasta que se lleva a cabo la diferenciación floral. Para una mejor comprensión, ésta fase se ha dividido en tres etapas: Brotación: abarca desde la siembra del cormo hasta la aparición de la primera hoja sobre la superficie del suelo. Cronológicamente y dependiendo de la estructura y textura del suelo pueden transcurrir de 15 a 30 días. Organogénesis: esta etapa tiene que ver principalmente con los siguientes parámetros de desarrollo: Formación del cormo superior o de la planta madre, crecimiento del pseudotallo y producción de raíces. Formación del cormo superior: el cormo sembrado, da origen a una planta cuyo pseudotallo en un principio es de forma cilíndrica y al transcurrir 2 meses, la porción superior del cormo, comprendida entre el borde superior del cormo sembrado y la superficie del suelo, empieza a ensancharse hasta tomar con el tiempo una forma redondeada. Fase reproductiva: esta fase puede ser considerada de singular importancia, por cuanto de su correcta evolución va a depender el rendimiento, el cual está relacionado directamente con el tamaño del racimo. Se caracteriza por la diferenciación y formación de flores femeninas y masculinas, 57 las primeras de las cuales darán origen a los frutos que conformarán en primera instancia las manos y el conjunto de ellas, el racimo. Fase productiva: hace referencia principalmente a los parámetros de rendimiento y calidad de producción. Se inicia al finalizar el proceso de diferenciación florar, continua con el ascenso de ésta yema hacia el ápice del pseudotallo y posterior organización de la inflorescencia y llenado de frutos que conforman el racimo (Montero, 1999). 3.3.2 Sistema de clasificación y genética. Dentro de las familias de las Musáceas, el género Musa ha adquirido importancia en la alimentación humana a nivel mundial; de él derivan dos tipos específicos: los plátanos de cocción (“Cookin bananos”) y los bananos que se consumen crudos (“Dessert bananos”). Las teorías sobre el origen indomalayo de esos cultivares se remontan a los estudios de Kurt en 1865, y hoy ha sido ampliamente demostrado que todos los bananos y plátanos comestibles se derivan de dos especies silvestres: Musa acuminata Colla (M. Cavendishi tamb export) y Musa balbisiana Colla. Actualmente, los sistemas de clasificación generalmente aceptados, se basan en los trabajos de Simmonds y Shephard (1956) quienes establecieron calificaciones para identificar los aportes genómicos provenientes de las especies M. Acuminata (genama A) y M. Balbisiana (genoma B) (Perea y Angarita, 1991). Simmonds plantea la siguiente clasificación para los diferentes cultivares de plátano: I. Cultivares que solamente tienen genomas acuminata. Diploides (AA). Este plátano es de follaje verde amarillento, frutos cortos y pulpa azucarada. Triploides (AAA). Este grupo comprende la mayorías de las variedades que se cultivan de forma comercial Gros - Michel, Lacatán, Robusta, Cavendish enano, etc. Estas variedades tienen diferentes alturas del pseudotallo, el tamaño de los limbos varía y los racimos tienen desde 8 hasta 14 manos; sus frutos son desarrollados y de color verde amarillento y amarillos al madurar. 58 Cuadro 2. Caracteres utilizados en la calificación de los cultivares de plátano CARÁCTER M. ACUMINATA M. BALBISIANA Color de seudotallo Canal peciolar Más o menos densamente marcado con manchas de color pardo o negro. Margen erecto o dilatado, con alas escariosas por debajo, sin abrazar al seudotallo. Manchas ligeras o ausentes. Margen cerrado, sin alas por debajo, abrazando al seudotallo. Pedúnculo Pedicelos Por lo general pubescente o piloso. Cortos. Glabro Largos Óvulos Dos hileras regulares en cada lóculo. Cuatro hileras irregulares en cada lóculo. Hombro de la bráctea Enrollamiento de la bráctea Forma de la bráctea Ápice de la bráctea Por lo general alto (razón <0.28) La bráctea se repliega y enrolla hacia atrás, después de abrirse. Lanceolada o estrechamente aovada, aguzándose abruptamente a partir del hombro. Agudo Por lo regular bajo (razón > 0.30) La bráctea se levanta, pero no se enrolla. Ampliamente aovada, sin aguzarse abruptamente Obtuso. Color de la bráctea Atenuamiento del color Rojo, púrpura mate a amarillo, en la pare exterior, rosado, púrpura, mate o amarillo, dentro. El color interno de la bráctea se atenúa hasta llegar al amarillo en dirección a la base. Púrpura pardusco bien definido en la parte externa; carmesí brillante en la parte interna. El color interno de la bráctea es continuo hasta la base. Cicatrices bracteales Prominentes. Apenas prominentes Sépalo libre de la flor masculina Color de la flor masculina Color del estima Corrugado en forma variable por debajo de la punta. Blanco cremoso. Anaranjado o amarillo intenso. Muy rara vez corrugado. Con un tinte rosado variable. Crema, amarillo pálido o rosado pálido. Fuente: LÓPEZ ZADA, Mateo. El plátano. Cuba: puebla y educación, 1998. p. 55–67 59 II. Cultivares que poseen genomas acuminata y balbisiana. Triploides con predominio de acuminato (AAB). Este grupo comprende, entre otros, los subgrupos de los plátanos plantains, cuyos frutos se consumen solamente cocidos. Sus flores son masculinas y están pigmentadas de amarillo – naranja. Estos plátanos ocupan grandes áreas en algunos países de África, América Latina y Asia. Se les debe considerar como plantas alimenticias. Diploide híbrido natural (AB). Este grupo comprende el subgrupo Nay Poovan que es conocido en la India. Triploide con predominio balbisiana (ABB). De éste grupo existe un representante que se encuentra distribuido por todos los continentes, el plátano bumo (Cacambou). Tetraploide natural (ABBB) con un genoma acaminata y tres balbisiana. Dentro de éste grupo tenemos el Kloe Teparod y el Pya - ye – san (López, 1989). Los plátanos con dominancia balbisiana han demostrado tolerancia a la Sigatoka Negra (por ejemplo: los clones Saba y Pelipita) puesto que el genoma B (de balbisiano), transfiere residencia a esta enfermedad (Krikorian y Cronaver, 1983) (ver cuadro 2) 3.3.3 Clasificación taxonómica. La clasificación taxonómica para el plátano clon hartón es la siguiente: Reino: Plantae. División Magnoliophyta Clase: Liliopdisa Orden: Escitaminales Familia Musaceae Subfamilia Musoideae Género: Musa Sección Eumusa Especie Musa AAB, c.v. Hartón Nombre vulgar: Plátano Hartón Esta planta se encuentra determinada en el herbario del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. D.C. 3.3.4 Características edafoclimatológicas. Suelos: en el mundo, se cultiva el plátano en diversos tipos de suelos. Según Simmonds, son tres los factores que determinan si el suelo se puede dedicar al cultivo de plátano: la estructura, la profundidad y la ausencia o presencia de sustancias tóxicas. Para una buena producción, los suelos para plátano deben ser sueltos, profundos y ricos en materia orgánica, además de poseer buenas condiciones de drenaje y retención de humedad. 60 pH: con respecto al valor del pH, el plátano posee una adaptabilidad extraordinaria, ya que tiene buen crecimiento en suelos cuyos valores fluctúan entre 4.5 y 8. Algunos autores plantean que los mejores rendimientos se alcanzan con valores de pH del suelo de 6 a 6.5 (López, 1989). Temperatura: es un factor íntimamente relacionado con la altura. El plátano es originario de zonas selváticas y clima cálido, húmedo, sin embargo, en nuestro medio produce dentro de rangos comprendidos entre 16 y 37ºC. Se considera óptima una temperatura de 25ºC. Altitud: dependiendo de la variedad, se adapta a alturas desde el nivel del mar hasta 2200 m. A medida que aumenta la altura, el período vegetativo se alarga. Precipitación: la planta necesita para su normal crecimiento y buena producción, un suministro de 4 a 5 mm diarios de agua, lo cual equivale a 120 – 150 mm de lluvia mensual, bien distribuidos. Vientos: los vientos ocasionan daños y ruptura en el limbo de la hoja, lo cual ocasiona retraso en el crecimiento y frutificación de la planta y disminución en el desarrollo de hijuelos. Luminosidad: es un factor muy importante en el proceso de desarrollo y producción del cultivo. Se requieren por lo menos 1500 horas de sol al año, para que la planta crezca vigorosamente y produzca un buen racimo (Montero 1999). 3.3.5 Importancia económica y productividad del cultivo del plátano. El plátano es uno de los productos básicos de la dieta alimentaria de los países en desarrollo, ya que, junto con las raíces y los tubérculos, aporta el 40% del total de la oferta de alimentos en términos de calorías. Según la FAO, este producto no sólo puede contribuir a la seguridad alimentaria, sino que, además, es una fuente generadora de ingresos y de empleo y, por lo tanto, mejora el nivel de vida de los agricultores. El plátano se comercializa en fresco y, en menor escala, deshidratado y en harina. En el comercio internacional sólo se transa el 1% de la producción mundial (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. IICA. “Acuerdo de Competitividad de la Cadena Productiva del Plátano en Colombia”, 2001.). Es un de los productos alimenticios más importantes a nivel nacional, ya que participa con el 6.8% del total de la producción agrícola, ocupando el quinto lugar después del café, la caña de azúcar, la papa y las flores (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Anuario estadístico, 1999). La producción mundial de plátano fue de 30 millones de toneladas en 1998, siendo Uganda el principal productor, seguido de Colombia, República del Congo, Ghana, Ruanda, Costa de Marfil y Camerún. Aunque los países africanos participan con un 61 amplio volumen dentro de la producción mundial, la mayor parte éste se destina a consumo interno, razón por la cual tienen una participación marginal en el mercado internacional, principalmente en Europa. Vale la pena destacar que tan sólo el 1% de la producción es comercializada en el mercado internacional. Colombia participa con el 8.7% de la producción mundial en plátano, con un comportamiento relativamente estable en los últimos años, alcanzando 2.7 millones de toneladas en 1999, situación que, como se desprende de las cifras preliminares del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, se seguirá manteniendo así. Este comportamiento se debe a que disminuyeron los rendimiento al pasar de 7,2 ton/ha en 1992 a 6.8 ton/ha en 1999, lo que representa una tasa de crecimiento negativo del 0.8% anual, debido principalmente a la alta incidencia de enfermedades como la Sigatoca negra (Mycosphoarella fijiensis) que, además de disminuir los rendimientos, ha incrementado los costos de producción. El área cultivada, por su parte, mostró un comportamiento creciente, al pasar de 356.743 hectáreas a 385.129 hectáreas en el mismo período, con un crecimiento promedio anual de 0.6%. La producción de plátano se concentra en la Región Andina (71% de la producción total) y en la Orinoquia (7%), principalmente en los departamentos de Quindío, Meta, Antioquia, Tolima, Córdoba, Arauca y Valle. Las variedades cultivadas a nivel nacional son: dominico hartón, dominico, hartón, pelipita y cachaco o popocho y su distribución geográfica depende las condiciones arqueológicas a las cuales se adaptan las distintas variedades. Así, el plátano hartón se cultiva en las zonas cálidas ubicadas entre 0 y 1.000 msnm; el dominico hartón, en las regiones ubicadas entre 100 y 1.600 msnm, y el dominico, en zonas que llegan hasta 2.000 msnm. El plátano cachaco se cultiva principalmente en las regiones donde se producen los plátanos dominico hartón y dominico y el plátano pilipita en los Llanos Orientales. Por lo general, estas dos últimas variedades se orientan principalmente al consumo de cada región. De las variedades cultivadas comercialmente en el país, los plátanos hartón y dominico hartón presentan el mayor potencial para el procesamiento debido a que el clima cálido en el cual se producen favorece el desprendimiento de la cáscara, labor que resulta bastante dispendiosa al procesar el producto. Igualmente, según las empresas procesadoras, se presentan diferencias entre el plátano dominico hartón y el plátano hartón en cuanto al tamaño, el contenido de agua (mayores en la variedad hartón) y de sólidos solubles (mayor en la variedad dominico hartón). Es de anotar, sin embargo, que no se han adelantado investigaciones conducentes a caracterizar estas dos variedades y sus usos en la agroindustria. En el departamento Norte de Santander, donde la agricultura es una actividad de gran importancia, que contribuye en la generación de riquezas económicas el 75% del área sembrada corresponde a cultivos permanentes y semipermanentes, de los cuales el 0,67% se encuentra sembrada en plátano. Según datos de la División de Planeación -URPA, Secretaría de Agricultura de Norte de Santander, 2001, el cultivo de plátano tiene una superficie aproximada de 13.116 Ha., una producción de 86.882 toneladas y un rendimiento de 7.044 kg/ha, siendo los municipios más productores: Bucarasica con 9.510 ton/año, Tibú con 8.360 ton/año, Cucutilla con 7.950 ton/año, Sardinata con 7.520 ton/año y San Calixto 62 con 7240 ton/año. 3.3.6 Enfermedades y plagas del cultivo. Entre los principales problemas fitosanitarios que afectan al cultivo, en mayor o menor grado, sobresalen las siguientes: La Sigatoca negra (Mycosphaerella fijiensis) el Moko bacteriano (Raistonia solanacearum), el Virus del Rayado del Banano (BSV), el Picudo Negro (Cosmopolites sordidus), el Picudo Rayado (Metamasius hemipterus), el Gusano del Tornillo (Castniomera humboldti) y algunos nematodos fitopatógenos. Enfermedades: Sigatoka Negra: Es causada por el hongo patógeno (Mycosphaerella fijiensis) Morelet, el cual se propaga a través de dos clases de esporas de tamaño microscópico conocidas como conidias y ascosporas (Mercha, 1996). El hongo en su fase conídica, Cercospora musae, fue descrito por primera vez en Java, en 1902; presentándose focos epidémicos en Fiji (Valle de Sigatoca) en 1913 (Simmonds, 1973). Figura 14. Acercamiento de la superficie de una hoja de banano atacada por la sigatoka negra. Bajo condiciones de alta humedad y precipitación. Fuente: BELALCÁZAR, Silvio. El cultivo del plátano en el trópico. Manual de asistencia técnica. N° 50 ICA – INIBAB. Armenia: Feriva, 1998. p. 21 – 28, 125 – 127 Desde 1970 la producción de plátano y banano en América Latina ha sido afectada por la presencia de Sigatoca negra, la cual se ha diseminado rápidamente a la mayoría de los países productores. Esta enfermedad es considerada una de las más destructivas y costosas para las musáceas comerciales. El impacto económico de la Sigatoca negra por la reducción del área de producción ha sido más crítico en la producción de plátano que en la de banano, ya que los productores, por lo general, no cuentan con los recursos y tecnologías necesarias para hacerle frente a la enfermedad (Jácome, 1998). La Sigatoka negra, ataca directamente las hojas de plátano y banano. Se caracteriza por la presencia de un gran número de rayas y manchas más notorias por debajo de las hojas, las cuales aceleran el secamiento y la muerte de la superficie foliar, ocasionando 63 marcada reducción del área fotosintética (Merchan, 1996). Moko del plátano: causado por la bacteria Ralstonia solanacearum, fue observado por primera vez en Colombia en 1954 en los municipios de Prado y Purificación (Tolima), diseminándose luego a las zonas bananeras y plataneras (Merchán, 1998). La enfermedad puede tener consecuencias devastadoras si no se aplican medidas efectivas de manejo y control una vez se ha comprobado su presencia en plantaciones. El contagio ocurre a través de las heridas existentes en las raíces o cormos, extendiéndose a través de los conductos vasculares a toda la planta. Como consecuencia puede aparecer una maduración prematura de frutos, así como una marchitez y oscurecimiento de los hijos y los conductos vasculares. Estos últimos se tiñen de amarillo primero y luego se toman pardos oscuros. Por ser un organismo patógeno del suelo se hace muy difícil su control (López, 1989). Mosaico del banano: se conoce de su aparición desde el año 1930 en Australia y después siguió propagándose en distintos lugares (López, 1989). El virus del mosaico del pepino (CMV), agente causal de la enfermedad mosaico del banano; se viene presentando con mayor incidencia en plantaciones de plátano y banano en la zona cafetera en donde se produce cerca del 70% del plátano del país. Belalcázar, 1991; Castaño et al., 1994). Figura 15. Planta del clon dominico – harton afectada por elvirus del mosaico del pepino (CMV). 1350 msnm. Fuente: BELALCÁZAR, Silvio. El cultivo del plátano en el trópico. Manual de asistencia técnica. N° 50 ICA – INIBAB. Armenia: Feriva, 1998. p. 21 – 28, 125 – 127 Las plantas infectadas por CMV son más pequeñas, presentan síntomas de mosaico en las hojas y producen pocos frutos, pequeños y con desarrollo incompleto. En casos severos, las plantas infectadas mueren (Jones, 1994). El CMV pertenece al grupo de los cucumo – virus y es uno de los más diseminados en el mundo, con más de 800 especies hospederas que incluyen plátano, banano, maíz, fríjol, hortalizas y tabaco. El virus puede ser transmitido a través de la semilla, por 64 medios mecánicos y por más de 60 especies de áfidos vectores (Francki et al., 1985; Jones, 1994). Hasta el momento no se conocen fuentes naturales de resistencia genética a CMV en germoplasma de Musa (Reichel et al., 1996). Rayado del Banano. Esta enfermedad es causada por el virus del rayado del banano (BSV) y fue reportada por primera vez en 1974 en Costa de Marfil (África) en donde ocasionó pérdidas del 90% en plantaciones de banano Cavendish (Lockhart, 1993). Esta enfermedad se presenta en casi todas las regiones productoras de plátano y banano. El BSV es un miembro del grupo de los badnavirus; las plantas afectadas presentan inicialmente un rayado clorótico continuo que luego se convierte en necrótico (Lockhart, 1986); su crecimiento y vigor son menores y produce racimos pequeños y deformes. El BSV es transferido entre las plantas por el insecto Planococcus citri, conocido como “Cochinilla” o “Chinche harinosa” de los cítricos, pero también puede transmitirse por inoculación mecánica, a través de la semilla y mediante propagación vegetativa (Lockhart, 1988). Se encuentra universalmente distribuido, ocasionado grandes pérdidas en plantaciones de plátano y banano, lo que ha originado la prohibición de importación de germoplasma de musáceas, con el fin de prevenir la entrada del virus, ya que éste, se encuentra asociado a su genotipo. Plagas del cultivo de plátano: El Picudo Negro (Cosmopolites sordiduos germar). El picudo negro es nativo del Sudeste de Asia, pero se ha esparcido ampliamente sobre los plátanos cultivados de todo el mundo, siendo su punto de origen probablemente la región de Malaya – Java, Borneo (Simmonds, 1973). Es considerada la plaga más importante de las musáceas cultivadas en la mayoría de los países tropicales y, ataca más severamente al plátano que al banano. (Merchán, 1998). Se encuentra distribuida en todo el país y su dispersión ocurre probablemente a través de la semilla infestada. La intensidad del daño en los cormos y pseudotallos, es mayor en aquellas plantaciones que no reciben labores de mantenimiento, favoreciendo un ambiente propicio para la multiplicación del insecto (García et al., 1994). El picudo negro deposita sus huevecillos aisladamente, ubicándolos en una cavidad que abre con sus mandíbulas, en la base del pseudotallo, junto al suelo y cerca al cormo. Estas larvas, después que el adulto pone sus huevos en el falso tallo, se desarrollan y abren galerías en el cormo, debilitando la planta y afectando la producción; cuando el ataque es severo, las plantas se observan clorótica, y los hijos débiles, con hojas secas adheridas a los mismos (López, 1989). El gusano tornillo: (Castniomera humboldti Maubl Ashby, lepidóptera: castnide). Es una plaga de relativa incidencia que cada día adquiere más importancia en el país. El 65 insecto hace grandes perforaciones en el cormo que se extiende hasta el corazón del pseudotallo, imposibilitando a la planta para producir un buen racimo; también es la vía de entrada para el ataque de otros insectos y patógenos (Londoño et al., 1991). Nemátodos del cultivo de plátano: son organismos microscópicos en forma de lombricillas, que viven como parásitos externos o internos de diversas plantas cultivadas y en especial del plátano, pueden encontrarse en muchos suelos infectados con anterioridad y de ahí pasar a atacar raíces y cormos. Entre los principales nematodos filapatógenos encontramos: Radopholus similis, protylenchus coffeae y Helycotilenchus multicinctus. Los nemátodos causan en general, retardo del crecimiento de la planta, al disminuir el diferenciamiento de raíces activas e incapacitándola en la absorción normal de nutrientes. Es por eso que la producción se reduce al obtener racimos de poco peso, mal formados y ciclos vegetativos cortos. El principal transmisor de los nematodos es la propia semilla (cormo) que se extrae de campos infectados (López, 1989). 3.3.7. Factores limitantes en la productividad del plátano. Desde el punto de vista de sanidad del cultivo, las enfermedades y plagas constituyen las principales limitaciones para la explotación del cultivo, afectando la cantidad y calidad de la producción y el rendimiento, incrementando los costos del mismo por la ejecución de medidas de manejo y control. En la actualidad, la atención se centra en las enfermedades de origen fungoso como la Sigatoka Negra y Amarilla y, en el virus del Mosaico del Pepino (CMV), agente causal de la enfermedad mosaico del banano. Estas afecciones registran en Colombia un alto índice de daño agronómico, por lo que se puede encontrar hasta pérdidas del 100% en producción. Las plagas, están en capacidad de atacar a la planta y ocasionar daños directos al reducir significativamente el rendimiento del cultivo, e indirectos disminuyendo la calidad de presentación de frutos. El picudo negro es considerado la plaga mas importante de las musáceas, cultivadas en la mayoría de los países tropicales y ataca más severamente al plátano que al banano. Desde el punto de vista de problemática tecnológica, la siembra, explotación y mercadeo del plátano, afrontan dificultades de carácter técnico, social y económico y se constituyen en un reto para los investigadores, en la búsqueda y la aplicación de soluciones, mediante la generación y transferencia de tecnologías nuevas, que mejoren la productividad y rentabilidad del cultivo, haciéndolo sostenible, competitivo para productores y consumidores. El plátano se cultiva con labores agronómicas mínimas, lo cual ha favorecido el incremento en intensidad y diseminación de enfermedades. A esto se le suma la siembra de variedades susceptibles, la escasa o nula cultura por parte de los productores sobre la ejecución de prácticas adecuadas de cultivo (Merchán, 1996) y, la baja disponibilidad de semillas de plátano de buen calidad fitosanitaria y productiva, para establecer plantaciones. 66 3.4. PROPAGACIÓN CLONAL DEL PLÁTANO 3.4.1 Generalidades. La rápida propagación clonal, fue la primera aplicación práctica en el cultivo de tejidos de plantas (George y Sherrington, 1984). Otras aplicaciones importantes han sido la erradicación de enfermedades y la conservación e intercambio de germoplasma (De Langhe, 1984; Las cruces y Williams, 1985). Éstos también eran los objetivos de las primeras aplicaciones del cultivo del tejido en plátano (Musa sp). Los primeros estudios producidos en plantas de bananos obtenidas por el cultivo in vitro, vinieron de Taiwán, China, en 1970; En Honduras Berg y Bustamante (1974) usaron el cultivo de meristemos combinada con la terapia de calor, con el fin de producir plantas de plátano libres de virus. Un equipo de la Universidad de Filipinas produjo retoños o brotes de plátanos in vitro para inducir mutaciones (Del Guzman et al., 1976; 1980). Estos primeros informes fueron basados en investigaciones llevadas a cabo en un número muy limitado de plantas bananeras del Musa AAA, principalmente los tipos de Cavendish. Desde 1980, se ha presentado una gama amplia de especies de Musa y cultivares de todas las constituciones genómicas y que se han encontrado mediante el cultivo in vitro de tejidos (Cronauer y Krikorian, 1984a; 1984b; El Jarret et al., 1985; Müller y Sandoval, 1986,; El Novak et al., 1986; Ponga al sol, 1985; Vessey y Rivera, 1981,; Vuylsteke, 1983,; Vuylsteke y De Langhe, 1985; Wong, 1986,; El Zamora et al., 1986). La propagación in vitro tiene sus ventajas y limitantes. La principal ventaja es la de obtener un mayor numero de plantas en corto tiempo y libre de enfermedades, que comparando con la propagación convencional, no se garantiza la calidad fitosanitaria ni los volúmenes de plantas. La principal limitante de la producción mediante el cultivo in vitro, está dada por el número de personas calificadas, que pueden ocuparse de grandes volúmenes, lo que implica altos costos en la producción. Se han establecido grandes cantidades de plantas en campo de plátano y bananos obtenidos mediante la técnica del cultivo in vitro y cuyos estudios se han realizado en Taiwán, China (el Hwang et al., 1984), Filipinas (Epp, 1987,; El Zamora et al., 1986) Australia (Johns, 1985), Costa Rica (el Jarret et al., 1985), Jamaica (Oglesby y Griffis, 1986,; Stover, 1987), Puerto Rico (la Piscina e Irizarry, 1987), las Islas de la Virgen americanas (el Ramcharan et al., 1987), Colombia (R. Swennen, el pers. el comm., 1987), Israel (el al de et de reuveni., 1985), Marruecos (Kenny y Aaouine, 1987), Camerún (C. Teisson, el pers. el comm., 1987), y Nigeria (IITA, 1986,;El Vuylsteke et al., 1988). Mediante los bancos de germoplasma de Musa, se ha logrado el intercambio internacional desde la primera mitad de esta década (el et de Jarret. el al., 1985; El Zamora et al., 1986). Desde 1985, el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) en Ibadan - Nigeria, ha usado el cultivo de meristemos con éxito para intercambio interregional e intercontinental con germoplasma; más de 120 especies de Musa y cultivares se han introducido y más de 100 han sido distribuidas en muchas partes del mundo (IITA, 1988). Existe un interés muy grande en la aplicación del cultivo in vitro para la conservación de germoplasma de Musa, donde se han obtenido resultados satisfactorios mediante condiciones mínimas controladas (Banerjee y De Langhe, 1985; El Jarret et al., 1986; El Zamora et al., 1987). 67 Esta apreciación global de desarrollo durante los últimos 15 años da énfasis al valor potencial de esta técnica como herramienta importante para el manejo de germoplasmas en Musa. Así mismo el cultivo de tejidos, es una técnica relativamente simple, ya que se han propagado y conservado en bancos de germoplasma diferentes tipos de plátanos y bananos. 3.4.2 Método de cultivos de tejidos para multiplicación clonal del plátano. Métodos de cultivo de tejidos in vitro han sido utilizados en la propagación, conservación y mejoramiento genético de las Musáceas (Cronaver and Krikorien, 1986 a; Krikorian and Cronaver, 1984 a; Stover and Buddenhagen, 1986). El cultivo de brotes meristemáticos se ha utilizado satisfactoriamente para la micropropagación clonal rápida de diferentes especies y cultivares de Musa y como medio de intercambio y conservación de germoplasma, siendo la única técnica en donde se generaron plántulas libres de problemas fitosanitario de manera consistente y rutinaria con una elevada probabilidad de mantener estabilidad genética, además de presentar una tasas de multiplicación menor a la obtenida en el sistema convencional (Voylsteke, 1989). La técnica de cultivo aséptico de meristemos in vitro , aunque presenta algún tipo de reinfección en campo, permite el establecimiento de cultivos con plantas sanas y evita la diseminación de enfermedades. Se han observado diferencias en las tasas de proliferación dependiendo de factores como el genotipo, el tamaño del explante, el número de brotes subcultivadas, el tipo de corte que se emplee (transversal o longitudinal), la consistencia del medio de cultivo, la concentración de citoquinina y el estado fisiológico del tejido. Uno de los mayores riesgos de la micropropagación, es la posibilidad de propagar in vitro enfermedades de tipo vascular o sistémico (mal de panamá, moko o virus) si el propágulo inicial está contaminado. Para evitarlo, puede requerirse un tratamiento de termoterapia previo al aislamiento de meristemo según los trabajos de Berg y Bustamante (1974). Otra dificultad práctica de la propagación in vitro de las Musáceas es la oxidación de polifenoles, especialmente en algunos cultivares, donde se recomiendan subcultivos frecuentes y la eliminación de tejidos senescentes de la bases de los brotes (Roca et al, 1991). Otra alternativa que se encuentra al alcance es el establecimiento de cultivo de células embriogénicas en suspensión como método de multiplicación rápida y masiva de Musáceas (Dhedá et al, 1991; INIBAP, 1994) para el establecimiento de cultivo de células embriogénicas en suspensión, se parte de ápices meristemáticos provenientes de plantas desarrolladas en campo o establecidas in vitro, los cuales se cultivan inicialmente en un medio con altos niveles de citoquinina (BAD o Zeatina 8 – 20 mg/l), para inducir la proliferación de brotes adventicios. Los brotes se pasan a un “medio semisólidos de inducción” con altos niveles de 2, 4 – D, en donde se obtienen glóbulos regulares que dan origen a estructuras irregulares que se desarrollan en embriones somáticos, los cuales se pueden cultivar y mantener indefinidamente en medio líquido en suspensión. La regeneración de plántulas a partir de estas células en suspensión se logra transferiéndolas a medios semilíquidos sin auxinas y dosis medios de citoquinina (Dhed´o et al. 1991; París et al., 1992). La alta rata de multiplicación que se obtiene a partir de un solo explante hace que la técnica de cultivo de células embriogénicas en suspensión figura como una alternativa viable de explantes provenientes de inflorescencia masculinas, constituyendo otra alternativa para la 68 obtención de embriones somáticos. Está técnica consiste en el establecimiento de órganos florales masculinos jóvenes en medio de cultivo con 2.4-D, en donde se ha reportado un 50% de formación en embriones somáticos a partir de los cuales se han obtenido plantas completas (Escalante et al., 1994). Otra de las aplicaciones de las tecnologías de multiplicación rápida y masiva de plantas in vitro es en la producción de variedades mejoradas a través de la ingeniería genética (May et al., 1995; Sagi et al., 1995). El mejoramiento genético convencional del banano y el plátano es largo y dispendioso. Uno de los fenómenos que se presentan frecuentemente en las plantas regeneradoras a partir de células o tejidos cultivados in vitro, es la variación somaclonal, es decir, que las plantas que se obtienen pueden presentar características fenotípicas diferentes a las de las plantas original donante del explante. El incremento de variabilidad por la variación somaclonal, es precisamente, uno de los problemas de estudio en plátanos y bananos micropropagados a partir de cultivos de meristemos. 69 4. MATERIALES Y MÉTODOS Esta investigación se realizó en el laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Francisco de Paula Santander, ubicado en los Campos Eliseos, vía al municipio de Los Patios, Norte de Santander. Para la recolección de información, se realizaron evaluaciones cualitativas y cuantitativas. Desde el punto de vista cuantitativo, se tuvieron en cuenta el coeficiente de multiplicación, altura de plantas y el desarrollo de raíces y hojas. Cualitativamente, se evaluó el grado de fenolización y conformación de la planta. Las evaluaciones se realizaron semanalmente en los cuartos de crecimiento, con control de luz y temperatura, mediante tablas confeccionadas donde se relacionaron los parámetros mencionados anteriormente. Una vez obtenidos los datos cuantitativos, se compilaron en el programa estadístico denominado STATLE, donde primero, se hizo el análisis de varianza para determinar si existían o no diferencias significativas entre las variables evaluadas para las tres siembras. Posteriormente, se utilizaron las tablas de medias con intervalos de error estándar, para determinar el número promedio de las variables evaluadas y el error estándar. Finalmente, si existían diferencias significativas, se comprobaron mediante Pruebas de comparación múltiple por el método de Duncan, el cual tiene un 95% de veracidad. 4.1 MATERIALES Los explantes utilizados para cada uno de los tratamientos, se obtuvieron a partir de colinos de plátano hartón en sus primeras fases de desarrollo (ver figura 5) . El material de plátano fue recolectado en plantaciones localizadas en los municipios de Santiago y el Tarra, Norte de Santander (ver figura 16). El suministro de reactivos como hormonas, sales minerales, vitaminas, Phytagel, etc., y la disponibilidad de equipos (autoclaves, cámara de flujo laminar, etc.) estuvo apoyada por el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Francisco de Paula Santander. 70 Figura 16. Ubicación geográfica de las zonas seleccionadas para la recolección del material vegetal inicial Fuente: ECOMILENIO. El plan de gestión ambiental de Norte de Santander. Cúcuta: publicaciones publicar Ltda., 2000. p. 162 71 4.2 MÉTODOS Las fases que se trabajaron a nivel de laboratorio y de vivero, se dividieron según las etapas de la micropropagación. 4.2.1 Fase 0: Preparación de la planta madre. La selección de la planta donadora del explante, se realizó teniendo en cuenta sus condiciones fisiológicas, fitosanitarias y productivas, además, de contar con el criterio del agricultor, que posee experiencia en ésta labor de campo, para realizar la elección del clon correspondiente a propagar. Seleccionada la planta y, teniendo en cuenta el tamaño de los colinos, se realizó el deshije, es decir, la separación del retoño de la planta para después sembrarlo en germinadores durante 20 días bajo condiciones ambientales con temperatura promedio de 30ºC y luz solar (60% con polisombra), con el fin de reducir la contaminación durante el establecimiento del cultivo. Seguido a esto, se realizó una limpieza preliminar, donde se extraen las plantas del sustrato y se eliminan las raíces; con abundante agua, se lava la base del cormo para eliminar residuos de suelo. Luego, se realizaron cortes longitudinales y transversales en cormo y pseudotallo hasta obtener un tamaño final de 5 cm., como se observa en la Figura 17. Se sumerge el material en una solución de detergente con hipoclorito de sodio al 2% para retirar los residuos de grasa. Enjuagar con abundante agua e introducirlos en una solución de agua con cisteína para evitar la fenolización de los explantes y ser transferidos al área estéril (ver figura 17) Figura 17. Tamaño final del explante en la fase preparativa (tamaño: 5 cm) Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 72 4.2.2 Fase I: Establecimiento. En condiciones de asepsia, los explantes se suspendieron en una solución de etanol al 70%, durante 10 minutos, en agitación constante. Se realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril con cisteína; luego se introdujeron en una solución de hipoclorito de sodio al 5% durante dos períodos de tiempo de desinfección: 10 y 15 minutos con el fin de comparar y determinar cuál permite la disminución de contaminantes en el explante, sin afectar la respuesta de crecimiento (ver figura 18) Figura 18. Desinfección de explante con hipoclorito de sodio al 5% Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Posterior al proceso de desinfección en la cámara de flujo laminar, se hicieron cortes longitudinales y transversales al explante hasta obtener un tamaño final de 1 cm., para inocular en los medios de cultivo formulados (ver figuras 19 y 20). Figura 19. Cortes transversales y longitudinales a los explantes en cámara de flujo laminar (1 cm) para la inoculación en el medio de cultivo Figura 20. Tamaño final del explante Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 73 Cuadro 3. Formulación de los medios de cultivo para cada fase de la micropropagación . Fase Medio / tiempo de desinfección Composición del medio 1 A 4 mg/L 6-BAP 1 B 4 mg/L 6-BAP 2 A 4 mg/L 6-BAP + 1,5 mg/L AIA Establecimiento 2 B 4 mg/L 6-BAP + 1,5 mg/L AIA 3 5 mg/L 6-BAP Multiplicación 4 3 mg/L KIN + 0,5 mg/L AIA Enraizamiento 5 1,5 mg/L AIA 6 1,5 mg/L AIB 7 Sin Hormonas Aclimatación 8 Abono 9 Abono- Escoria * A 10 minutos de exposición al hipoclorito de sodio B 15 minutos de exposición al hipoclorito de sodio Todos los medios enriquecido con MS 100% Agentes antioxidantes utilizados: L-Cisteína 100 mg/L y Ácido Ascórbico 100 mg/L Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Durante ésta fase se trabajaron los medios 1 y 2 (ver cuadro 3) que variaron tanto en la concentración hormonal, como en su estado físico; es decir, se utilizaron alternadamente, medio líquido y sólido (ver figura 21) 74 figura 21. Medio líquido para el establecimiento de explantes Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Los explantes que fueron ubicados en cuarto de crecimiento, se evaluaron cada 8 días durante 1 mes, teniendo en cuenta los siguientes parámetros: contaminación (endógena y exógena), fenolización, altura, número de hojas y color del explante. 4.2.3. Fase II: Multiplicación. Los explantes que lograron sobrevivir, en la fase de establecimiento, fueron pasados a un medio de cultivo de multiplicación, donde se les realizó un corte longitudinal para romper la dominancia apical. Los brotes obtenidos se subcultivaron en un nuevo medio de multiplicación, mediante cortes realizados con bisturí, este procedimiento se realizó cada mes hasta el quinto subcultivo. En esta fase se trabajó con dos medios de cultivo (ver cuadro 3) en estado físico sólido. Así mismo se utilizaron dos antioxidantes: ácido ascórbico y L-Cisteína (ver figura 22). Figura 22. Vitroplanta con brotes Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Durante esta fase se evaluaron los explantes cada ocho días durante 1 mes, teniendo en 75 cuenta: contaminación (endógena y exógena), fenolización, número de brotes, número de malformaciones, número de raíces y número de hojas. 4.2.4 Fase III: Enraizamiento. Los brotes obtenidos en la fase de multiplicación fueron transferidos a un medio nutritivo (ver cuadro 3) en estado físico líquido (ver figuras 23– 24 y 25) Figura 23. Medio de cultivo 5 Figura 24 Medio de cultivo 6 Figura 25 Medio de cultivo 6 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Los explantes se evaluaron cada ocho días durante un mes, teniendo encuenta: contaminación (endógena o exógena), número de hojas, altura, número de raíces y longitud de la raíz principal. Los parámetros que se controlaron para la incubación de los explantes en el cuarto de crecimiento fueron: Fotoperíodo: 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Temperatura: 28 – 32ºC ± 2 Periodo de mantenimiento: 1 mes 4.2.5. Fase IV: aclimatación. Lograda la formación de raíces durante la tercera fase, los recipientes son destapados durante tres días antes de transferirlos al sustrato con el fin adaptar progresivamente las plantas a las condiciones del ambiente (ver figura 26); luego se lavaron bien las raíces con el fin de eliminar los residuos de phytagel o medio de cultivo que puede afectar las raíces. 76 Figura 26. Explantes aclimatados gradualmente antes de siembra en el sustrato Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Finalmente son transplantados en dos tipos de sustratos desinfectados con agua caliente, no necesariamente estériles, donde se utilizó abono al 100% y escoria con abono en una relación de 1:1 (ver figura 27). Figura 27. Sustratos utilizados en la aclimatación de las plantas: escoria y abono Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 4.2.6. Metodo de diagnostico utilizado para detección de cmv en plantas de platano harton. Anexo al trabajo de la estandarización del proceso de micropropación de plátano hartón, se realizó la prueba serológica ELISA por ser una prueba de gran sensibilidad para identificar virus en plantas. La metodología empleada en esta técnica fue la siguiente: Extracción de la muestra. De las plantas aclimatadas se tomó un total de 45 muestras de hoja con un peso de 0.1gr. y se colocó en el interior de una bolsa plástica previamente marcada. Maceración de la muestra. Se colocó la bolsa en una superficie lisa y estable donde se maceró ejerciendo una presión moderada sobre la bolsa hasta que se consiguió una suspensión fina. 77 Adición del buffer de extracción. Posterior a la maceración se adicionó el buffer con el fin de extraer el virus de la savia si éste se encontraba presente. Sensibilización de la placa. Consistió en adicionar el anticuerpo específico del virus en los pozos de la placa de microtitulación para que se adhirieran a las paredes de ésta. Posterior a un periodo de 4 horas se realizaron varios enjuagues con una solución de lavado previamente preparada. Adición de la muestra. Con la ayuda de la micropipeta se adicionó 100 µL del extracto formado por la solución del buffer de extracción y el macerado de la muestra a cada pozo de la placa por duplicado. Incubación de la placa. Se incubaron las placas en cámara húmeda durante toda la noche a 4 ºC. Lavado de la placa. Se hicieron enjuagues a la placa con el buffer de lavado. Adición del conjugado enzimático. Se preparó el buffer ECI y se mezcló con los anticuerpos A y B, adicionando 100 µL a los pozos de la placa (ver figura 28). Posteriormente se incubó en cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente. Adición del sustrato. Finalmente, se adicionó 100 µL de la solución PNP a los pozos de la placa microtitulada y se incubó 30 minutos en cámara húmeda. Lectura de resultados. Se hizo una lectura visual, donde se registró como positivo el cambio de color o, negativo, si no hubo cambios Figura 28. Adición del conjugado enzimático Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 78 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Siguiendo las etapas de la micropropagación y de acuerdo a la metodología empleada, se presentará en este capítulo el análisis de los resultados estadísticos obtenidos durante el proceso. 5.1 FASE DE ESTABLECIMIENTO En la fase de establecimiento se busca obtener cultivos axénicos y vigorosos para iniciar la multiplicación, por lo cual, se evaluaron niveles de contaminación endógena, grado predominante de contaminación exógena, promedios de altura, porcentaje de fenolización y características fisiológicas predominantes cuando se emplean medios de cultivo líquidos o sólidos para el crecimiento del explante. Para el control de contaminación endógena, se consideraron dos tiempos de desinfección: 10 minutos (A) y 15 minutos (B) con Hipoclorito de Sodio al 5% observándose diferencias en los tiempos utilizados, (ver cuadro 4). Cuadro 4. Comparación de los porcentajes de contaminación endógena para las tres siembras. CONTAMINACIÓN ENDOGENA (%) MEDIO – TIEMPO DE DESINFECCIÓN PRIMERA SIEMBRA SEGUNDA SIEMBRA TERCERA SIEMBRA 1 A 6,67 6,66 0 1 B 0 13,33 0 2 A 40 0 0 2 B 0 6,67 0 Fuente: Figura 29. Comparación de los porcentajes de contaminación endógena para la primera, segunda y tercera siembra. 0 10 20 30 40 50 1 2 3 1A 1B 2A 2B Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Analizando lo anterior, se puede apreciar que ambos tiempos de desinfección muestra bajos 79 porcentajes de contaminación endógena. Teniendo en cuenta la interacción entre los tiempos de desinfección y el crecimiento de los explantes, el tiempo mas favorable para el desarrollo de éstos durante esta fase fue el tiempo A, que corresponde a 10 minutos, por lo que a menor tiempo de exposición al agente desinfectante, hay menor daño del tejido vegetal y por lo tanto, mayor desarrollo. Sin embargo, el tiempo de mayor exposición B, controla la presencia de agentes contaminantes en el explante, pero afecta su desarrollo por ocasionar daños directos en el tejido vegetal y limitar su crecimiento (ver cuadros 5, 6 y 7) Bonga (1981), comprobó que era difícil obtener una desinfección superficial que simultáneamente no dañara el tejido vegetal y Pierik (1990), ha planteado que la contaminación irá disminuyendo a medida que aumente el tiempo de desinfección, pero señala que este no debe sobrepasar un valor crítico por encima del cual se provocará la muerte de los explantes. Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, se comprueba los resultados obtenidos en este trabajo durante la desinfección de las yemas de plátano hartón, donde a mayor tiempo de desinfección, mayor afectación del tejido vegetal y por tanto, menor desarrollo y crecimiento. La contaminación exógena se manifestó en esta fase con un porcentaje promedio de 15,55 que se considera bajo, debido a las condiciones ambientales y de manejo dentro del laboratorio, ya que en éste se realizan actividades académicas con un alto número de estudiantes y no se maneja una rutina adecuada de desinfección. Durante el desarrollo de la fase de establecimiento se hicieron algunos aislamientos para los recipientes que presentaron contaminación, donde se encontró que los principales microorganismos contaminantes fueron de tipo fúngico introducidos al laboratorio por el hombre, los cuales permanecen en el ambiente por condiciones de manejo inadecuados. Teniendo en cuenta los medios de cultivo para el crecimiento de los explantes en cuanto a la altura, el resultado en el análisis estadístico mostró que no existen diferencias significativas entre ellos, por lo cual ambos medios pueden ser utilizados en esta fase (ver cuadro 5 y 6). Comparando los medios de cultivo para esta fase, se encontró que el balance de los reguladores de crecimiento utilizados en el medio 2 presentó un mejor resultado que el medio 1 (ver figura 30 y 31), donde se utilizaron citoquininas como único regulador de crecimiento, mientras que el medio 2, contiene una alta concentración de citoquininas y baja concentración de auxinas, favoreciendo la formación de hojas y elongación del pseudotallo, lo que afirma Vitorelly (1989) al decir que algunos aspectos de diferenciación celular y organogénesis en tejidos y cultivos de órganos son controlados por la interacción entre las concentraciones de auxinas y citoquininas. 80 Cuadro 5. Variables evaluadas para la primera siembra en medio líquido. FENOLIZACIÓN (%) CRECIMIENTO MEDIO C O N T A M I N A C I Ó N E N D Ó G E N A ( % ) 0 I II III A L T U R A ( c m ) # H O J A S OBSERVACIONE S 1 A 6,67 6.66 66.6 7 6.66 20.0 2.453 a 0 1 B 0 33.33 26.6 7 40.0 0 1.920 ab 0.26 2 A 40 0 46.6 7 20.0 33.33 3.893 a 1.066 2 B 0 0 80.0 6.66 13.33 2.240 ab 0.13 Los explantes mostraron una rápida respuesta en cuanto a crecimiento longitudinal. Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Letras distintas muestran diferencias significativas. % de Contaminación exógena: 3334 % Error estándar: 0.408 Cuadro 6. Variables evaluadas para la segunda siembra en medio sólido. FENOLIZACIÓN (%) CRECIMIENTO MEDIO C O N T A M I N A C I Ó N E N D Ó G E N A ( % ) 0 I II III ALTUR A (cm) # HOJAS OBSERVACIONES 1 A 6.66 0 46.67 53.33 0 2.073 a 0 1 B 13.33 0 26.67 53.33 20 1.846 ab 0.13 2 A 0 0 46.67 53.33 0 2.380 a 0 2 B 6.67 0 33.33 46.67 13.33 2.126 ab 0.36 Los explantes presentaron grosor en la parte basal y poco crecimiento longitudinal. Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Letras distintas muestran diferencias significativas. % de Contaminación exógena: 6.667 Error estándar: 0.108 81 Cuadro 7 Variables evaluadas para la tercera siembra en medio líquido. FENOLIZACIÓN (%) CRECIMIENTO MEDIO C O N T A M I N A C I Ó N E N D Ó G E N A ( % ) 0 I II III ALTUR A (cm) No HOJAS OBSERVACIONES 1 A 0 6.66 93.33 0 0 1.42 ab 0 1 B 0 0 93.33 46.66 0 1.88 a 0 2 A 0 0 53.33 16.66 0 1.65 ab 0 2 B 0 13.33 86.66 0 0 1.37 a 0.26 Los explantes fueron doblemente desinfectados por presentar contaminación y carencia de material vegetal. SEGUNDA SIEMBRA 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1A 1B 2A 2B ALTURA # HOJAS PRIMERA SIEMBRA 0 1 2 3 4 5 1A 1B 2A 2B ALTURA HOJAS Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Letras distintas muestran diferencias significativas. % de Contaminación exógena: 6.667 Error estándar: 0.127 Figura 30. Crecimiento promedio de los explantes para la primera siembra. Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Figura 31. Crecimiento promedio de los explantes para la segunda siembra. Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 82 De igual manera, esa interacción que favorece el desarrollo del explante, se ve afectada con el tiempo de desinfección del mismo. Esta afirmación la observamos en los resultados de la primera y segunda siembra correspondientes al medio 2, donde los explantes muestran una mejor respuesta fisiológica, indicándonos que la interacción del balance de auxinas y citoquininas con el tiempo de desinfección A, permite obtener explantes vigorosos para pasar a la fase II ó multiplicación. El estado físico del medio es un factor muy importante en el desarrollo y crecimiento de los explantes en esta fase. En la primera y segunda siembra, se emplearon medio líquido y sólido respectivamente, mostrando mayor vigor los explantes de la primera siembra, confirmando las afirmaciones hechas por Pierik (1990) acerca del crecimiento y desarrollo de los explantes en medio líquido donde la absorción de nutrientes, reguladores, entre otros, se facilita por toda la superficie basal, mientras que en el sólido sólo existe un contacto con el medio en una parte de ésta, reflejándose lo anterior en las alturas promedias de las dos siembras. En el caso de la tercera siembra que se realizó en medio líquido, todos los promedios de altura fueron inferiores. Este comportamiento contradictorio lo observamos en el cuadro 7 que nos confirma aún más la interacción del tiempo de desinfección del explante con el desarrollo del mismo. Por la poca disponibilidad de material vegetal para realizar introducciones, alto grado de contaminación y la dificultad de diferenciar los dos tipos de contaminación endógena y exógena, por ser medio líquido, se decidió hacer una desinfección adicional a los explantes que mostraron contaminación, lo que disminuyó notablemente el grado de contaminación, pero afectó el desarrollo de los explantes, al causar daño físico en los tejidos y limitar su crecimiento. (ver gráfica 4). Figura 32. Crecimiento promedio de los explantes para la tercera siembra. TERCERA SIEMBRA 0 0,5 1 1,5 2 1A 1B 2A 2B ALTURA # HOJAS Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Uno de los principales problemas durante el establecimiento de yemas de plátano hartón, son las oxidaciones fenólicas que afectan la supervivencia de los explantes, las cuales se 83 manifiestan con un oscurecimiento del medio de cultivo, que comienza por la zona cercana al explante y puede extenderse a todo el medio, produciendo la muerte del explante. Al analizar los grados de fenolización presentes, de acuerdo al cuadro 8, se logró observar que no hay diferencias en los medios de cultivo para las tres siembras , por lo que se puede deducir que no es necesaria la adición de L-cisteína al medio de cultivo, sin embargo se encontró que prácticas como: el enjuague en soluciones antioxidantes, previo y posterior a la disección de los explantes y, eliminación del tejido necrótico sin realizar cortes profundos, controló la oxidación fenólica. Así mismo, se demostró que el empleo de medio líquido para la primera y tercera siembra como se muestra en las figura 33 y 34 se evidenció un alto porcentaje con grado de fenolización bajo (I), lo que confirma Jiménez (1990) al recomendar el medio líquido como una de las prácticas más comunes para contrarrestar el efecto de la oxidación fenólica. Cuadro 8. Porcentaje de fenolización para la primera, segunda y tercera siembra. FENOLIZACIÓN PRIMERA SIEMBRA SEGUNDA SIEMBRA TERCERA SIEMBRA MEDIO DE CULTIVO 0 I II III 0 I II III 0 I II III 1 A 6.66 66.67 6.66 20.0 0 46.67 53.33 0 6.66 93.33 0 0 1 B 33.33 26.67 40.0 0 0 26.67 53.33 20 0 93.33 46.66 0 2 A 0 46.67 20.0 33.33 0 46.67 53.33 0 0 53.33 16.66 0 2 B 0 80.0 6.66 13.33 0 33.33 46.67 13.33 13.33 86.66 0 0 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Figura 33. Grados de fenolización para la primera siembra. 0 20 40 60 80 1A 1B 2A 2B PRIMERA SIEMBRA 0 I II III Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 84 Figura 34. Grados de fenolización para la tercera siembra TERCERA SIEMBRA 0 20 40 60 80 100 1A 1B 2A 2B 0 I II III Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 En cuanto a la segunda siembra que se realizó en medio sólido, se observa de acuerdo a la figura 35, los explantes presentaron un mayor porcentaje de fenolización en el grado II, lo que indica con respecto al medio líquido que hubo una difícil dilución de metabolitos tóxicos en el medio, especialmente las polifenoloxidasas, que son las causantes del proceso de oxidación. Figura 35. Grados de fenolización para la segunda siembra SEGUNDA SIEMBRA 0 10 20 30 40 50 60 1A 1B 2A 2B 0 I II III Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Por todo lo anterior, el mejor medio para obtener explantes viables en esta fase fue el 2 en estado liquido, por ser el más económico y el que mejor respuesta produce en los explantes, con un tiempo de desinfección inicial de 10 minutos, con Hipoclorito de Sodio al 5%. 5.2 FASE DE MULTIPLICACIÓN La fase II o Multiplicación, busca fundamentalmente la obtención de un gran número posible de brotes bien desarrollados a partir de los explantes ya establecidos en la fase I; por lo tanto, se evaluó el número promedio de brotes, número de hojas y número de raíces en los dos medios de cultivo para la primera, segunda y tercera siembra, con el fin de 85 determinar el mejor crecimiento y desarrollo de los explantes (ver cuadros 9, 10 y 11). Cuadro 9. Variables evaluadas para los medios 3 y 4 para la primera siembra. CRECIMIENTO SUBCULTIVO MEDIOS # EXPLANTES # BROTES # RAÍCES # HOJAS 3 15 2.20 a 0.06 a 1.53 a I 4 15 1.73 a 0.73 a 2.6 a 3 15 6.73 a** 0.8 a 1.4 a II 4 15 1.93b 2.0 a 2.93 a 3 15 5.53 a 1.8 a 1.86 a III 4 15 4.53 a 2.53 a 3.06 a 3 15 5.4 a 5.2 a 7.4 a IV 4 15 5.46 a 6.8 a 7.06 a 3 15 6.13 a 8.866 b 14.93 a V 4 15 7.26 a 14.40 a 12.80 a Letras distintas muestran diferencia significativas Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Cuadro 10. Variables evaluadas para los medios 3 y 4 para la segunda siembra. CRECIMIENTO SUBCULTIVO MEDIOS # EXPLANTES # BROTES # RAÍCES # HOJAS 3 15 2.26 a 0.0 b 0.0 b I 4 15 3.4 a 0.333 a 0.733 a 3 15 3.66 a 1.266 b 1.666 b II 4 15 4.66 a 3.333 a 4.400 a 3 15 4.4 a 1.466 b 1.466 b III 4 15 5.93 a 10.933 a 10.933 a 3 15 4.46 a 0.466 b 3.600 b IV 4 15 7.53 a 11.466 a 10.733 a 3 15 5.6 a 0.866 b 4.400 a V 4 15 7.0 a 5.400 a 5.333 a Letras distintas muestran diferencia significativas Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 86 Cuadro 11. Variables evaluadas para los medios 3 y 4 para la tercera siembra. SUBCULTIVO MEDIOS # EXPLANTES # BROTES # RAÍCES # HOJAS 3 15 3.06 a 0,00 a 0.20 b I 4 15 2.93 a 0.866 a 2.53 a 3 15 4.33 a 0.13 b 0.86 b II 4 15 3.86 a 4.53 a 5.93 a 3 15 7.86 a* 1.466 b 6.33 b III 4 15 4.06 b 10.933 a 11.2 a 3 15 4.80 b 2.06 b 8.13 a IV 4 15 7.26 a* 9.93 a 9.53 a 3 15 6.66 a 1.13 b 4.8 a V 4 15 6.06 a 8.73 a 5.4 a Letras distintas muestran diferencia significativas Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 En esta etapa del proceso, se utilizaron dos medios de cultivo, 3 y 4, suplementados con diferentes reguladores de crecimiento, donde se estableció, que las tasas de multiplicación obtenidas con 6-BAP del medio 3, difieren de manera significativa con las obtenidas en medio 4 al utilizar conjuntamente AIA y Kinetina (ver cuadro 12). Cuadro 12. Numero promedio de brotes para la primera, segunda y tercera siembra. NUMERO DE BROTES SUBCULTIVO MEDIOS PRIMERA SIEMBRA SEGUNDA SIEMBRA TERCERA SIEMBRA 3 2.20 a 2.26 a 3.06 a I 4 1.73 a 3.4 a 2.93 a 3 6.73 a** 3.66 a 4.33 a II 4 1.93 b 4.66 a 3.86 a 3 5.53 a 4.4 a 7.86 a* III 4 4.53 a 5.93 a 4.06 b 3 5.4 a 4.46 a 4.80 b IV 4 5.46 a 7.53 a 7.26 a* 3 6.13 a 5.6 a 6.66 a V 4 7.26 a 7.0 a 6.06 a Letras distintas muestran diferencia significativas Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 87 En el medio 3 durante la primera siembra, se obtuvo un coeficiente de multiplicación de 2,07 brotes por explante establecidos, mostrando una respuesta rápida en cuanto al establecimiento en el medio y formación de brotes, favorecido por la vigorosidad de los explantes que provenían del medio líquido correspondiente a la fase I como se observa en la figura 36. Así mismo, la concentración hormonal con 6 – BAP, permitió la formación de multibrotes (closter), es decir, un conjunto de yemas no diferenciadas con la capacidad de originar plantas; este factor implicó realizar cortes que permitieran separar por grupos las yemas formadas. Figura 36. Número promedio de brotes para los medios 3 y 4 de la primera siembra. 0 2 4 6 8 1 2 3 4 5 # DE SUBCULTIVOS # D E B R O T E S MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 En la segunda siembra, de igual manera, el medio de cultivo que mejor resultado mostró fue el 3, con un coeficiente de multiplicación de 2 brotes por explantes establecidos; hecho que se le atribuyó a los explantes que provenían de medios sólidos en la fase I, viéndose reflejado la influencia del estado físico del medio para el posterior desarrollo del explante en esa fase del esquema, como se observa en el cuadro12 y en la figura 37. Figura 37. Número promedio de brotes para los medios 3 y 4 para la segunda siembra. 0 2 4 6 8 1 2 3 4 5 # DE SUBCULTIVOS # D E B R O T E S MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 88 En la tercera siembra, se observó un menor coeficiente de multiplicación con respecto a la primera y segunda siembra, debido a que el material utilizado para esta fase fue rescatado en la fase de establecimiento. Se obtuvo un coeficiente de 1,95 brotes por explantes establecidos, sin embargo las diferencias no son significativas como se observa en el cuadro 12 y figura 38., si tenemos en cuenta el doble proceso de desinfección aplicado a algunos explantes en la anterior fase que afectaron el crecimiento y desarrollo. Figura 38. Número promedio de brotes para los medios 3 y 4 para la tercera siembra. 0 2 4 6 8 10 1 2 3 4 5 # DE SUBCULTIVOS # D E B R O T E S MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Los resultados obtenidos para esta fase, son confirmados con el trabajo realizado por Leyva (1994), donde el mayor coeficiente de multiplicación lo obtuvo utilizando 6-BAP como único regulador de crecimiento; así mismo se comprueba el medio formulado por Krikorian y Cronaver (1984), donde se utiliza 5 mg /L de 6-BAP para la proliferación de brotes en musáceas. Según Novak (1989), la diferenciación celular y la morfogénesis in vitro están controladas por una interacción entre las concentraciones de auxinas y citoquininas, manifestándose lo anterior en los explantes cultivados en el medio 4, donde los resultados analizados estadísticamente mostraron una mejor respuesta fisiológica en cuanto a formación de hojas, raíces, vigorosidad y brotes; sin embargo, en este tratamiento, la presencia conjunta de Kinetina y AIA en el medio de cultivo, favoreció el efecto organogénico tanto para la caulogénesis como para la rizogénesis; aunque hubo formación de brotes, los explantes mostraron un bajo número de éstos con respecto al medio 3, donde el coeficiente promedio para las tres siembras fue de 1,77 brotes por explantes establecidos. Así mismo, se comprueban estos resultados con las afirmaciones hechas por George and Sherringtong (1984), donde las interacciones entre auxinas y citoquininas en cultivos de tejidos vegetales con frecuencia son complejas y requieren más de una combinación entre ellas para lograr un óptimo resultado. Cabe resaltar que durante el proceso de la multiplicación para obtener los brotes se presentaron malformaciones que proliferaron en su gran mayoría en el medio de cultivo 3, 89 esto se le atribuye al efecto que realiza el 6 – BAP en altas concentraciones (5 mg/L), así como la producción de citoquininas endógenas de los explantes. Tal efecto fue demostrado en varias especies por Evans y Bravo (1985). En cuanto al número de raíces, se observaron diferencias entre los medios 3 y 4 para las tres siembras como se puede apreciar en las figuras 39, 40 y 41, que confirma lo planteado anteriormente por Novak (1989), con los resultados obtenidos en este trabajo, donde el medio 4 favoreció notablemente la formación de raíces, el cual fue inducido por la interacción auxina – citoquinina. Figura 39. Número promedio de raíces para la primera siembra. PRIMERA SIEMBRA 0 5 10 15 20 1 2 3 4 5 # SUBCULTIVOS MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Figura 40. Número promedio de raíces para la segunda siembra. SEGUNDA SIEMBRA 0.00 5.00 10.00 15.00 1 2 3 4 5 # SUBCULTIVOS MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 90 Figura 41. Número promedio de raíces para la tercera siembra. TERCERA SIEMBRA 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 1 2 3 4 5 #SUBCULTIVOS MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Así mismo, el número de hojas como se muestra en las figuras 42, 43 y 44 presentaron diferencias entre los dos medios utilizados en esta fase, donde el medio 4 permitió una buena conformación de la planta. Figura 42. Numero promedio de hojas para los medios 3 y 4 de la primera siembra. PRIMERA SIEMBRA 0 5 10 15 20 1 2 3 4 5 # SUBCULTIVOS MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 Figura 43. Número promedio de hojas para los medios 3 y 4 de la segunda siembra. SEGUNDA SIEMBRA 0,00 5,00 10,00 15,00 1 2 3 4 5 # SUBCULTIVOS MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 91 Figura 44. Número de hojas para los medios 3 y 4 de la tercera siembra. TERCERA SIEMBRA 0 5 10 15 1 2 3 4 5 # SUBCULTIVOS MEDIO 3 MEDIO 4 Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 La contaminación es otro factor importante que se debe tener en cuenta, debido a que éste se ha convertido en uno de los principales problemas que afecta el desarrollo de un esquema de micropropagación de plantas, por limitar su productividad al ocasionar pérdidas de materiales potenciales dentro del laboratorio. El principal problema de contaminación presentado fue de tipo exógeno con un porcentaje promedio de 16,64 % para las tres siembras, teniendo como principales fuentes de contaminación el hombre y el ambiente debido a la cultura inapropiada existente por parte del estudiantado al realizar actividades académicas y al no existir una rutina de desinfección adecuada y diaria para el laboratorio. Sin embargo, los porcentajes analizados cuantitativamente reportan bajo grado de contaminación exógena, porque las prácticas de desinfección realizadas antes y después de cada siembra en los cuartos de siembra y de crecimiento fueron periódicos durante el proceso de la propagación. Así mismo, no se presentó contaminación endógena, lo que ratifica que el procedimiento de desinfección efectuado en la fase de establecimiento logró eliminar los agentes contaminantes de tipo endógeno que se asociaban a los explantes. Al analizar los grados de fenolización presentes en cada siembra, se observó que no hay diferencias entre los medios de cultivo al utilizar Ácido Ascórbico o L-cisteína como antioxidantes, aunque es recomendado utilizar antioxidantes en el medio de cultivo, para esta fase se puede utilizar cualquiera de los dos para controlar la fenolización, realizando siempre enjuagues cada vez que se hagan cortes al separar los brotes De acuerdo a los resultados obtenidos y planteados anteriormente se deduce que el mejor medio para cumplir el propósito de esta fase es el medio 4, ya que presentó un mejor desarrollo y conformación de las plantas, aunque el coeficiente de multiplicación fue bajo con respecto al medio 3, en éste se presentó un número bajo de malformaciones debido a la interacción y balance hormonal utilizado para tal medio. 5.3 FASE DE ENRAIZAMIENTO Es una fase preparativa para el posterior enraizamiento ex vitro, la cual pretende obtener plantas individuales que puedan sobrevivir durante la aclimatación, por lo tanto es necesario inducir la formación de raíces y elongación de los explantes provenientes de la 92 fase de multiplicación, por ello, se evaluó la longitud de la raíz, el número de raíces y número de hojas para determinar el medio de cultivo favorable para la planta formada en esta fase. Durante esta fase, se presentaron diferencias entre los medios 5, 6 y 7 como se puede observar en la cuadro 13 y en la figura 15, donde el número de raíces y longitud de la raíz varía de acuerdo a las interacciones y/o ausencia de auxinas inductoras de la rizogénesis. Sin embargo al cabo de 20 días, los explantes mostraron un mejor resultado en el medio 7 que contenía MS al 100% sin hormonas, mientras que los medios 5 y 6, suplementados con auxinas AIA y AIB respectivamente, permitieron la formación de un mayor número de hojas, elongación de los explantes y un bajo número de raíces. Por lo anterior, se deduce que los niveles hormonales que favorece la caulogénesis, disminuyen la rizogénesis, como lo establecen Vásquez y Torres (1995) donde las raíces son mas sensibles a las concentraciones de auxinas que las yemas y los tallos. Cuadro 13. Variables evaluadas para la primera, segunda y tercera siembra No. DE SIEMBRA MEDIOS # EXPLANTES LONGITUD – RAIZ (cm) # HOJAS # RAIZ ALTUR A (cm) 5 15 12.486 a 3.400 b 4.133 a 6.973 6 15 13.253 a 4.266 a 3.466 a 7.453 1 7 15 14.315 a 3.266 c 4.200 a 6.960 5 15 10.4 c 5.0 a 2.5 a 5.9 6 15 10.7 b 4.6 a 2.3 a 6.3 2 7 15 14.8 a 4.7 a 2.3 a 5.1 5 15 9.2 a 2.6 a 3.0 a 4.4 6 15 12.1 a 2.7 a 3.2 a 4.7 3 7 15 12.4 a 2.4 a 4 a 6.0 Letras distintas difieren significativamente. Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 93 Figura 45. Comparación de variables evaluadas para las tres siembras en la fase de enraizamiento. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 LONGITUD DE RAIZ # HOJAS # RAICES ALTURA 5 6 7 5 6 7 5 2a. siembra 6 7 1a. siembra 3a. siembra Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 En cuanto al estado físico del medio de cultivo utilizado en esta fase fue el líquido, que permitió una mayor absorción de nutrientes y una mejor difusión de los residuos tóxicos fundamentalmente los fenoles que son abundantes durante esta fase. Por lo anterior, las plantas presentaron un rápida respuesta en cuanto a la formación de raíces y altura, lo cual se demuestra con el trabajo realizado por Jiménez (1995) donde las vitroplantas en medio de enraizamiento líquido fueron superiores significativamente a las subcultivadas en medios semisólidos en altura, número y longitud de las raíces. Durante la fase de enraizamiento no se presentó contaminación endógena ni exógena, por lo que se logró controlar los agentes contaminantes con prácticas periódicas de desinfección con sustancias químicas como alcohol al 70% e hipoclorito de sodio al 1%. Por lo anterior y de acuerdo al análisis que muestra la Figura 45, se seleccionó el medio 7 como el más favorable para la formación de raíces, como lo comprobaron Drew y Smith (1990) en bananos y Sandoval y colaboradores (1991) en clones con genoma AAA, AAB y ABB al no utilizar concentraciones hormonales en los medios de cultivo, ya que la producción endógena de hormonas inducen a la formación de raíces. Además el medio líquido sin reguladores hormonales es más económico para el desarrollo de un esquema de propagación, por reducir los costos de producción. 5.4. FASE DE ACLIMATACIÓN La aclimatación o endurecimiento de las plantas es una fase determinante del proceso de la micropropagación, ya que el número de plantas sobrevivientes dependerá en gran medida del manejo y las condiciones ambientales controladas. Durante el desarrollo y aclimatación de las plantas se evaluó la altura y número de hojas con el fin de determinar el mejor sustrato para cumplir el objetivo de esta fase como se observa en el cuadro 14. 94 Cuadro 14. Variables evaluadas durante la fase de aclimatación. NUMERO DE SIEMBRA SUSTRATO # HOJAS ALTURA (cm) ABONO 3.33 a 11.47 a 1 ABONO - ESCORIA 2.60 a 8.11 a ABONO 3.46 a 7.11 a 2 ABONO - ESCORIA 2.93 a 5.42 a ABONO 1.93 a 4.0 a 3 ABONO - ESCORIA 2.06 a 2.8 a Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 En cuanto al manejo del material vegetal no fue el más adecuado, ya que no se contó con una infraestructura propia para la aclimatación, donde se controlaran los factores físicos como la temperatura, la luz y la humedad relativa presentando un 39,1 % de sobrevivencia y un 60,9% de mortalidad, por esta razón se hace necesario contar con un invernadero que permita proteger y regular la adaptación del material vegetal proveniente del laboratorio a la condiciones ambientales, ya que las plantas desarrolladas in vitro se encuentran en un estado débil con hojas finas y estomas poco funcionales, que necesitan una adaptación gradual para su buen desarrollo en el campo. Figura 46. Comparación de los sustratos utilizados (abono y abono –escoria). 0 2 4 6 8 10 12 14 # HOJAS ALTURA A AE A A AE AE 1a. siembra 2a. siembra 3a. siembra Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 95 Teniendo en cuenta las variables evaluadas de acuerdo al cuadro 14, no se encontraron diferencias significativas entre los sustratos utilizados, sin embargo el mejor resultado de altura y número de hojas lo presentó el sustrato con abono, por ser un sustrato enriquecido con nutrientes esenciales para la planta como Nitrógeno, Fósforo, Potasio, Calcio, Magnesio, Hierro, Cobre, Zinc y Molibdeno, lográndose una mejor adaptación de las plantas en 45 días. El riego es importante durante esta fase para el mantenimiento de las plantas, por lo que es necesario la adición de agua por aspersión en las hojas para poder controlar la humedad relativa de las plantas establecidas en suelo sin que se deshidraten y mueran rápidamente, ya que éstas por las condiciones “in vitro” de donde provenía, presentaban una alta humedad relativa, donde se tuvo que controlar utilizando bolsas plásticas para semejar un microinvernadero por planta establecida. Así mismo, se debe mencionar la existencia de plantas desarrolladas mediante esta técnica adaptadas en campo, las cuales han mostrado un buen desarrollo, como se aprecia en la figura 47. Figura 47. Plantas aclimatadas a las condiciones naturales provenientes del laboratorio Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 5.5. DIAGNOSTICO SEROLÓGICO MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA. La base fundamental de la técnica de propagación in vitro de material vegetal es la obtención de plantas libres de agentes patógenos, por lo cual se hizo un diagnóstico mediante la técnica de inmunoabsorción ligada a una enzima (Enzyme – Linked Inmunosorbent Assay), ELISA, para determinar la presencia del virus del Mosaico del pepino – CMV en las plantas obtenidas durante el proceso. 96 Teniendo en cuenta las plantaciones de plátano hartón de donde se recolectó el material vegetal inicial para la micropropagación, ubicadas en los municipios de Santiago y El Tarra (departamento Norte de Santander), permitió conocer el estado sanitario de éstos. De las 54 muestras analizadas, 17 correspondían a plantas recolectadas en el municipio de El Tarra y las restantes al municipio de Santiago; mediante los resultados obtenidos, se encontró que la muestra 16 como se observa en cuadro 15, manifestó una coloración amarilla en el pozo correspondiente, indicando una respuesta positiva a la presencia de CMV, lo que comprueba lo informado por el ICA (Sanidad Vegetal – ICA), al recomendar la utilización del material del municipio de Santiago, debido a que este se mantiene en constante control fitosanitario y no presentan sintomatología de CMV en campo, mientras que en la zona de El Tarra no se han realizado diagnósticos fitosanitarios, debido a los problemas de orden público, que dificultan el acceso a dicho lugar. Cuadro 15. Distribución de las muestras de plantas diagnosticadas en la placa microtitulada. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2 2 8 8 16 16 30 30 40 40 B 3 3 9 9 18 18 32 32 41 40 C 4 4 10 10 23 23 33 33 42 42 D 4ª 4ª 11 11 24 24 35 35 43 43 E 5 5 12 12 25 25 36 36 44 44 F 6 6 13 13 26 26 37 37 45 45 G 7 7 14 14 27 27 38 38 testigo H 7a 7a 15 15 28 28 39 39 ( - ) (+) Fuente: ACOSTA y MONTAÑO, Cúcuta 2003 97 6. CONCLUSIONES Se estableció una metodología para la propagación vegetativa de plátano hartón (Musa AAB cv. Hartón) utilizando las técnicas de cultivo in vitro en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Francisco de Paula Santander. El tiempo de desinfección influyó notablemente en el desarrollo del explante, ya que a mayor tiempo de exposición al hipoclorito de sodio al 5%, se presentó un mayor daño en el tejido vegetal afectando su crecimiento. De acuerdo a lo anterior, se seleccionó el tiempo A, correspondiente a 10 minutos el cual controló la contaminación endógena sin afectar el desarrollo del explante, obteniendo cultivos axénicos y vigorosos. El medio de cultivo favorable para el establecimiento de los explantes fue el 2, con una concentración de 4 mg/L de 6-BAP y 1,5 mg/L de AIA, cuya interacción hormonal favoreció la organogénesis y por tanto, la obtención de explantes fisiológicamente aptos para la siguiente fase. El estado físico del medio que favoreció el buen desarrollo del explante durante la fase de establecimiento es el líquido, ya que éste permitió una absorción más rápida de los nutrientes y una mayor dilución de las sustancias tóxicas, como los fenoles. Además, es un medio económico y rentable en el proceso de la micropropagación, siendo ésta una alternativa para disminuir los costos de la producción de material in vitro. La mejor proliferación de yemas de plátano se logró en el medio 3, sin embargo el grado de malformaciones que se observó fue alto debido a la concentración de citoquinina utilizada (5 mg/L). Se evidenció que la interacción de Kinetina y AIA del medio 4, favoreció el efecto organogénico tanto para la formación de raíces como de hojas; contrario a esto, se observó una afectación en la formación de brotes, la cual mostró un bajo coeficiente de multiplicación. Se comprobó que los subcultivos III y IV presentaron una mayor formación de brotes para cada uno de los medios formulados (3 y 4) durante la fase de multiplicación, aunque se presentaron diferencias notables entre éstos. El medio de cultivo favorable para lograr la multiplicación u obtención de brotes y conformación organogénica completa de plantas, fue el medio 4, con una concentración de 4 mg/L de Kinetina y 1,5 mg/L de AIA. Se comprobó que, el uso de soluciones con agentes antioxidantes como la L-cisteína y el Ácido Ascórbico para realizar enjuagues, reducen el grado de fenolización en los explantes, 98 después de realizar escisiones para separar los brotes obtenidos. Así mismo la presencia de éstos en el medio redujo el grado de fenolización de los explantes, aunque las diferencias entre los medios formulados (3 y 4) no fueron heterogéneas. Se logró controlar la contaminación exógena en los medios de cultivo mediante el manejo y uso de agentes desinfectantes como Hipoclorito de sodio y Alcohol en los cuartos de siembra y de crecimiento. Durante la fase de enraizamiento se obtuvo un buen número de raíces en el medio de cultivo con MS al 100 % sin adicionar hormonas, por lo que las concentraciones endógenas de éstas en los explantes se autorregularon, favoreciendo la formación rizogénica y elongación del tallo. Aunque no se utilizaron agentes antioxidantes en los medios de cultivo de enraizamiento que se encontraban en un estado líquido, no se evidenció ningún tipo de oxidación o fenolización, debido a que el medio líquido permite disolver las sustancias fitotóxicas liberadas por los explantes después de realizar cortes superficiales. El período comprendido entre el enraizamiento y la aclimatación, determinó que es una fase donde se requieren mucho cuidado y buen manejo en la transferencia de las plantas al suelo bajo un proceso gradual de aclimatación a las condiciones ambientales. El sustrato en el que mayor desarrollo se presentó en las plantas durante la aclimatación, fue el abono al 100%, por lo que el crecimiento fue más rápido y vigoroso, así como la retención de la humedad de éste se mantuvo durante un tiempo más largo. Se observó un porcentaje de mortalidad alto de las plantas durante la fase de aclimatación, ya que no se contó con una infraestructura adecuada para el buen desarrollo de las plantas en estas fases. 99 7. RECOMENDACIONES Por la gran biodiversidad que presenta la región en sus diferentes pisos térmicos con especies de gran potencial productivo y de conservación de reservas naturales, se hace necesario impulsar grupos investigativos en la Universidad Francisco de Paula Santander, ya que cuenta con una infraestructura adecuada y personal capacitado para realizar trabajos de investigación en el área de la Biotecnología Vegetal con diferentes especies. El material inicial para realizar introducciones, se debe sembrar previamente en semilleros o viveros, con el fin de disminuir los niveles de contaminación del material vegetal en el laboratorio, así como el aumento en la tasa de multiplicación de las plántulas. Para controlar la contaminación exógena, se hace necesario establecer unas jornadas de desinfección de las áreas y equipos del Laboratorio, así como la rotación de agentes desinfectantes. Para el desarrollo de explantes vigorosos, recomendamos utilizar un medio de cultivo líquido, porque permite un mayor contacto de éste con la base del explante, una mayor absorción de nutrientes y una disolución de sustancias fitotóxicas. Es importante realizar un estudio para establecer un esquema de propagación masiva de materiales promisorios de plátano hartón, para cubrir los requerimientos de material vegetal de buena calidad sanitaria, convirtiéndose en una alternativa necesaria para los productores que proyecten establecer plantaciones con altos niveles de productividad y rentabilidad. Durante el proceso de la aclimatación, es importante tener en cuenta diferentes factores físicos como la luz, la temperatura, la humedad relativa entre otros, que deben ser controlados gradualmente bajo una infraestructura adecuada como el invernadero, que permita regular estos factores, brindándole a la planta las condiciones propicias para su buen desarrollo y adaptación al medio natural. Por esta razón se recomienda el montaje de un invernadero que complemente el proceso de la propagación del material vegetal, realizado en el laboratorio de Biotecnología Vegetal. En la fase de multiplicación, es importante realizar otros estudios donde se utilice una menor concentración de 6-BAP para la formación de brotes, ya que éste regulador de crecimiento a altas concentraciones (≥5mg/L) induce a las malformaciones, lo cual no es favorable en el proceso de micropropagación. Así mismo, realizar estudios para establecer la interacción de 6-BAP y AIA y ensayar diferentes concentraciones entre AIA y Kinetina. Para comprobar los resultados obtenidos de las muestras de plátano hartón de las zonas de El Tarra, se recomienda realizar un diagnóstico visual en campo de la enfermedad causada por el Virus del Mosaico del Pepino (CMV), con la asistencia técnica de personal capacitado para comprobar la presencia de CMV en esta zona del departamento. 100 BIBLIOGRAFÍA ANGARITA, A., PEREA, M. 1991. Micropropagación de plátano y bananos. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Cali: Roca, W., Mroginski, L,1991. p. 496 – 511. BELALCAZAR, Silvio. El cultivo del plátano en el trópico. Manual de asistencia técnica N°50 I.C.A.-INIBAB. Armenia: Feriva, 1998. p. 21-28, 125-127. CIENCIA Y VIDA. Salvar el plátano. v. 8. España: cultural. 1998. p. 92-96. CORPOICA., Plan de investigación y transferencia para aumentar la sostenibilidad y competitividad del plátano en Colombia. Colombia. [On line], julio 2001. web:<www.corpoica.org.co>. DIVISIÓN DE PLANEACION - URPA. Secretaría de Agricultura del Norte de Santander. 2.001 GARCIA GARIBAY, Mariano y QUINTERO RAMÍREZ, Rodolfo. Biotecnología alimentaria. México: Limusa, 2.000. p.70-75. GARCIA MORENO, Clarissa Mercedes y LEYVA ROJAS, Jorge Alonso. Propagación vegetativa In Vitro de plátano (Musa AAB) Clon Dominico Harton y Ginger (Alpinia speciosa) a partir de yemas caulinares. Universidad Libre de Colombia: Santafe de Bogotá, 1994. p. 103 GEORGE E.F. and SHERRINGTON, P.D. Plant propagation by tisuue culture. Handbook and Directory of Commercial Laboratory. U.K: Exegetics Limited Eversley, 1990. p. 307 – 330. GIRALDO CARDONA, Manuel José et al. Seminario Internacional sobre producción de Plátano, memorias. Universidad del Quindío: 2001. Web: http://www.uniquindio.edu.co/infoadmi/platano/memorias.htm GUZMÁN BARNEY, Mónica y BUITRAGO, Gustavo. Ñame: Producción de semillas por biotecnología. Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia – Santafe de Bogotá: UNIBIBLOS, 2000. p 215 HERNANDEZ SAMPIER, Roberto et al. Metodología de la Investigación. México: Mc Graw-Hill, 1991. p. 59 KRIKORIAN, A.D. 1982. Cloning higher plants from aseptically cultured tissues and cell. Biol. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Cali: Roca, W., Mroginski, L., 1991. p. 115 – 101 126. LOPEZ ZADA, Mateo. El plátano. Cuba: Puebla y educación, 1.998. p.55-67. MARTINEZ CANALEJO, A y SANTANA PORBEN, S. Manual de procedimiento bioestadístico. Bogotá: SCM, 1989 p. 113 –116 MEJIA AMAYA, Rubino y VITTORELLI, Cesar. Manual de laboratorio: Cultivo in vitro de planta de papa. Santiago de Chile: Instituto Nacional Agrícola y Agroindustrial,1988 p. 101. MENDEZ ALDAMA, Hernando et. al. Análisis de los sistemas agropecuarios del departamento Norte de Santander: Programa Regional Sistemas de Producción. Cúcuta: Corpoica, 1997. p. 11. MERCHAN VARGAS, Víctor Manuel. Prevención y manejo de la sigatoka negra. Manizales: ICA Seccional Caldas, 1.996. p.1-13. MONTERO ESCOBAR, Hugo. Manejo post-cosecha y comercialización del plátano (Musa spp. Grupo AAB). Armenia: FUDESCO, 2000. p.33-40. MONTOYA HENAO, Luz Marina. Cultivo de tejidos vegetales, Medellín: Ealón, 1991. p.7-11. NAGHI NAMAKFOROOSH, Mohammad. Metodología de la investigación. México: Limusa, 1993 p. 526. OLAYA OSPINA, Edgar et al. Ecomilenio: Plan de gestión ambiental de Norte de Santander, 1999 – 2007. Colombia: Publicaciones Cultural, 2000 p. 53 – 56. PALACIOS CARDENAS, Miguel Alberto. Monografía ilustradas de Norte de Santander. Cúcuta: Offset la Opinión, 2000 p. 117 – 294. PATIÑO, María Isabel. Los derechos de obtentor de nuevas variedades vegetales. Bogotá: Gustavo Ibáñez, 1998. p. 43. PEREZ PONCE J. N., et al. Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Cuba: Instituto de Biotecnología de las Plantas, 1.998. p.16-19. PIERIK, R.L.M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid: Mundi-Prensa, 1999. p. 325. RESTREPO JAIME, Isaza et al. Desarrollo tecnológico en biotecnología. Cooperación Universidad - Empresa: Universidad Católica de Oriente. Febrero, 2001. Web:www.icfes..gov.co/fomento/oriente.htm 102 ROCCA, William. Cultivo de tejidos en la agricultura. Cali: C.I.A.T, 1.987. p.495-509. RODRÍGUEZ Á., Jaime Moisés. Método de investigación pecuaria. España: Trillas, 1991. p. 38 – 54. ROMERO VERA, Olger David y GARCIA MADARIAGA, Nicolás. Marco legal en diagnóstico, actualización y reestructuración metodológica de las guías de laboratorio de fisiología vegetal enfocadas al plan de estudio de biología y química. Trabajo de grado (Licenciatura de Biología y Química). Universidad Francisco de Paula Santander. Facultad de Ciencias Básicas. San José de Cúcuta: 2000. SIMMONS, N.W. Los plátanos. Cuba: BLUME, 1973. p.12-26. TAMAYO y TAMAYO, Mario. El proyecto de investigación. Santafé de Bogotá: ICFES, 1998. p. 63. 103 Anexo A. Esquema de la micropropagación en plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. Hartón) 104 Anexo B. Costos para la producción de plantas in vitro de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón) y ecuación general de la producción. 1. PROCESO “in vitro” 1.1. Fase de Establecimiento para 1000 explantes DETALLE COSTO ($) Costo material inicial 300.000 Medio de cultivo Sales 16.766 Vitamina 45 Hormonas 1545 Azúcar y otros 6600 Subtotal 324.956 1.2. Fase de Multiplicación Subcultivo I DETALLE COSTO ($) Medio de Cultivo Sales 16.766 Vitaminas 45 Hormonas 2480 Azúcar y otros 6600 Agar 49700 Subtotal 75591 Subcultivo II DETALLE COSTO ($) Medio de Cultivo Sales 4195 Vitaminas 11,25 Hormonas 1240 Azúcar y otros 3300 Agar 24850 Subtotal 33600 105 Subcultivo III, IV y V Subtotal $100.800 1.3. Enraizamiento DETALLE COSTO ($) Medio de Cultivo Sales 4195 Vitaminas 11,25 Azúcar y otros 3300 Subtotal 7506.25 COSTO TOTAL DE PRODUCCIÓN FASE COSTO ($) Establecimiento 324.956 Multiplicación 209.991 Enraizamiento 7.506,25 TOTAL 542.453,25 VALOR UNITARIO POR VITROPLANTA in vitro = $ 542 Nota: Al valor anterior no se le incluyó costos de servicios de luz y agua, mano de obra y aclimatación. ECUACIÓN GENERAL DE LA PRODUCCIÓN P = MI { CM [1 – (% R / 100) ] } Np P = Producción a obtener CM = Coeficiente de Multiplicación MI = Material inicial “in vitro” que se dispone Np = Número de subcultivo %R = Porciento de rechazo planificado 106 Producción para el coeficiente de multiplicación promedio del medio 3 ( CM = 2.0) P = 1000 { 2.0 [ 1 – (15.5 / 100) ] } 5 P = 13.786 plántulas / 6 meses. Producción para el coeficiente de multiplicación promedio del medio 3 ( CM = 1.77) P = 1000 { 1.77 [ 1 – (15.5 / 100) ] } 5 P = 7.484 plántulas / 6 meses 107 Anexo C. Resultados de la fase de establecimiento para las tres siembras de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. Hartón). 109 110 Anexo D. Resultados de la fase de multiplicación de la primera siembra de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 111 112 Anexo E. Resultados de la fase de multiplicación de la segunda siembra de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 113 114 Anexo F. Resultados de la fase de multiplicación de la tercera siembra de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). 115 116 Anexo G. Resultados de la fase de enraizamiento para las tres siembras de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). SIEMBRA MEDIOS # EXPLANTES LONGITUD - RAIZ # HOJAS # RAIZ 5 15 6.973 3.400 4.133 6 15 7.453 4.266 3.466 1 7 15 6.960 3.266 4.200 5 15 10.4 5.0 2.5 6 15 10.7 4.6 2.3 2 7 15 14.8 4.7 2.3 5 15 9.2 2.6 3.0 6 15 12.1 2.7 3.2 3 7 15 12.4 2.4 4 Anexo H. Resultados de la fase de aclimatación para las tres siembras de plátano hartón (Musa AAB subgrupo cv. hartón). SIEMBRA SUSTRATO # HOJAS ALTURA (cm) ABONO 3.33 11.47 1 ESCORIA 2.60 8.11 ABONO 3.46 7.11 2 ESCORIA 2.93 5.42 ABONO 1.93 4.0 3 ESCORIA 2.06 2.8 117 Anexo I. Resultados de los análisis estadísticos Mediante el método de análisis de varianza simple (ANOVA) y el Test de Duncan, se evaluaron los datos cuantitativos como la altura, número de hojas, número de raíces y número de brotes, que fueron recogidos en cuadros de evaluación para cada una de las fases de la micropropagación. 1. Primera siembra. a. Fase de establecimiento Mediante el análisis de varianza se determinaron las diferencias entre los medios de cultivo y la interacción entre éstos y los tiempos de desinfección, para lo cual se encontró lo siguiente: Análisis de varianza Variable: altura en cm de los explantes. Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Cuadrado medio F c Probabilidad A. Medio de cultivo 5.9535 1 5.9535 2.38 0.1287 B. Tiempo de desinfección 27.0682 1 27.0682 10.81 0.0017 Interacción AxB 1.4415 1 1.4415 0.58 0.4512 Error 140.247 56 2.5044 Total 174.41 59 NS (P≥0.1287) entre los medios de cultivo 1 y 2, utilizados para la primera siembra en la fase de establecimiento, luego podemos decir que vamos a obtener los mismos resultados respecto a la altura de la planta usando cualquiera de los dos medios. Existen diferencias altamente significativas ** (P≤0.0017) entre los tiempos de desinfección 10 min. y 15 min. NS (P≥0.4512) en la interacción de medio de cultivo y tiempo de desinfección, luego podemos afirmar que no existe relación entre medio de cultivo y tiempo de desinfección. Como existen diferencias entre los tiempos de desinfección, se hizo la comparación con la Prueba de Duncan con un 95 % de veracidad para lo cual se determinó las medias de las variables cuantificadas. Cuadro de medias para medios de cultivo y tiempo de desinfección Cuadros de medias con intervalos del error estándar Variable: altura del explante en cm. Explantes Altura media Error estándar Límite inferior Límite superior Total 60 2.751 118 Medio de cultivo 1 30 2.436 0.288 2.147 2.725 2 30 3.066 0.288 2.777 3.355 Tiempo desinfección 10 min. 30 3.423 0.288 3.134 3.712 15 min. 30 2.080 0.288 1.791 2.368 Medio de cultivo x Tiempo desinfección 1-10 15 2.953 0.408 2.544 3.361 1-15 15 1.920 0.408 1.511 2.328 2-10 15 3.893 0.408 3.484 4.301 2-15 15 2.240 0.408 1.831 2.648 De acuerdo a la cuadros anterior, los explantes totales (60) utilizados en los cuatro tratamientos presentaron una altura promedio de 2.75 cm. Teniendo en cuenta la interacción entre el medio de cultivo y los tiempos de desinfección para esta fase, denota que el tratamiento correspondiente al medio de cultivo 2 con un tiempo de desinfección de 10 minutos para 15 explantes, presentó una altura promedia de 3,893 cm, el cual fue superior a los demás tratamientos. Mientras que el tratamiento con el medio de cultivo 1 con un tiempo de desinfección de 15 minutos, presentó una altura promedia de 1,92 cm, inferior a los demás tratamientos. Para los dos tratamientos restantes se encontró lo siguiente: El medio de cultivo 1 con un tiempo de desinfección de 10 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 2.95 cm. Utilizando el medio de cultivo 2 con un tiempo de desinfección de 15 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 2.24 cm. Para verificar y determinar las diferencias significativas de los tiempos de desinfección mediante la prueba de comparación múltiple se comprobó que el mejor tiempo de desinfección fue de 10 minutos presentando una diferencia de 1,343 cm de altura con respecto a la variable de desinfección de 15 minutos. Pruebas de comparación múltiple para tiempo de desinfección Pruebas de comparación múltiple Variable: altura en cm del explante. Método: Duncan 95% Tiempo de desinfección Explantes Altura media Grupos homogéneos 15 minutos 30 2.08 cm X 10 minutos 30 3.42 cm X Contraste Diferencia 10 minutos- 15 minutos *1.343 119 b. Fase de multiplicación Primer Subcultivo Análisis de varianza Numero de Brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc Probabilidad Medios de cultivo 1.633 1 1.633 0.75 0.3952 Error 61.333 28 2.190 Total 62.966 29 Numero de Raíces Medios de cultivo 3.333 1 3.333 2.60 0.1179 Error 35.866 28 Total 39.200 29 Numero de hojas Medios de cultivo 8.533 1 8.533 1.24 0.2757 Error 193.333 28 6.904 Total 201.867 29 1.280 El análisis de varianza para el primer subcultivo de la fase de multiplicación determinó los siguientes resultados para cada una de las variables evaluadas: No existen diferencias significativas NS (P≥0.3952), entre los medios de cultivo 3 y 4 No existen diferencias significativas NS (P≥0.1179) entre los medios de cultivo 3 y 4. No existen diferencias significativas NS (P≥0.2757) entre los medios de cultivo 3 y 4. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 2.20 0.382 1.81 2.58 4 15 1.73 0.382 1.35 2.11 Total 30 1.96 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 0.06 0.292 0.225 0.358 4 15 0.73 0.292 0.441 1.02 Total 30 0.4 120 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.53 0.678 0.854 2.211 4 15 2.6 0.678 1.921 3.278 Total 30 2.06 Los cuadros de medias permitieron determinar el número promedio de cada una de las variables evaluadas del primer subcultivo, para lo cual arrojó los siguientes resultados: El número de brotes promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 1.96 brotes. ( 2 brotes). El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 3, con 2.2 ± 0.38 brotes, aunque todos los promedios son homogéneos se puede confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de raíces promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 0.4 raíces. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 0.73 raíces, aunque todos los promedios son homogéneos se puede confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de hojas promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 2.0 hojas. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 2.6 hojas. Segundo subcultivo Análisis de varianza Número de Brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios de cultivo 172.8 1 172.8 17.04 0.0004 Error 283.86 28 10.13 Total 456.66 29 Numero de Raíces Medios de cultivo 10.8 1 10.8 1.49 0.2318 Error 202.4 28 7.22 Total 213.2 29 Numero de Hojas Medios de cultivo 17.63 1 17.63 3.00 0.0942 Error 164.53 28 5.87 Total 182.16 29 Mediante el análisis de varianza se determinó las diferencias significativas existentes entre los medios de cultivo mediante las variables evaluadas, encontrando los siguientes resultados: 121 Existen diferencias altamente significativas ** (P≤0.0004), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa del cultivo; luego si usamos cualquiera de ellos va a influir de diferente forma sobre la producción de brotes en el explante. No existen diferencias significativas NS (P≥0.2318) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego los medios de cultivo influyen sobre el desarrollo de raíces en el explante en el segundo subcultivo de la fase de multiplicación, es lo mismo usar cualquiera de los dos. No existen diferencias significativas NS (P≥0.0942) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego los medios de cultivo influyen de manera similar sobre el desarrollo de hojas en el explante en el segundo subcultivo de la fase de multiplicación, es lo mismo usar cualquiera de los dos. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 6.73 0.822 5.91 7.55 4 15 1.93 0.822 1.11 2.75 Total 30 4.33 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 0.8 0.694 0.105 1.494 4 15 2.0 0.694 1.305 2.694 Total 30 1.4 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.4 0.625 0.774 2.025 4 15 2.93 0.625 2.307 3.559 Total 30 2.16 De acuerdo a los análisis del cuadro de media, se determinó las medias de cada una de las variables del segundo subcultivo, encontrando los siguientes resultados: El número de brotes promedio en general en el segundo subcultivo de la fase de multiplicación fue de 4.3 brotes. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 4, con 1.93 ± 0.82 brotes. Luego se comprobó la existencia de diferencias altamente significativas ** (P≤0.0004) entre los medios de cultivo; debido a la disparidad entre promedios El número de raíces promedio en general en el segundo subcultivo de la fase de multiplicación fue de 1.4 raíces. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 2 raíces. El número de hojas promedio en general en el segundo subcultivo de la fase de multiplicación fue de 2.1 hojas. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 3 hojas. 122 Pruebas de comparación múltiple variable: # de brotes Método: Duncan 95% Medio de cultivo datos Brotes promedio Grupos homogéneos 3 15 6.73 X 4 15 1.93 X Contraste Diferencia 3 – 4 4.80 El medio de cultivo 3 presentó un promedio de brotes de 6.7±0.82 brotes (7 brotes). El medio de cultivo 4 presentó un promedio de brotes de 1.93±0.82 brotes (2 brotes). Afirmamos que los medios de cultivo 3 y 4 influyen de diferente manera sobre la producción de brotes en ésta etapa del cultivo; el medio que presenta un mejor comportamiento es el medio 3; ya que tiene una diferencia de 5 brotes sobre el medio 4. Tercer subcultivo Análisis de varianza Numero de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc Probabilidad Medios de cultivo 7.5 1 7.5 0.68 0.4170 Error 309.46 28 11.05 Total 316.96 29 Número de raíces Medios de cultivo 4.033 1 4.033 0.48 0.4949 Error 236.133 28 8.433 Total 240.167 29 Número de hojas Medios de cultivo 10.8 1 10.8 1.33 0.2578 Error 226.667 28 8.09 Total 237.467 29 El análisis de varianza permitió determinar las diferencias significativas que existen entre las variables evaluadas durante la fase de multiplicación para el tercer subcultivo, encontrando los siguientes resultados: No existen diferencias significativas NS (P≥0.4170), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa del cultivo; luego si usamos cualquiera de ellos va a influir de la misma forma sobre la producción de brotes en el explante. No existen diferencias significativas NS (P≥0.4949) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego los medios de cultivo influyen de manera similar sobre el desarrollo y número de raíces en los explantes para el tercer subcultivo de la fase de multiplicación, obteniendo en los dos medios de cultivos los mismos efectos. No existen diferencias significativas NS (P≥0.2578) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego los medios de cultivo influyen de manera similar sobre el desarrollo de hojas en el explante, 123 en los dos medios de cultivos vamos a obtener los mismos efectos. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 5.53 0.858 4.67 6.39 4 15 4.53 0.858 3.67 5.39 Total 30 5.03 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.8 0.749 1.050 2.549 4 15 2.53 0.749 1.783 3.283 Total 30 2.16 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.86 0.734 1.132 2.601 4 15 3.06 0.734 2.332 3.801 Total 30 2.46 El número de brotes promedio en general en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 5.0. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 3, con 5.5 ± 0.85 brotes. El número de hojas promedio en general en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 2. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue el 4, con 2.5. El número de hojas promedio en general en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 2.4. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue el 4, con 3.0. Cuarto subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc Probabilidad Medios de cultivo 0.033 1 0.033 0.00 0.9626 Error 417.33 28 14.90 Total 417.36 29 Numero de raíces Medios de cultivo 19.2 1 19.2 1.43 0.2411 124 Error 374.8 28 13.385 Total 394.0 29 Número de hojas Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc Probabilidad Medios de cultivo 0.833 1 0.833 0.06 0.8082 Error 388.533 28 13.876 Total 389.367 29 No existen diferencias significativas NS (P≥0.9626), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa del cultivo; luego si usamos cualquiera de ellos va a influir de la misma forma sobre la producción de brotes en el explante. No existen diferencias significativas NS (P≥0.2411) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que los medios de cultivo influyen de igual manera sobre el desarrollo de raíces en el explante en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación, en los dos medios de cultivos vamos a obtener efectos iguales. No existen diferencias significativas NS (P≥0.8082) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que los medios de cultivo influyen de igual manera sobre el desarrollo de hojas en el explante, en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación, en los dos medios de cultivos vamos a obtener efectos iguales. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 5.4 0.996 4.40 6.39 4 15 5.46 0.996 4.46 6.46 Total 30 5.43 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 5.2 0.944 4.255 6.144 4 15 6.8 0.944 5.855 7.744 Total 30 6.0 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 7.4 0.961 6.438 8.36 4 15 7.06 0.961 6.104 8.02 Total 30 7.23 El número de brotes promedio en general en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 5.4. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue el 3, con 5.4±0.99. El número de raíces promedio en general en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 6. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue el 4, con 6.8. 125 El número de hojas promedio en general en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 7.2. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue el 3, con 7.4. Quinto subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc Probabilidad Medios de cultivo 9.63 1 9.63 0.79 0.3811 Error 340.66 28 12.16 Total 350.3 29 Numero de raíces Medios de cultivo 229.633 1 229.633 8.25 0.0077 Error 779.333 28 27.833 Total 1008.97 29 Número de hojas Medios de cultivo 34.133 1 34.133 1.30 0.2639 Error 735.333 28 26.261 Total 769.467 29 NS (P≥0.3811), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa del cultivo; luego si usamos cualquiera de ellos va a influir de la misma forma sobre la producción de brotes en el explante. Existen diferencias altamente significativas ** (P≤0.0077) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre el desarrollo de raíces en el explante, en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación, en los dos medios de cultivos vamos a obtener efectos diferentes, a través de las pruebas de comparación múltiple determinaremos las diferencias. NS (P≥0.2639) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que los medios de cultivo influyen de igual manera sobre el desarrollo de hojas en el explante, en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación, en los dos medios de cultivos vamos a obtener efectos iguales. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 6.13 0.900 5.23 7.03 4 15 7.26 0.900 6.36 8.16 Total 30 6.7 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 8.866 1.362 7.504 10.228 4 15 14.400 1.362 13.037 15.762 Total 30 11.633 126 La producción promedio de brotes en el quinto subcultivo fue de 6.7 brotes. (7 brotes). Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 14.93 1.323 13.610 16.256 4 15 12.80 1.323 11.476 14.123 Total 30 13.86 El medio de cultivo 3 presentó un promedio de brotes de 6.1±0.90 brotes ( 6 brotes). El número de brotes promedio en general en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 6.7. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue el 3, con 6.1 ±0.90. El número de raíces promedio en general en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 11.6. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue el 4, con 14.4. El número de hojas promedio en general en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 13.8. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue el 3, con 15. c. Fase de enraizamiento Análisis de varianza Altura del explante Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios de cultivo 2.369 2 1.184 0.44 0.644 Error 112.123 42 2.669 Total 114.492 44 Longitud de la raíz Medios de cultivo 6.680 2 3.340 0.14 0.8678 Error 986.332 42 23.484 Total 993.012 44 Número de hojas Medios de cultivo 8.844 2 4.422 3.12 0.0544 Error 59.466 42 1.415 Total 68.311 44 úmero de raíces edios de cultivo 933 .466 450 .6378 2 otal 2.8 N M 4. 2 2 0. 0 Error 227.867 4 5.425 T 23 44 NS (P≥0.644) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7, luego en cualquiera de ellos que utilicemos vamos a obtener los mismos efectos sobre el crecimiento. NS (P≥0.8678) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7, luego en cualquiera de ellos que utilicemos vamos a obtener los mismos efectos sobre la longitud de la raíz. Existen diferencias significativas * (P≥0.0544) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7, luego 127 debemos determinar las diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple para saber cuál de los medios es más convenientes usar para obtener un mayor número de hojas. NS (P≥0.6378) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7, luego podemos decir que obtendremos igual número de raíces usando cualquier medio de cultivo. Cuadros de medias con intervalo del error estándar Medio de cultivo explantes Longitud media (cm) Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 6.973 0.421 6.551 7.395 6 15 7.453 0.421 7.031 7.875 7 15 6.960 0.421 6.538 7.381 Total 45 7.128 Medio de cultivo explantes Número de hojas (cm) Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 3.400 0.307 3.092 3.707 6 15 4.266 0.307 3.959 4.573 7 15 3.266 0.307 2.959 3.573 45 3.644 Total Medio de cultivo explantes Número de raíces (cm) Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 4.133 0.601 3.531 4.734 3.466 0.601 4.068 0.601 3.598 Total 45 3.933 6 15 2.865 7 15 4.200 4.801 La altura promedio en general en la primera fase de establecimiento fue de 7.12 cm . El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de crecimiento fue el 6, con 7.45 cm, aunque todos los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. La longitud promedio de la raíz en general en la primera fase de establecimiento fue de 13.028 cm. El número de hojas promedio en general en la primera fase de establecimiento fue de 3.6 hojas. El número de raíces promedio en general en la primera fase de establecimiento fue de 3.9 raíces. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de longitud de la raíz fue el 7, con 13.34 cm, aunque todos los promedios son homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 6, con 4.2 hojas, aunque todos los promedios son homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 7, con 4.2 raíces, aunque todos los promedios son homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. 128 Pruebas de comparación múltiple. Pruebas de comparación múltiple Variable: número de hojas del explante. Método: Duncan 95% Medios de cultivo Explantes # hojas promedio Grupos homogéneos 7 15 3.2 X 5 15 3.4 XX 6 15 4.2 X Contraste Diferencia 5-6 -0.86 6-7 *1.0 5-7 0.13 Se obtienen la misma cantidad de hojas usando el medio 5 y el medio 7, al igual que el medio 5 y el medio 6: pero no se obtienen los mismos resultados con el medio7 y el medio 6, luego sería más conveniente para obtener un buen número de hojas el medio 6 ya que presenta un mejor promedio de producción de hojas y presenta la diferencia más alta. d. Fase de aclimatación Análisis de varianza Número de hojas Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Sustrato 4.033 1 4.033 0.59 0.4506 Error 192.933 28 6.890 Total 196.967 29 Altura (cm) 84.672 0.3030 Error 2153.47 28 76.9095 Total 2238.14 29 Fuente de variación Sustrato 84.672 1 1.10 NS (P≥0.4506) entre los sustratos abono y escoria, luego en cualquiera de ellos que utilicemos vamos a obtener los mismos efectos sobre el número de hojas en el explante. NS (P≥0.3030) entre los sustratos abono y escoria, luego en cualquiera de ellos que utilicemos vamos a obtener los mismos efectos sobre la altura del explante. Cuadros de medias con intervalo del error estándar 129 El número de hojas promedio en general en la primera siembra, fase de aclimatación fue de 2.96. El sustrato que presentó el mejor promedio de número de hojas fue el abono, con 3.33 hojas, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los sustratos utilizados en ésta fase. El sustrato que presentó el mejor promedio de altura de los explantes fue el abono, con 11.4 cm, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los sustratos utilizados en ésta fase. Segunda siembra a. Fase de establecimiento Existen diferencias significativas * (P≤0.0303) entre los tiempos de desinfección 10 min. y 15 min. Aplicados para la primera siembra en la fase de establecimiento, se determinó las diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple de Duncan al 95%. La altura promedio en general en la primera siembra, fase de aclimatación fue de 9.7 cm. Existen diferencias altamente significativas ** (P≤0.0088) entre los medios de cultivo 1 y 2, No existen diferencias significativas NS (P≥0.9022) en la interacción de medio de cultivo y tiempo de desinfección. Cuadros de medias para medios de cultivo y tiempo de desinfección Cuadros de medias con intervalos del error estándar Variable: altura del explante en cm. Explantes Altura media Error estándar Límite inferior Límite superior Total 60 2.10 Medio de cultivo 1 30 1.96 1.883 0.076 2.036 2.25 0.076 2.176 30 2.22 2.150 2.303 15 min. 30 1.98 0.076 1.910 2.063 Medio de cultivo x Tiempo desinfección 1-10 15 2.073 0.108 1.965 2.181 1-15 15 1.846 0.108 1.738 1.954 2.380 0.108 2.271 2.488 2-15 15 2.126 0.108 2.018 2.234 2 30 2.329 Tiempo desinfección 10 min. 0.076 2-10 15 Con un total de 60 explantes utilizados, se obtuvo un crecimiento promedio de 2.10 cm, Límite superior Sustrato Explantes # hojas promedio Error estándar Límite inferior Abono 15 3.33 0.677 2.65 4.01 15 2.60 0.677 1.92 3.27 Total 30 2.96 Escoria Sustrato Explantes Altura promedio cm. Error estándar Límite inferior Límite superior Abono 15 11.47 2.26 9.20 13.73 Escoria 15 8.11 2.26 5.84 10.37 Total 30 9.79 130 hablando en términos generales. En el medio de cultivo 1 se utilizaron 30 explantes con un crecimiento promedio de 1.96 cm; un crecimiento mínimo de 1.88 cm y uno máximo de 2.03 cm. En el medio de cultivo 2 se utilizaron 30 explantes con un crecimiento promedio de 2.25 cm; un crecimiento mínimo de 2.17 cm y uno máximo de 2.32 cm. Se aplicó un tiempo de desinfección de 10 minutos a 30 explantes, obteniéndose un crecimiento promedio de 2.22 cm; un crecimiento mínimo de 2.15 cm y uno máximo de 1.91 cm. Se aplicó un tiempo de desinfección de 15 minutos a 30 explantes, obteniéndose un crecimiento promedio de 1.98 cm; un crecimiento mínimo de 1.91 cm y uno máximo de 2.06 cm. Teniendo en cuenta la interacción de los dos tratamientos: medios de cultivo y tiempo de desinfección, podemos decir que: Utilizando el medio de cultivo 1 con un tiempo de desinfección de 10 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 2.07 cm. Utilizando el medio de cultivo 1 con un tiempo de desinfección de 15 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 1.84 cm. Utilizando el medio de cultivo 2 con un tiempo de desinfección de 10 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 2.38 cm. Utilizando el medio de cultivo 2 con un tiempo de desinfección de 15 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 2.12 cm. De acuerdo con lo anterior podríamos afirmar que las mejores alturas las obtenemos utilizando el medio de cultivo 2 combinado con un tiempo de desinfección de 10 minutos. Pruebas de comparación múltiple para tiempo de desinfección. Pruebas de comparación múltiple Variable: altura en cm del explante. Método: Duncan 95% Tiempo de desinfección Explantes Altura media Grupos homogéneos 15 minutos 30 2.08 cm X 10 minutos 30 3.42 cm X 10 minutos- 15 minutos *1.343 Contraste Diferencia Los tiempos de desinfección influyen de diferente manera sobre el crecimiento del explante cuantificado en la altura que alcanza, podríamos recomendar el uso de un tiempo de desinfección de 10 minutos ya que los explantes cultivados en un medio con éste tiempo presentan un crecimiento superior (+1.34 cm) al que se obtiene con 15 minutos de desinfección. b. Fase de multiplicación Primer subcultivo Análisis de varianza 131 Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios de cultivo 9.63 1 9.63 1.29 0.2650 Error 208.53 28 7.44 Total 218.16 29 0.833 0.833 4.37 Error 5.333 4.033 1 4.033 10.33 0.0033 Error 10.933 0.390 28 Numero de raíces Medios de cultivo 1 0.0457 28 0.190 Total 6.166 29 Número de hojas Medios de cultivo Total 14.966 29 No existen diferencias significativas NS (P≥0.2650), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa del cultivo; luego si usamos cualquiera de ellos va a influir de la misma forma sobre la producción de brotes en el explante. Existen diferencias significativas * (P≤0.0457) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que no obtendremos igual número de raíces usando uno de los dos medios de cultivo; han de determinarse las diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple para saber cuál de los dos medios es más apto. Existen diferencias altamente significativas ** (P≤0.003) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que no obtendremos igual número de hojas usando uno de los dos medios de cultivo; han de determinarse las diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple para saber cuál de los dos medios es más apto. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo # de brotes Límite inferior explantes Error estándar Límite superior 3 15 0.704 4.10 3.4 2.69 2.26 0.704 2.97 Total 30 2.83 4 15 1.56 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.110E-16 0.112 -0.112 0.112 4 15 0.333 0.112 0.220 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 3.330E-16 -0.161 0.161 0.161 4 15 0.161 0.894 0.733 0.571 0.446 Total 30 0.166 Total 30 0.366 El número de brotes promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 2.8 brotes. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 3, con 3.4 brotes, todos los promedios son homogéneos; luego podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de raíces promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 0.16 raíces. 132 El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 0.33 raíces, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de hojas promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 0.36 hojas. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 0.73 hojas, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias altamente significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos X 4 15 X 0.333 Contraste Diferencia 3-4 *-0.333 3 15 1.11E-16 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+0.33 raíces) al medio 3 (0) raíces. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de hojas del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Hojas promedio Grupos homogéneos 3 15 3.330E-16 X 15 0.733 Contraste 4 X Diferencia 3-4 *-0.733 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de hojas del explante cuantificado en el número de hojas que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de hojas superior (+0.73 raíces) al medio 3 (0) hojas. Segundo subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Suma de Grad Cuadrado probabilidad Fuente de variación os Fc 133 cuadrados libertad medio Medios de cultivo 7.5 1 7.5 0.4530 0.58 28 12.95 Total 370.16 29 Número de raíces Medios de cultivo 32.033 1 32.033 9.72 0.0042 Error 92.266 28 3.295 Total 124.3 29 Medios de cultivo 56.033 3.54 1 56.033 0.0703 28 Total 498.967 29 Error 362.66 Número de hojas Error 442.933 15.819 No existen diferencias significativas NS (P≥0.4530), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa del cultivo; luego si usamos cualquiera de ellos va a influir de la misma forma sobre la producción de brotes en el explante. Existen diferencias significativas altamente ** (P≤0.0042) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego debemos decir que no obtendremos igual número de raíces usando uno de los dos medios de cultivo; han de determinarse las diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple para saber cuál de los dos medios es más apto. explantes Límite inferior No existen diferencias significativas NS (P≥0.0703) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego podemos decir que obtendremos igual número de hojas usando cualquier medio de cultivo. No existen diferencias significativas NS (P≥0.6789) entre los medios de cultivo 3 y 4, luego podemos decir que obtendremos igual número de hojas usando cualquier medio de cultivo. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo # de brotes Error estándar Límite superior 4.66 3.73 5.59 0.929 4.59 Total 30 4.16 3 15 0.929 4 15 3.66 2.73 Medio de cultivo explantes # de raíces Límite superior Error estándar Límite inferior 3 15 0.797 1.266 0.468 1.735 4 15 3.333 0.468 2.864 3.802 Total 30 2.3 Medio de cultivo Límite inferior explantes # de hojas Error estándar Límite superior 3 15 1.666 1.026 0.639 2.693 4 15 4.400 1.026 3.373 5.426 Total 30 3.033 El número de brotes promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 4.1 brotes. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 3, con 4.66 brotes, todos los promedios son homogéneos; luego podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de raíces promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 2.3 raíces. 134 El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 3.33 brotes, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias altamente significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 4.4 hojas, los promedios no son homogéneos; sin embargo no hay diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4, luego podemos recomendar cualquiera de ellos en ésta etapa. Pruebas de comparación múltiple El número de hojas promedio en general en el primer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 3.0 hojas. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Raíces promedio Explantes Grupos homogéneos 3 15 X 1.266 4 15 X 3.333 Contraste Diferencia 3-4 *-2.066 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+2.0 raíces) al medio 3 (1.2) raíces. Tercer subcultivo Análisis de varianza Numero de brotes Fuente variación uadrado medio Prob Suma de cuadrados Grados de libertad C Fc 486.53 28 1.05 0.3134 Error 17.63 17.63 1 Total 486.16 29 Numero de raíces Medios de cultivo 672.133 1 672.133 26.63 0.0001 Error 706.667 28 25.238 26.63 0.0001 Error 706.667 25.238 28 Total 1378.8 29 Medios de cultivo 16.73 Total 1378.8 29 Número de hojas Medios de cultivo 672.133 1 672.133 NS (P≥0.3134) entre los medios de cultivo 3 y 4. ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4. ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4. * (P≤0.0232) entre los medios de cultivo 3 y 4. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. 135 Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 El número de brotes promedio en total fue de 5.1 brotes. El medio de cultivo 3 presentó el mejor promedio de producción de brotes con 5.93 brotes. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de raíces con 11 raíces. El número de raíces promedio total fue de 6.2 hojas. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de hojas con 11 raíces. Pruebas de comparación múltiple Variable: # de raíces del explante. Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos 3 15 1.466 X 4 15 10.933 X 3-4 *-9.466 Método: Duncan 95% Contraste Diferencia Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (11 raíces) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+9.5 raíces) al medio 3 (1.4) raíces Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de hojas del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Hojas promedio Grupos homogéneos 3 15 1.466 X 4 15 X 10.933 Contraste Diferencia 3-4 *-9.466 Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.05 6.98 5.93 4.87 4.4 3.34 5.45 5.16 4 15 1.05 Total 30 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 15 1.466 1.297 0.169 2.763 4 15 10.933 1.297 9.636 12.230 Total 30 6.200 3 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.466 1.297 0.169 2.763 4 15 10.933 1.297 9.636 12.230 Total 30 6.200 136 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de hojas del explante cuantificado en el número de hojas que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (11 hojas) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de hojas superior (+9.5 hojas) al medio 3 (1.4) hojas Cuarto subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios de cultivo 70.53 1 70.53 3.82 0.0608 Error 517.46 28 18.48 Total 588.0 29 Número de raíces Medios de cultivo 907.5 1 907.5 69.91 28 12.981 Total 1270.97 29 Medios de cultivo 381.633 381.633 19.27 1 0.0001 Error 554.533 28 19.804 Total 936.167 29 0.0001 Error 363.467 Número de hojas NS (P≥0.0608) entre los medios de cultivo 3 y 4 para número de brotes ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4 para número de raíces NS (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4 para número de hojas. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Límite superior Medio de cultivo Explantes # de brotes Error estándar Límite inferior 3 15 7.53 1.10 6.42 8.64 4.46 1.10 3.35 5.57 4 15 Total 30 6.0 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 0.466 0.930 -0.463 1.396 4 15 11.466 0.930 10.536 12.396 Total 30 5.966 Medio de cultivo # de hojas Límite superior explantes Error estándar Límite inferior 1.149 2.450 4.749 15 10.733 1.149 9.584 3 15 3.600 4 11.882 Total 30 7.166 137 El número de brotes promedio en total fue de 6.0 brotes. El medio de cultivo 3 presentó el mejor promedio de producción de brotes con 4.4 brotes. El número de raíces promedio en total fue de 6 raíces. El número de hojas promedio en total fue de 7 hojas. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de raíces con 11 raíces El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de hojas con 11 hojas. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos 3 15 0.466 X 15 11.466 X Contraste Diferencia 3-4 *-11.0 4 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (11 raíces) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+11 raíces) al medio 3 (0.4) raíces. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de hojas del explante. Método: Duncan 95% Explantes Hojas promedio 3 15 3.600 X 15 10.733 X Contraste Diferencia Medio de cultivo Grupos homogéneos 4 3-4 *-7.133 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de hojas del explante cuantificado en el número de hojas que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de hojas superior (+7 hojas) al medio 3 (3.6) hojas. Quinto subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de Grados Cuadrado Fc probabilidad 138 cuadrados libertad medio Medios de cultivo 14.7 1 14.7 0.57 0.4570 Error 723.6 28 25.84 738.3 29 Número de hojas Medios de cultivo 6.533 1 6.533 1.01 0.3233 Error 180.933 28 6.461 Total 180.467 29 Número de raíces Medios de cultivo 154.133 1 154.133 47.25 0.0001 Error 91.333 28 3.261 Total 245.467 29 Total NS (P≥0.4570) entre los medios de cultivo 3 y 4, para número de brotes. NS (P≥0.3233) entre los medios de cultivo 3 y 4, para número de hojas. ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4, para número de raíces. El número de hojas promedio en total fue de 4.8 hojas. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de hojas con 5.3 hojas. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 1.600 1.188 2.011 4 15 1.400 0.411 0.988 1.811 Total 30 1.500 3 15 0.411 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 4.400 0.656 3.743 5.056 4 15 5.333 0.656 4.676 5.989 Total 30 4.866 El número de brotes promedio en total fue de 6.3 brotes. Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 0.866 0.466 0.400 1.332 4 15 5.400 0.466 4.933 5.866 Total 30 3.133 El medio de cultivo 3 presentó el mejor promedio de producción de brotes con 5.6 brotes. El número de raíces promedio en total fue de 3 raíces. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de raíces con 5.4 raíces. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos 0.866 X 15 5.400 X 3 15 4 139 Contraste Diferencia 3-4 *-4.53 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (5.4 raíces) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+4.5 raíces) al medio 3 (0.8) raíces. c. Fase de Enraizamiento Análisis de varianza Número de raíces Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios 1.733 2 0.866 0.13 0.8782 Error 279.467 6.653 42 Total 281.2 44 Longitud de la raíz Medios 178.789 2 89.39 3.28 0.0476 Error 1146.24 42 27.29 Total 1325.03 44 Número de hojas Medios 0.4 2 0.2 0.58 0.5625 Error 14.4 42 0.34 Total 14.8 44 Altura Medios 10.77 2 5.38 1.79 0.1792 Error 126.3 42 3.00 Total 137.07 44 NS (P≥0.8782) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7, el número de raíces del explante. * (P≤0.0476) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7, para la longitud de la raíz NS (P≥0.5625) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7 para número de hojas. NS (P≥0.1792) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7 para altura del explante. Error estándar Cuadros de medias con intervalo del error estándar Medios Explantes # hojas promedio Límite inferior Límite superior 5 15 5.0 0.66 4.4 5.7 6 15 4.6 0.66 3.9 5.2 7 15 4.7 0.66 4.0 5.3 Total 45 4.8 140 Medios Explantes Long raíz promedio cm. Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 10.4 1.34 9.11 11.80 6 15 10.7 1.34 9.41 12.11 7 15 14.8 1.34 13.48 16.18 Total 45 12.0 Medios Explantes # hojas promedio Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 2.5 0.15 2.38 2.68 6 15 2.3 0.15 2.18 2.48 7 15 2.3 0.15 2.18 2.48 Total 45 2.4 El número de hojas promedio en total fue de 4.8 hojas. Medios Explantes Altura promedio Error estándar Límite inferior Límite superior 5.9 0.44 5.45 6.35 6 15 6.3 0.44 5.90 6.80 7 15 5.1 0.44 4.71 5.61 45 5.8 5 15 Total El medio 5 presentó la mejor producción de hojas en los explantes con 5 hojas. La longitud de la raíz promedio en total fue de 12 cm. El medio que presentó la mejor longitud de la raíz en los explantes fue el medio 7, con 14 cm, los promedios no son muy homogéneos; podemos confirmar la existencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo utilizados en ésta fase. El número de hojas promedio en general en la segunda siembra, fase de enraizamiento fue de 2.4. El medio que presentó la mejor producción de hojas en los explantes fue el medio 5, con 2.5 hojas, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la inexistencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo utilizados en ésta fase. La altura promedio en general en la segunda siembra, fase de enraizamiento fue de 5.8 cm. El medio que presentó la mejor altura en los explantes fue el medio 6, con 6.3 cm, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la inexistencia de diferencias significativas entre los medios de cultivo utilizados en ésta fase. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 5, 6 y 7. Pruebas de comparación múltiple Variable: longitud de raíz del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Longitud promedio cm. Grupos homogéneos 5 15 10.4 X 6 15 10.7 X 7 15 14.8 X Contraste Diferencia 5 - 6 -0.30 *-4.37 5 – 7 141 6 – 7 *-4.06 Los medios de cultivo 5 y 6 influyen de igual manera sobre la longitud de raíz del explante, el medio 7 influye de mejor manera que los anteriores ya que presenta un promedio claramente superior al de los medios 5 y 6, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 7 (15 cm) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de malformaciones superior al de los demás. d. Fase de aclimatación Análisis de varianza Número de hojas Suma de cuadrados Grados Cuadrado medio Fc probabilidad Sustrato 2.133 1 2.133 0.78 0.3849 Error 76.666 28 2.738 Total 78.800 29 1 21.336 1.68 0.2056 Error 355.827 28 12.708 Total 377.163 29 Fuente de variación libertad Altura (cm) Sustrato 21.336 NS (P≥0.3030) entre los sustratos abono y escoria para el número de hojas del explante. NS (P≥0.3030) entre los sustratos abono y escoria, para la altura de la planta. Cuadros de medias con intervalo del error estándar Sustrato Explantes # hojas promedio. Error estándar Límite inferior Límite superior Abono 15 3.46 0.427 3.03 3.89 Escoria 15 2.93 0.427 2.50 3.36 Total 30 3.20 Sustrato Explantes Altura promedio cm. Error estándar Límite inferior Límite superior Abono 15 7.11 0.920 6.19 8.03 Escoria 15 5.42 0.920 4.50 6.34 Total 30 6.27 El número de hojas promedio en total fue de 3.2. El abono presentó el mejor número de hojas con 3.46. La altura promedio en total fue de 6.2 cm. El abono presentó la mejor altura de los explantes con 7.11cm. 3. Tercera siembra 142 a. Fase de establecimiento. NS (P≥0.2887) entre los medios de cultivo 1 y 2, luego se obtendrán los mismos resultados respecto a la altura de la planta usando cualquiera de los dos medios. NS (P≥0.4835) entre los tiempos de desinfección 10 min. y 15 min., luego tienen la misma influencia en la desinfección y crecimiento del explante. ** (P≤0.0053) en la interacción de medio de cultivo y tiempo de desinfección, se determinó que medios de cultivo y qué tiempos de desinfección nos ofrecen los mejores resultados. Cuadros de medias para medios de cultivo y tiempo de desinfección Cuadros de medias con intervalos del error estándar Variable: altura del explante en cm. Explantes Altura media Error estándar Límite inferior Límite superior Total 60 1.58 Medio de cultivo 1 30 1.65 0.090 1.55 1.74 2 30 1.51 0.090 1.42 1.60 Tiempo desinfección 10 min. 30 1.53 0.090 1.44 1.62 15 min. 30 1.62 0.090 1.53 1.71 Medio de cultivo x Tiempo desinfección 1-10 15 1.42 0.127 1.29 1.54 1-15 15 1.88 0.127 1.75 2.00 2-10 15 1.65 0.127 1.52 1.78 2-15 15 1.37 0.127 1.24 1.50 Con un total de 60 explantes utilizados, se obtuvo un crecimiento promedio de 1.58 cm. En el medio de cultivo 1 se utilizaron 30 explantes con un crecimiento promedio de 1.65 cm; un crecimiento mínimo de 1.55 cm y uno máximo de 1.74 cm. En el medio de cultivo 2 se utilizaron 30 explantes con un crecimiento promedio de 1.51 cm; un crecimiento mínimo de 1.42 cm y uno máximo de 1.60 cm. Se aplicó un tiempo de desinfección de 10 minutos a 30 explantes, obteniéndose un crecimiento promedio de 1.53 cm; un crecimiento mínimo de 1.44 cm y uno máximo de 1.62 cm. Se aplicó un tiempo de desinfección de 15 minutos a 30 explantes, obteniéndose un crecimiento promedio de 1.62 cm; un crecimiento mínimo de 1.53 cm y uno máximo de 1.71 cm. Teniendo en cuenta la interacción de los dos tratamientos: medios de cultivo y tiempo de Análisis de varianza Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Cuadrado medio F c Probabilidad A. Medio de cultivo 0.2801 1 0.2801 1.15 0.2887 B. Tiempo de desinfección 0.1215 1 0.1215 0.50 0.4835 Interacción AxB 2.0535 1 2.0535 0.0053 0.0053 Error 13.674 56 0.2441 Total 16.129 59 Variable: altura en cm de los explantes. 143 desinfección, podemos decir que: Utilizando el medio de cultivo 1 con un tiempo de desinfección de 10 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 1.42 ± 0.127 cm. Utilizando el medio de cultivo 1 con un tiempo de desinfección de 15 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 1.88 ± 0.127 cm. Utilizando el medio de cultivo 2 con un tiempo de desinfección de 10 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 1.65 ± 0.127 cm. Utilizando el medio de cultivo 2 con un tiempo de desinfección de 15 minutos obtenemos un crecimiento promedio de 1.37 ± 0.127 cm. b. Fase de multiplicación Primer subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios de cultivo 0.133 1 0.133 0.04 Error 91.86 28 3.28 Total 92.0 29 Número de raíces Medios de cultivo 5.633 1 5.633 2.83 0.1036 Error 57.733 28 1.990 Total 61.366 29 Número de hojas Medios de cultivo 40.833 1 40.833 11.65 0.0020 Error 98.133 28 3.504 Total 138.967 29 De acuerdo con el análisis de varianza se determinaron las diferencias existentes en cada una de las variables evaluadas del primer subcultivo (tercera siembra), encontrando los siguientes resultados: NS (P≥0.8417), entre los medios de cultivo 3 y 4 NS (P≥1036) entre los medios de cultivo 3 y 4. ** (P≤0.0020) entre los medios de cultivo 3 y 4. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 3.06 0.467 2.59 3.53 4 15 2.93 0.467 2.46 3.40 Total 30 3.0 144 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 1.665E-16 0.364 -0.364 0.364 4 15 0.866 0.364 0.502 1.230 Total 30 0.433 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 0.20 0.483 -0.28 0.68 4 15 2.53 0.483 2.04 3.01 Total 30 1.36 El número de brotes promedio en total fue de 3.0 brotes. El medio de cultivo 3 presentó el mejor promedio de producción de brotes con 3.0 brotes. El número de raíces promedio en total fue de 0.43 raíces. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de raíces con 0.86 raíces. El número de hojas promedio en total fue de 1.36 hojas. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de hojas con 2.53 hojas. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de hojas del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Hojas promedio Grupos homogéneos 3 15 0.20 X 4 15 2.53 X Contraste Diferencia 3-4 *-2.333 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de hojas del explante cuantificado en el número de hojas que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados en éste medio presentan una producción de hojas superior (+2.33 raíces) al medio 3 (0.2) hojas. Segundo subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Medios de cultivo 1.633 1 1.633 0.45 0.5067 Error 101.06 28 3.60 Total 102.7 29 Número de raíces Medios de cultivo 145.200 1 145.200 18.87 0.0002 Error 215.467 28 7.695 Total 360.667 29 Número de hojas Medios de cultivo 192.53 1 192.53 14.47 0.0007 145 Error 372.66 28 13.30 Total 565.2 29 NS (P≥0.5067), entre los medios de cultivo 3 y 4 ** (P≤0.0002) entre los medios de cultivo 3 y 4. ** (P≤0.0007) entre los medios de cultivo 3 y 4. Pruebas de comparación múltiple Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo Explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 4.33 0.490 3.84 4.82 4 15 3.86 0.490 3.37 4.35 Total 30 4.1 Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 0.13 0.84 0.71 0.58 4 15 4.53 0.71 3.81 5.24 Total 30 2.33 Medio de cultivo Error estándar Explantes # de hojas Límite inferior Límite superior 3 15 0.86 0.94 0.07 1.80 4 15 0.94 6.87 5.93 4.99 Total 30 3.4 El número de brotes promedio en total fue de 4.1 brotes. El medio de cultivo 3 presentó el mejor promedio de producción de brotes con 4.33 brotes. El número de raíces promedio en total fue de 2.3 raíces. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de raíces con 4.53 raíces. El número de hojas promedio en total fue de 3.4 hojas. El medio de cultivo 4 presentó el mejor promedio de producción de hojas con 5.9 hojas. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos 3 15 0.13 X 4 15 4.5 X Contraste Diferencia 3-4 *-4.4 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+4.4 raíces) al medio 3 (0.1 raíces). 146 Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de hojas del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Hojas promedio Grupos homogéneos 3 15 0.86 X 15 5.93 X Contraste Diferencia 4 3-4 *-5.06 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+5.0 hojas) al medio 3 (0.8 hojas). Tercer subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Fc Cuadrado medio probabilidad Medios de cultivo 108.3 108.3 1 6.28 0.0183 Error 482.66 17.23 28 Número de raíces Medios de cultivo 672.133 1 672.133 26.63 0.0001 Error 706.667 28 25.238 Total 1378.8 29 Número de hojas Medios de cultivo 177.633 1 177.633 4.80 0.0369 Error 1035.730 28 36.990 Total 1213.37 29 Total 590.96 29 Existen diferencias significativas * (P≤0.0183), entre los medios de cultivo 3 y 4 utilizados en ésta etapa por lo cual debemos determinar éstas diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple; para hacer una recomendación adecuada. ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4. * (P≤0.0369) entre los medios de cultivo 3 y 4. Límite inferior Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite superior 3 15 1.07 7.86 6.79 8.93 4 15 5.13 4.06 1.07 2.99 5.96 Total 30 147 Variable: # de brotes Método: Duncan 95% Medio de cultivo explantes # de raíces Límite inferior Error estándar Límite superior 3 15 0.169 1.466 1.297 2.763 4 15 10.933 1.297 9.636 12.230 Total 30 6.200 Medio de cultivo explantes # de hojas Error estándar Límite inferior Límite superior 3 15 6.33 1.57 4.76 7.90 4 15 11.2 1.57 9.62 12.77 Total 30 8.76 La producción promedio de brotes en el tercer subcultivo fue de 5.96 brotes. ( 6 brotes). El medio de cultivo 3 presentó un promedio de brotes de 7.86±1.0 brotes (8 brotes). El medio de cultivo 4 presentó un promedio de brotes de 4.0±1.0 brotes (4 brotes). El número de raíces promedio en general en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 6.2 raíces. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 11 raíces, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias altamente significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de hojas promedio en general en el tercer subcultivo de la fase de multiplicación fue de 8.7 hojas. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 11.2 raíces, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias altamente significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. Pruebas de comparación múltiple medio de cultivo datos Brotes promedio Grupos homogéneos 4 15 4.06 X 3 15 7.86 X Contraste Diferencia 3 - 4 3.80 El medio de cultivo 3 presentó un promedio de brotes de 7.86±1.0 brotes (8 brotes). El medio de cultivo 4 presentó un promedio de brotes de 4.06±1.0 brotes (4 brotes). Afirmamos que los medios de cultivo 3 y 4 influyen de diferente manera sobre la producción de brotes en ésta etapa del cultivo; el medio que presenta un mejor comportamiento es el medio 3; ya que tiene una diferencia de 3.8 brotes (4 brotes) sobre el medio 4; luego sería recomendable el uso de éste. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple 148 Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos 3 15 1.466 X 4 15 10.933 X Contraste Diferencia 3-4 *-9.466 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (11 raíces) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+9.5 raíces) al medio 3 (1.4) raíces. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de hojas del explante. Método: Duncan 95% Hojas promedio Grupos homogéneos 3 15 6.33 X 4 15 11.2 X Medio de cultivo Explantes Contraste Diferencia 3-4 *-4.86 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de hojas del explante cuantificado en el número que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (11 hojas) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de hojas superior (+5 hojas) al medio 3 (6 hojas). Cuarto subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Fc Cuadrado medio probabilidad Medios de cultivo 45.633 1 45.633 5.48 0.0266 8.333 Total 278.967 29 Número de raíces Medios de cultivo 464.133 1 49.63 464.133 0.0001 Error 261.867 9.352 28 Número de hojas Medios de cultivo 14.7 14.7 0.4219 1 0.66 Error 619.467 28 22.123 Total 634.167 29 Error 233.333 28 Total 726.0 29 Existen diferencias significativas * (P≤0.0266), entre los medios de cultivo 3 y 4 luego 149 debemos determinar éstas diferencias a través de las pruebas de comparación múltiple; para hacer una recomendación. NS (P≥0.5078) entre los medios de cultivo 3 y 4. ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4. NS (P≥0.4219) entre los medios de cultivo 3 y 4. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 9.5 hojas, los promedios son homogéneos; luego podemos confirmar la no existencia de diferencias entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de brotes promedio en general en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 6.0 brotes. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 4, con 7.26 brotes. El número de raíces promedio en general en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 6 raíces. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 9.9 raíces, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias altamente significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El número de hojas promedio en general en el cuarto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 8.8 hojas. Pruebas de comparación múltiple VARIABLE: # DE BROTES METODO: Duncan 95% datos Brotes promedio X 4 15 X 7.26 medio de cultivo Grupos homogéneos 3 15 4.80 Contraste Diferencia Medio de cultivo # de brotes Límite inferior explantes Error estándar Límite superior 3 15 4.80 0.745 4.05 5.54 4 15 7.26 0.745 6.52 8.01 Total 30 6.03 Medio de cultivo explantes Error estándar # de raíces Límite inferior Límite superior 3 15 2.06 0.789 1.27 2.85 4 15 9.93 0.789 9.14 10.72 Total 30 6.0 Medio de cultivo # de hojas Límite inferior explantes Error estándar Límite superior 3 15 6.91 8.13 1.21 9.34 4 15 9.53 1.21 8.31 10.74 Total 30 8.83 150 -2.46 3 - 4 El medio de cultivo 3 presentó un promedio de brotes de 4.80±0.745 brotes (5 brotes). Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 El medio de cultivo 4 presentó un promedio de brotes de 7.2±0.745 brotes (7 brotes). Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número de raíces que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (9.9 raíces) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+7.8 raíces) al medio 3 (2 raíces). Quinto subcultivo Análisis de varianza Número de brotes Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad probabilidad Cuadrado medio Fc 1 2.7 0.6287 28 Total 318.96 29 Número de raíces Medios de cultivo 433.2 1 433.2 64.29 0.0001 Error 188.66 28 6.73 Total 621.86 29 Número de hojas 2.7 2.7 0.4415 Error 124 28 4.42 29 Medios de cultivo 2.7 0.24 Error 316.26 11.29 Medios de cultivo 1 0.61 Total 126.7 NS (P≥0.6287), entre los medios de cultivo 3 y 4 ** (P≤0.0001) entre los medios de cultivo 3 y 4. NS (P≥0.4415) entre los medios de cultivo 3 y 4. Cuadros de medias con intervalo del error estándar. Pruebas de comparación múltiple Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Raíces promedio Grupos homogéneos 3 15 2.06 X 15 X Contraste Diferencia 3-4 *-7.8 4 9.93 NS (P≥0.1361) entre los medios de cultivo 3 y 4. 151 Medio de cultivo explantes # de brotes Error estándar Límite inferior Límite superior 6.66 5.79 7.53 0.867 5.19 6.93 Total 30 6.36 3 15 0.867 4 15 6.06 El número de raíces promedio en general en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 4.9 raíces. El número de hojas promedio en general en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 5.1 hojas. Medio de cultivo explantes # de raíces Error estándar Límite inferior Límite superior 0.463 4 15 8.73 0.670 8.063 9.403 Total 30 4.93 3 15 1.13 0.670 1.803 Medio de cultivo explantes Error estándar Límite superior # de hojas Límite inferior 3 15 4.8 4.25 5.34 0.54 0.54 5.94 Total 30 5.1 4 15 5.4 4.85 El número de brotes promedio en general en el quinto subcultivo de la fase de multiplicación fue de 6.3 brotes. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de brotes fue el 3, con 6.66 brotes. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de raíces fue el 4, con 8.7 raíces, los promedios no son homogéneos; luego podemos confirmar la existencia de diferencias altamente significativas entre los medios de cultivo 3 y 4. El medio de cultivo que presentó el mejor promedio de producción de hojas fue el 4, con 5.4 hojas, los promedios no son homogéneos; sin embargo no hay diferencias significativas entre los medios de cultivo 3 y 4, luego podemos recomendar cualquiera de ellos en ésta etapa. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Explantes Brotes promedio 4 15 X 0.73 Contraste Variable: # de brotes del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Grupos homogéneos 3 15 1.73 X Diferencia 3-4 *1.0 Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de brotes del explante cuantificado en el número que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 3 (1.7 brotes) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de brotes superior (1 brotes) al medio 4 (0.7 brotes). 152 Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 3 y 4 Pruebas de comparación múltiple Variable: # de raíces del explante. Método: Duncan 95% Explantes 3-4 *-7.59 Medio de cultivo Raíces promedio Grupos homogéneos 3 15 1.13 X 4 15 8.73 X Contraste Diferencia Los medios de cultivo influyen de diferente manera sobre la producción de raíces del explante cuantificado en el número que alcanza, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 4 (8.7 raíces) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+7.5 raíces) al medio 3 (1.1) raíces. d. Fase de enraizamiento Análisis de varianza Número de hojas Fuente de variación Suma de cuadrados Fc Grados libertad Cuadrado medio probabilidad Medios 0.844 2 0.26 0.7721 0.422 1.622 Medios 7.64 2 3.82 2.08 0.1381 Error 77.33 42 1.84 Total 84.977 44 Longitud de la raíz (cm) 2 45.81 1.83 0.1726 42 25.00 Total 1141.81 44 Medios 20.81 2 10.40 6.73 0.0029 Error 64.98 42 1.54 Total 85.80 44 Error 68.133 42 Total 68.977 44 Número de raíces Medios 91.63 Error 1050.17 Altura (cm) NS (P≥0.7721) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. NS (P≥0.1381) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. NS (P≥0.1726) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. ** (P≤0.0029) entre los medios de cultivo 5, 6 y 7. Cuadros de medias con intervalo del error estándar Medio Explantes # hojas promedio cm. Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 2.6 0.32 2.27 2.92 6 15 2.7 0.32 2.40 3.06 7 15 2.4 0.32 2.07 2.72 45 2.5 Total 153 Medio Explantes # raíces promedio Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 3.0 0.35 2.71 3.41 6 15 3.2 2.84 0.35 3.55 7 15 0.35 4.35 4 3.64 Total 45 3.4 Medio Explantes Long. raiz promedio (cm) Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 9.2 1.29 7.98 10.57 6 15 12.1 1.29 10.88 13.47 7 15 12.4 1.29 11.12 13.71 Total 45 11.2 Medio Explantes Altura promedio cm. Error estándar Límite inferior Límite superior 5 15 4.4 4.15 0.32 4.80 6 15 4.7 0.32 4.37 5.02 7 15 6.0 0.32 5.69 6.34 Total 45 5.0 El número de hojas promedio en general en la tercera siembra, fase de aclimatación fue de 2.5. El medio que presentó el mejor promedio de hojas de los explantes fue el medio 6, con 2.7 hojas, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios utilizados en ésta fase. El número de raíces promedio en general en la tercera siembra, fase de aclimatación fue de 3.4. El medio que presentó el mejor promedio de raíces de los explantes fue el medio 7, con 4 raíces, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios utilizados en ésta fase. La altura promedio de los explantes en general en la tercera siembra, fase de aclimatación fue de 5.0 cm. El medio que presentó el mejor promedio de altura de los explantes fue el medio 7, con 6.0 cm, los promedios son homogéneos; sin embargo existen diferencias altamente significativas entre los medios utilizados en ésta fase. La longitud promedio de las raíces en general en la tercera siembra, fase de aclimatación fue de 11.2 cm. Pruebas de comparación múltiple para medios de cultivo 5, 6 y 7. El medio que presentó el mejor promedio de longitud de raíces de los explantes fue el medio 7, con 12.4 cm, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los medios utilizados en ésta fase. Pruebas de comparación múltiple Variable: altura del explante. Método: Duncan 95% Medio de cultivo Explantes Altura promedio cm. Grupos homogéneos 5 15 4.4 X 6 15 4.7 X 154 7 15 6.0 X Contraste Diferencia 5 – 6 -0.21 5 – 7 *-1.5 6 – 7 *-1.3 Los medios de cultivo 6 y 7 influyen de diferente manera sobre la altura del explante, podríamos recomendar el uso del medio de cultivo 7 (6.0 cm.) ya que los explantes cultivados con éste medio presentan una producción de raíces superior (+1.5cm.) al medio 5 (4.7 cm) y al medio 6 (1.3 cm). d. Fase de aclimatación Análisis de varianza Número de hojas Fuente de variación Suma de cuadrados Grados libertad Cuadrado medio Fc probabilidad Sustrato 0.133 1 0.133 0.06 0.8046 59.86 28 2.138 Total 60.0 29 Altura (cm) Sustrato 10.44 1 10.44 1.96 0.1728 29 Error Error 149.39 28 5.33 Total 159.83 NS (P≥0.1728) entre los sustratos abono y escoria. Cuadros de medias con intervalo del error estándar El sustrato que presentó el mejor promedio de número de hojas de los explantes fue la escoria, con 2.06, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los sustratos utilizados en ésta fase, podríamos recomendar cualquiera de los dos. Sustrato # hojas promedio. Límite inferior NS (P≥0.8046) entre los sustratos abono y escoria. Explantes Error estándar Límite superior Abono 15 0.377 1.55 2.31 2.06 0.377 1.68 Total 30 2.0 1.93 Escoria 2.44 15 Sustrato Explantes Altura promedio cm. Error estándar Límite inferior Límite superior Abono 15 0.59 4.0 3.43 4.62 Escoria 15 2.8 0.59 2.25 3.44 Total 30 3.4 El número de hojas promedio en general en la segunda siembra, fase de aclimatación fue de 2.0. La altura promedio en general en la tercera siembra, fase de aclimatación fue de 3.4 cm. 155 El sustrato que presentó la mejor altura de los explantes fue el abono, con 4.0 cm, los promedios son muy homogéneos; podemos confirmar la no existencia de diferencias significativas entre los sustratos utilizados en ésta fase. 156