tesis aviar

Estudio químico y de potencial antimicrobiano del estípite de shiitake (Lentinula edodes) y su factibilidad de empleo como ingrediente nutraceútico en la preparaciónde alimento aviar Janeth Rocío Rojas Luna   Universidad Nacional de Colombia Facultad Ciencias, Departamento Química Bogotá D.C., Colombia 2012 Estudio químico y de potencial antimicrobiano del estípite de shiitake (Lentinula edodes) y su factibilidad de empleo como ingrediente nutraceútico en la preparación de alimento aviar       Janeth Rocío Rojas Luna     Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias-Química    Directora: Dr. Sci. Ivonne Jeannete Nieto Ramírez Línea de Investigación: Productos Naturales Grupo de Investigación: Química de Hongos Macromicetos Universidad Nacional de Colombia Facultad Ciencias, Departamento Química Bogotá D.C., Colombia 2012 GRACIAS A DIOS PARA EL SEA SIEMPRE TODO EL HONOR Y LA GLORIA. PARA LO MEJOR QUE HAY EN MI VIDA MATILDE, HUMBERTO, HEIDI Y MARLON MI FAMILIA………… GRACIAS Departamento de Química. por todo el conocimiento transmitido. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. por su apoyo siempre incondicional muchas gracias. técnico del Laboratorio de Control Microbiológico del ICTA. por su valioso consejo al momento de ingresar al programa de posgrado. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Al químico Jorge Daza. por el material fúngico empleado para este .Departamento de Química. Al profesor Augusto Rivera. gracias por su apoyo en el trabajo experimental. A Carolina Chegwin y Carolina Suarez. A Julián Guevara. Laboratorio de Nutrición. por la oportunidad. por brindarme las instalaciones del laboratorio para mi trabajo experimental. Gracias. A los profesores Leonardo Castellanos y Freddy Ramos. Laboratorio de Productos Naturales Marinos. Director del Laboratorio de Microbiología. Al profesor Gonzalo Díaz González. gerente de “Fungita” estudio. por brindarme las instalaciones del laboratorio para realizar los primeros ensayos de actividad. Al profesor Pedro de Brito.Agradecimientos A mi directora. A Nancy Sánchez. por su confianza. A Gregorio Medina. gracias por su apoyo en la parte experimental. por su ayuda en los primeros ensayos de actividad. Director del Laboratorio de Toxicología. Profesora Ivonne Nieto. Por el préstamo de equipos que permitieron parte del desarrollo de este trabajo. Mil gracias. A la Química Sandra Liliana Molina. Nhora Mora.A la veterinaria Amparo Cortes Sierra. por su amor incondicional. Laboratorio de Productos Naturales Marinos. por estar siempre a mi lado y por ayudarme en momentos difíciles. Gracias. Director del Laboratorio de Toxicología Acuática Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. A mi familia. Gracias. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. gracias por su ayuda. . gracias por su asesoría y amistad. Al profesor Jaime Fernando González. Heidi. Diana Ochoa. Mario Muñoz. A mis amigos Carolina Montaño. Gracias por toda su ayuda y sus palabras de apoyo. Matilde. Marlon. Laboratorio de Toxicología. Yenny Pinilla. A la Profesora Liliana Betancourt. Humberto. Eliana Espitia. aeruginosa..VI Resumen y abstract Resumen La fracción lipídica del estípite de Shiitake fue analizada por Cromatografía de Gases acoplada a espectrometría de Masas encontrándose que está constituida por ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos saturados e insaturados.22-dien-3β-ol (3. junto con el acido linoléíco exhiben actividad antimicrobiana frente a S.39%).22-tetraen3β-ol (1. Shiitake. enteriditis y E. Así mismo.22–trien-β-ol (ergosterol) con un 39. epóxiesteroles y cetoesteroides. nutraceútico. siendo el mayoritario de ellos el ácido linoléico (25. triterpenoides. el Ergosta-7.9(11). enteritidis.21%). análisis proximal. En cuanto a los compuestos de carácter triterpenoide estos corresponden estructuralmente al núcleo ergostánico. dentro de los cuales se encuentran esteroles. actividad antibacteriana. La determinación de la actividad antibacteriana mostró que todos los esteroles. seguido del Ergosta7-en-3β-ol (8.08%).5.22pentaeno) en una proporción del 1. indicando que son estos compuestos los responsables de la actividad antimicrobiana previamente reportada para el extracto clorofórmico del estípite de Shiitake. S.9(11). coli. S. siendo el mayoritario el ergosta-5. .7. Palabras clave: Estípite.7. ácido palmítico(10.7. se encuentra presente un triterpeno (Ergosta-2.91%.52%. aureus.29%) y el Ergosta-5.52%). Ps. and ergosta-5. antibacterial activity.08%). Testing to determine antimicrobial activity showed that all sterols together with linoleic acid exhibit antibacterial activity against S. Shiitake.Resumen y abstract VII Abstract When we analyzed the lipid fraction the Shiitake stipe by gas chromatography coupled with mass spectrometry. enteritidis and E.91% of a triterpene . ergosta-7 . aureus.7. Key words: Stipe. followed by ergosta-7-en-3β-ol (8.39%).7. 7.29%). . nutraceutical. proximate composition. The largest part are ergosta-5.9 (11). 1. 52%. 22 -tetraen-3β-ol (1.is also present.5. aeruginosa.22-dien-3β-ol (3. S.21%). triterpenoids. palmitic acid (10. This indicates that these compounds are responsible for the antibacterial activity previously reported for the chloroform extract of the Shiitake stipe. Ps. of which the largest part were linoleic acid (25. we found that it was composed of methyl and ethyl esters of saturated and unsaturated fatty acids.22-trien-β-ol (ergosterol) with 39.9(11). S. enteritidis.ergosta-2. coli.52%). epoxysterols and ketosteroids. Triterpenoid compounds have ergostane cores placing them structurally in the larger group of molecules which includes sterols.22pentaene . .......................................................................................2.... 28  2............2......................2............................................................................................................ 1  1..................................... 27  2................................4 Extracción de polisacáridos ...............................................................................................2...............XVI  Lista de símbolos y abreviaturas ..... VII  Lista de figuras ....................................................................................................................2.................................................................................................... 28  2.......................................................................1 Generalidades de los hongos ..................................... 26  2........................................................................................ 29  2............. 29  2..............................................................................................2 Materiales y métodos .... ......................................... 28  2.............................................. 2  1........................XVII  Capitulo 1......................................................................................................................................2 Análisis proximal ...........VIII Contenido Contenido Resumen....3 Planteamiento del problema .... ............... 5  1........................................................................ 8  1..................3 Resultados y discusión ........................................1 Valor nutricional del Shiitake.................................... 30  ..................................... Valor nutricional del estípite de Shiitake ..................................2 Shiitake (Lentinula edodes)..................................................................3 Análisis de minerales ................. VI  Abstract .....................4 Bibliografía ............................................1 Introducción ............................................... XI  Lista de tablas ............................................... 17  Capitulo 2........................................................2............................................ 5  1............................... XIII  Lista de diagramas ...................1 Material fúngico ............................................................. 28  2........6 Cuantificación de β-Glucanos ..... 28  2..... 16  1....................... Estado del arte .........5 Cuantificación de polisacáridos totales ...................2 Valor medicinal del Shiitake ..2....................2............ ........... 74  4.....................................5 Separación y purificación de los compuestos triterpenoides por cromatografía en columna (CC) ...........................................3.... 69  3......2 Materiales y métodos ........................6 Purificación de las fracciones por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) semipreparativa ............... 44  3.............4 Evaluación de la actividad antimicrobiana ........................................................................... 67  3........4 Conclusiones ..................3 Elección del disolvente de extracción ................................................................ 75  4................................................................... Determinación de ácidos grasos.......................1 Introducción .....................2.....2......................2................................. 40  3........................................... ésteres de ácidos grasos y compuestos triterpenoides del estípite de Shiitake ..........................................................................................................................................5 Cuantificación relativa de los compuestos mayoritarios del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) .3...................................... 43  3.................................................... 35  2.............3................................ 68  3................................1 Material fúngico ................... 39  3...........................................5 Bibliografía .......2 Materiales y métodos ......1 Material fúngico .................3 Microorganismos utilizados ..................................4 Extracción de los compuestos triterpenoides .........................................2........................................................2 Extracto clorofórmico crudo .....................................1 Introducción ..3 Resultados y discusión ...................................2.................................................6 Purificación de las fracciones por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) con columna semipreparativa ....... 39  3........................................ 41  3.....1 Elección del disolvente de extracción ................................. 39  3..........................2 Técnicas cromatografías utilizadas..........................3...............................3........................... Actividad antimicrobiana del estípite de Shiitake ........................................................5 Biblografía ................................................................ 38  3....... 74  4............. 75  ................2.................................................... 44  3......................... 75  4........................................................4 Fracción de triterpenoides presentes en el extracto de estípite de Shiitake .......................................... 53  3......................................................3 Resultados y discusión ........................ 70  Capitulo 4..................Contenido IX 2................................. 45  3.........2...2 Compuestos utilizados en la actividad antimicrobiana . 74  4.......................................................................................... 39  3........... 35  Capitulo 3.........2............ 74  4.................. 73  4..................2............................4 Conclusiones .. 40  3.2...................... ................. 97  Anexo 1: Desviación estándar y coeficiente de variación ....... 86  4.........................................................................3.... Conclusiones generales y perspectivas .....................................3.. 85  4.................. 98  ................................X Contenido 4.......................... 87  5...........................................................................................1 Actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas .................................................5 Bibliografía ....................... 77  4...................4 Conclusiones ..2 Actividad antimicrobiana del extracto crudo del estípite contra bacterias benéficas ..................................................... .............49 Espectro de masas del compuesto 4 .......................................................................................................................................50 Espectro de masas del compuesto 5 ....48 Espectro de masas del compuesto 2 ......................................3-1...................33 Curva de calibración de β-1............................................44 Figura 3-2: Cromatograma de gases del extracto clorofórmico crudo del estípite de Shiitake .................................................................................51 Espectro de masas del compuesto 7 ....................................................................................53 ................Contenido XI Lista de figuras Figura 1-1: Figura 1-2: Figura 1-3: Figura 1-4: Figura 2-1: Figura 2-2: Figura 3-1: Cuerpo fructifero de un Basidiomiceto Amanita cesarea .......................48 Espectro de masas del compuesto 3 ................................................................48 ........................47 Espectro de masas del compuesto 1 .............................................................................. 9 Estructura de la eritadenina ..................... 3 Hongo Shiitake ..50 Espectro de masas del compuesto 6 ...............................................................10 Curva de calibración de glucosa ..................................................................................................................................... 5 Estructura del lentinan .............................................46 Figura 3-3: Figura 3-4: Figura 3-5: Figura 3-6: Figura 3-7: Figura 3-8: Figura 3-9: Figura 3-10: Figura 3-11: Figura 3-12: Cromatograma de gases de la fracción 17.................................................................6 glucanos ......................................................................................... ...................................52 Cromatograma de gases de la fracción 102-121 .......................................................................34 Cromatogramas de gaeses del extracto metanólico y clorofórmico del estípite de Shiitake.............51 Cromatograma de gases de la fracción 65-88 ......... .....69 ...XII Figura 3-13: Figura 3-14: Figura 3-15: Figura 3-16: Figura 3-17: Figura 3-18: Figura 3-19: Figura 3-20: Figura 3-21: Figura 3-22: Figura 3-23: Figura 3-24: Figura 3-25: Figura 3-26: Figura 3-37: Contenido Espectro de masas compuesto 1T ..............................................................................................62 Espectro de masas compuesto 11T ...............................................................................59 Espectro de masas compuesto 7T ....................68 Cromatograma CLAE de la fracción 122-133 ..............................................................55 Espectro de masas compuesto 3T ............56 Espectro de masas compuesto 4T ..........................63 Espectro de masas compuesto 11T ...................................................................................................................................................................................................................................60 Espectro de masas compuesto 10T .58 Cromatograma de gases de la fracción 198-204 ...........................................63 Espectro de masas compuesto 12T ...................................................................................................................................54 Espectro de masas compuesto 2T .....57 Espectro de masas compuesto 5T ...................................................56 Cromatograma de gases de la fracción 122-133 .........................65 Cromatograma CLAE de la fracción 102-121 ..............59 Espectro de masas compuesto 8T .............................................. ............................................................................................... 6  Composición de aminoácidos del Shiitake .......11  Compuestos triterpenoidales asilados del Shiitake (Lentinula edodes) .....................................67  Tabla 4-1: Tabla 4-2: Actividad antimicrobiana del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake .......................................... de sorgo y de torta de soya .........30  Tabla 2-3: Contenido de minerales del estípite de Shiitake........Contenido XIII Lista de tablas Tabla 1-1: Tabla 1-2: Tabla 1-3: Tabla 1-4: Tabla 1-5: Tabla 1-6: Tabla 2-1: Tabla 2-2: Composición proximal y de minerales del Shiitake ..............81  ............................................................................ 7  Estudios de actividad antimicrobiana del Shiitake (Lentinula edodes) ...77  Actividad antimicrobiana a menor concentración .......................................................15  Composición proximal del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) ................................................................................................12  Compuestos triterpenoides con actividad antimicrobiana ...... 6  Composición de ácidos grasos del Shiitake ................................................................................................................................... de maíz....52  Tabla 3-2: Componentes mayoritarios de la fracción triterpenoidal del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) .31  Tabla 3-1: Componentes mayoritarios de la fracción grasa no triterpenoidal del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) ..............................66  Tabla 3-3: Componentes mayoritarios del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) ...............................................................30  Comparación entre la Composición proximal del estípite de Shiitake y la de ingredientes básicos en la dieta de aves ...................................................................................... .........................................................86 .......................................83  Actividad antibacteriana de compuestos puros frente a S.........XIV Tabla 4-3: Contenido Actividad antimicrobiana de los compuestos asilados del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake ...........85  Actividad antimicrobiana del extracto crudo del estípite contra bacterias benéficas .................80  Tabla 4-4: Tabla 4-5: Tabla 4-6: Actividades antimicrobianas reportadas para hongos Basidiomicetos ................................. aureus ......................................................................... . ..............76 .........................43  Fragmentaciones del compuesto 8T ............................61  Fragmentaciones de los compuesto 11T-13T ..............................................42  Purificación de las fracciones por CLAE semipreparativa ...............................29  Obtención del extracto clorofórmico crudo ..................XVI Contenido Lista de diagramas Diagrama 2-1: Diagrama 3-1: Diagrama 3-2: Diagrama 3-3: Diagrama 3-4: Diagrama 3-5: Diagrama 3-6: Diagrama 4-1: Extracción de carbohidratos .....66  Método de difusión en agar ...............41 Cromatografía en columna del extracto clorofórmico crudo...............................................................64  Fragmentaciones del compuesto 12T ....................................................................................................................................... Contenido XVII Lista de símbolos y abreviaturas Abreviaturas AcOEt CC CCD CLAE CG CG-EM CHCl3 CL CZ LB EM M⁺ m/z MeOH min PM Tol tr uma Término Acetato de etilo Cromatografía en columna Cromatografía en capa delgada Cromatografía liquida de alta eficiencia Cromatografía de gases Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas Cloroformo Cadena lateral ZnCl2 en metanol al 30% Liebermann-Burchard. Espectro de masa Pico del ión molecular Relación masa/carga Metanol Minutos Peso molecular Tolueno Tiempo de retención en minutos para CG Unidad de masa atómica . . Estado del arte .Capitulo 1 1 Capitulo 1. et al. . el cual vive y se desarrolla en el suelo o en el substrato en donde crece (Miles.  Clasificación de los hongos En la naturaleza es posible encontrar una gran variedad de hongos y los criterios utilizados para su clasificación se basa fundamentalmente en sus características morfológicas. algunos hongos son importantes en la industria de quesos. la industria y la alimentación. 1999). teniendo que utilizar un microscopio para su observación. está la excelente fuente de vitaminas. vinos y otros en las cuales se utilizan para mejorar sus propiedades organolépticas y/o producir alimentos funcionales. unicelulares o pluricelulares. farmacológicos y bioquímicos (Guzmán. Dichas fructificaciones son a las que comúnmente se les llama “hongo”. los estudios realizados sobre estos organismos han permitido incrementar su conocimiento en aspectos taxonómicos. (figura 1. fibra y minerales que aportan los hongos comestibles (Miles.  Qué importancia tienen los hongos? En la naturaleza su función principal es descomponer y transformar la materia orgánica en sustancias más simples y asimilables para ser utilizadas por otros seres vivos. nutricionales. como por su acción en el ecosistema y al hecho de que han estado ligados al hombre desde tiempos inmemoriales. ecológicos. Los superiores o macroscópicos (macromicetos). Pero también pueden desarrollarse formando asociaciones de beneficio mutuo con las raíces de las plantas (micorrizas) y con algas dando origen a los líquenes. de ahí que se llamen también hongos microscópicos o micromicetos. La era de los antibióticos se inicia con el descubrimiento de la penicilina. 1992).1 Generalidades de los hongos Debido a la importancia que tienen los hongos dentro de la naturaleza tanto por su papel en la alimentación humana y en la prevención de enfermedades. obtenida a partir del hongo Penicillium notatum. proteínas. sin embargo estas estructuras constituyen el fruto (cuerpo fructífero) del verdadero hongo. los hongos han jugado y juegan un papel muy importante en la medicina. Los inferiores son los que no se pueden ver a simple vista. Aunado a lo anterior. et al.1) son las populares “setas” cuyo órgano productor de esporas es lo suficientemente grande para ser visto por el ojo humano y que se recolectan en bosques o en otros casos se cultivan.  Qué son los hongos? Los hongos son organismos eucariotas. En relación con el hombre. Así mismo. cerveza.2 Capitulo 1 1. et al. 1999). que presentan nutrición heterotrófica y se reproducen por esporas asexuales y sexuales. Existen varias clasificaciones para los hongos una de ellas los agrupa en inferiores y superiores. los comestibles y los no comestibles. 1978). también se puede hacer una clasificación sencilla de acuerdo a su comestibilidad. Desde tiempos remotos en la historia primitiva del hombre. todos cultivados en China. como en Norte América. Los romanos conocían varios hongos comestibles y venenosos. De allí se derivan dos grupos.Capitulo 1 Figura 1-1: Cuerpo fructífero de un Basidiomiceto Amanita cesarea 3 Fuente: Recuperado. con alrededor de 1400 años de antigüedad. abril 11 de 2012 en: http://commons. a pesar de la potencialidad que existe en la región para . et al. El cultivo de los hongos comestibles es actualmente una actividad que es desarrolla ampliamente en diversas partes del mundo. Chang. et al. Agaricus bisporus fue cultivado por vez primera en Francia por los años de 1650 y es actualmente el hongo con mayor desarrollo tecnológico y una gran producción a nivel mundial (Chang. Teofrasto y Plinio describieron el consumo de los hongos comestibles en su tiempo. Europa y el sureste de Asia. por lo que han jugado un papel muy importante en la dieta de muchos pueblos (Chang. Los hongos comestibles cultivados más antiguos son de las especies Auricularia auricula. 2004). 1978). ya se conocían una gran variedad de especies de hongos comestibles. Lentinula edodes con aproximadamente 1000 años y Volvariella volvacea con 300 años. Flammulina velutipes con alrededor de 1100 años.wikimedia. conocido popularmente como “Shiitake” (Chang 1980. et al. Los griegos Eurípides. Es así como los basidiomicetos (pertenecientes a los macromicetos) incluyen especies venenosas como la Amanita phalloides y especies importantes por su comestibilidad y relación simbiótica con plantas como el caso de Amanita caesarea o por su valor nutritivo y características organolépticas como el Agaricus bisporus (champiñon de Paris) (Polese 2005).org/wiki/File:Amanita_Cesarea_(diagrama). En América Latina.png Dentro del gran grupo de hongos macromicetos. los japoneses aprendieron hace siglos la técnica para cultivar Lentinula edodes. útiles en el mantenimiento de una buena salud física. En Colombia. el cultivo de estos se ha desarrollado muy poco (Martínez-Carrera. et al. et al. et al. . 1992). 1999). Alfredo Beck. Por ejemplo. Recientemente se ensayo con mejores resultados el cultivo del Shiitake sobre desechos orgánicos agroindustriales como la zoca y la borra de café (Jaramillo. et al. el Shiitake. El mismo iniciador del cultivo de champiñón en Bogotá. significativo contenido de proteínas. et al. Cuando su consumo se efectúa mediante la utilización de sus extractos o compuestos que han sido extraídos de sus fructificaciones y/o micelio se habla entonces de nutricéuticos y presentan un gran potencial tomados como suplementos nutricionales. además de sus funciones nutricionales básicas.  Los hongos como alimento funcional Un alimento funcional es todo aquel alimento que al ser consumido como parte de la dieta diaria. comprende cerca del 25% de la producción mundial. estos hongos se han incorporado en el tratamiento de diversas enfermedades lo cual ha llevado a un incremento en su producción en las últimas décadas. es el segundo hongo comestible mas cultivado. los cuales sirven tanto para la prevención como para el tratamiento de varias enfermedades (Miles. después del Agaricus bisporus (Chandra. minerales. Su potencial en el mercado interno depende mucho de la educación que reciba el consumidor y de la persuasión acerca de sus cualidades nutritivas. Adicionalmente. introdujo el cultivo del Shiitake (Lentinula edodes) sobre granos de cereales esterilizado. Los hongos comestibles en los últimos años han sido objeto de intensa comercialización por su valor nutritivo dada su importancia en la alimentación debido a su valor dietético (bajo contenido en grasas).4 Capitulo 1 cultivar especies que se desarrollan de manera silvestre y de la enorme tradición etnomicológica que existe para el consumo de los hongos comestibles. sin pasar de su etapa vegetativa solo con el propósito de producir micofarina. ayudando en la reducción del riesgo de enfermedades (Valencia. et al. Cuando se consumen como parte de una dieta normal nos podemos referir a ellos como nutracéuticos. 2004). Precisamente a partir de 1950 se cultivo en la sabana de Bogotá el Champiñon (Agaricus bisporus) para abastecer un mercado nacional que demanda tantos champiñones frescos como enlatados. 2011). cultivo que se fue expandiendo en el país. ácidos grasos esenciales y vitaminas que los posiciona por encima de la mayoría de vegetales y frutas (Guzmán. es capaz de producir efectos metabólicos o fisiológicos. 1998). 2001). Basados en este concepto los hongos comestibles son considerados un excelente alimento funcional que proporcionan valores nutricionales altos y beneficios para la salud. hasta la mitad del siglo XX se consumían solamente champiñones (Agaricus bisporus) importados por estratos altos y no con mucha frecuencia. como el de caña de azúcar y de café. valor que es ligeramente menor a la de alimentos como carne de res 24-31%. algunos tipos de bagazo. indica que es una buena fuente de proteínas.  Clasificación taxonómica Figura 1-2: Hongo Shiitake Shiitake •Reino: Fungi •División: Eumycota •Subdivisión: Basidiomycota •Clase: Hymenomycetes •Orden: Agaricales •Familia: Thricholomataceae •Género: Lentinula •Especie: edodes Shiitake Shiitake Fuente: Recuperado.5% y . tanto en la agricultura como en la fuentes hídricas por la contaminación que ellos producen (Guzmán.Capitulo 1 5 1.2. La composición nutricional del Shiitake (Tabla 1-1). Y es precisamente el hecho de que este hongo se desarrolle sobre residuos agroindustriales lo que lo hace todavía más importante. ya que se pueden emplear para degradar materiales residuales que constituyen un problema ambiental.mdidea. 1. cerdo 23-24%.1 %. como la que contienen la madera y sus derivados. el trigo 14. en su denominación latina hace referencia a su forma de lente “Lentínula” y “edodes” por ser comestible. donde “Shii” es un tipo de árbol donde crece naturalmente y “take” significa hongo. et al.html  Generalidades El nombre Shiitake es tomado del idioma Japonés. El Shiitake es un hongo basidiomiceto cuyo nombre científico es “Lentinula edodes”. mayo 10 de 2012 en: http://www. 1993). También se le conoce como “hongo negro del bosque” y “Shiang-gu”.1 Valor nutricional del Shiitake. (Carvajal 2001) y mayor a cereales como el maíz 8.com/products/new/new05911.2 Shiitake (Lentinula edodes). Crece de forma silvestre sobre residuos de lignina y celulosa. 3 mg 5. al compararlo con cereales como maíz.7% 0.2 Linoléico C18. Longvah. seguido del ácido palmítico (19. calcio. de los cuales el 77.1 mg 0. 2004). et al. 2003) también tiene un alto contenido de fibra y concentraciones altas de minerales como potasio.0 Araquídico C18.3% 77. et al. Tabla 1-2: Composición de ácidos grasos del Shiitake Ácidos grasos C 16.3% 68.4 g 439 mg 200 mg 127 mg 4.2%.7% . El ácido linoléico es el ácido graso insaturado que se presenta en mayor proporción (68. et al. Sauvant.7 g 22. 2010. 2003).0 Palmítico C 18. proporcionándole al hongo un valor adicional ya que estos son esenciales y por ende requeridos en la dieta humana.4% 8. 2006. et al. trigo.0 Esteárico C 20. sorgo (Sauvant. Martínez-Carrera.6 Capitulo 1 leche 3-4% (Calderón.2 g 6. magnesio.9 mg *Valores expresados en base en materia seca Fuente: (Bisen.2%).3 Linolénico Total de saturadas Total de insaturadas *Valores del porcentaje total de grasa Concentración 19.8% 0. manganeso y cobre (Bisen. avena.2% 2.0 g 64.7% son insaturados (Tabla 1-2).8 g 3. et al.1 Oleico C18.88%). 2010. Tabla 1-1: Composición proximal y de minerales del Shiitake / 100 g de muestra Componentes Humedad Proteína Cruda Grasa Cruda Cenizas Carbohidratos y fibra Fósforo Magnesio Calcio Zinc Manganeso Cobre Concentración 4.6% 22. es importante destacar la presencia de ácidos grasos. et al. et al. 1998) Si bien el contenido de lípidos totales en el Shiitake es bajo 3. carbohidratos.8 4. siendo la fibra del Shiitake de un tipo particular que en estudios clínicos parece ser beneficiosa para el colon. et al.6 8. .8 32. muestran que el Shiitake posee solamente un 18% de proteína cruda. 2002).8 97.3 8. 1998) Concentración g/16g N 3. vitaminas y minerales. esta seta contiene los 9 aminoácidos esenciales en proporción similar a la ideal para nutrición humana. et al. como una fuente de proteína. 1998) 7 Estudios realizados por Crisand y Sands (1978) citados por Miles y Chang (1999). incluyendo leucina y lisina en grandes cantidades (Tabla1-3). con el valor agregado de que. atribuyéndole al consumo del hongo la baja incidencia de cáncer de colon en la población oriental (Smith. B12.0 9. Longvah. B2. Según Shu-Ting Chang. B6. 2010. D. Tabla 1-3: Composición de aminoácidos del Shiitake Aminoácidos Treonina Valina Cisteina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Lisina Histidina Arginina Aspartato Serina Glutamato Prolina Glicina Alanina Total de amino ácidos esenciales Total de amino ácidos Fuente:(Bisen. grasas.2 Del análisis anterior se ve claramente que el Shiitake puede ser utilizado en la alimentación humana y animal. 2010. los cuales por lo general están ausentes en la mayoría de cereales y sus subproductos. Philip G.1 7. fibra. estudios comparativos realizados con hongos de gran aceptación y consumo como son los típicos champiñones. Además contiene cantidades significativas de vitaminas A.9 5.Capitulo 1 Fuente: (Bisen.3 3.2 6. C.9 7. 2010).4 2. en ella se encuentran todos los aminoácidos esenciales para el hombre. et al. profesor de biología en la Universidad del Estado de Nueva York. Longvah. B1.2 6. profesor de biología en la Universidad china de Hong Kong.7 1. Miles. et al.3 4.0 5. niacina. indican que contiene cerca de dos veces el volumen de la fibra que éstos. et al. pro-vitamina D (Bisen.4 0. Si bien esta cantidad es baja si se la compara con la obtenida de la carne. y Dr.3 12. et al. Wasser 2005). 2010. antiviral y potencial antimicrobiano.2 Valor medicinal del Shiitake En la medicina oriental se ha empleado durante milenios principalmente en el tratamiento de la hipertensión y en la disminución del colesterol en sangre. así como para la prevención y el tratamiento de muchas afecciones al punto de ser conocido como el “elixir de la vida” (Liu 2004) y es conocido tradicionalmente en la culturas orientales como nutracéutico. et al. células N-K (natural-killer). et al. macrófagos citotóxicos y anticuerpos. donde es utilizado en asociación con la quimioterapia en el tratamiento de cáncer gástrico. hipocolesterolemica. nombre del producto Shiitake y Maitake contenido Lentinan y G. et al. frondosa) En todas las etiquetas se especifica que el propósito no es tratar. En países americanos y europeos. et al. este producto es comercializado como suplemento dietético (nombre del producto Betaglucanos de levadura. 2011. curar o prevenir alguna enfermedad y que estos no han sido evaluados por la FDA (Llauradó. 2011. Las investigaciones realizadas hasta el presente arrojaron como resultado que las propiedades medicinales son debidas a la producción de metabolitos secundarios.6 y β -1. cerevisiae.3 y 1.8 Capitulo 1 1.3. Hearst. estimulando al máximo el sistema inmunológico de los pacientes (Bisen. Martínez-Carrera.2.6) de: S. 2010. et al.3 glucano con ramificaciones glucopiranósidas β -1. varios de los cuales han sido aislados y evaluados como compuestos con actividad farmacológica. colorrectal y de mama. Lindequist.  Actividad antitumoral e inmunomoduladoras Las propiedades antitumorales e inmunoestimuladoras reportadas se atribuyen a la presencia de polisacáridos de alto peso molecular como el “lentinan” que es el polisacárido más importante aislado del Shiitake. et al. contenido β-glucanos (1. antioxidante y antibacterial (Bisen. prolongando eficazmente la sobrevivencia de pacientes. inmunológico y complementario. que corresponde a un β-1. Dentro de las bioacciones presentadas por ellos se destacan actividad antitumoral e inmoestimuladora. et al. 2009. Lindequist. diagnosticar. L. Como antitumoral la administración de este polisacárido produce reacciones biológicas inmediatas. específicas y no específicas. et al. 2005. Rop. tales como las células T. 2004). edodes. a nivel celular. El lentinan fue descubierto en Japón. Shah. Mizuno 1996. et al. 2009. . y de estructura de triple hélice (Figura 1-3). se encuentra formando parte de la pared celular de los hongos y se le atribuye propiedades antitumoral. 2005). El “lentinan” estimula la producción de células antitumorales naturales.  Actividad hipocolesterolemica La eritadenina (Figura 1-4) compuesto denominado también lentinacina o lenticina. alanina y prolina) dentro de la cadena peptídica. que contiene aminoácidos (serina. Del fraccionamiento del LEM se obtiene el EP3. carbohidratos (10% ) y proteína (10% )(Mizuno 1995. 1983). Su modo de acción no inhibe la biosíntesis del colesterol sino que acelera la excreción del colesterol consumido y su . péptido α-manano. B2(riboflavina) y ergosterol. Del cultivo del micelio se obtiene también el KS-2. arabinosa. Smith et al.glucanos como las glicoproteínas exhiben además actividad inmunoestimuladora o inmunopotenciadora. 1999. El LEM y LAP contienen en común galactosa.tiene la capacidad de reducir el colesterol y lípidos en animales. Suzuki.Capitulo 1 9 Figura 1-25: Estructura del lentinan HO HO H OH H H CH 2OH H H O HOH 2C H HO O H O H H OH H HO HO H H CH 2OH H H OH O H 2OH H CH H2C O O O HO H HO HH O O H H O H H OH H OH H H2C O HOH 2C HO H O H HO HH O O H H H OH H O H OH H Igualmente se encuentran en el hongo glicoproteínas como son el LEM (micelio Lentinula edodes). 2002). et al. Yamashita. 2004. et al. Tanto los β. que se produce a partir de un extracto en polvo de los micelios del hongo y el LAP es un precipitado obtenido de una solución acuosa del micelio. manosa y fructosa. lo que puede generar diferentes efectos terapéuticos (Wasser et al. particularmente del carcinoma de Ehrlich y del Sarcoma 180 (Martínez-Carrera. xilosa. el cual es capaz de inducir la producción de interferón. Wasser 2005). 1979. inhibiendo eficazmente el desarrollo del cáncer. compuestos de vitamina B especialmente B1 (tiamina). sustancia inmunoactiva consistente en un complejo de lignina (80%). Ambos extractos han demostrado tener fuerte actividad antitumoral al administrarse en animales y humanos. et al. ya que son modificadores de la respuesta biológica de un organismo (MRB) debido a la estimulación del sistema inmunológico. también sean utilizado para el tratamiento de hepatitis B. adicionalmente el LEM incluye derivados de ácidos nucleicos. treonina. et al. derivados disulfuros. se ha reportado dicha actividad en micelio y medio de cultivo proveniente de la fermentación en estado sumergido del Shiitake. así como Kabir y Kimura en 1989. ácido gálico y el lentinan. Chivata. lo que se ha convertido según la OMS (Organización Mundial de la Salud) y algunos autores como la mayor emergencia y el problema de salud pública más importante en la actualidad (Hearst et al. Así mismo. Son varias las investigaciones que ponen de manifiesto el hecho de que los principios activos contenidos en los extractos clorofórmicos. Es importante anotar que la actividad antimicrobiana varía de acuerdo al tipo de extracto evaluado y que en algunos casos se atribuye la actividad de los mismos a compuestos tales como la lentionina. 2007). adicionó 0. Kimoto y colaboradores en 1976. La relevancia de este hongo en la búsqueda de nuevos compuestos antibióticos radica en que se ha considerado como una posible fuente natural de ellos (Kitzberge et al. 2009). reduce la presión arterial y remueve los lípidos del sistema circulatorio (Wasser. 1999).005% de eritadenina en el alimento para ratas. Rokujo y colaboradores en 1969 concluyeron que la actividad de la eritadenina es mayor si se tiene una dieta alta en grasas.10 Capitulo 1 descomposición metabólica. Figura 1-3: Estructura de la eritadenina NH2 N N N HO HO N H H COOH  Actividad antimicrobiana La actividad antrimicrobiana de extractos de Shiitake reviste especial importancia en los últimos años dado la aparición de muchas cepas bacterianas multirresistentes. . acuoso y en acetato de etilo a partir del cuerpo fructífero del Shiitake exhiben actividad antibacteriana sobre un buen número de microorganismos (Tabla 1-4). llegaron a la conclusión de que una dieta alimenticia con Shiitake reduce el colesterol libre en el plasma sanguíneo. en 1969. observando una disminución del 25% del colesterol total en tan sólo una semana. . Lactobacillus spp.. Pseudomonas fluorescens. Escherichia coli y Candida albincans Bacillus cereus. Sthaphylococcus aureus. Porphyromonas spp... Scedosporium apiospermum Bacillus subtilis. et al. 2007) Carpóforo Acuoso Carpóforo Acuoso Bacillus cereus. Micrococcus luteus. Streptococcus sobrimus. Klebsiella erogenes. Enterobacter sp. Listeria monocytogenes.. Bacillus pumilis. Aspergillus niger. et al. Enterococcus spp. Salmonella poona.. Escherichia spp. Actinomyces spp. Aspergillus flavus. et al. Eschericha coli (Hearst. 2009) (Pereira.. Campylobactor jenjuni. Bacillus subtilis. Serratia marcescens. Sthaphylococcus aureus. Eschericha coli Extracto Cloroformo Referencias Carpóforo Acetato de etilo Acuoso (Hirasawa. Serratia/Rapnella sp. Enterococcus faecalis.. Bacillus subtilis. 1999) Micelio Cloroformo Metanol (9:1) (Hatvani 2001) Micelio Acuoso (De Carvalho. Eschericha coli. Salmonella typhymurium. Bacillus cereus. Micrococcus luteu s y Candida albincans (Kitzberger. Escherichia coli. Streptococcus mutans. Candida glabrata. Sthaphylococcus aureus.. Sthaphylococcus spp. Klebsiella pneumoniae.. Pseudomonas aeruginosa. Exophiala dermatitidis Penicillium sp. Streptococcus pyogenes. 2011) . Pseudomonas sp... y Candida spp. et al. Prevoytella spp. Klebsiella pneumonia. Enterococcus faecalis. Cupriavides sp. Sthaphylococcus epidermidis. Aspergillus fumigates. Sthaphylococcus sp. et al. Pseudomonas aeruginosa. Candida krusei... Bacillus spp. Sthaphylococcus epidermidis... 2007) Carpóforo Fluido supercrítico C02 co-solventes Etanol Diclorometano Acetato de etilo Sthaphylococcus aureus.Capitulo 1 11 Tabla 1-4: Material evaluado Estudios de actividad antimicrobiana del Shiitake (Lentinula edodes) Microorganismo ensayado Streptococcus spp. Candida parapsilosis. Candida albicans. Bacillus megaterium. 1981) HO Ergosta-5.22-pentaeno y compuesto como el estigmast-5.8α-epidioxi-(22E. et al. et al.9(11).22-tetraen-3-ol HO (Benavides 2004) .24R)-23-metilergosta-6. 1981) Ergosta-5. Tabla 1-5: Compuestos triterpenoidales asilados del Shiitake (Lentinula edodes) Shiitake (Lentinula edodes) Compuesto Referencia Ergosta-7-en-3-ol HO (Yokokawa.5. triterpenos como el ergosta-2.24R)-23-metilergosta7. esteroles polihidroxilados y epoxidados como: 5α. 1981) HO Ergosta-5.7.7-dien-3-ol. todos ellos con núcleo ergostano. el (22E.9(11). Es bien conocido que compuestos triterpenoides forman parte de los metabolitos secundarios de los basidiomicetos. no comunes para esta seta.7.22-trien-3-ol (Yokokawa.5.22-tetraen-3-ol.24R)-23metilergosta-7.6-triol.22-dien-6-ona. (Tabla 1-5).7-dien-3-ol (Yokokawa.7.22-dien-3. et al.5α.9(11). ergosta-5.7.9α-trihidroxi-(22E. Dentro de los estudios químicos realizados en Lentínula edodes se encontraron esteroles como el ergosta-7-en3-ol. cetoesteroides como la 3β.22-dien-3β-ol.12 Capitulo 1 Dado que extractos en disolventes como cloroformo y acetato de etilo presentan actividad antimicrobiana se puede inferir que compuestos de polaridad baja pueden ser responsables de la bioacción. 5α.24R)-23-metilergosta-7.24R)ergosta-22-en-3β.8α-epidioxi-(22E. 1998) R=H R=CH3 R 3β.8α-epidioxi-(22E. et al.22dien-3. et al. et al. 1998) H 5α.22dien-3β.24R)-23-metilergosta-7.6-triol OH HO OH CH3 (Yahoita.9α-diepoxi-(22E. et al.9α-trihidroxi-(22E.22dien-3β.6β-triol (Yahoita.6β. 1999) (22E. 1998) O R= CH3 5α.5.24R)-23metilergosta-7.24R)-ergosta6.5α.8α.22-dien-6-ona OH HO OH H (Yahoita.Capitulo 1 Shiitake (Lentinula edodes) 13 Compuesto Referencia (22E.24R)-23metilergosta-6.22-dien-3β-ol 5α.5α.7α-diol O H HO O OH (Yahoita.9α-tetrol R HO OH H OH R=H R=OH . et al.6α.22-dien-3β-ol H HO O H O R (Yahoita.24R)-23-metilergosta-7. 1999) 22E. 2000) (22E)-ergosta-6.7. Mora 2010). realizados por el grupo de Investigación de Química de Hongos Macromicetos (Jaramillo 2009. et al. et al. et al. 2000) Ergosta-2.5.7-dien-3-ol (Cucaita 2007) HO O Tilopiol B O HO (Wu.22-pentaeno (Yahoita.14 Shiitake (Lentinula edodes) Capitulo 1 Compuesto Referencia (24S)-ergosta-7-en-3β.6β-triol H HO OH H (Yahoita. los cuales arrojaron .22-trien3β-ol H HO H (Ohnuma. 2009) Con base en lo reportado en cuanto a actividad antimicrobiana de triterpenoides y en los estudios de extractos crudos de hongos. et al. et al.5α.7.8αtriol OH HO OH (Rivera. 1999) OH 22E)-23-metilergosta-5. 1998) Estigmast-5.9(11).22-dien-3β.5α. 8α-epidioxi-(22E. et al.8-epidioxi-5.24R)-ergosta-6. et al.24R)-ergosta-22-en-7-one-6-il 5α.24 dien-21-oico Acido Pinicolico A Acido Trametenolico B Ácido Fomitopsico Ácido 3-acetiloxylanosta-8.5. Elmastasa.22-dien-3β-ol ergosta-2.8α-epoxiergosterol Acido polyporenico C Acido 3-acetiloxilanosta-8. colesta-5.5α-dihidroxi-(22E. Igualmente se reporta que el extracto metanólico del cuerpo fructífero de esta seta muestra una moderada actividad .24-trien-3β-ol ergosta-5.9 – 81.. 2005) (Cateni. 2009) (Zhong.22-dien-6-il Oleato-3β.9(11). Tabla 1-6: Compuestos triterpenoides con actividad antimicrobiana Hongos Ganoderma applanatum Stereum hirsutum Fomitopsis pinicola Fomitopsis pinicola Fomitopsis rosea Tricholomopsis rutilans Agrocybe aegerita Ganoderma lucidum Fomitopsis sp.22.3β-ol Referencia (Zjawiony 2004) (Lindequist. ya que la mayoría de los mismos hacen referencia a las propiedades antioxidantes de los extractos de las fructificaciones.22-dien-3β-ol Ácido 3α-Hidroxi-24-metilen-23-oxolanost-8-en-26carboxilico Ácido 3α-oxepanoquercinico C Ácido 3α-carboxiacetoxiquercinico C Acido poliporenico C Oleato-3β. Así mismo.8α-epoxiergosterol. En el caso del Shiitake su porcentaje de actividad antioxidante (42.9(11).7.5. 2007) (Zjawiony 2004) (Petrova. et al. ergosta-2. et al.22-pentaeno.24R)-ergosta-7.Capitulo 1 15 como resultados que los compuestos triterpenoidales presentes tanto en el micelio como en el cuerpo fructífero de basidiomicetos son en parte responsables de la actividad antimicrobianas para bacterias Gram negativa y Gram positivas (Tabla 1-6) no se puede descartar que sean compuestos de esta clase los responsables de dicha actividad.7.14.5. 2007). 2007) (Popova.5α-dihidroxi-(22E.7. et al.22-hexaeno.22-tetraen. et al.3) fruta aportante de antioxidantes por excelencia (Yang.8-ergosta-6. varias investigaciones permiten ver que la actividad antioxidante de los hongos comestibles es comparable con la reportada para diversos productos vegetales. 2009) (Zhong.7. et al.24-dien-21-oico Acido pinicolico 5α. 2009) (Jaramillo 2009) (Mora 2010)  Actividad antioxidante Los estudios sobre esta actividad en hongos son escasos y muy generales.22-tetraen-3β-ol) Ergosta. et al.8) es comparable a la manzana (58. sin precisar que compuestos son los responsables de dicha bioacción (Avila 2010.7.9(11). 2002).dien-3β-ol 5α. 24-demetil-5α.8α-epidioxi-24(ξ)-metilcolesta-6.22-dien-3-ol 5. Compuestos triterpenoidales 5-Ergosta-7-en-3β-ol 5-ergosta.7.9(11).4–92. lo cual los convierte en una excelente alternativa como fuente de antioxidantes. existe la necesidad permanente de investigar nuevas y diferentes fuentes de alimentación y de revaluar los ingredientes comúnmente usados.16 Capitulo 1 antioxidante evidenciada por su porcentaje de peroxidación de lípidos (Kitzberger. buscando. siendo ampliamente utilizada en dietas para aves (Lesson. en los alimentos balanceados para los animales. dando así una solución a los . Tal es el caso particular del hongo Shiitake. con base en el estudio químico y farmacológico. 2000). lo que los posicionan como aportantes a la dieta de un muy buen contenido de proteína de alta calidad (aminoácidos esenciales) así como vitaminas. Al revisar los trabajos publicados en los últimos años. alimento considerado como “nuevo” en muchas partes de Norteamérica cuando en otros países se ha empleado desde hace 20 – 30 años (Leeson et al. 1. que sean económicos y de fácil consecución y que además cumplan los requerimientos nutricionales propios de los animales a que van dirigidos y siendo los macrohongos y dentro de ellos el Shiiitake. et al. et al. sino que no habían sido considerados como tales en una determinada región geográfica. et al. que por sus características fibrosas no es aceptado por el consumidor debido a su baja palatabilidad. minerales y ácidos orgánicos (Bisen. 1998). en cuyo ciclo de comercialización se presenta una pérdida de un 15 a 20% de la eficiencia biológica. Debido a que el alimento representa el mayor costo de producción de cualquier producto avícola. Un claro ejemplo lo constituye el trigo.3 Planteamiento del problema La proteína es esencial en las dietas ya que para satisfacer los elevados requerimientos nutricionales de los animales se necesitan altos niveles de ella. se observa que la evaluación de ingredientes ocupa la mayor parte de la investigación en nutrición aviar práctica y las compañías que elaboran alimentos para aves deben estar al tanto del potencial que representan estos nuevos ingredientes (Lesson. La necesidad sentida de contribuír en la búsqueda de estos ingredientes. A menudo ciertos “ingredientes nuevos” no lo son en realidad. el potencial de utilización del estípite del Shiitake en la producción de un alimento nutraceútico para la dieta de pollos de engorde. permiten pensar en ellos como posibles “ingredientes nuevos” para introducirlos en la alimentación aviar. dando como resultado la generación de desechos que pueden ser utilizados como posibles fuentes de proteína. correspondiente a la mayor parte del estípite. La industria avícola consume una importante parte de la producción total de alimentos concentrados en el mundo. La harina de pescado por ejemplo es considerada la fuente primaria de proteína. et al. los nutraceúticos por excelencia. 2000). 2007). et al. 2000). entre otros aspectos darles utilización en el desarrollo de nuevos productos y en este trabajo en particular en su posible utilización como componente de un alimento aviar. Esta investigación tiene como finalidad el explorar. En este orden de ideas y dado que la producción de hongos comestibles se ha incrementado significativamente en nuestro país. 2010. ha iniciado el desarrollo de proyectos de investigación interdisciplinaria enfocados a la bioprospeccción de los macrohongos. Es por esto que el Grupo de Investigación de Química de Hongos Macromicetos. Longvah. El no aprovechamiento de este desecho se ve reflejado en pérdida económica para los fungicultores. . sino en la posible disminución de la cantidad de antibióticos que las aves deben recibir durante su crecimiento. S.Capitulo 1 17 fungicultores al utilizar un desecho del cultivo y utilizar sus propiedades medicinales para prevenir enfermedades de origen bacterial que pueden atacar a los pollos durante su crecimiento. L. A.. Current Medicinal Chemistry. Bogotá. Yamauchi. nutritent digestibility and metabolizable energy of shiitake mushroom stalk meal. 2005.. 11: (1). Evaluación de aceites esenciales de orégano en la dieta de pollo de engorde.. 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Esta parte del hongo es cerca de un 25 a 30% de la biomasa total. 2007). 2000. et al.1 Introducción En Colombia el consumo de hongo Shiitake se está posicionando con fuerza por las características particulares que presenta como son su excelente sabor. ponen de manifiesto que es una buena fuente de carbohidratos. Turlo. Huila y Cauca (Biosetas Andinas).Capitulo 2 27 2. es muy poco conocido su gran potencial como alimento funcional. Actualmente la producción de setas (denominación dada a los hongos comestibles) en nuestro país es cerca de dos toneladas mensuales en cultivos de Bogotá. Medellín. antimicrobiana y antioxidante que han sido intensamente investigadas. textura. vitamina D y minerales (Bisen. Si bien la principal función de la dieta es aportar los nutrientes necesarios para satisfacer las necesidades nutricionales de las personas. B12. 2008). En este orden de ideas los hongos comestibles son alimentos funcionales por excelencia ya que proporcionan beneficios nutricionales y medicinales. gracias al aporte de los nutrientes básicos y de algunos metabolitos con acción biológica. como evitar las deficiencias de nutrientes y la suficiencia nutricional básica. Yen. En vista de lo anterior se crea la necesidad de buscar alternativas para emplear estos contaminantes ya que ellos pueden ser utilizables. 2004. et al. bajo contenido de grasas. niacina. Adicionalmente los extractos de Shiitake tienen varias propiedades como antitumorales. aroma. En el ciclo de comercialización del Shiitake se descartan los estípites que por su textura fibrosa no son aceptados por el consumidor. Estos cultivos vienen acompañados de generación de desechos que no sólo producen pérdidas a los fungicultores sino que aumentan la contaminación ambiental. B1. hipocolesterolemico. Los estudios que sobre el cuerpo fructífero del Shiitake se han realizado. proteína y aminoácidos esenciales. Hoy en día. cantidades importantes de vitaminas C. antitumorales y antimicrobianas. la ciencia de la nutrición ha evolucionado a partir de conceptos clásicos. et al. que ofrezcan la posibilidad de mejorar las condiciones físicas y mentales. y ocasiona sobre el medio ambiente contaminación por detritos y malos olores (Buwjoom. et al. como es el caso particular del hongo Shiitake (Lentinula edodes) el cual es conocido tradicionalmente en la culturas orientales como nutracéutico por sus propiedades nutricionales. B2. a los conceptos de nutrición "positiva" u "óptima". Las investigaciones han pasado a centrarse más en la identificación de componentes biológicamente activos en los alimentos. existen cada vez más pruebas científicas que apoyan la hipótesis de que ciertos alimentos. Con base en lo anterior y partiendo del hecho de que el estípite debe contener los mismos componentes que el cuerpo fructífero aunado a la necesidad de contribuir en la búsqueda de nuevos ingredientes que sean económicos y de fácil consecución que puedan emplearse en la dieta aviar. antioxidantes. 2010. alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados. así como de reducir el riesgo a contraer enfermedades. et al. así como algunos de sus componentes tienen efectos tanto físicos como farmacológicos beneficiosos. Mattila. El material fresco.1 Material fúngico El estípite de Shiitake.38 (Yang. El factor de conversión de nitrógeno utilizado para la proteína fue de 4. 2.28 Capitulo 2 nutricionales propios de los animales a que van dirigidos se plantea el evaluar el valor nutricional del estípite del Shiitake con el fin de explorar su posible empleo como ingrediente “nutraceútico” en la producción de un alimento en la dieta de pollos de engorde. 2001).2 Materiales y métodos 2. fue proporcionado por la empresa Fungitá.4 Extracción de polisacáridos Los estípites deshidratados y pulverizados.2. Los extractos se reunieron.2 Análisis proximal El análisis proximal se realizó siguiendo los métodos oficiales de la AOAC (2006). se filtraron y se concentraron hasta un volumen de 200 mL. 2.2. Los polisacáridos precipitados fueron filtrados y secados a 40ºC. 2. Todas las determinaciones fueron realizadas por triplicado. para posteriormente ser sometido a proceso de pulverización.3 Análisis de minerales La determinación de minerales se hizo por espectroscopía de absorción atómica y su determinación se realizó siguiendo los métodos oficiales de la AOAC (2006). et al. et al.2. se cortó en láminas delgadas. etanol frio con la finalidad de precipitar los polisacáridos (Yap. de bajo costo y con el valor agregado que aporta metabolitos que proporcionaran a los animales protección contra bacterias patógenas. . aportando al desarrollo de “nuevos ingredientes” al utilizar un componente de excelente contenido proteíco . 2001).2. se secó a una temperatura de 35°C por 36 horas. al cual se le adicionó. 2. se sometieron a extracción sucesivas con agua a 92ºC durante 20 min. para su posterior cuantificación (Diagrama 2-1). previa refrigeración. et al. 2011). el cual fue modificado de la siguiente manera: la extracción de los β-Glucanos se realizo en agua y la cuantificación se hizo a partir de una solución de 2.Capitulo 2 Diagrama 2-1: Extracción de carbohidratos 29 Estipite deshidratado y pulverizado Agua a 92ºC por 20 min.se agita periodicamente Se filtra y se concentra hasta tener un volumen de 200mL aproximadamente Se adiciona etanol frio hasta la precipitación total de carbohidratos Se filtra y se seca en estufa a 35ºC Cuantificación de Carbohidratos 2. 2.6. la cuantificación se hizo a partir de una solución de carbohidratos a una concentración de 1. la solución buffer del rojo congo a un pH=5.2.2.5 Cuantificación de polisacáridos totales La cuantificación de polisacáridos totales se realizó por el método colorimétrico de Dubois (Dubois.3-1.6-glucanos se hizo siguiendo el método empleado por (Nitschke. se utilizó un espectrofotómetro UV/VIS a una longitud de onda de 523 nm.6 Cuantificación de β-Glucanos La cuantificación de β-1.5 mg/mL en NaOH 0. et al. Para medir la cantidad de . 1956). se utilizó un espectrofotómetro UV/VIS a una longitud de onda de 490 nm y empleando una curva de calibración de 0 µg/ml a 100 µg/mL de glucosa.03 mg/mL.1M. torta de soya y sorgo materias primas que son las más utilizadas en dietas para aves (Tabla 2-2).62 Ceniza 5. Grifola frondosa 160 mg Now Beta1.60% **FDN 46. et al.50 Fibra Cruda 30. Tabla 2-2: Comparación entre la Composición proximal del estípite de Shiitake y la de ingredientes básicos en la dieta de aves Ingrediente Estípite Shiitake *Torta de soya *Maíz Amarillo *Sorgo Materia seca 89.80 2. 2000). leguminosa utilizada por la calidad de la proteína. la desviación estándar y el coeficiente de variación.30 Capitulo 2 β-1.72 0. ** FDN: fibra en detergente neutro. se compararon los valores obtenidos en el análisis proximal (Tabla 2-1) con los valores reportados para maíz.3 Resultados y discusión Siendo uno de los objetivos del estudio el evaluar el valor nutricional del estípite para determinar su implementación como ingrediente en alimento aviar. Tabla 2-1: Composición proximal del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) Muestra Estípite Lentinula edodes *Materia seca 89. los porcentajes corresponden al promedio de tres determinaciones. como principal fuente de proteína. 2.00 8.00 *Los valores están expresados en porcentajes con base en materia seca (Lesson. Para cumplir con este requerimiento es necesario incluir en la misma. empleando como patrón una disolución β-glucanos de un producto comercial derivado de hongos comestibles (Maitake.6-D.50 2. pero menor que en la torta .60 7.3/1.70 Proteína 14.40 1.50 3.15 6.00 2.00 86. sorgo).60 9.3-1.80 87. et al.72% *Fibra Cruda 30.31 2.45% *Los valores expresados en porcentaje en base seca. ingredientes como torta de soya.6-glucanos presentes en la muestra se realizo una curva de calibración de 50 µg/ml a 250 µg/mL.15% *Grasas 0. Al comparar los resultados obtenidos para la proteína cruda en el estípite el porcentaje es mayor que en el maíz y el sorgo. El anexo 1 muestra.45 44.30 Grasa 0. 2000)  Proteína El porcentaje de proteína cruda requerido en una dieta de pollos de engorde varia durante el crecimiento entre un 22 % en la etapa de iniciación y un 19% en la etapa de finalización (Lesson.65 % *Cenizas 5.Glucan).57% *Proteína 14.65 89. harina de pescado o de carne y cereales (maíz. fosfato de calcio. de sorgo y de torta de soya Minerales Ca P Na 101 100 100 200 Mg 1363 1079 1500 2700 K 2149 3248 3500 2610 Cu 3 4 4 13 Mn 13 7 11 33 Fe 20 28 52 120 Zn 70 24 18 48 Estipite de Shiitake mg/Kg 773 8136 *Maiz mg/Kg 483 2996 *Sorgo mg/Kg 300 3500 *Torta de soya mg/Kg 290 6100 Valores en base seca *(Sauvant. la influencia de esta desventaja en el potencial del estípite sólo se podría determinar. et al. yodo 0. considerando todos los demás aspectos. en su real dimensión. selenio 0. (Bisen. cobre 10mg/kg. aceite de coco.5% a un 7% (Betancourt 2012). el fósforo entre 14g/kg-15g/kg y el sodio entre un 2g/kg a 4g/kg. para cumplir con este requerimiento en las dietas de aves se incluyen grasas como aceite de palma. Cabe anotar aquí que la calidad de la proteína está en función primordialmente de su composición en aminoácidos esenciales y que en este aspecto el maíz. 2003) . et al. Estas grasas también contienen cantidades variables de ácido linoléico un nutriente esencial en la dieta de aves ya que todas las dietas deben contener 1% como mínimo. mayor es la proporción de aminoácidos. ya que su contenido tanto de grasa como de ácido linoléico es menor.40 mg/kg (Lesson. En las dietas también se incluye minerales trazas en la siguiente proporción manganeso 70mg/kg.1% de ácido linoléico y la de maíz 1. De acuerdo a lo anterior el estípite presentaría una desventaja frente a cereales como el maíz y el sorgo. 2000). La grasa es una fuente de energía.9% (Lesson. En estípite el porcentaje de grasa es menor y el contenido de acido linoléico también es menor y corresponde a (0. 1998).18%). 2000). ingrediente valorado por su proteína más que por su porcentaje de grasa. etc. aceites vegetales. al ser mayor el porcentaje de proteína en el estípite. et al. Para suplir con estos niveles se adiciona a la formulación carbonato de calcio. Longvah. Tabla 2-3: Contenido de minerales del estípite de Shiitake. El porcentaje de grasa del estípite es similar al de la torta de soya.  Minerales El contenido de minerales en las dietas de pollos de engorde varía con el crecimiento. ya que un gramo de estípite proporcionaría más cantidad de aminoácidos esenciales que un gramo de maíz o sorgo.30 mg/kg. 2010.Capitulo 2 31 de soya. razón por la cual el estípite podría suplir a estos dos cereales en la formulación de un alimento aviar. Los minerales que requiere del ave en mayor cantidad son el calcio entre 15g/kg – 17g/kg. Sin embargo. Sin embargo. hierro 80 mg/kg. zinc 80 mg/kg. y cloruro de sodio. et al. La grasa del sorgo contiene 1.  Grasa El contenido de grasa cruda en las dietas de pollo de engorde cambia dependiendo de la etapa de crecimiento del ave entre 6. et al. y el sorgo los contienen todos a diferencia del Shiitake que presenta ausencia del triptófano. sebo. de maíz. de manera tal que el incluir el estípite en la dieta proporcionaría más fósforo disponible y por lo tanto la cantidad empleada en la suplementación sería menor.  Determinación de carbohidratos De la aplicación del método de Dubois. lo que se vería reflejado en el buen desarrollo de las aves. por lo que la dieta de las aves debe ser suplementada con fósforo inorgánico aumentando el costo de la misma (Cuca. Cabe anotar aquí que la adición de este ingrediente fúngico a la formulación del alimento aviar aportaría además fitasas. 2003). 2011). .28% (valor correspondiente al promedio de cinco replicas) contenido que es menor al reportado para el carpóforo de Shiitake el cual se encuentra entre 59. De los pocos estudios realizados sobre el contenido de ácido fítico en basidiomicetos se ha determinado que la concentración de este compuesto es mucho menor que la que se encuentra en plantas y granos (Akindahunsi. enzimas que hidrolizan el ácido fítico en los cereales incrementando la biodisponibilidad de nutrientes (Cheng. frutos secos y legumbres almacenan el fósforo. Si bien el contenido de calcio en el estípite no suple el requerimiento de la dieta. et al. 2006).32 Capitulo 2 La tabla 2-3 presenta la comparación entre el contenido de minerales en el estípite y los ingredientes usualmente empleados.1). y siendo un compuesto que no se hidroliza por las enzimas endógenas de los pollos. en donde se vé que el contenido de Ca en el estípite es mayor que en el maíz. et al. disminuiría el porcentaje de suplementación con carbonato de calcio y por ende el precio de la dieta. solo 30 a 40% del fósforo está disponible.2% y 64% por (Martínez-Carrera. y hacer la respectiva cuantificación mediante la curva estándar de glucosa (Figura 2. forma en que cereales. resultado que reviste importancia si se tiene en cuenta que tanto en el maíz y el sorgo como en la torta de soya entre el 60-70% del total de este elemento se encuentra como ácido fítico. 2004) y (Bisen. et al. el sorgo y la torta de soya. En cuanto al contenido de fósforo éste también es mayor. se determinó que el total de carbohidratos del estípite de Shiitake es de 27. et al. lo que llevaría a una disminución del costo del alimento. et al. 2010) respectivamente. su inclusión como ingrediente en formulaciones para pollos de engorde. Con relación a los demás minerales sus variaciones con respecto a los ingredientes empleados en dietas de pollos no son muy grandes de manera que podría eventualmente reemplazar a cualquiera de ellos. et al. . El contenido energético del maíz y sorgo lo aporta el endospermo el cual está compuesto principalmente de almidón. resultado que proporciona el valor aproximado de los carbohidratos digeribles se puede concluir que el estípite de Shiitake no es una buena fuente de energía.0128x + 0. 2005. et al. La importancia de esta clase de polisacáridos radica en que los de βglucanos presentes en los hongos exhiben actividad anticancerigena. inmunoestimuladora.76%.  Determinación de β-1.1384 R² = 0.6 0.6 glucanos (Figura 2-2) se determinó que el contenido de de β-1. Wasser.4 0. para el caso del Shiitake ese valor seria del 22. Mizuno. Los cereales como el maíz. antimicrobiana (Lindequist. por eso son las principales fuentes energéticas de los alimentos concentrados.Capitulo 2 Figura 2-1: Curva de calibración de glucosa 1. y el sorgo contienen 73% y 70.6 glucanos Mediante el empleo de la curva de calibración de β-1.2 0 0 20 40 60 80 Concentración de Glucosa µg/ml 100 120 y = 0. siendo las dos primeras las más importantes y que no las presentan los glucanos de los cereales y de las leguminosas. 2000) (FAO).3-1.8 0.6-glucanos en el estípite es de 9.6 1. et al.33 g/100 g en base seca. antiviral. 2001. ya que su contenido carbohidratos es principalmente fibra insoluble.4 1. y constituye la mayor parte de los carbohidratos presentes en el maíz 87% y del sorgo cerca del 75% aproximadamente (Lesson.2 Absorbancia 33 1 0.28% menor al de sorgo y el maíz y que al realizar el cálculo de extracto libre de nitrógeno o extracto no nitrogenado. 1999).3-1.7% de carbohidratos respectivamente más el contenido de aceite.3-1. et al.9921 Con base en que el contenido de carbohidratos totales en el estípite es 27. 2000). El aumento de la viscosidad disminuye el contacto con las enzimas digestivas y también afecta el transporte y la absorción de nutrientes a través de la mucosa intestinal. et al.2 0.6 glucanos presentes en el estípite de Shiitake son diferentes en estructura.4 glucanos (estructura lineal) en cereales como avena.5 % etapa de finalización (Lesson.061 R² = 0.4% en la etapa de iniciación.6 glucanos Capitulo 2 1 0. puedan ser perjudiciales en las dietas para pollos de engorde. . el sorgo y la harina de soya. Sin embargo. et al. Al comparar los resultados del análisis proximal se observa un mayor porcentaje de fibra cruda en el estípite que en el maíz. La fibra proveniente del estípite esta constituída por polisacáridos de cadenas largas como quitina.3-1.34 Figura 2-2: Curva de calibración de β-1. 2.8 Absorbancia 0.7 0.1 0 0 50 100 150 200 250 300 Concetración en µg/ml de glucanos y = 0.3-1. mananos y β-glucanos.6 0. (presencia de ramificaciones y estructura de triple hélice) lo cual podría llevar a una acción diferente a la de los β-1.6 glucanos. 2000).9 0.8% etapa de levante y 2.9991  Fibra cruda Los niveles adecuados de fibra cruda en la dieta de pollos de engorde varían entre 2.3 0. estrechamente relacionados a la pared celular (Manzi. 2000). se adicionan enzimas βglucanasa sintéticas o antibióticos como la neomicina para solucionar este problema en las dietas (Lesson.glucanos es del 3-7% o cebada del 4-9%. Para contrarrestar este efecto en las dietas que incluyen avena donde el contenido de β. hemicelulosa.4 glucanos de los cereales.4 0. cebada y trigo es desfavorable en las dietas avícolas porque el ave es incapaz de digerirlos lo cual ocasiona una mayor viscosidad del contenido intestinal y de las excretas. et al. Hasta el momento no hay un reporte en literatura que indique que los β-1.5 0.0032x + 0.31.3-1. La presencia de los β-1.3-1. el tipo de β-1. 2006) indica que hoy en día no se considera la fibra como un solo factor antinutricional ya que dependiendo del tipo y la cantidad incorporada puede afectar de forma positiva la salud y la productividad del animal. permitiría proporcionar un valor nutracéutico a la dieta aviar al emplearlo como ingrediente en formulaciones 2.3-1.6 glucanos que. ya que hidrolizan el ácido fítico en los cereales incrementando la biodisponibilidad de nutrientes. et al. A. et al. Pleurotus tuber-regium (fries) singer. es inferior al de maíz y el sorgo. 548-553. 39: (5). al ser actualmente un desecho. 1989). 2006. El estípite del Shiitake tiene un gran contenido de fibra dietaría. Un beneficio que podría aportar la harina de estípite de Shiitake se basa en el hecho de que al ser incluida en las dietas de pollos de engorde permitiría minimizar costos no sólo porque su valor comercial. dada sus acciones biológicas.5 % hasta 5% sin ser afectado el rendimiento de la canal en los pollos de engorde (Buwjoom.4 Conclusiones La harina de estípite de Shiitake puede ser considerada como un ingrediente alternativo a ser incluido en las dietas de pollos de engorde. et al.5 Biblografía Akindahunsi. se aumentaría el número de deposiciones en el ave y tendría influencia sobre la productividad del animal debido a la disminución en el consumo de alimento (Vergara. 2.. LWT. Nutrient and antinutrient distribution of edible mushroom. Oyetayo. sino que por la cantidad de algunos de sus nutrientes disminuiría los gastos producidos por la suplementación de las mismas La posible presencia de fitasas en el estípite del Shiitake le proporcionaría un valor agregado al alimento aviar. En este mismo sentido (Mateos. donde se concluye que se pueden incluir niveles de 2. L. . es de destacar que en estudios como el realizado por (Pottgüter 2008) se indica que si bien el maíz y la harina de soya se consideran en todo el mundo como los ingredientes estándar de materias primas para la dietas de aves existen regiones donde estos ingredientes no están disponibles o no son rentables para los avicultores y se utiliza como alternativa otras materias primas. fibra de alto valor por su contenido de β-1.Capitulo 2 35 Si bien algunos autores consideran que un porcentaje alto de fibra cruda en la dieta de pollos de engorde traería un efecto negativo sobre la digestibilidad de los nutrientes.Food Science and Technology. 2005). A. cuyo empleo dio como resultado que la productividad es por lo menos igual y en algunos casos incluso es superior. Con base en esto se realizó un estudio con el empleo de harina de estípite de Shiitake. que llevan a un mayor contenido de fibra en la dieta. F. L. 2000. 82: 57-63. 285-299. G. P.. Mattila.. Food Chemistry. G. W. T. Y. M. Sobal. T. L.. Rebers. Chen. D. Journal of Poultry Science. Chemical composition. U. Mayett. J. K. Díaz. Lázaro. A. Smith.. Lentinus edodes: A Macrofungus with Pharmacological Activities. S. Dosthale. 41: 322-328. 2005. Baghel. M. S. Martínez. medicinales. 1998.. Lindequist. 2003. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Martín. Compositional and nutritional studies on edible wild mushroom from northeast India. Yamauchi.. Summers.. W. 1956. Martínez. P. Prasad. N.. Cheng... 2011.. G. J. L. Y. C. Baeza. Vicente. J. F. G. 2005. Gilles. Nutrition. R. 2000.-Y. Animal Science. Piironen.-D. Thongwittaya. K. Los hongos comestibles: propiedades nutricionales. Inclusion of oat hulls in diets for young pigs based on cooked maize or cooked rice. México. Pró. Bisen. M.. M.. 81-86. T. Tangataweewipat. P. S. Effects of shiitake mushroom stalk meal on growth performance. Manzi. Lesson. 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Effect of colour LEDs on mycelia growth of Aspergillus ficuum and phytase production in photo-fermentations. V. T. Martínez-Carrera. C. Le' Print Club Express Ltda. 28: (3). Food Chem.-K. Colombia. A. Chen.. 2004.. P. 2006. Disponibilidad del fósfoforo del la pasta de soya y sorgo-glúten de maíz. Mateos. Niedermeyer. Longvah. 2: (3).. 2012. K. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology.. Técnica Pecuaria en México. A. P. Busch. Enzyme and Microbial Technology. P. Factors determining gastrointestinal transit time of several markers in the domestic fowl.-H. J. J. H. Lin. Fibre in layer diets. Tran. Tablas de composición y de valor nutritivo de las materias primas destinadas a los animales de interés ganadero. Pegl. L.-J. 127: 791-796.3-1. Vergara.. LWT.. T. 3: (1).-M.. 2001. Tsuchida. Gutkowska. J. D.) Sing. 2003... Krzyczkowski. A.. 1999. Jimenez. Ediciones Mundi-Prensa. C. Food Sciencie and Technology Research. E. Ferrando. Blazewicz.-C. 31-34.. Weis. B. 369-374. 2008.. Altenbach. 22-31. S.. Food Chemistry. 1989.. 1: 47-55..Capitulo 2 37 Mizuno.. M. J. 2001.-L. Mölleken.. S. Non-volatile taste components of several commercial mushrooms. K. Wasser. R. Fernandez. España. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives International Journal of Medicinal Mushrooms. A. Tatsuoka. Rekowski. Nitschke. Mau. 2011. . Pérez. (Agaricomycetideae). Yap... Gonalons. H.6-glucans in comparison with total B-1.. H.. 72: 465-467. Food Chemistry. Pottgüter. R. J. Lohmann Information. Y. Contents of anti-tumor polysaccharides in certain mushrooms and their immunomodulating activities. International Journal of Medicinal Mushrooms..-L. 71: (1).. Turlo. Minato. Quarterly Journal of Experimental Physiology. Selected physical properties of chitin prepared from shiitke stipe. E. Optomizing vitamin B12 biosynthesis by micelial cultures of Lentinula edodes (Berk).. Mau. Kocjan. E. Kawakami... 2007. 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Dentro de estos metabolitos secundarios se encuentran los compuestos terpenoides, que no solo están presentes en vegetales, sino que también se encuentran en hongos y tienen importancia puesto que exhiben actividad farmacológica. Dentro de este grupo se hallan los triterpenoides, compuestos biosintetizados por los hongos que han sido objeto de estudio por su actividad biológica. Entre los más ampliamente distribuídos en el reino se encuentra el ergosterol que presenta actividad antitumoral y antiviral (Ravi Subbiah, et al. 2003, Rivera, et al. 2002) Los estudios químicos realizados en Shitake han arrojado como resultado el aislamiento de triterpeonides tales como los esteroles ergosta-7-en-3-ol; ergosta-5,7,9(11),22tetraen-3-ol, esteroles polihidroxilados y epoxidados como: 5α,8α-epidioxi-(22E,24R)23-metilergosta-6,22-dien-3β-ol; el (22E,24R)-23-metilergosta-7,22-dien-3,5,6-triol; cetoesteroides como la 3β,5α,9α-triidroxi-(22E,24R)-23-metilergosta-7,22-dien-6-ona y triterpenos como el ergosta-2,5,7,9(11),22-pentaeno (Benavides 2004, Cucaita 2007, Ohnuma, et al. 2000, Yahoita, et al. 1998, Yahoita, et al. 1999, Yokokawa, et al. 1981). En este capítulo se presenta el estudio químico de compuestos triterpenoides, tetracíclicos del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake, así como la cuantificación de los mismos. 3.2 Materiales y métodos 3.2.1 Material fúngico El shiitake, fue proporcionado por la empresa Fungitá. El estípite fresco, se cortó en láminas delgadas, se secó a una temperatura de 35°C por 36 horas, para posteriormente ser sometido a proceso de pulverización. 3.2.2 Técnicas cromatografías utilizadas  Cromatografía de gases a acoplada a un espectro de masas (CG-EM) Cromatógrafo marca Hewlett Packard 6890 columna capilar HP 5 de 30 m, 0.33 mm de diámetro interno y 25 µm de espesor, gas de arrastre helio de 4.5 con un flujo de 40 Capitulo 3 1ml/min, modo Split 1:10 temperatura desde 90 °C hasta 300 °C a 5°C/ min. Acoplado a un espectrómetro de masas 5973 con una fuente de ionización de 70eV.  Cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAE) Cromatógrafo marca Hitachi con detector UV-VIS a longitud de onda de 210nm, columna RP-18 de 25 cm x 10mm (5 µm), temperatura ambiente, flujo 2.0 ml/min, fase móvil metanol: agua (95:5) en modo isocrático.  Cromatografía en columna (CC) Como fase estacionaria se utilizó Sílica Gel Macherey-Nagel (0.063 - 0.200mm de diámetro de partícula), con elución en gradiente y empacadas en suspensión con el disolvente menos polar dependiendo del sistema de elución seleccionado.  Cromatografía en capa delgada (CCD) Cromatofolios de aluminio de silicalgel 60 F254 (10-12µm), se utilizó como revelador universal luz ultravioleta a 254 nm - 366nm y como revelador específico ZnCl2 al 30% en metanol. 3.2.3 Elección del disolvente de extracción Para determinar cuál sería el mejor solvente para la extracción, se realizó un ensayo preliminar, en el cual se pesaron dos muestras de 60 gramos de estípite en frascos schott, se adicionó a la primera muestra 150 ml de metanol y 150 ml de cloroformo para la segunda muestra, se colocaron en agitador de vaivén por 24 horas con remoción diaria de solvente, hasta obtener resultado negativo para la prueba de Lieberman-Buchard. Los extractos obtenidos se concentraron al vacio hasta sequedad en un rotavapor y se analizaron por CG-EM. 3.2.4 Extracción de los compuestos triterpenoides Elegido el disolvente de extracción para los compuestos de interés, se obtuvo el extracto clorofórmico crudo, para lo cual se pesaron 850 gramos de estipe seco y molido y se le adicionó cloroformo. La mezcla agitó durante 24 horas removiendo diariamente el disolvente, hasta agotamiento de los compuestos objeto de estudio. El extracto se concentró obteniéndose 10.5 gramos que corresponden a un rendimiento de 1.23% (Diagrama 3-1). Capitulo 3 Diagrama 3-1: Obtención del extracto clorofórmico crudo 41 850 g de hongo seco y molido Cloroformo Extracción por agitador de vaiven Hasta prueba lieberman-buchard (-) Concetración del extracto Extracto clorofórmico crudo (10.5 g) Pruebas Preliminares CCD 3.2.5 Separación y purificación de los compuestos triterpenoides por cromatografía en columna (CC) Utilizando diferentes solventes se procedió a la determinación por CCD el mejor para realizar la separación de los compuestos presentes en el extracto clorofórmico por cromatografía en columna, encontrándose que el mejor solvente es tolueno:acetato de etilo (7:3). Del extracto clorofórmico se tomaron 10.4 gramos para la separación por CC, se uso una relación de 1 gramo de extracto de CHCl3 por 36 gramos silica, con un gradiente de elución de tolueno y acetato de etilo (Tol:AcOEt), desde 0% hasta 100% AcEOt. El volumen de las fracciones recolectadas fue de 30 ml cada una, las cuales fueron monitoreadas por CCD utilizando Tol: AcOEt (7:3), los cromatogramas se revelaron con solución de ZnCl2 como se mencionó inicialmente. Se recogieron 255 fracciones y se unieron aquellas fracciones que tenia Rf similares, dando como resultado 18 nuevas fracciones que se analizaron por CG-EM (Diagrama 3-2). El rendimiento de la columna cromatógrafíca fue de 73.52%. 5 gramos Extracto crudo clorofórmico de estípite Gradiente Tol: AcEOt Separación por CC Monitorear fracciones por CCD Fracciones F 3-10 F 17-48 F 54-62 F 65-88 F 99-101 F 122-133 F 179-197 F 205-227 F 247-255 F 1-2 F 11-16 F 49-53 F 63-64 F 89-98 F 102-121 F 134-178 F 198-204 F 228-246 CG-EM .42 Capitulo 3 Diagrama 3-2: Cromatografía en columna del extracto clorofórmico crudo 10. F 122133). para proceder a purificarlos por CLAE semipreparativa. 56. De cada una de estas fracciones se pesaron 150 mg y se disolvieron en 1mL de metanol. Diagrama 3-3: Purificación de las fracciones por CLAE semipreparativa Análisis por CG-EM F 102-121 F 122-133 Purificación por CLAE F 65-88 F 2P F 3P F 5P F 198-204 Actividad Antimicrobiana .31% (F 122-133). (Diagrama 3-3).2.Capitulo 3 43 3.6 Purificación de las fracciones por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) con columna semipreparativa Una vez realizado el análisis de CG-EM. El rendimiento de la columna preparativa fue de 57% (F 102-121). se eligieron las fracciones (F 102-121. donde los compuestos triterpenoides eran mayoritarios. 55 33.82 13.00 40.00 35.247. Figura 3-1: Cromatograma de gases del extracto metanólico y clorofórmico del estípite de Shiitake.00 30.00 25.55 18.03 23.68 38.74 28.52 19.D 800000 750000 700000 650000 600000 550000 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 5.57 30.00 15.33 32.16 .40 30.39 23.19 34.44 Capitulo 3 3.29 34.25 35.43 12.19 16.77 34.1 Elección del disolvente de extracción Los extractos obtenidos se analizaron por CG-EM (Figura 3-1).00 5. puesto que el análisis cromatográfico indico que permite la extracción más selectiva de los compuestos de interés para el estudio.86 23.39 Extracto metanol Ácidos Grasos Triterpenoides 32.90 12.25 32.3.3 Resultados y discusión 3.35 21.44 34.87 34.00 20. Los resultados permitieron seleccionar como disolvente extractante al cloroformo.81 28. Abundance TIC: 10120207.89 20.00 Time--> 10. Capitulo 3 45 Abundance Ácidos Grasos Triterpenoides TIC: 11051703.D 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 19.23 21.35 31.74 Extracto Cloroformo 32.31 40000 30000 20000 10000 0 Time--> 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 21.61 31.81 29.65 31.39 44.13 3.3.2 Extracto clorofórmico crudo El análisis del perfil cromatográfico del extracto clorofórmico se enfocó especialmente en las dos zonas de interés para nuestro trabajo. La primera que comprende un rango de tiempos de retención entre 19-25 minutos que corresponde a la fracción de ácidos grasos y el segundo rango entre 29-38 minutos que corresponde a la fracción de compuestos triterpenoides (Figura 3-2). 46 Capitulo 3 Figura 3-2: Cromatograma de gases del extracto clorofórmico crudo del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) Abundance Ácidos grasos 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 19.23 21.35 Triterpenoides 31.74 TIC: 11051703.D 32.31 40000 30000 20000 10000 0 5.00 Time--> 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 21.61 31.81 29.65 31.39 44.13 Como se observa en el cromatograma, la elección de hacer la extracción con cloroformo permitió obtener los metabolitos de interés sin tener compuestos que interfieran en su detección e identificación y con una buena relación entre ácidos grasos y compuestos triterpenoides, lo que es muy importante ya que cuando esta relación es muy grande, se tiene como comportamiento general en los macromicetos dificultad en la detección de los triterpenoides. Con la finalidad de separar los componentes del extracto clorofórmico crudo se procedió a realizar cromatografía en columna obteniéndose 255 fracciones. Aquellas que presentaron el mismo comportamiento cromatográfico en CCD se reunieron, concentraron y se analizaron por CG-EM, de las cuales se seleccionaron aquellas donde se encontraba la mayor proporción de compuestos triterpenoides y ácidos grasos para la determinación estructural de sus componentes mediante el análisis de sus espectros de masas y comparación con literatura y posteriormente evaluar su actividad antibacteriana. 3.3.3 Determinación de los constituyentes de la fracción grasa no triterpenoidal del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake Para la determinación de los compuestos no triterpenoides se seleccionaron las fracciones donde estos compuestos se encontraban en mayor proporción. Capitulo 3 47  Fracción 17- 48 El cromatograma de esta fracción (Figura 3-3), mostró la presencia de cinco compuestos con tiempos de retención correspondientes a ácidos grasos de los cuales los compuestos 3 y 5 son los mayoritarios. Figura 3-3: Cromatograma de gases de la fracción 17- 48 Abundance TIC: 12012001.D 20.80 21.60 5000000 4500000 4000000 3500000 19.52 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 Time--> 5500000 4 5 3 18.62 1 18.19 21.13 14.01 17.27 19.20 19.57 16.91 2 23.08 25.72 21.93 23.71 22.10 6 34.89 32.43 31.41 34.36 32.81 29.71 33.32 29.56 32.29 30.84 28.17 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00  Compuesto 1 En el espectro de masas (Figura 3.4), este compuesto presentó un pico de ion molecular a m/z 270 uma, concordante con la fórmula molecular C17H34O2 y cuyas fragmentaciones corresponden a ésteres de ácidos grasos, con picos a m/z 255 [M - CH3]+, 239 [M OCH3]+, 227 [M - C3H7]+, 213 [M - C4H9]+, 199 [M - C5H11]+, 185 [M - C6H13]+, 171 [M C7H15]+, 157 [M - C8H9]+, 143 [M - C9H19]+, 129 [M - C10H21]+, 115 [M - C11H23]+, 87 [M C13H27]+, 74 [M - C14H29]+. Así mismo, aparece un ion correspondiente al rearreglo de Mc. Lafferty a m/z 74 y pérdidas consecutivas de 14 uma, típicas de cadenas alifáticas largas. Según el análisis anterior y lo encontrado en literatura el compuesto corresponde al hexadecanoato de metilo, el cual ha sido reportado en Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes (Shiitake) (Cucaita 2007, Chegwin 2007). 157 [M . 143 [M .D 74 320000 300000 280000 260000 240000 220000 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 m/z--> 15 20 40 60 80 100 28 101 115 120 140 129 157 160 180 171185 199 213 200 220 240 43 55 143 87 Capitulo 3 CH3 O O 227 239 255 270 260  Compuesto 2 Este compuesto presenta en su espectro de masas (Figura 3-5). características de compuestos alifáticos de cadena larga para ácidos carboxílicos alifáticos.C9H19]+.199 min): 12012001.C6H13]+. 1998).CH3]+.D 28 40000 35000 30000 25000 OH 20000 O 55 41 73 15000 10000 129 213 111 157171185 143 199 140 160 180 200 237 225 220 240 256 282 270 260 280 5000 14 0 20 m/z--> 40 60 85 97 80 100 120 . 129 [M .C10H21]+. et al.C8H9]+.C7H15]+. 185 [M . (Longvah. 199 [M . 171 [M .615 min): 12012001.OCH3]+. concordante con la formula C16H32O2 y los picos correspondientes a perdidas sucesivas de 14 uma a m/z 213 [M .48 Figura 3-4: Espectro de masas del compuesto 1 Abundance Scan 2528 (18. 115 [M . Figura 3-5: Espectro de masas del compuesto 2 Abundance Scan 2623 (19.C11H23]+. un ion molecular a m/z 256 uma. Por comparación con literatura y teniendo en cuenta previos resultados en el grupo de investigación de Química de Hongos Macromicetos (Chegwin 2007) puede identificarse el compuesto como el ácido hexadecanóico (ácido palmítico). pérdidas sucesivas de 14 uma y un ion a m/z 264 producido por el fragmento [M – OCH3]⁺.Capitulo 3 49  Compuesto 3 Su espectro de masas (Figura 3-6) presenta un pico de ión molecular a m/z 284 uma.C4H9]+. 255 [M . Lafferty. . que concuerda con la fórmula molecular C18H36O2. 2002). Del análisis anterior y por comparación con reportes en la literatura (Cucaita 2007. Así mismo.D 88 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 m/z--> 17 20 40 60 29 43 55 101 O CH3 O 73 157 143 115 129 241 255 269 284 185199213 227 171 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280  Compuesto 4 El compuesto presenta en su EM (Figura 3-7) un ion molecular a m/z 296 uma. como el ion a m/z 74 producido por el rearreglo de Mc. iones característicos de ésteres de cadena alifática larga. Con base en lo anterior y comparación con literatura el compuesto se identificó como el hexadecanoato de etilo (Chegwin 2007. et al.518 min): 12012001. 213 [M . 227 [M . Figura 3-6: Espectro de masas del compuesto 3 Abundance Scan 2675 (19.CH3]+.C5H11]+ y el pico a m/z 88 debido al rearreglo de Mc Lafferty. que corresponde a la fórmula molecular C19H36O2. Valencia.C3H7]+.C2H3]+. a m/z 269 [M . el compuesto es el 9-octadecenoato de metilo. Mora 2010). Aparecen fragmentaciones típicas para ésteres. 241 [M . La similitud del espectro con literatura permitió identificarlo como el octadecanoato de metilo ya reportado en los hongos Pleurotus ostreatus y Fomitposis sp. Mora 2010).C2H5]+.50 Figura 3-7: Espectro de masas del compuesto 4 Abundance Scan 2888 (20. Los picos significativos se observaron a m/z 270 [M .D 55 Capitulo 3 80000 75000 70000 65000 60000 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 20 m/z--> 40 15 28 41 O 69 O CH3 83 97 264 110 123 180 137 152 166 222 207 193 60 80 235 249 296 278 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300  Compuesto 5 El EM del compuesto 5 (Figura 3-8). Lafferty y pérdidas sucesivas de 14 uma. Estos fragmentos indican la presencia de un éster metílico con cadena lineal saturada. 227 [M . como el ion a m/z 74 producido por el rearreglo de Mc.127 min): 12012001. 241 [M .C4H9]+. Figura 3-8: Espectro de masas del compuesto 5 Abundance Scan 2937 (21.826 min): 12012001.D 160000 150000 140000 130000 120000 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 m/z--> 14 20 40 60 80 28 57 129 101 115 100 120 140 199 185 157 171 160 180 213 241 227 220 240 269 283 260 280 300 43 143 87 74 O O CH3 255 298 200 . 255 [M -C3H7]+.C5H11]+. (Chegwin 2007. presenta un ion molecular a m/z 298 que concuerda con la fórmula molecular C19H38O2. 12-octadecadienoato de etilo. mostro un solo compuesto mayoritario.00 40. así como pérdida de 263 [M -O C2H5]+. Figura 3-9: Espectro de masas del compuesto 6 Abundance Scan 3015 (21.00 . El análisis anterior y la comparación con reportes previos (Coy.D 67 81 300000 O 250000 95 O CH3 200000 41 150000 109 54 100000 123 150 136 28 14 20 40 60 80 100 120 140 160 263 308 220 234 247 240 260 279 293 280 300 50000 164 178 191 205 180 200 0 m/z--> 220  Fracción 65-88 El cromatograma de la fracción 65-88.D 3500000 3000000 7 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 5. 2009). en la zona de ácidos grasos (Figura 3-10) el cual se denominó compuesto 7. concordante con la fórmula molecular C20H36O2 y pérdidas sucesivas de 14 unidades de masa características de compuestos alifáticos de cadena larga.606 min): 12012001. Además. Figura 3-10: Cromatograma de gases de la fracción 65-88 Abundance TIC: 12012005. exhibe los picos a m/z 74 y m/z 88 rearreglo de McLafferty para esteres de cadena alifática larga.00 35. permitió deducir que la estructura corresponde al 9.00 30.Capitulo 3 51  Compuesto 6 El espectro para el compuesto (Figura 3-9). et al.00 15. muestra un pico de ion molecular a m/z 308 uma.00 25.00 20.00 Time--> 10. Cucaita 2007). Chegwin 2007.D 320000 300000 280000 260000 240000 220000 95 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 18 0 m/z--> 0 50 100 150 123 150 182 220 201 200 256 250 300 341 350 400 446 450 280 41 67 O OH Con base en los resultados anteriores. resultado que coincide con lo reportado en estudios previos realizados en hongos basidiomicetos por el grupo de Química de Hongos Macromicetos Colombianos (Cucaita 2007. Nieto. De acuerdo con las fragmentaciones anteriores y comparación con literatura el compuesto 6 es el ácido 9.12-octadecadienoato de etilo Ácido linoléico . los compuestos mayoritarios de la fracción grasa no triterpenoidal del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake (Tabla 3-1). corresponden a esteres metílicos y/o etílicos de ácidos grasos saturados e insaturados y ácidos grasos. Figura 3-11: Espectro de masas del compuesto 7 Abundance Scan 3067 (21. et al. Mora 2010.52 Capitulo 3  Compuesto 7 El espectro del compuesto 7 (Figura 3-11). 2008) Tabla 3-1: Componentes mayoritarios de la fracción grasa no triterpenoidal del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) Formula C17H34O2 C16H32O2 C18H36O2 C19H36O2 C19H38O2 C20H36O2 C18H32O2 M⁺ 270 256 284 296 298 308 280 IDH 1 1 1 2 1 3 3 Nombre Hexadecanoato de metilo Ácido palmítico Hexadecanoato de etilo 9-octadecaonato de metilo Octadecanoato de metilo 9.926 min): 12012005.12-octadecadienóico ya identificado en Shiitake (Benavides 2004. muestra un pico de ion molecular a m/z 280 uma que se ajusta a la fórmula molecular C18H32O2. Presenta a su vez picos correspondientes a pérdidas sucesivas de 14 unidades de masa (cadena alifática larga) y pico a m/z 60 típico del rearreglo de McLafferty para ácidos carboxílicos alifáticos. 1998. Martínez-Carrera.  Fracción 102-121 El cromatograma de gases de esta fracción (Figura 3-12). 2010.00 3T 4T 2T 1T .4 Fracción de triterpenoides presentes en el extracto de estípite de Shiitake Para la determinación de los compuestos triterpenoides se seleccionaron las fracciones donde estos compuestos se encontraban en mayor proporción.00 15. et al.Capitulo 3 53 Cabe aquí anotar que la proporción relativa del ácido linoléico en el cromatograma de gases es alta coincidiendo con lo encontrado en los carpóforos del Shiitake. Longvah.00 30. 3.00 Time--> 10. De acuerdo a lo expuesto anteriormente y con base en que el ácido linoléico es un componente mayoritario del extracto clorofórmico. además de presentar actividad antibacteriana (Zhenga.D 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 5. 2004).00 20.00 35. para determinar su actividad antibacteriana (Capítulo 4).00 40. muestra 4 compuestos de los cuales dos son mayoritarios. donde este ácido graso insaturado se encuentra como componente mayoritario (Bisen. et al. se tomó la fracción 65-88.3. 2005). Figura 3-12: Cromatograma de gases de la fracción 102-121 Abundance TIC: 12012011. et al. donde este compuesto se encuentra como único componente.00 25. et al. disminuye el colesterol y la presión arterial. Este resultado es una característica importante para el valor nutraceútico del estípite de Shiitake ya que no solamente el ácido linoléico se considera esencial para la dieta de humanos y animales haciendo necesario su consumo para la buena salud sino que también brinda protección frente a enfermedades cardiovasculares. presenta un tiempo retención de 31.9(11). (Mora 2010). Figura 3-13: Espectro de masas compuesto 1T Abundance Scan 4310 (29.7.9(11). Chegwin 2007. 157 [Fisión anillo C]⁺ y 141 [Fisión anillo C – CH3]⁺.561 min): 12012011. 236 [M – Cadena lateral – CH3 ]⁺. Pleurotus ostreatus. Cucaita 2007.D 50000 48000 46000 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 20 m/z--> 40 60 55 81 105 129 155 197 376 251 28 181 235 219 281 333 355 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380  Compuesto 2T El espectro de masas del compuesto 2T (Figura 3-14). dado por el cierre de los cuatro anillos y cinco dobles enlaces ubicados en la molécula.H2O]⁺. 251 [M– cadena lateral]⁺ intenso. con un IDH = 9.22–pentaeno aislado de Pleurotus sajor-caju (Rivera. presenta en su espectro de masas un ion molecular [M]⁺ = 376 uma (Figura 3-13).22–tetraen–3β–ol. et al.5. Lentinula edodes (Yahoita. et al. 1998). El espectro coincide para el compuesto ergosta–5.H2O]⁺. el cual es diagnóstico para esteroles Δ 5.CH3 . Entre los fragmentos característicos se encuentran m/z 376 [M. 269 [M – cadena lateral]⁺. 2007) .cadena lateral .H2O]⁺. un ion molecular [M]⁺= m/z 394 que es consistente con la fórmula condensada C28H42O. 2009.H2O . el cual concuerda con la fórmula molecular C28H40.CH3 -2H]⁺. Los fragmentos característicos se dan a m/z 361 [M – CH3]⁺. et al. 251 [M. 361 [M . 209 [Fisión anillo D . 141 [Fisión anillo C . Lentinula edodes (Coy.H2O]⁺.56 min. et al.36 min.9(11). Nieto.54  Capitulo 3 Compuesto 1T Con un tiempo de retención de 29. Pleurotus ostreatus (Chegwin 2007) Fomitposis sp. 197 [Fisión D – CH3]⁺. Con base en sus fragmentaciones y a lo reportado en literatura el compuesto se identificó como ergosta–2. 2005).7. 209 [Fisión anillo D – 2H]⁺. reportado previamente en Laetiporus sulphureus.7. Capitulo 3 Figura 3-14: Espectro de masas compuesto 2T Abundance Scan 4604 (31. el cual es el esterol más abundante en hongos superiores y ha sido reportado en basidiomicetos por (Kitzberger. Nieto. 271 [M – cadena lateral]⁺. 1981) .367 min): 12012011. 2007.D 55 48000 46000 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 m/z--> 28 251 HO 69 209 376 394 95 155 181 129 227 277 305 333 355 51 429 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420  Compuesto 3T Presenta un ion molecular [M]⁺ = 396 uma (Figura 3-15). de las cuales 4 se atribuyen al cierre de los anillos y las tres restantes a la presencia de tres dobles enlaces en la molécula. consecuente con una fórmula molecular condensada C28H44O. et al. Yokokawa. 229 [Fisión anillo D]⁺. 253 [M – cadena lateral – H2O]⁺. Su fragmentos característicos se presentan a: m/z 376 [M – H2O]⁺ 363 [M – CH3 –H2O]⁺. De acuerdo al espectro de masas y comparación con datos bibliográficos se determinó que el compuesto corresponde al ergosta–5. indicando la presencia de 7 insaturaciones. et al. con un IDH = 7. 2007. et al.22– trien–3β–ol (Ergosterol). 143 [Fisión anillo C – H2O – CH3]⁺. 211 [Fisión de anillo D – H2O]⁺.7. previamente para Lentinula edodes. 367 [M . 255 [M – cadena lateral. et al.D 150000 140000 130000 120000 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 m/z--> 51 20 40 60 193 91 119 171 271 229 293 311 28 69 143 211 253 396 Capitulo 3 363 HO 337 429 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420  Compuesto 4T Este compuesto (Figura 3-16).D 170000 160000 150000 140000 130000 120000 255 110000 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 173 10000 0 m/z--> 18 20 40 60 129 191 301 325 343 367 429 81 43 400 HO 107 147 213 231 273 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 .723 min): 12012011. que corresponde a una fórmula molecular C28H48O con IDH = 5. 1981) Figura 3-16: Espectro de masas compuesto 4T Abundance Scan 4755 (32.294 min): 12012011. Por comparación con literatura se identifica el compuesto como ergosta-7-en-3β-ol. Yokokawa. Valencia. 246 [Fisión anillo D]⁺. 213 [Fisión de anillo D – H2O]. 231 [Fisión de anillo D – CH3]⁺ .H2O]⁺.56 Figura 3-15: Espectro de masas compuesto 3T Abundance Scan 4662 (31. Ganoderma australe reportado por (Cucaita 2007. 2002. 145 [Fisión anillo C – CH3]⁺. Presenta fragmentos a m/z 382 [M . exhibe un ion molecular [M]⁺= 400 uma. 273 [M – cadena lateral]⁺. et al.H2O]⁺.   entre los más importantes.H2O-CH3]⁺. H2O]⁺.68 5. Del análisis anterior y por comparación con lo reportado. 300 [M-C3H7]⁺.22–dien–3β–ol.00 15.a (Figura 3-18).2H]. Figura 3-17: Cromatograma de gases de la fracción 122-133 Abundance TIC: 12012012.00 20.m.30 6T 5T 21.D 2600000 2400000 2200000 2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 Time--> 21.  145 [M .00 25. el compuesto se identificó como ergosta–7. Nieto. previamente aislado de hongos basidiomicetos Lentinula edodes.89 31.00 30.H]⁺.CH3]⁺. 1981) . 229 [M+ .77 32. 365 [M+ -CH3-H2O]⁺. 271 [M+ . que corresponde a la formula C28H46O con IDH= 6.Fisión C – CH3 H2O]⁺.00 10.00 40. 255 [M+ cadena lateral .cadena lateral.Fisión D –cadena lateral.56 31.81 21. muestra los siguientes iones: m/z 383 [M .00 35.00  Compuesto 5T Su espectro de masas presenta un ion molecular [M]⁺ = 398 u. 2008.Capitulo 3 57  Fracción 122-133 El cromatograma de gases de esta fracción muestra 2 compuestos mayoritarios (Figura 3-17) y se denominaron 5T y 6T. et al. Pleurotus sajor-cajú (Cucaita 2007. Yokokawa. et al.  Fracción 198-204 El cromatograma de gases de esta fracción (Figura 3-19) muestra 7 compuestos (7T13T) de los cuales tres son compuestos mayoritarios.58 Figura 3-18: Espectro de masas compuesto 5T Abundance Scan 4669 (31.765 min): 12012012.D 46000 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 m/z--> 50 100 150 128 193 200 250 300 327 350 173 355 379 400 213 147 246 300 107 398 69 271 28 Capitulo 3 HO 429 450  Compuesto 6T Este compuesto presenta un espectro de masas idéntico al compuesto 4T de la fracción 102-121 y que se identificó como el ergosta-7-en-3β-ol. . 41 34. et al.55 33.92 31.00 29.78 32.552 min): 12012606. 400 [M-C-O]⁺. Figura 3-20: Espectro de masas compuesto 7T Abundance Scan 4471 (30.40 30.87 31.5033.0030. así como los iones con m/z 410 [M.57 30. presenta ión molecular [M]⁺= 428 uma consistente con una formula molecular C28H44O3 con IDH= 7. 385[M-CO-CH3]⁺ 303[M-cadena lateral]⁺.29 32.78 12T 9T 8T 33.  Este espectro coincide con lo reportado por(Benavides 2004.56 31.5035.0032. Cucaita 2007.0031.H2O]⁺.5031.5030.06 11T 10T 7T 30.20 31.5032.93 31.D 80000 75000 70000 65000 60000 43 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 20 m/z--> 40 69 97 HO OH O 179 161 121 385 205 18 60 143 317 233 259 285 343 367 428 410 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 . 2009) quienes lo identificaron en el carpóforo del shiitake como ergosta-7. 285 [M-cadena lateral.81 33.D 2400000 2200000 2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 Time--> 29.5034.Capitulo 3 Figura 3-19: Cromatograma de gases de la fracción 198-204 Abundance TIC: 12012606.77 13T 31.22-dien-3. Rivera.25 34.20).5-diol-6-ona.H2O ]⁺.82 31.35 32.0034.0033.53 59 33.41 31.13 31.88 34.00  Compuesto 7T El espectro de masas de este compuesto (Figura 3. y los iones m/z 410 [ M-H20]⁺. Las fragmentaciones del compuesto se presentan en el (Diagrama 3-4).  303 [M-cadena lateral]⁺.  357 [M-C2H4]⁺. 2009). et al. 385 [M-C3H7]⁺.60 Capitulo 3  Compuesto 8T Con un tiempo de retención de 30. 261 [M-fisión anillo D]⁺. Figura 3-21: Espectro de masas compuesto 8T Abundance Scan 4505 (30.H2O]⁺. con formula molecular C30H52O. 285 [M-cadena lateral.76min (Figura 3-21).4-dimetil-ergosta-24-en-3β-ol (Coy. con IDH=5.761 min): 12012606.D 44000 42000 40000 38000 36000 34000 32000 30000 28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 m/z--> 51 152 175 207 257 239 329 123 285 95 428 69 303 28 HO 357 385 410 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 .  De acuerdo a lo anterior y a lo reportado por se planteó como posible compuesto al 4. el compuesto presenta una ion molecular [M]⁺=428 uma. 7. de las cuales cuatro se atribuyen al cierre de los anillos y las tres .H2O Fisión anillo C m/z 175 + + + .  Compuesto 10T Presenta en su espectro de masas (Figura 3-22) un ion molecular [M]⁺=410 uma. concordante con una fórmula molecular C29H46O con un IDH = 7.CH3 m/z 410 m/z 208 .Capitulo 3 Diagrama 3-4: Fragmentos del compuesto 8T + 61 + H O + .C4H2 m/z 385 m/z 243 + HO m/z 357  Compuesto 9T El compuesto corresponde al ergosta–5.H2O .H2O HO M⁺ 428 .22–tetraen–3β–ol ya identificado en la fracción 102-121 (compuesto 2T).C3H7 m/z 261 .CL HO Fisión anillo D HO m/z 303 .9(11).H2 O + + + H 3C CH3 HO m/z 285 . indicando la presencia de 7 insaturaciones. una fragmentación a m/z 410 [M – H2O]⁺ que corresponde.22-dien-3β. 185 [M-Fisión del anillo C-2H2O] (Diagrama 3.406 min): 12012606.161 [M-Fisión anillo C.CH3 . et al. 2001. Del análisis anterior se propone como posible estructuras para los compuestos 11T y 13T el 5.7. 377 [M . Como los espectros de estos dos compuestos tienen el mismo patrón de fragmentación que se demuestra por la presencia de los mismos iones.(14)22-dien-3β. 1999. Yue. en cambio se observa. Del análisis anterior se propone como estructura para el compuesto el 4–metil-ergosta– 5. Zhou. pero con una baja abundancia relativa. 392 [M -2H2O]⁺. Weete 1973).06 min (Figura 3-24).62 Capitulo 3 restantes a dobles enlaces presentes en la molécula.CH2]⁺. 2011). 367 [M – C3H7]⁺. 203 [M-Fisión anillo C]⁺.6epoxi-ergosta-8. previamente reportado (Coy. Figura 3-22: Espectro de masas compuesto 10T Abundance Scan 4610 (31. .H2O -H.56 min (Figura 3-23) y 34. Entre los fragmentos característicos se presentan: m/z 410 [M .CH3]⁺. Entre los fragmentos característicos se presentan: m/z 392 [M – H2O]⁺. una fórmula molecular de C28H44O3 con IDH = 7.2H2O]⁺.2H2O]⁺.H2O]⁺. 349 [M-C3H7-H2O]⁺.D 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 m/z--> 50 50 28 69 123 95 203 HO 410 147 175 251 229 100 150 200 250 285 367 311 341 387 300 350 400 430  Compuesto 11T y Compuesto 13T Estos compuestos tienen un tiempo de retención de 33.H2O]⁺.5).25–trien–3β–ol. 285 [M+ – cadena lateral]⁺. 2009. 251 [M .6-epoxi-ergosta-8.cadena lateral. et al.7-diol reportado por ( Yahoita. En sus espectros de masas presentan un ión molecular [M]⁺= 428 uma.7-diol y 5. 267 [M – cadena lateral . et al. 285 [M . et al.cadena lateral . es posible plantear que estos dos compuestos sean isómeros. 060 min): 12012606.D 377 63 45000 28 40000 69 35000 410 30000 HO O OH 25000 267 20000 91 185 145 213 15000 239 10000 119 349 5000 293 325 446 477503 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 m/z--> Figura 3.568 min): 12012606.D 40000 28 69 377 35000 30000 410 25000 HO O OH 267 20000 91 213 15000 145 185 239 10000 119 5000 311 289 0 0 m/z--> 50 100 150 200 250 300 349 504 350 400 450 500 .24: Espectro de masas compuesto 11T Abundance Scan 5042 (34.Capitulo 3 Figura 3-23: Espectro de masas compuesto 11T Abundance Scan 4962 (33. 303 [M-cadena lateral. presenta ión molecular [M]⁺=428 uma con la fórmula molecular C28H44O3.H2O + + + .64 Diagrama 3-5: Fragmentos de los compuesto 11T-13T + + Capitulo 3 m/z 392 O OH m/z 410 O . Chegwin 2007. et al.CL + + m/z 285 HO O OH m/z 349 .22-dien-3βol (Diagrama 36).CH3 O m/z 367 HO O OH .2H]⁺. Kim. 349 [M.C3H7 HO O OH M⁺ 428 m/z 377 .8-epidioxi-6. .O2]⁺. et al.C3H7]⁺. Los fragmentos característicos se dan a: m/z 410 [M-2H2O]⁺.2H2O . 2009.C3H7-2H2O]⁺. De acuerdo a lo anterior y a lo reportado por (Coy. se identifico como probable compuesto al ergosta-5. 285 [M-cadena lateral-H2O]⁺. 385 [M.H2 O O OH + O OH m/z 267  Compuesto 12T El espectro de masas de este compuesto (Figura 3-25).H2 O . 396 [M. 330 [MC7H14]⁺.2H2O . 1997). Hypsizigus marmoreus. También se encontraron compuestos con mayor grado de oxigenación de tipo epóxiesteroles y cetoesteroides. 2009. Cucaita 2007. 2009. Yokokawa. et al. Yue. 2001). et al. Mora 2010). Lactarius deliciosus.Capitulo 3 Figura 3-25: Espectro de masas compuesto 12T Abundance Scan 4996 (33. Flammulina velutipes. 2007. . Chegwin 2007. y con aquellos. et al. et al. Lactarius piperatus. Pholiota nameko. Jaramillo 2009. et al. 2011. Pleurotus ostreatus. Yahoita. Lactarium volemus (Rivera. Tricholoma portentosum. 1981).777 min): 12012606. Aislados e identificados de basidiomicetos por el grupo de Química de Hongos Macromicetos (Coy. et al. et al. corresponde a núcleo ergostano. previamente reportados en hongos Lentinula edodes (Shiitake). 1999. et al. Yahoita. Teichmanna. Las estructuras coinciden con lo reportado para esteroles aislados del shiitake por (Phillips.D 55 65 85000 80000 75000 70000 65000 60000 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 m/z--> 28 O O HO 81 301 107 330 133 161 239 267 385 428 185 213 349 408 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Del análisis anterior se determinó que los compuestos mayoritarios de la fracción de triterpenoides presentes en el extracto clorofórmico de estípite de Shiitake (Tabla 3-2). 1998. 3.4-dimetil-ergosta-24-en-3β-ol 4-metil-ergosta-5.7.CL O O HO + + .22-pentaeno Ergosta-5.22-dien.66 Diagrama 3-6: Fragmentos del compuesto 12T + Capitulo 3 m/z 396 HO .H 2O + O HO m/z 330 + O O m/z 285 O O m/z 367 Tabla 3-2: Componentes mayoritarios de la fracción triterpenoidal del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) Compuesto Formula 1T C28H40 2T.9(11).5-diol-6-ona 4.7.7.H2 + M⁺428 O O m/z 410 .25-trien-3β-ol 5.22-tetraen-3β–ol Ergosta-5.7.7-diol 5.H 2O O O HO m/z 303 .22-dien-3β.C7H14 + O O HO O O HO m/z 301 .5.6-epoxi-ergosta-8(14).6T C28H48O 5T C28H46O 7T C28H44O3 8T C28H44O3 10T C29H46O 11T-13T 12T M⁺ IDH 376 9 394 8 396 7 400 5 398 6 428 7 428 7 410 7 7 5 Nombre Ergosta-2.22-dien-3β.O2 + .H2O m/z 385 O .C3H7 + .6-epoxi-ergosta-8.22–trien-3β-ol Ergosta-7-en-3β-ol Ergosta-7.8-epidioxi-6.22-dien-3βol C28H44O3 428 C28H46O3 428 .9T C28H42O 3T C28H40O 4T.7-diol Ergosta-5.22-dien-3β-ol Ergosta -7.9(11). 1998). Los siguientes compuestos mayoritarios en el extracto crudo del estípite son el ácido linoléico y el ácido palmítico reportados también en el carpóforo de Shiitake en los estudios realizados por (Bisen. et al.7. Cabe aquí anotar que en el estudio realizado por (Kitzberger. en los estudios realizados por el grupo de Química de Hongos Macromicetos (Benavides 2004. Tabla 3-3: Componentes mayoritarios del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) Tiempo de retención 19. en la literatura este compuesto se identificó en el carpóforo de Shiitake en estudios realizados por (Yahoita.8% por (Cucaita 2007).29 8.23 21. 2000. et al.39 31.74 31. se hizo por aéreas relativas (Tabla 3-3).29% en el extracto clorofórmico del estípite estos compuestos han sido aislados del carpóforo de Shiitake por (Ohnuma.31 Porcentaje relativo 10.52 3.7.52%. Sin embargo.22-dien-3β-ol presenta un porcentaje de 8. resultado que coincide con lo reportado en carpoforo tanto para Shiitake como para Pleurotus ostreatus (Cucaita 2007.) para el carpóforo de Shiitake.22-trien-3β-ol Ergosta-7.22-pentaeno Ergosta-5. 2010. Chegwin 2007). 1999).91 1.08 25.7.22-tetraen-3β-ol Ergosta-5. Yahoita. estos compuestos no se encuentran como mayoritarios. 1998).7.21 Compuesto Ácido palmítico Ácido linoleico Ergosta-2.9(11). en la cuantificación del extracto. encontrándose el mayoritario es el ergosta-5. también se reportaron para el carpóforo.Capitulo 3 67 3. En cuanto al triterpeno Ergosta-2. et al.3.39 39. et al.52 1.7%.21%. Cucaita 2007). 2007).22–trien-β-ol (ergosterol) 39. et al.81 32.9(11).91 %.22-pentaeno en el estípite se encuentra en menor proporción 1.5. Los compuestos ergosta-7-en-3β-ol y ergosta-7. comparado con lo reportado para el carpóforo 8. compuesto de mayor abundancia en hongos macromicetos. Longvah. et al.7. se reporta un menor porcentaje de ergosterol (3.64 31.34 29.9(11). y 3.22-dien-3β-ol Ergosta-7-en-3β-ol .5 Cuantificación relativa de los compuestos mayoritarios del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake (Lentinula edodes) La cuantificación de los compuestos presentes en el estípite.5. 3. con el fin de obtener de forma pura los compuestos triterpenoidales.7. Se separaron las fracciones correspondientes a ellos y se analizaron de nuevo por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas arrojando como resultado que el 1P no corresponde a un compuesto de tipo triterpeno.  Fracción 102-121 Como se muestra en el cromatograma (Figura 3-26) esta fracción esta constituida por siete compuestos de los cuales los mayoritarios son los denominados 1P.68 Capitulo 3 3.6 Purificación de las fracciones por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) semipreparativa Con base en los resultados anteriores las fracciones 102-121 y 122-133 se sometieron a CLAE semipreparativa como se indico previamente. 2P y 3P. Figura 3-26: Cromatograma CLAE de la fracción 102-121 2P 3P F 102-121 1P . Los compuestos 2P y 3P corresponden a los esteroles ergosta-7-en-3β-ol y ergosta-5.22-trien-3β-ol respectivamente. se identificaron siete compuestos que corresponden a cinco esteres de ácidos grasos y dos ácidos grasos (ácido palmítico y ácido linoléico) ácidos grasos que han sido identificados también para el carpóforo de Shiitake De la fracción de triterpenoides.4 Conclusiones De la fracción grasa no esterólica. Figura 3-27: Cromatograma CLAE de la fracción 122-133 5P 4P 6P F 122-123 Con base en los resultados anteriores. 5P y 6P junto con las fracciones 65-88 y 198-204 obtenidas de la CC. que corresponden a 6 esteroles. 3 epoxiesteroles.22-dien-3β-ol respectivamente (Figura 3-27). las estructuras coinciden con lo reportado en literatura para esteroles aislados de hongos basidiomicetos. . y 1 triterpeno. 1 cetoesteroide. de acuerdo a lo expuesto en el (Diagrama 3-2). se identificaron 11 compuestos mayoritarios con núcleo ergostano. 3.Capitulo 3 69  Fracción 122-133 Esta fracción está constituida por dos compuestos triterpenoides mayoritarios (5P y 6P) que después de su separación y posterior análisis por CG-EM se corroboró su identidad correspondiendo a ergosta-7-en-3β-ol y ergosta-7. se seleccionaron los compuestos puros 2P. 3P. para realizar la determinación de la actividad antibacteriana. Estudio químico de la fracción insaponificable del hongo macromiceto Lentinula edodes. Thakur.3. Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Química.22-dien-3βol. ergosta-7-en-3β-ol. Revista Iberoamericana de Micología. Bogotá. Current Medicinal Chemistry. E.9(11). Lentinus edodes: A Macrofungus with Pharmacological Activities. 15: 69-74.22-dien-3β-ol. O.22-dien. 3.. .. C. C. Sanodiya. 2011. Benavides. Nieto. Chegwin.7-diol y ergosta-5. B. Bogotá. García. Chemistry of Natural Compounds. 2009. S. Higuita. Bogotá. L. 2007. M.7-diol. un cetoesterol ergosta -7...7. Facultad de Ciencias. ergosta-7. Jaramillo. L. T..8-epidioxi-6. J. ergosta-5..22–trien-β-ol. O. M. K.70 Capitulo 3 De los 11 compuestos identificados en el estípite de Shiitake. E. P. A... Estudio de la influencia del sustrato en la cantidad y clase de triterpenoides de Pleurotus ostreatus así como en el contenido de estatinas si dicho hongo las presenta. 2004.22tetraen-3β–ol. J. 2004. Pérez. ácido palmítico que son considerados esenciales aunado a compuestos triterpenoidales con posible actividad biológica. Bisen. Estudio químico de la fracción insaponificable del hongo macromiceto Lentinula edodes (shiitake). Rugeles.22-dien-3β. Infectio. A.22-dien-3β. Prasad. E.7. S. I. Bogotá.5-diol6-ona y tres epoxiesteroles 5. R. Estudio químico comparativo de metabolitos secundarios de los hongos comestibles Laccaria laccatta y Lentinula edodes y determinación de su variación respecto al estadio del hongo. se puede concluir que el estípite de Shiitake proporcionaría beneficios nutraceúticos al ser empleado como suplemento alimenticio. 45: (2). un triterpeno ergosta-2. 2009. G. S. Baghel. 2007. 9 han sido reportados en el carpoforo del hongo que corresponden a cuatro esteroles ergosta-5. 2010. Actividad inmunomoduladora y anti-VIH de las estatinas. 17: 2419-2430.7.22-pentaeno. G. B. Mansur. Montoya. 193-196. 108-117. Determinción estructural y antimicrobiana de los intra y exo metabolites secundarios triterpenoidales en Ganoderma lucidum obtenido en cultivo sumergido. 1998.6-epoxi-ergosta-8. Cucaita. Coy.5. M. 5. 15: (2). Bogotá.5 Bibliografía Benavides.. Brizuela. K. M. Sterol composition of the macromycte. Basidiomicetos: nueva fuente de metabolitos secundarios. S. De los resultados encontrados en cuanto al valor nutricional y a la determinación de la presencia de ácidos grasos insaturados como el ácido linoléico..9(11).6-epoxi-ergosta8(14). S. S. Nieto. Osorio. Food Chem. D. I. medicinales. R. 2003. M. Martínez. A. Valencia. 2002.. Martínez-Carrera. Nieto. Kakuda... 59: 7841-7853. G.. 31: (2).. Ravi Subbiah. Abplanalp. Morales. Oh.. Mayett. K. T. Kitzberger. Mora. Determinación estructural de los metabolitos secundarios triterpenoidales en búsqueda de antimicrobianos de un hongo silvestre Aphyllophoral Colombiano. J. Y. 2007. 749-751. Longvah. R. 2005... K. 20: (3).... Benavides. Chemical and Pharmaceutical Bulletin... Minor. Cucaita. Jung.. Rivera. C. H. J. H.. Machida. Lentinula edodes and Tricholoma matsutake.. Ruggio. K.. Sobal. Haytowitz. Ohnuma. 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Actividad antimicrobiana del estípite de Shiitake .Capitulo 4 73 Capitulo 4. 22- . diterpeno. constituído por ácido hexadecanoico. tal es el caso de la pleuromutilina. El estípite fresco. ha sido ya comprobado frente a una gran variedad de microorganismos (Bisen. 2009). el cual es empleado para tratamiento de infecciones por micoplasma en animales y se convierte en el primer antibiótico de uso comercial a partir de basidiomicetos (Rosa. et al.7. 4. Formando parte de los basidiomicetos se encuentra el Shiitake (Lentinula edodes).5. representa un desafío mundial para la medicina humana y animal. Esta última actividad. passeckerianus. aún antes del auge de búsqueda de nuevos antibióticos. fue proporcionado por la empresa Fungitá. Actualmente es reconocida la necesidad que existe de encontrar nuevos antibióticos para reducir al mínimo la amenaza de la resistencia a los antimicrobianos (Hearst.74 Capitulo 4 4.2. De hecho. 4.. Sin embargo la aparición de patógenos resistencia a múltiples fármacos. su toxicidad selectiva ha permitido su uso amplio y eficaz para combatir infecciones. actualmente desechada. 2010. ergosta-2. como posible fuente de compuestos antibacterianos. et al. ácido linoléico. varios compuestos que inhiben el crecimiento de bacterias y hongos ya se habían obtenido de estos hongos.2 Compuestos utilizados en la actividad antimicrobiana Los ensayos de la actividad se realizaron con el extracto clorofórmico crudo del estípite de Shiitake. hipocolesterolemica. Basados en este enfoque. antiviral. aislado de Pleurotus mutilis y Pl. se secó a una temperatura de 35°C por 36 horas.9(11). 2003).2. En el presente trabajo se evaluó la actividad antibacteriana contra bacterias Gram negativas y Gram positivas de los extractos clorofórmicos del estípite de Shiitake con la finalidad de explorar la posibilidad de utilizar esta parte del hongo. et al. antioxidante y antibacteriana.1 Introducción Desde el descubrimiento y la explotación de agentes antibióticos en el siglo XX. presentada tanto por los extractos del micelio como de los cuerpos fructíferos.2 Materiales y métodos 4. ya que se reporta que este hongo presenta actividad antitumoral.1 Material fúngico El Shiitake. 2009). para posteriormente ser sometido a proceso de pulverización. se cortó en láminas delgadas. hongo comestible cuyo estudio ha tomado gran interés no solo por su valor nutricional sino también por su valor medicinal. et al. los basidiomicetos han sido en los últimos años objeto de atención como potencial fuente de nuevas clases de antibióticos. Rao. y una especie de bacteria Gram positiva: Staphylococcus aureus (ATCC 29923). ergosta-5. con el fin de determinar si el estípite es activo o no frente a estas bacterias de la microflora intestinal de las aves de corral. ergosta-5. así como con los compuestos puros obtenidos de la columna preparativa (ácido linoléico. ergosta-7. Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). se evaluó la actividad con la fracción enriquecida en compuestos triterpenoides (Ergosta-7. ergosta-7-en-3β-ol).9(11).Capitulo 4 75 pentaeno. ergosta-7.7. 22E.5α. respuesta leve entre 10-15mm y respuesta pequeña menor de 10mm.7α-diol). que catalogan la actividad según el diámetro de la zona de inhibición en respuesta muy fuerte para un halo mayor de 30mm. ergosta-7-en-3β-ol. 4. et al.22-dien-3β-ol.22dien-3β-ol. Igualmente. 4.22-tetraen-3β-ol. El tamaño de la zona de inhibición indica la actividad de la sustancia evaluada. ergosta-5.3 Microorganismos utilizados Los microorganismos de ensayo seleccionados fueron tres especies de bacterias Gram negativas: Salmonella enteritidis (ATCC 13076).(14)22-dien-3β.2. se empleó la bacteria benéfica Gram-positivas: Bifidiobacterium bifidus.7.22-trien-3β-ol.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana Para evaluar la sensibilidad de estos microorganismos a los triterpenoides. utilizando agar Mueller–Hinton.22-trien-3β-ol.5-diol-6-ona. que son las que comúnmente atacan a los pollos de engorde. respuesta moderada entre 16-20mm.22-dien-3β.3 Resultados y discusión Las zonas de inhibición fueron medidas y el grado de actividad determinado mediante la escala normalmente empleada (Lee. respuesta fuerte para 21-29 mm.24R-5α-6αepoxiergosta-8.7α.22-dien-3.8α-triol.7.7α-diol. 2004).2. 22E-ergosta-6. Igualmente. Escherichia coli (ATCC 25922).22-dien-3β. Esta técnica está fundamentada en el conocido método de Kirby-Bauer (Diagrama 4-1) y se basa en la formación de un halo de inhibición de crecimiento de los microorganismos cuando ellos son efectivos contra el microorganismo probado.24R5α-6α-epoxiergosta-8. se empleó el método de difusión en agar en pozo. 4. 22E. . se diluyen de uno a dos “loop” de los microorganismos que se activaron. 100 µL del control negativo y 30 µL de controll positivo cefalotina 40µg/mL y ciprofloxacina 0. se mide su absorbancia a 620 nm.3%. En cada pozo se adiciona 100 µL del extracto a diferentes concentraciones. En 10 mL de solución salina (0.2 equivalente a la escala de MacFarland de 0.5 (108 células/mL). Prepración del inóculo. Se agita la suspensión. se siembra en agar TSA y se activan durante 18 horas a 37 C. En cajas de pretri con agar Muller-Hinton.76 Diagrama 4. se adicionaron 100 µL del inóculo. Se incubaron a 37 C durante 24 horas.1: Método de difusión en agar Capitulo 4 Cepa Bacteriana.9% NaCl) estéril . Se hacen pozos sobre la superficie del agar con un sacabocados estéril de 5mm. se deja secar. se extiende el inóculo. . se ajusta la densidad óptica a 0. Se realiza un cultivo fresco. realizándose las lecturas de los halos a las 24 y 48 horas.1-0. Este resultado coincide con lo reportado tanto por (Hirasawa. con una respuesta leve para S. Ps. I  N. * Control positivo. N. Tabla 4-1: Actividad antimicrobiana del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake Extracto crudo del estipite de Shiitake Concetración O. aeruginosa y para bacterias Gram positivas con una respuesta moderada para S. C N.3. I  8 mm  10 mm  12 mm 12 mm  14 mm  40 mm  E. N. la cual se hace evidente en el rango de 8 a 20 mg/mL.C no creció Los resultados obtenidos indican la presencia de compuestos con actividad antibacteriana en el extracto crudo contra bacterias de tipo Gram negativas.5 mg/mL  1 mg/mL  8 mg/mL  10 mg/mL  12 mg/mL  15 mg/mL  20 mg/mL  *Cefalotina  Bacterias Gram negativas Ps. C  N. enteritidis. I  N. aureus. C  N. et al. C  35 mm  Bacterias Gram positivas S. I  10 mm  12 mm  16 mm 18 mm  20 mm  S. C  N. I  15 mm  16 mm  16 mm  20 mm  22 mm  38 mm  *Ciprofloxacina  45 mm           Halos medidos en milímetros (mm). coli N. Aeruginosa N. una primera capa muy fina de peptidoglucano y una capa externa adicional denominada membrana externa que les permite tener más resistencia a algunas sustancias.Capitulo 4 77 4.aureus. enteritidis N. . notándose además que la misma es concentración dependiente.I no inhibe. aureus N. C  N. et al.1 Actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas Los datos obtenidos en el extracto crudo (Tabla 4-1) indican que a concentraciones menores de 8 mg/mL no hay inhibición probablemente debido a que las concentraciones de los posibles compuestos activos son muy bajas a esos niveles y no les permite la expresión de su actividad. I  N. C  N. La pared celular de las bacterias Gram negativas está compuesta por dos capas. Las bacterias Gram positivas tienen solo una capa gruesa de peptidoglucano como pared celular y esto hace que la membrana celular sea más permeable que las Gram negativas permitiendo el paso de los compuestos a su interior (Stainer. quienes encontraron respectivamente que los extractos clorofórmicos del Shiitake presentan una mejor actividad frente a bacterias de tipo Gram positivas y con una mejor actividad frente a S. 1999) y (Hatvani 2001). 1992). Esta diferencia en la actividad probablemente está relacionada con la diferencia que existe entre la pared celular de los dos grupos de bacterias. presentado la mejor actividad contra este microorganismo el compuesto Ergosta-5. resultado que para el S. 2009) que reporta actividad contra esta bacteria y que coincide con los datos de actividad obtenidos en la presente investigación. el extracto clorofórmico del estípite no exhibe actividad para E. enteritidis hasta la fecha no hay información en literatura convirtiendo este resultado en el primer reporte de la actividad de extractos de Shiitake para este microorganismo. El resultado anterior junto con el obtenido en la presente investigación contrasta con el de (Hearst. Los resultados (Tabla 4-2) ponen de manifiesto que en el caso del ácido linoléico (18:2) este compuesto presenta actividad leve contra Ps. solo hay un estudio realizado en extractos de Shiitake (Hearst. Con base en la respuesta presentada por el extracto clorofórmico y con miras a la posible determinación del(los) compuesto(s) responsable(s) de la acción antibacteriana se realizó el ensayo con los compuestos puros obtenidos de la columna preparativa. pero siendo la concentración en que exhibe la actividad (1mg/µL) mayor a la del estípite (0. que reportan actividad de los extractos del Shiitake frente E. lo cual indica que la acción presentada por el extracto podría ser debida en parte a este ácido graso conjugado confirmando que los ácidos grasos de cadena mediana y larga son más activos frente a bacterias Gram-positivas que a Gram-negativas y que específicamente el acido linoléico presenta actividad comprobada frente a las primeras (Desbois.22-trien-3β-ol. Hirasawa. Zhenga. et al. et al. aeruginosa y moderada contra S.coli. En cuanto Ps. como la reportada por (Pérez Guitierrez 2005) en Tubifex tubifex.7.78 Capitulo 4 Así mismo. Estos resultados son importantes ya que ponen de manifiesto que los extractos del estípite de Shiitake son una buena fuente natural de compuestos antibacterianos. . resultado concordante con las investigaciones realizadas por (Hatvani 2001.7. en primera instancia.5 mg/mL. aureus. Kitzberger. et al. Si bien no hay estudios sobre actividad antibacterial de ácidos grasos asilados de los hongos.22-trien-3β-ol con halos de inhibición entre 10mm-20mm. aureus es similar al obtenido en esta investigación. Con relación a los compuestos Ergosta-5. et al. et al.02mg/ µL). indican que los ácidos grasos (ácido linoléico) presentan actividad antibacteriana para Staphylococcus aureus (15mm). a concentraciones de 1 a 4. aeruginosa de los compuestos presentes en el extracto crudo. que las concentraciones utilizadas podrían ser muy altas para este microorganismo ejerciendo acción bactericida a estos niveles de concentración. aeruginosa. Todos los compuestos mostraron actividad para S. 2007). et al. Cabe aquí anotar que en el ensayo con el extracto clorofórmico del estípite no hubo crecimiento de E. 2005).coli. En lo referente a la actividad frente a S. así como una fracción enriquecida en compuestos triterpenoides. investigaciones realizadas en plantas y animales. Eschericha coli (12mm). 1999). 2009. quienes reportan no actividad frente a esta bacteria. Ergosta-7-en-3β-ol. mostraron actividad contra las bacterias Gram positivas y Gram negativas. la respuesta fue de leve a moderada. Ergosta7. lo que permitiría inferir. coli.22-dien-3β-ol. 2010. aureus. lo que indica una mayor actividad contra Ps. siendo el Ergosta-5. entritidis.22-dien-3β-ol con halos de inhibición muy similares (12-20mm). Igualmente los compuestos exhibieron actividad frente a Ps. y E. y el Ergosta-7-en-3β-ol para E. aeruginosa. a las concentraciones ensayadas.7. con respuesta de moderada a fuerte y de pequeña a moderada respectivamente. coli. coli. aeruginosa. se registra también entre leve y moderada pero los compuestos que presentaron mejor actividad para dicha bacteria son el Ergosta-7-en-3β-ol y el Ergosta-7. .Capitulo 4 79 La actividad de los compuestos contra S.22-trien-3β-ol y el Ergosta-7-en-3β-ol los más activos para Ps. C 18mm N.6-epoxiergosta-8. C 6mm N.22-trien-3β-ol S. C 7mm N. enteritifdis Ps.5. creció 20mm N. I N. enteritifdis Ps. C 10mm N.22-dien-3β-ol S. Aeruginosa E. aureus Ácido Linoléico S.5-diol-6-ona 5. C 8mm N. aureus Ergosta-7-en-3β-ol S.8-triol 5. C 12mm N.(14)22-dien-3β. C 25mm 18mm ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― 14mm N. coli S. C 16mm 6mm ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― 8mm N. Aeruginosa E. C 0. C 25mm 22mm ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― 15mm N. C 10mm N.No fue evaluado.25 mg/mL N. creció 16mm N. C 20mm N.22-dien-3. aureus Ergosta-5. C 2 mg/mL 16mm N. C 45mm 35mm 45mm 35mm 38mm 40mm 45mm 35mm 38mm 40mm 45mm 35mm 38mm 40mm 45mm 35mm 38mm 40mm Control positivo Ciprofloxanina Cefalotina 38mm 40mm -----. Aeruginosa E.7-diol Ergosta-6. C 8mm N. enteritifdis Ps. coli S. C 10mm N.6-epoxi-ergosta-8. enteritifdis Ps. coli Ergosta-7. Aeruginosa E. C 8mm N. C 10mm N. enteritifdis Ps.7-diol S. C 0.22-dien-3β. coli S.C no creció .22-dien-3β. C 4 mg/mL 20mm N. Aeruginosa E. C 1 mg/mL 16mm N. C 10mm N.1 mg/mL N. C 18mm 14mm 10mm 12mm 18mm 15mm 10mm 15mm 12mm 6mm 11mm N. C 20mm 16mm 16mm 20mm 20mm 18mm 12mm 20mm 18mm 8mm 12mm N.7. C 12mm N.5 mg/mL 15 mm N. aureus Ergosta-7.80 Capitulo 4 Tabla 4-2: Actividad antimicrobiana de los compuestos asilados del extracto clorofórmico del estípite de Shiitake Compuesto Microorganismos ensayados S. C 18mm N. I N. N. aureus S. C 6mm N. coli Concentraciones O. C 18mm 10mm ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― ―― 10mm N. aureus y Gram negativas como E. enteritidis E.5-diol-6-ona 22. 24-5.aureginosa. resultados que guardan relación con los aquí presentados. 24-5.4). 1999) a los compuestos purificados.22-dien-3β. y Ps aeruginosa. enteritidis Ergosta-5. aureus y Ps.003 a 2. epoxiesteroles y cetoesteroles. En relación a la fracción constituída por polihidroxiesteroles.6-epoxiergosta-8. con una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 0. .25 mg/mL a 4mg/mL. al comparar los resultados de la actividad antimicrobiana del extracto y de los compuestos puros del estípite del Shiitake con lo reportado en literatura para hongos Basidiomicetos (Tabla 4. pero con menor inhibición para S. Con base en lo anterior y para confirmar o rechazar la hipótesis anterior se realizaron pruebas de actividad para S. Aeruginosa. aislados del Ganoderma applanatum. en cuanto a extractos crudos se refiere.22-trien-3β-ol E. en los cuales se concluye que los compuestos de tipo triterpenoidal presentan efecto antibacteriano. ésta presentó también inhibición frente a los microorganismos ensayados. indica que el 5α-ergosta-7en-3β-ol y el 5α-ergosta-7.Capitulo 4 81 Los resultados de la actividad antibacteriana del estípite del Shiitake son concordantes con lo hallado en trabajos previos realizados por el grupo de Química de Hongos Macromicetos (Jaramillo 2009. enteriditis y E. hongo reconocido por su propiedades antimicrobianas.050mg/mL 6mm 6mm 10mm 0. se ve claramente que lo presentado por el hongo en estudio es concordante.025 mg/mL 6mm 6mm 10mm 0.(14)22-dien-3β. coli. Tabla 4-3: Actividad antimicrobiana a menor concentración Compuestos Microorganismos S. coli con menores concentraciones obteniéndose como resultado el crecimiento de estas bacterias. Cabe anotar aquí. coli 6mm 7mm 7mm 7mm 8mm 7mm 7mm 8mm 7mm Concentraciones 0. sólo la investigación realizada por (Smania. que en la literatura dentro de los muy pocos estudios que hacen referencia a la actividad antibacteriana de extractos conteniendo esteroles. enteritidis E.7-diol S. coli S. a lo exhibido frente a S.5α.10 mg/mL 8mm 7mm 12mm Acido linoléico De forma general. aureus y Ps.8α-triol 22. Mora 2010).22-dien-3.22-dien-3β-ol mostraron actividad antibacteriana contra bacterias Gram positivas como S.0 mg/mL respectivamente. estos compuestos tienen probablemente un efecto bactericida (Tabla 4-3). lo que permite concluir que a concentraciones de 0.7-diol 22E-ergosta-6.7.0 a 4.0 mg/mL y de 1. por Ganoderma lucidum. et al. coli Ergosta-7.22-dien-3β.6-epoxiergosta-8. Es de anotar que en el caso de la actividad antibacteriana reportada para los extractos acuosos de Lentínula edodes ésta es mayor y debe ser debida a compuestos polares y no a los triterpenoides. disminución debida probablemente a su menor concentración en el extracto crudo. .82 Capitulo 4 comparada con los compuestos anteriores. 2008) (Rosa. I N. E N. 2011) (Turkoglu. Aeruginosa 9mm N. 2006) (Mora 2010) (Kalyoncu. E N. E N. I 20mm 20mm 4mm 4 mm N. I N. I 7mm E. I N. 2002) (Jonathan. E N. enteritidis N. I N. Inhibe N. E N. coli 9mm N. et al. et al. E N. E N. 2006) (Gezer. I N. E N. 2009) (Ozturk. I N. et al. I 25mm 20mm N. I 14mm N. I 9mm 25mm (Jaramillo 2009) 20mg/mL 20mg/mL 20mg/mL ----------------------------20mm 13mm 8mm N. I N. I N. 2003) Referencia Acuoso Acuoso Acuoso Metanol Metanol Metanol Acetato de etilo Acetato de etilo Acetato de etilo Etanol Cloroformo Etanol Etanol Cloroformo Metanol Diclorometano micelio Diclorometano Medio agotado Etanol Etanol Metanol Metanol Metanol Etanol 1 mg/µL --------------25 mg/mL 20 mg/mL 20 mg/mL 1 mg/mL 1 mg/mL 1 mg/mL 5 mg/mL 8 mg/mL 15 mg/mL 12 mg/mL 12 mg/mL 2 a 4mg/mL 20mg/mL (Hearst. E N. 2007) . I 11mm 10mm N. aureus 12mm 25mm 15mm 16mm 14mm 11mm Menor a 12mm Menor a 12mm Menor a 12mm 13mm N. et al. 2009) (De Carvalho. I N. et al. I N. I N. E N. 2003) (Dulgera. I 9mm S. et al. E N. et al. Inhibe 14mm 20mm 16mm 12mm N. I N. E N. Ganoderma lucidum Morchella conica Ramaria flava Agaricus bisporus Agaricus bitorquis Agaricus essettei Russula delica Extracto Concentración Bacterias Gram negativas Ps. Inhibe 12mm 11mm 10mm (Yaltirak. I N. E N. E N. I N.Capitulo 4 83 Tabla 4-4: Actividades antibacterianas reportadas para hongos Basidiomicetos Hongos Lentinula edodes Lentinula edodes Lentinula boryana Lepista nuda Lycoperdon pusilum Lycoperdon giganteum Irpex lacteus Nothopanus hygrophanus Pycnoporus sanguineus Clitocybe geotropa Meripilus giganteus Sparassis crispa Armillaria mellea Fomitopsis sp. E N. et al. et al. I 10 mm 12mm 8mm 10mm N. I N. I N. E N. I N. I N. E N. I 7mm Bacterias Gram positivas S. I N. E N. et al. I 10mm N. E N. 2010) (Johnsy. aureus 18mm 12mm 16mm 16mm 19mm 18mm 10mm 4mm Referencia Lycoperdon perlatum Cantharellus cibarius Clavaria vermiculris Ramaria Formosa Marasmius oreades Pleurotus pulmonarius Trametes gibbosa (Ramesh. E N. E N. enteritidis N. E N. et al. E N. N. E N. coli 19mm 15mm 18mm 13 mm 19mm 12mm 5mm 3mm Bacterias Gram positivas S. Aeruginosa 10mm 13mm 19mm 15mm 15mm 19mm 7mm 6mm S.84 Capitulo 4 Hongos Extracto Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Metanol Concentración 10 mg/mL 10 mg/mL 10 mg/mL 10 mg/mL 10 mg/mL 10 mg/mL 25 a 50µg/mL 25 a 50µg/mL Bacterias Gram negativas Ps. et al.No reporta concentración.I no inhibe . N.E no evaluado. E N. 2011) Acuoso --------. E E. E N. 5. 2009) y aunque el extracto crudo contiene dentro de sus componentes un triterpeno (Ergosta-2.9(11).3. convirtiendo esto es un posible requerimiento estructural. ya que sería una respuesta indeseable. su pequeña proporción impidió la separación y obtención del compuesto puro y por tanto la determinación de su actividad antibacteriana. Tabla 4-5: Actividad antibacteriana de compuestos puros frente a S. siendo la diferencia estructural entre los esteroles antes nombrados y el Ergosta-5. los valores de halo de inhibición permiten deducir que a medida que aumenta el número de insaturaciones en la molécula aumenta la actividad. Esto mismo se aplica para Ps.0mg/mL 10mm 16mm 10mm 12mm 12mm 18mm Así mismo. impidiendo a la vez la confirmación de este requerimiento estructural.22-pentaeno).5 mg/mL 1. 2003).22-trien-3β-ol la presencia de un doble enlace en C-5 y dado que la concentración que presenta un halo de inhibición de la misma magnitud es cinco veces menor se puede inferir que es esta característica estructural la responsable de la mayor actividad exhibida por el compuesto. tomando la bioacción frente a S.7. Al realizar un análisis preliminar de la relación estructura . lactobacilos y bifidobacterias. El hecho de que el Ergosta-7. 4. Sin embargo. et al. los resultados obtenidos dentro del grupo de investigación sobre la actividad de los triterpenos ergostánicos.7.22-trien-3β-ol CONCETRACIÓN 0. permitieron determinar que dichos compuestos no contribuyen a la acción antibacteriana (Mora 2010). aureus (Tabla 4-5).22-dien-3β-ol Ergosta-5.2 Actividad antimicrobiana del extracto crudo del estípite contra bacterias benéficas Siendo el objetivo de esta investigación el de evaluar la factibilidad de empleo del estípite de Shiitake como ingrediente nutraceútico en la preparación de alimento aviar y conociendo ya su actividad antibacteriana sobre las bacterias que usualmente atacan a los pollos de engorde se hace necesario determinar que los compuestos presentes en el extracto crudo del estípite no sean activos contra bacterias benéficas. aureus COMPUESTO Ergosta-7-en-3β-ol Ergosta-7.Capitulo 4 85 De la comparación entre la actividad antibacteriana del extracto y los esteroles puros se observa que estos últimos son más activos que el extracto.7.actividad. La microflora del tracto intestinal juega un papel importante en procesos tanto de digestión y absorción de nutrientes como inmunológicos (Guarner. Las especies del género Bifidobacterium forman parte de esta microflora normal y su importancia reside en proporcionar . Si bien se ha reportado que la actividad requiere de la presencia de un hidroxilo en el Carbono 3 (Mutai.22-dien-3β-ol y el Ergosta-7-en-3β-ol presenten idéntica acción parece indicar que la insaturación en C-22 no sería indispensable para que la acción antibacteriana se presente. Aeruginosa. et al. Ergosta-7-en-3β-ol. 2006). aureus.22-trien-3β-ol presenta la mejor actividad contra S. I 10 mg/mL N. I 15 mg/mL N. Este resultado es muy importante debido a la necesidad de introducir en los alimentos suplementos o aditivos que ayuden a mantener la microflora intestinal para un adecuado funcionamiento del tracto digestivo (Aida. Ergosta-7. et al. con respuesta entre leve y moderada. Los esteroles Ergosta-5.15 y 20 mg/mL) y se incubaron por 48 horas en condiciones anaeróbicas (Tabla 4-6). siendo los más activos el Ergosta-7-en-3β-ol y el Ergosta-7.86 Capitulo 4 resistencia a infecciones de tipo gastrointestinal. aureus con respuesta leve a moderada. Para tal fin se realizó la determinación de la actividad del extracto crudo contra bifidobacterias en agar MRS. lo que es benéfico al inhibir la adhesión de microorganismos patógenos gracias a la destrucción de los receptores (Ruseler-Van Embden. et al. mostraron actividad contra las bacterias Gram positivas y Gram negativas. la edad y alimentación (IñiguezPalomares. I 20 mg/mL N. dado que estudios realizados sobre ella arrojan como resultado que produce glicosidasas que degradan los carbohidratos asociados a las mucinas intestinales. 10. 2009).7. entritidis. et al.22-dien-3β-ol. La presencia de las distintas especies varía con la especie de animal.22-dien-3β-ol.I no inhibe. Todos los compuestos exhiben actividad contra S. y Staphylococcus aureus. de las cuales se seleccionó la bacteria Bifidobacterium bifidus. Pseudomonas aeruginosa. Tabla 4-6: Actividad antimicrobiana del extractocrudo del estípite contra bacterias benéficas Estipite de Shiitake Extracto crudo Clorofórmico Microorganismos Concentraciones 8 mg/mL N.4 Conclusiones El estípite del hongo comestible Shiitake contiene compuestos de carácter triterpenoidal con actividad antibacteriana frente a Salmonella enteritidis. con el individuo. Todos los compuestos triterpenoidales aislados del estípite del Shiitake exhiben actividad para S. 4. .7.22-trien-3β-ol. I Bifidobacterium bifidus N. El bioensayo se efectuó con las mismas concentraciones empleadas en los ensayos de actividad contra bacterias patógenas (8. 1995). El Ergosta-5. Escherichia coli. 4. LWT. coli fue de moderada a fuerte y de pequeña a moderada respectivamente. 2004 Benavides. Parece ser. M. Bogotá. 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Evaluación de aceites esenciales de orégano en la dieta de pollo de engorde. 2009. siendo así las dos clases de compuestos los que le proporcionan al estípite del Shiitake dicha actividad.. que la presencia de un doble enlace en C-5 aumenta la acción antibacteriana de los esteroles y que la insaturación en el C-22 no es requerimiento estructural para dicha acción. 2010 Benavides. F. aeruginosa. 2006. Departamento de Química. Universidad Nacional de Colombia. T.. S.. W. 45: (2).... Chemistry of Natural Compounds.. K. S. Pérez. Thongwittaya. Academic press Chang.. 1978.. Disponibilidad del fósfoforo del la pasta de soya y sorgo-glúten de maíz. 2004. 11: (1). García. T. Indicadores de calidad de leches crudas en diferentes regiones d Colombia. Basidiomicetos: nueva fuente de metabolitos secundarios. S. Kuvibidila. D.. medicinal effect. Smith. G. M. Yamauchi. 2007 Chandra. J. L. Lentinus edodes: A Macrofungus with Pharmacological Activities. 1998. 2001.. 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J. 2009. desempeño productivo y disminución de enfermedades causadas por bacterias. la investigación realizada se enfocó a su utilización en alimentación animal. mejorando el desarrollo de las aves.3-1. el efecto de la inclusión del estípite de Shiitake en la dieta de pollos de engorde sobre la digestibilidad de nutrientes. para la aplicación de los resultados obtenidos. . en aquellas dietas con más de dos cereales. presenta un gran potencial para ser empleado en formulaciones de alimento aviar. manteniendo los niveles de nutrientes y posiblemente disminuyendo antinutrientes como el ácido fítico. bien sea incluyéndolo como ingrediente adicional o. reemplazando al tercero total o parcialmente. no se puede pensar en la eliminación del uso de los antibióticos.glucanos.glucanos. Conclusiones generales y perspectivas El análisis nutricional. químico y de actividad antibacteriana realizado al estípite de Shiitake permitió ver que esta parte del hongo.3-1. ya que la actividad anticancerígena e inmunoestimuladora que presentan ayudaría en gran medida a disminuir la incidencia de cáncer de colon. Dado que la proporción de estos bioactivos es relativamente baja y su actividad moderada. ya que los mismos podrían ser empleados como prebióticos.Conclusiones 97 5. los resultados dan pauta para iniciar estudios sobre la posibilidad de incluir al estípite de Shiitake en la elaboración de alimentos funcionales para consumo humano por su alto contenido de fibra y su proporción de β-1. Se hace necesario. dada su composición de ácidos grasos y esteroles antimicrobianos. Si bien.6. así como la posibilidad de su utilización como alternativa al uso de antibióticos promotores de crecimiento (APC). cuya concentración en el estípite es apreciable. pero si en una posible disminución de la cantidad empleada. aunado al hecho de que se trata de un desecho reduciría costos a los avicultores. sin dejar de lado profundizar en los β-1. que en la actualidad constituye desecho en su producción.6. evaluar en futuros trabajos. Así mismo. su inclusión en la dieta aviar aportaría protección contra bacterias patógenas sin inhibir la acción de las benéficas. aumentaría utilidades a los fungicultores y produciría un impacto positivo al medio ambiente. Esto. 1 28.46 2150.56 773.08 1.07 2149.78 *Proteína 14.3 70.89 70.16 0.26 0.70 3.16 4.14 Cenizas 5.87 Fe 19. Variación Ca 770.81 9.99 102.56 14.89 773.17 5.71 0.41 0.69 0.45 20.55 5.3 28.80 19.51 Grasas 0.29 Promedio 9.44 47.87 99.65 1363.3-1.20 0.12 4.76 101.24 0.09 Carbohidratos 26.73 0.69 **FDN 45.64 89.48 14.78 89.91 3.98 3.05 Na 100.88 0.22 3.09 13.72 0.58 46. Variación .15 0.35 β-1.35 14.08 0.17 2.98 Anexos Anexo 1: Desviación estándar y coeficiente de variación Promedio Materia seca 89.30 K 2148.96 1.67 0.04 13.29 2.12 5.21 0.59 σ C.04 Mg 1358.02 2.91 8.52 3.00 0.52 1.33 0.16 5.65 46.2 27.12 1363. Variación Promedio σ C.02 0.75 30.33 3.79 774.93 0.12 0.33 8132.52 89.71 0.76 20.73 1367.3 26.6-glucanos 9.56 0.56 1.90 σ C.78 8136.05 69.1 27.13 0.53 Mn 13.35 0.32 14.88 8136.03 31.36 2149.04 30.81 Fibra Cruda 30.87 Cu 3.05 Zn 71.25 P 8139.77 1.