TEMA 6.- La controversia “Ox-Phos”.Hipótesis quimiosmótica de Mitchell e hipótesis del acoplamiento químico. Principales evidencias experimentales. Los orígenes de la Bioenergética pueden situarse en la segunda mitad del siglo XIX cuando Louis Pasteur publicó los primeros trabajos en los que cuantificaba cuánta levadura se formaba por gramo de glucosa consumido. En su comunicación en 1861 a la Academia Francesa demostraba que la presencia de oxígeno posibilitaba un aprovechamiento más eficaz de la glucosa, formándose una mayor cantidad de levadura. En el mencionado estudio Pasteur observó también el fenómeno más tarde bautizado como efecto Pasteur, al describir que el consumo de glucosa era más lento en presencia de aire que en su ausencia. Desde 1861 hasta 1938 se postularon múltiples hipótesis sobre la naturaleza del mecanismo de control por el oxígeno del consumo de glucosa, sin que ninguna llegara a ser aceptada. La participación directa del oxígeno como elemento regulador era una de estas hipótesis, pero el hecho de que el 2,4- dinitrofenol provocara un aumento del consumo de glucosa incluso en presencia de oxígeno llevaba a descartar dicha hipótesis, incluso desconociéndose el mecanismo de acción del 2,4 – dinitrofenol. A finales de los años 30’ se habían producido avances importantes en relación a la fermentación alcohólica y a la fosforilación oxidativa. Se sabía que ambos procesos eran diferentes pero que requerían fosfato. Esto llevó a Feodor Lynen en Alemania, y a M.J. Johnson en los EEUU a proponer en 1941 que el efecto Pasteur no era sino el resultado de la competencia por el fosfato entre la glucolisis y las oxidaciones aerobias, competencia que posteriormente se ampliaría al ADP. A la luz de lo que conocemos hoy en día resulta evidente que la competencia por el fosfato habría justificado una menor formación de ácido láctico, o de CO2, pero en ningún caso un menor consumo de glucosa, la cual en presencia de ATP se consume hasta F-1,6-BisPi. Sin embargo, por aquel entonces Otto Warburg había introducido nuevos métodos de medir la actividad glucolítica que cuantificaban el CO2 desprendido o el ácido láctico formado, pero se había abandonado la determinación del consumo de glucosa como tal, por lo que esta interpretación errónea del efecto Pasteur fue aceptada sin muchas objeciones. A lo largo de los años 50’ y 60’ se fue poniendo de manifiesto lo incorrecto de la hipótesis mencionada, planteándose nuevas posibilidades entre las que cabe mencionar: 1. Secuestro del ATP en la mitocondria y carencia del mismo para la HK (no se obtuvo evidencia experimental que avalara la hipótesis). 2. La existencia de “inhibidores Pasteur” que controlaran la glucolisis, como por ejemplo, la Glucosa-6-Pi, inhibidor de la HK (si bien en levaduras no tiene lugar dicha inhibición), o el propio ATP a elevadas concentraciones, que se comporta como inhibidor de la PFK (aunque muchas células que muestran efecto Pasteur no presentan variaciones en los niveles de ATP al pasar de una situación aerobia a una anaerobia). 3. Las anomalías mencionadas llevaron a postular la existencia de otros inhibidores Pasteur , como el PEP, que inhibe la PFK o la Manosa-6-Pi, que inhibe la HK. Severo Ochoa (1943) fue de los primeros en llevar a cabo estimaciones de la denominada razón P:O. estaban exclusivamente implicados en reacciones redox. Todos estos hallazgos permitieron establecer un esquema de regulación parecido al que hoy aceptamos. Además. flavoproteínas. plantas y levaduras. resultó actuar contrarrestando el efecto de la G-6-Pi sobre HK y del ATP sobre la PFK. llegó a la conclusión de que la oxidación aerobia del piruvato a CO2 y H2O estaba asociada a una razón P:O = 3. Lo dicho para la fosforilación oxidativa resultó igualmente válido para la fotofosforilación. induciendo un aumento del consumo de glucosa. concepto que ha resultado especialmente controvertido pero cuya utilidad difícilmente puede ser puesta en tela de juicio. Otto Warburg y Wieland. HISTORIA DE LA FOSFORILACION OXIDATIVA En 1925 David Keilin describe el sistema del citocromo c. Todo ello despertó el interés por desentrañar cómo se producía el acoplamiento entre el transporte electrónico y la síntesis de ATP. Ello dio lugar al concepto de “cadena respiratoria” que se definía como una serie de complejos insolubles en medio acuoso que participaban de un modo secuencial en el transporte electrónico desde los coenzimas reducidos hasta el oxígeno. Tras cálculos cuidadosos y llevando a cabo múltiples controles. Los . del ATP producido por O2 consumido. La idea de fosforilación oxidativa puede atribuirse a Engelhardt quien en 1930 describió un proceso aerobio en eritrocitos nucleados que estaba ligado a la fosforilación.4. y sus correspondientes coenzimas. cuya necesidad para la glucolisis había sido postulada por Harden. Fritz Lipmann y el propio Kalckar serán los que introduzcan el concepto de “intermediarios de alta energía”. trabajando en preparaciones libres de células obtenidas de tejido renal. Los transportadores de electrones. durante la década de los 30’ aislaron varias deshidrogenasas. La década de los 40’ supone el inicio de los cálculos cuantitativos referentes al proceso de fosforilación oxidativa. Sin embargo. publicó que el transporte electrónico estaba ligado a la formación de ATP y que dicho proceso estaba físicamente separado del de formación de ATP que tenía lugar durante la glucolisis. al que considera un pigmento respiratorio presente en animales. Por su parte. fue Herman Kalckar quien en 1937. es decir. de acuerdo a este concepto. el Pi. Un programa de investigación se abría. proceso que tenía lugar en la mitocondria. También describió la oxidación del ascorbato a través del citocromo c la cual estaba ligada a la formación de ATP.). Su laboratorio contribuyó a identificar los denominados “tres sitios de fosforilación” junto con los grupos de Chance. encaminado a localizar los tres “sitios de fosforilación”.. Es interesante constatar hasta qué punto un cálculo no del todo exacto (hoy en día sabemos que dicha relación ha sido revisada a la baja) impulsaba a los investigadores del campo a proponer hipótesis basadas en la veracidad absoluta de dicha evaluación cuantitativa. Entre ellos cabe mencionar a los siguientes: Albert Lehninger (años 50’) demostró que el NADH es el auténtico sustrato de la fosforilación oxidativa.experimentos de Ochoa dirigieron la atención hacia la termodinámica del proceso y además. Varios laboratorios contribuyeron posteriormente al avance en este campo. oxidación del citocromo c y reducción del Oxígeno a H2O Albert Lehninger (1917-1986) El laboratorio de Briton Chance (1955) desarrolló una técnica polarimétrica para mediar la fosforilación oxidativa y estableció los estados “clásicos” de la respiración (estado 3. cada uno de los cuales estaría ligado a un proceso de fosforilación oxidativa. en concreto en tres pasos. sitios que quedaron establecidos tal como aparecen en los textos clásicos de Bioquímica. estado 4. . Sitio I. etc. oxidación del NADH y reducción del citocromo b Sitio II. dieron pié a postular que la oxidación del NADH (obtenido en la metabolización del piruvato) tendría lugar por pasos. empleando 32P. Hunter y Lardy. oxidación del citocromo b y reducción del citocromo c Sitio III. Además. introdujo un ensayo de alta sensibilidad para medir la fosforilación oxidativa. Green. mecanismo que incluía la formación de un tioéster de “alta energía” entre la enzima y el sustrato. Esto llevó a Slater en 1953 a postular para la fosforilación oxidativa un mecanismo similar. El laboratorio de Henry Lardy contribuyó enormemente al esclarecimiento de la acción del dinitrofenol. Estos hallazgos permitieron establecer el papel de la ATPasa mitocondrial en el acoplamiento entre oxidación y fosforilación. Entre 1956 y 1972 se describieron 17 intermediarios diferentes que apoyarían la teoría del “acoplamiento químico”. mediante algún tipo de cambio conformacional. siendo el fosfato transferido posteriormente al ADP para formar ATP. La hipótesis del acoplamiento químico fue dando paso poco a poco a otra formulación que podríamos denominar “acoplamiento conformacional” (Paul Boyer) según la cual la ATPasa estaría directamente acoplada a los complejos de la cadena respiratoria y al producirse el transporte electrónico. En 1951 Efraim Racker postuló un mecanismo para la fosforilación a nivel de sustrato que tenía lugar en la glucolisis en la reacción catalizada por la Gliceraldehido-3-P DH. así como de los diferentes complejos respiratorios y de la propia ATPasa. ninguno de ellos pudo ser relacionado con el proceso de la fosforilación oxidativa ligada al transporte electrónico. y a establecer el papel de la oligomicina como inhibidora de la ATPasa y de la fosforilación oxidativa. lo que posibilitó la purificación de los componentes individuales de la cadena transportadora de electrones. esta última llevada a cabo por Efraim Racker (1960) de la Universidad Cornell del estado de New York. se produciría la estimulación de dicha ATPasa. . No obstante.El grupo de David Green (1957) fue el primero en desarrollar preparaciones a gran escala de mitocondrias. y a pesar de la abundante literatura respecto a la identificación de intermediarios de alta energía. Slater proponía que el transporte electrónico daba lugar a la formación de un intermediario de “alta energía” X∼Y que por fosforólisis se transformaba en X∼P. Paul Boyer (1918) . Esto sí despertó el interés de Mitchell que estaba interesado en buscar los principios del acoplamiento entre metabolismo y transporte.Un aspecto que había pasado desapercibido era el hecho de que la insolubilidad acuosa de los transportadores de las respectivas cadenas mitocondrial y fotosintética no era sino consecuencia de su localización en membrana. El transporte de protones da lugar a la formación de un gradiente electroquímico o fuerza protón-motriz. y los partidarios del acoplamiento químico comenzaron a plantear . Los puntos esenciales de la propuesta incluían ya toda una serie de aspectos que son aceptados en la actualidad. para el caso de la mitocondria las cosas no estaban tan claras. Las características del modelo podrían resumirse en los siguientes puntos: El acoplamiento es quimiosmótico. en los que observaron que un gradiente de pH artificial inducía la síntesis de ATP en ausencia de luz. No obstante. la búsqueda de un potencial de membrana y de un gradiente de pH en la mitocondria había sido infructuosa. Lo cierto es que los experimentos de Jagendorf y Uribe canalizaron la atención hacia el estudio de los gradientes de pH. puesto que un gradiente de K+ también era capaz de inducir la síntesis de ATP. no existen intermediarios de alta energía. lo que desfavorecía los postulados de Mitchell. se canalizaban hacia la formación de un intermediario químico de alta energía conforme a los postulados de Slater. de pH o de K+. cinco años más tarde. Mitchell publicó toda la evidencia experimental que había obtenido hasta el momento para sustentar su hipótesis. y el gradiente eléctrico generado por su transporte vectorial. La conclusión era que ambos gradientes. En 1966 la hipótesis quimiosmótica recibió un espaldarazo gracias a los experimentos de Jagendorf y Uribe en cloroplastos de espinacas. También poseen una estequiometría concreta entre H+ movilizados y electrones transportados.LA HIPOTESIS DEL ACOPLAMIENTO QUIMIOSMOTICO La teoría quimiosmótica fue propuesta por primera vez por Peter Mitchell en 1961 en la revista Nature. que consta de dos componentes: el gradiente químico de protones como tal (∆pH). Aunque la naturaleza asimétrica de la cadena de transporte electrónico fue puesta de manifiesto rápidamente. y generan un transporte vectorial de protones hacia el exterior de la matriz mitocondrial. La ATPasa se encuentra localizada en la membrana y posee una estequiometría característica y definida en lo que a H+ / ATP formado concierne Las cadenas transportadoras de electrones mitocondrial y fotosintética son asimétricas. o hacia el interior del tilacoide. En 1966. En la membrana existen también sistemas transportadores de metabolitos acoplados al transporte de protones. el Glyn Research Laboratory. Por consiguiente. Mitchell por su parte intentaba demostrar que dichas medidas estaban mál diseñadas y que no contradecían en modo alguno sus postulados. con un equipamiento más bien modesto (esencialmente un electrodo de pH) y utilizando preparaciones de mitocondrias aisladas. Otro aspecto interesante en esta controversia estaba en la explicación proporcionada sobre el efecto de agentes como el dinitrofenol. dichos experimentos resultaron no ser concluyentes. que dicho transporte no podía estar implicado en el proceso de fosforilación oxidativa. Los laboratorios de Slater en Amsterdam y de Chance en Philadelphia se centraron nuevamente en rebatir dichos resultados. La cuestión seguía sin decidir. Mitchell en 1961 propuso que los desacoplantes simplemente colapsaban el gradiente electroquímico de protones (aumentando la permeabilidad de la membrana a los mismos). los oponentes de Mitchel argumentaron. Aunque el transporte de protones resultó ser una realidad. que inhibían la fosforilación sin detener la respiración. además de los trabajos con mitocondrias aisladas se llevaban a cabo estudios en los que se empleaban mitocondrias sonicadas que producían partículas submitocondriales (vesículas de membrana mitocondrial interna). en Cornwell. En la década de los 60’. En su propuesta de 1953 Slater atribuía al dinitrofenol y demás agentes “desacoplantes” la capacidad para destruir los intermediarios químicos de alta energía. logró demostrar junto con su colaboradora Jennifer Moyle que las mitocondrias al respirar expulsan protones hacia su exterior. y allí. Andre T Jagendorf Por aquella época Mitchell abrió un laboratorio privado. No obstante. que se tratara de un proceso secundario inducido por el intermediario de alta energía.experimentos para refutar los hallazgos de sus oponentes y no sólo para confirmar sus propias teorías. es decir. Esto proporcionó una nueva ocasión a Mitchell para comprobar su hipótesis ya que en dichas partículas el flujo de protones se producía . lo que a la postre resultó convincente para la mayoría. tal como predecía la teoría quimiosmótica. basándose en estudios cinéticos. El planteamiento de Slater partía de la idea de que el que se generara un gradiente de protones no implicaba que éste fuera la causa de la fosforilación oxidativa. dicha demostración tampoco eliminaba la validez de la hipótesis química: si los desacoplantes incrementaban la permeabilidad a los protones. que el interior mitocondrial se disponía hacia el exterior de la partícula submitocondrial. como por ejemplo. éstos podrían destruir los intermediarios de alta energía como proponía Slater. Por su parte. sino que existían otras muchas posibilidades. Esto último fue confirmado por el propio Mitchell en 1966. Dichas partículas eran capaces de llevar a cabo la fosforilación oxidativa y tenían la particularidad de estar “del revés”. Para los defensores de la hipótesis química la membrana no era sino una especie de soporte mecánico en la que se situaban los componentes de la cadena respiratoria. El laboratorio de Racker consiguió aislar dicha ATPasa. Ernster. el laboratorio de Racker. . Boyer.en sentido contrario (de dentro a fuera). Puede considerarse que ese fue el punto final de la controversia ox-phos. que certifica la claudicación de los partidarios de la teoría química y el apoyo de los postulados de la teoría quimiosmótica. pero que daban lugar a la síntesis de ATP dependiente de luz. En el volumen de 1977 del Annual Review of Biochemistry aparece un artículo firmado conjuntamente por todos los grandes de esta historia. En el marco de esta nueva perspectiva el grupo de Racker procedió a reconstituir la ATPasa en liposomas (vesículas lipídicas). Chance. así como conjuntamente con la ATPasa. fue capaz en 1974 de reconstituir vesículas de membrana conteniendo la bomba de protones dependiente de luz (bacteriorrodopsina) y la ATPasa mitocondrial. Racker y Slater. comprobando que sintetizaban ATP y que en las mismas se promovía un transporte de protones dependiente de ATP. prestando atención a la cuestión de la integridad de la membrana. estos experimentos no descartaban la hipótesis conformacional de Boyer que postulaba una interacción molecular directa entre los componentes de la cadena transportadora y la ATPasa como forma de transferencia de la energía procedente de la oxidación del NADH. Sin embargo. No obstante. Otro de los rasgos propios de la hipótesis quimiosmótica era la distinción física entre transportadores de electrones y actividad ATPasa. en colaboración con Stockenius. Alrededor de 1970 el grupo de Racker empezó a considerar el problema desde la perspectiva quimiosmótica. Mitchell. mientras que para Mitchell su integridad era esencial. pero no consiguió que sintetizara ATP en disolución. Estos hechos demostraban la asimetría funcional de los transportadores electrónicos tal como postulaba la hipótesis quimiosmótica. dos componentes cuya interacción era más que improbable. Posteriormente fue posible reconstituir también los diferentes componentes de la cadena respiratoria en liposomas.