CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO.TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. ________________________________________________________________________________ TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS 1. CONCEPTOS BÁSICOS 1.1. Concepto de inmunoanálisis. Clasificación 1.2. Antígenos 1.3. Anticuerpos 1.4. Reacciones Ag-Ac 2. INMUNOANÁLISIS POR PRECIPITACIÓN 2.1. Técnicas en medio sólido 2.1.1. Técnicas de difusión 2.1.2. Técnicas electroforéricas 2.2. Técnicas en medio líquido 3. INMUNOANÁLISIS POR AGLUTINACIÓN 3.1. Aglutinación directa 3.2. Aglutinación indirecta 3.3. Inhibición de la aglutinación 3.4. Tect de Coombs (globulina-antiglobulina) 4. INMUNOANÁLISIS POR FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO 5. INMUNOANÁLISIS CON MARCADOR 5.1. Clases de inmunoensayos con marcador 5.2. Fluoroinmunoanálisis (FIA) 5.3. Radioinmunoanálisis (RIA) 5.4. Enzimoinmunoanálisis (EIA) • Técnicas ELISA 5.5. Luminoinmunoanálisis (electroquimioluminiscencia) ____________________________________________________________________________ 1. CONCEPTOS BÁSICOS. 1.1. Concepto de inmunoanálisis. Clasificación. Los inmunoanálisis o inmunoensayos son aquellas técnicas de laboratorio que utilizan la reacción antígeno-anticuerpo para poner de manifiesto la sustancia a determinar (el Ag o el Ac). La reacción Ag-Ac, in vitro, es indetectable por sí misma; según el sistema usado para revelar dicha reacción, podemos clasificar los inmunoensayos en: • Inmunoensayos por precipitación. • Inmunoensayos por aglutinación. - Aglutinación directa o activa. - Aglutinación indirecta o pasiva. - Inhibición de la aglutinación. - Test de Coombs o globulina-antiglobulina. • Inmunoensayos por fijación de complemento. 1 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. • Inmunoensayos con marcador: - Fluoroinmunoensayo (FIA): el marcador es un fluorocromo. - Radioinmunoensayo (RIA): el marcador es un isótopo radiactivo. - Enzimoinmunoensayo (EIA): el marcador es una enzima (p. ej., ELISA). - Luminoinmunoanálisis: el marcador es un compuesto quimioluminiscente. 1.2. Antígenos: Se denomina antígeno a cualquier sustancia que estimula la formación de un anticuerpo (también se les llama inmunógenos). En su mayoría se trata de sustancias proteicas.Las moléculas pequeñas que no son capaces por sí solas de estimular la formación de anticuerpos, pero unidas a otras moléculas más grandes si lo hacen, se les llama haptenos. Se denomina “determinante antigénico” a la parte del antígeno que se une al anticuerpo correspondiente. Un antígeno puede tener más de un determinante antigénico o epítopo. Los anticuerpos pueden actuar también como antígenos, ya que son proteínas capaces de activar la respuesta inmunitaria (los autoanticuerpos son los responsables de las enfermedades autoinmunes). 1.3. Anticuerpos: Las inmunoglobulinas son proteínas con actividad de anticuerpos. La estructura básica y común de todas las clases de Ig consiste en 4 cadenas polipeptídicas iguales dos a dos. Dos de ellas se llaman cadenas ligeras (L) y las otras dos, cadenas pesadas (H). Dentro de cada tipo de cadena se distinguen dos regiones denominadas variable y constante. En las regiones variables existe una gran diferencia en la secuencia de aminoácidos entre los distintos clones de Ig, de ahí su nombre. Esta región es la que le confiere el carácter único (específico) a cada clon de Ig. En las regiones constantes la secuencia de aminoácidos es siempre la misma en todos los tipos de inmunoglobulinas. 2 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Las Igs son sintetizadas y segregadas por los linfocitos B (al ser estimulados por un antígeno), que en fase de actividad máxima se transforman en células plasmáticas. Cada determinante antigénico de un Ag genera un clon de células plasmáticas diferentes que producen inmunoglobulinas distintas, de ahí que la respuesta inmunitaria sea policlonal. 3 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 1.4. Reacciones Ag-Ac: La unión Ag-Ac es una unión no covalente en la que se implican diversas fuerzas como: atracción electrostática, puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones hidrofóbicas. Las más importantes son las electrostáticas, debidas a los grupos polares de los aminoácidos; el pH de la solución donde se desarrolla la reacción es por ello tan crítico; los puentes de H son menos frecuentes, pero su alto nº los hace significativos. La fuerza de unión depende del ajuste complementario (estérico) entre el determinante antigénico y el idiotipo del Ac (aquello de la llave y su cerradura). La especificidad de la reacción Ag-Ac es teóricamente del 100%, aunque en la práctica, no siempre es así. La unión Ag-Ac tiene varias CARACTERÍSTICAS: Afinidad: es la suma de todas las fuerzas implicadas anteriormente descritas para un único complejo Ag-Ac; si existe alta afinidad, la mayor parte del Ag estará formando complejo con el Ac; depende mucho de la especificidad, de forma que a mayor especificidad mayor afinidad. Heterogeneidad de la respuesta: se producen distintos tipos de Ac para los diversas partes del Ag (determinantes antigénicos). Es debido a que la respuesta inmunitaria es policlonal (cada Ac es producido por una clona diferente de células plasmáticas). Sin embargo, hoy día podemos conseguir la producción de Ac monoclonales, es decir, un solo tipo de Ac dirigido a un único determinante o locus antigénico. Esto se ha logrado mediante la transformación “in vitro” de linfocitos B en células tumorales de mieloma productoras de una Ig concreta. Esto supone una fuente eterna y constante de una Ig definida. Avidez: a un antígeno pueden unirse, si tiene más de un epítopo, más de un Ac, formando macrocomplejos insolubles. La avidez mide la “estabilidad” del complejo multivalente Ag-Ac (la valencia de un Ag es el número de moléculas de Ac con las que puede combinarse dicho Ag). • Reactividad cruzada: cuando varios antígenos tienen epítopos con una estructura y composición química similar y por tanto reaccionan con el mismo anticuerpo. Es la base de muchas enfermedades autoinmunes. Existen también otros factores dependientes de la estructura molecular, que afectan a la formación de Ag-Ac. 4 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 2. INMUNOANÁLISIS POR PRECIPITACIÓN. Se basan en la insolubilidad del complejo Ag-Ac, de forma que la reacción de antígenos, con múltiples determinantes antigénicos, con anticuerpos origina precipitados observables a simple vista. Esta precipitación Ag-Ac puede realizarse en: • Medio sólido: existen diferentes técnicas, mediante las cuales se observa la formación de arcos o anillos de precipitación en el medio. - Técnicas de difusión: inmunodifusión simple, doble y radial. - Técnicas electroforéticas: electroforesis en cohete, inmuno-electroforesis, contrainmunoelectroforesis e inmunofijación. • Medio líquido se utiliza la inmunoturbidimetría o la inmunonefelometría. Detectan la turbidez o dispersión de la luz causada por los complejos Ag-Ac que forman partículas en suspensión. Uno de los factores que afectan a la precipitación de complejos antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la proporción que exista de Ag y Ac en el medio. Cuando a una solución con una alta concentración de Ac (en cantidad fija), dispuesta en una serie de tubos, se le va añadiendo Ag, a concentraciones crecientes, y se representa el porcentaje de precipitación frente a la cantidad de Ag, se obtiene una curva llamada “curva de precipitación” que tiene tres partes bien diferenciadas: • Zona de exceso de Ac o prozona: la precipitación no existe o es muy pequeña. Debido a la poca cantidad de Ag, cada molécula del mismo reacciona con varias de anticuerpo y el complejo que se forma es relativamente soluble (no se forma una red). • Zona de equivalencia: la precipitación es máxima. Cada Ag está ligado a un Ac, que a su vez está ligado por su otra (s) valencia (s) a otro Ag. Se forma una red con complejos grandes y de baja solubilidad. • Zona de exceso de Ag o postzona: el fenómeno es semejante al de exceso de Ac pero al revés, es decir, cada molécula de Ac reacciona con varias de Ag (tantas como valencias tenga el Ag, que suelen ser dos). Prácticamente no existe red y la precipitación de los complejos es muy baja o incluso nula. 5 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Los métodos de precipitación que a continuación vamos a describir suelen tener la misma fuente de error, que es la falta de precipitación. Para evitar esto, es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma precipitado, es decir, se originan falsos negativos. Las reacciones de precipitación Ag-Ac pueden realizarse en medio líquido o sólido. En medio sólido, como gel de agarosa, es ideal pues no existe la mezcla homogénea del Ag y Ac, formándose gradientes de concentración entre el Ag y Ac; en el punto de equilibrio entre los gradientes se forma un arco o línea de precipitación (esto no ocurre en el medio liquido, es decir, no se forman gradientes). 2.1. Técnicas en medio sólido: se distinguen T. de difusión y T. electroforéticas 2.1.1. Técnicas de difusión: Î Inmunodifusión simple ó técnica de Oudin: Consiste en incorporar el anticuerpo (a bajas temperaturas para no desnaturalizarlo) a un tubo o a una placa Petri con gel de agarosa. El antígeno a estudiar se añade al tubo, como una placa o se deposita sobre las placas impregnando un disco. Después de dejar un cierto tiempo para que se produzca la difusión del Ag, se observa la aparición de bandas de precipitación en el punto de equivalencia (la concentración del Ag y del Ac son equivalentes); es una reacción unidimensional que se produce en una sola dirección; se necesitan en el medio electrolitos para que la precipitación sea macroscópica (ClNa al 9%). La distancia desde el punto de aplicación del antígeno a la línea de precipitación es proporcional a la concentración del antígeno, si la concentración del anticuerpo es constante. Comparando con patrones de concentración conocida, puede construirse una curva de calibración y, a partir de ésta, se puede determinar la concentración del antígeno. Î Inmunodifusión doble: En esta técnica se colocan el Ag (proteína) y el Ac en dos pequeños pocillos hechos en una placa (o un tubo) que contiene gel de agarosa. Ambos difunden (“doble”) de forma radial en el gel, uno hacia otro, produciéndose un gradiente de concentración. Cuando se 6 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. ponen en contacto, después de un cierto tiempo (18 a 48 h), aparece un arco de precipitación o banda si es en tubo, que disminuye a medida que se alejan, en el punto de equivalencia Ag-Ac. La posición y forma del arco de precipitación depende de la concentración y tamaño de los reactantes (Ag y Ac). El arco estará más cerca del reactante de menor concentración, ya que la distancia recorrida es directamente proporcional a la concentración. El arco de precipitación será cóncavo con respecto al compuesto de mayor peso molecular cuya velocidad de difusión es menor. Î Inmunodifusión radial: Su utilidad principal es la cuantificación de proteínas específicas. Se incorpora el anticuerpo en el gel de agarosa (disperso en él). A continuación se forman pocillos en el gel y en ellos se colocan estándares de proteínas y la muestras a estudiar (antígenos). El Ag se difunde en el gel durante varias horas y produce anillos de precipitación a medida que el Ag y el Ac alcanzan la equivalencia. Existen dos tipos de técnicas: • Técnica de Mancini o método de punto final: Se permite que el Ag se difunda en el agar durante 24 a 48 horas, hasta que ya no se produzca expansión. El diámetro del anillo es proporcional a la concentración del Ag. Para saber su concentración exacta, se realiza una curva de calibración con soluciones de concentración conocida (estándares), que se pueden obtener a partir de una sola diluyéndola (por ejemplo 1:8, 1:4, 1:2), y a continuación se traslada el diámetro del anillo de la solución desconocida a dicha curva. La relación mm de diámetro con concentración no es lineal sino logarítmica, por lo que se representa en papel logarítmico para poder trazar una recta. 7 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. • Técnica de Fahey o método cinético: Se requiere un periodo de incubación más breve (hasta 18 horas). El diámetro del anillo se determina en un tiempo determinado, mientras el antígeno continúa difundiéndose. Esta técnica es menos fiable. 2.1.2. Técnicas electroforéticas: Electroforesis es la migración que sufren las partículas cargadas al someterlas a un campo eléctrico. Esta migración depende del tamaño y la carga de la partícula, de la viscosidad del medio y del voltaje empleado. Î Electroinmunodifusión simple o electroforesis en cohete (técnica de Laurell): Es un método cuantitativo utilizado para medir Ag en muestras biológicas. Es similar a la inmunodifusión radial, solo difiere en que la placa de gel se expone a un campo eléctrico que permite que las proteínas migren en una dirección en forma de cohete. Las alturas de los cohetes son proporcionales a la cantidad de proteína. El Ac está incorporado a un gel a un pH determinado (normalmente 8,6 que es su punto isoeléctrico) para que el Ac no se mueva y el Ag tenga carga negativa. Utilizando estándares de concentración conocidos, podemos extrapolar la concentración de la muestra. 8 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Î Inmunoelectroforesis: Es una técnica que combina la especificidad de las reacciones de precipitación con la separación de moléculas por electroforesis. Se utiliza para detectar alteraciones cualitativas, principalmente paraproteínas (inmunoglobulinas monoclonales). Consta de las siguientes etapas: ♦ Se realiza una electroforesis de la muestra, que separa distintas proteínas según su carga. ♦ A continuación, en un pocillo adyacente (de forma alargada y paralelo al área donde se ha separado la muestra) se dispone un antisuero frente a una o varias o todas las proteínas que queremos identificar y se procede a una inmunodifusión. ♦ Tras un periodo de incubación, se lava el agar en solución salina para quitar el exceso de proteínas que no han reaccionado y se interpreta el resultado, comparándolo con un patrón conocido (los arcos de precipitación pueden comprobarse directamente o bien teñirse con colorantes para proteínas). Por ejemplo, en un mieloma IgG pondríamos antisuero IgG y observaríamos el arco de precipitación comparándolo con un patrón conocido. ♦ Este procedimiento se utiliza, generalmente, para caracterizar proteínas séricas con concentraciones superiores a 500 microgr/ml. Î Contrainmunoelectroforesis: Esta técnica se llama también “doble electroinmunodifusión”. Se realiza una electroforesis, como en la técnica anterior, donde se separan los antígenos de la muestra. En segundo lugar, la inmunodifusión (difusión pasiva espontánea) es sustituida por la movilidad eléctrica debida a la electroforesis, es decir, por una segunda electroforesis 9 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. donde se va a dar la reacción inmune. El pocillo que contiene el anticuerpo se pone en el polo positivo (ánodo) y el que contiene el antígeno en el negativo (cátodo). Ello se consigue a un pH en el que los anticuerpos tengan carga positiva y los antígenos negativa, es decir con el tampón apropiado. Si la corriente eléctrica y las concentraciones de los reactantes son las adecuadas, se forma una línea de precipitación a mitad de camino entre los dos pocillos Éste método se utiliza fundamentalmente para la detección de antígenos bacterianos y virales en sangre. orina, L.C.R. y para la detección de autoanticuerpos. Î Inmunofijación: En primer lugar, se realiza una electroforesis en gel de agarosa (una dimensión) para separar las proteínas de la mezcla. Luego se dispersa el anticuerpo directamente sobre el gel, lo que hace que precipite la proteína que quiere detectarse. El precipitado queda atrapado en la matriz del gel y el resto de las proteínas que no han precipitado, pueden eliminarse lavando el gel. El gel puede teñirse para identificar las proteínas. Esta técnica se usa sobre todo para identificar paraproteinas. 2.2. Técnicas en medio líquido: inmunonefelometría e inmunoturbidimetría. Son técnicas espectrofotométricas que se emplean principalmente para la determinación de proteínas específicas. Se han aplicado para la determinación de inmunoglobulinas, proteínas del complemento, apolipoproteinas, proteínas de fase aguda, proteínas de la coagulación, y marcadores tumorales. También se usan en la determinación de fármacos y hormonas. Utilizan la técnica de inmunoprecipitación en fase líquida con reacción Ag-Ac, es decir, mediante un antisuero específico se puede determinar la proteína plasmática correspondiente. El complejo formado aparece en suspensión en un medio líquido dando lugar a una turbidez que puede ser medida por la dispersión de la radiación que producen estas partículas en determinados ángulos, siendo la cantidad de luz dispersada proporcional a la concentración del microprecipitado (inmunonefelometría) o por la medición de la luz transmitida (inmunoturbidimetría) 10 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 3. INMUNOANÁLISIS POR AGLUTINACIÓN. Las reacciones de aglutinación consisten en el agrupamiento de partículas en suspensión, debido a la reacción Ag-Ac. Las partículas pueden ser células vivas (hematíes o bacterias) o partículas inertes (látex, bentonita etc). El antígeno ha de estar presente en la superficie de la partícula de forma apreciable (si está en una hendidura el anticuerpo no llega a ellos) y debe poseer múltiples epítopos. Los antígenos con un solo determinante no permiten su aglutinación. Los anticuerpos capaces de producir una aglutinación se les denomina “aglutininas” o anticuerpos completos. La IgM es el más eficaz en la aglutinación, por su multivalencia y tamaño. Para que las reacciones de aglutinación se produzcan, la concentración del antígeno ha de ser de la misma magnitud que la del anticuerpo, ya que de lo contrario se produce el fenómeno de zona (exceso de antígeno). Las técnicas que facilitan el contacto Ag-Ac, como la agitación, centrifugación, potencian la aglutinación, y cuanto mayor sea el tiempo de incubación, mejor aglutinará. La aglutinación es un procedimiento cualitativo que puede usarse como semicuantitativo (se informa por cruces) o mejor como cuantitativo mediante diluciones progresivas de la muestra manteniendo constante la cantidad de antígeno unido a la partícula. 11 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Los estudios básicos sobre aglutinación se hicieron con hematíes y sirvieron para identificar los grupos sanguíneos. Existen diferentes técnicas de aglutinación: 3.1. Aglutinación directa o activa: En esta técnica, el anticuerpo reacciona con un antígeno que encuentra presente de forma natural en la superficie, o muy cerca de la misma, de un determinado tipo de células como hematíes o bacterias. Este tipo de reacciones se emplean generalmente para detectar anticuerpos en diluciones seriadas de suero y se leen a simple vista. El título del suero es la recíproca de la mayor dilución que da una aglutinación visible. A veces hay que aumentar la viscosidad del medio añadiendo albúmina bovina, dextrano, etc., para que la aglutinación pueda visualizarse ( caso de los Ac incompletos). Las técnicas de aglutinación directa se utilizan para el diagnóstico serológico de enfermedades microbianas, como por ejemplo, anticuerpos contra brucella y salmonella y para la determinación de los grupos sanguíneos. 3.2. Aglutinación indirecta o pasiva: En estas técnicas, el antígeno ha sido transferido a la superficie de una particula inerte, (p.ej. látex) o de una célula (hematíes de carnero o de pavo) que no lo poseen en estado natural. El proceso de recubrimiento de la partícula con los antígenos se llama sensibilización. A continuación se añade la muestra, que si es positiva producirá la aglutinación. La prueba se realiza en placa (porta) para detectar anticuerpos solubles que se fijan al antígeno adsorbido a la superficie de células o partículas. 12 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Como la concentración de antígeno puede ser controlada artificialmente, la sensibilidad de la prueba es algo mayor que en las de aglutinación directa. • • • Ejemplos de estas técnicas son: el VDRL (“prueba de laboratorio para la investigación de enfermedades venéreas”) para el diagnóstico de sífilis o la detección del factor reumatoide y Detección de Ac anti DNA (látex-DNA + Ac antiDNA). 13 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 3.3. Inhibición de la aglutinación: Estas técnicas son una modificación de las técnicas de aglutinación, que permiten detectar antígenos solubles. La muestra que contiene el antígeno en forma soluble se incuba con una cantidad conocida de anticuerpo. Después se enfrenta al mismo antígeno unido a partículas, y sólo será capaz de aglutinar, el anticuerpo que haya quedado libre; cuanto mayor sea la concentración de antígeno soluble en la muestra, mayor va a ser la inhibición de la aglutinación. La concentración de anticuerpo y partículas son cuidadosamente controladas para evitar un exceso de Anticuerpo. Esta técnica permite la semicuantificación, valorando el grado de inhibición en diluciones seriadas de la solución de antígeno. Ej: test de confirmación de embarazo: la orina humana contiene gonadotropina coriónica (HCG) que se detecta de esta forma. 14 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 3.4. Test de Coombs o globulina-antiglobulina: Demuestra la presencia de anticuerpos incompletos (no aglutinantes) tipo IgG (p.ej., IgG anti-Rh), que están fijados a un antígeno superficial (hematíes principalmente). El suero de Coombs es una inmunoglobulina antiglobulina-IgG (IgG antihumana de conejo), que aglutinará la IgG que esté fijada. Es necesario un paso previo de lavado con suero salino para eliminar la IgG en forma soluble (no ligada) que puede dar lugar a falsos negativos, ya que no se producirá la aglutinación. Existen dos test de Coombs: • Coombs directo: detecta directamente el anticuerpo en los eritrocitos del paciente. Suele utilizarse para la detección de hematies fetales recubiertos con IgG-materna • Coombs indirecto: analiza el suero para buscar anticuerpos, es decir, pone de manifiesto la IgG no aglutinante materna. Para ello es necesario, primero, mezclar la muestra con hematíes del grupo O (+) y después, aplicar el suero de Coombs. También se usa en la detección de IgG no aglutinante anti-brucella. Otra aplicación del Test de Coombs: detección de Ac anti-determinados fármacos, que se unen a los eritrocitos y producen anemia hemolítica. 15 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 4. INMUNOANÁLISIS POR FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO. Se trata de una técnica que detecta la existencia de una reacción antígeno-anticuerpo por la capacidad de este complejo para fijar el complemento. La prueba requiere dos pasos: • En el primer paso, el complemento es incubado con un suero (que contiene o no los anticuerpos) y los antígenos correspondientes. • En el segundo paso, se añaden eritrocitos de carnero sensibilizados (recubiertos de hemolisina -Ac antieritrocitos, que no lisan en ausencia de C') y la mezcla se incuba a 37º C durante una hora. Si el suero contiene anticuerpos contra el antígeno usado, se forman complejos Ag-Ac que fijan el complemento y éste ya no puede utilizarse para lisar los hematíes. Por tanto, la ausencia de hemólisis indica reacción positiva, mientras que una lisis completa señala reacción negativa: - Si hay Ac en muestra => No C' libre => No lisis => Prueba (+) - Si no hay Ac en muestra => C' Libre => Lisis => Prueba (-) Es una técnica que mide la concentración de C', necesario para que se produzca la lisis. Esta técnica (detecta [ Ac ] inferiores a 1 microgr/ml), se utiliza en el diagnóstico de infecciones y en la cuantificación de niveles funcionales de complemento por el grado de hemólisis que aparece en una suspensión de hematíes que se utiliza como elemento de visualización de la reacción. 5. INMUNOANÁLISIS CON MARCADOR. Revelan la reacción Ag-Ac mediante un marcador ligado a uno de los componentes del complejo. Su uso se ha ido generalizando debido a que necesita poca cantidad de muestra y reactivos (Ag y Ac), son relativamente rápidos (desde minutos hasta horas, pero habitualmente menos de 24 h), tienen una gran sensibilidad (de microgr. a nanogr.) y son automatizables. 16 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. En el caso de los radioinmunoensayos existe una dificultad adicional, que es la necesidad de tener una instalación radiactiva, por lo que la técnica está siendo progresivamente sustituida por las otras, salvo en mediciones concretas y en los laboratorios de investigación. 5.1. Clases de inmunoensayos con marcador: 1. SEGÚN EFECTO DE LA UNIÓN, los inmunoanálisis con reactivos (Ag o Ac) marcados pueden ser de dos tipos: Homogéneos: el compuesto marcado (p.ej, Ag*) se comporta de forma diferente, esté o no unido a su Ac (Ag* libre no da señal y sí, el complejo Ag*~Ac), por lo que no requiere lavado externo, es decir, no necesita separación la forma ligada (Ag* Ac) de la libre (Ag). En definitiva, no tenemos porqué eliminar el excedente de Ag que no ha reaccionado con el Ac, porque no interfiere. Heterogéneos: el compuesto marcado se comporta de forma análoga, esté o no unido a su Ac y, por tanto, se requiere lavado para separar la forma ligada de la libre. Esto sirve para asegurarnos que lo único que detectamos es la señal (fluorescencia, radiactividad, etc.) producida por el complejo Ag* -Ac y no por el Ag* solo. Generalmente se usan en fase sólida; puede ser competitivo o no competitivo. 2. SEGÚN LA FORMA DE UNIÓN, pueden ser de dos tipos: Inmunoanálisis no competitivo: son inmunoanálisis heterogéneos. Existe un “exceso de anticuerpo marcado” para unirse al antígeno. Se clasifican en los siguientes tipos. Directo: Se fija la muestra (Ag) al soporte sólido [Ag muestra ?] + Ac* => [Ag-Ac*] <= medir (previo lavado) La intensidad de la señal recogida es directamente proporcional a la cantidad de Ag presente en la muestra. Indirecto: Se fija el Ag al soporte sólido Ag + [Ac muestra ?] + Anti-Ac* => [Ag-Ac-Anti-Ac*] <= medir (previo lavado) 17 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Esta técnica tiene la ventaja de que el Anti-Ac* es un reactivo universal, es decir, sirve para cualquier inmunoglobulina la porción Fab del anti-Ac* se une a la porción Fc del Ac que buscamos en el suero, y esta porción Fc es igual en cualquier Ig. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra. Tipo Sandwich: Se fija un Ac monoclonal (mc) a una fase sólida Ac mc + [Ag muestra ?]+ Ac* => [Ac mc +Ag + Ac*] <= medir (previo lavado) El Ag de la muestra, que debe tener al menos dos epítopos (uno para el Ac monoclonal en fase sólida y otro para el Ac*) p.e, prolactina o insulina en suero. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la concentración del Ag de la muestra. Inmunoanálisis competitivo: Pueden ser homogéneos o heterogéneos. Los antígenos compiten por un anticuerpo que se encuentra en “cantidad limitada”. En estas técnicas se puede marcar el antígeno o el anticuerpo, por lo que podemos distinguir dos modalidades: Técnicas de Antígeno Marcado: El Ag de la muestra y al Ag* compiten por el Ac, por lo que la intensidad de la señal es inversamente proporcional a la concentración del Ag en la muestra. Son inmunoanálisis heterogéneos y según se realicen en uno o en dos pasos, distinguimos técnicas simultáneas o 18 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. secuenciales. > Técnicas simultáneas: un sólo paso: mezclar simultaneamente: [Ag muestra ?] + Ac + Ag* => [Ag-Ac] + [Ag*-Ac] <= medir (previo lavado) > Técnicas secuenciales : dos pasos: 1º) Ac fijados al soporte + [Ag muestra ?] => [Ag-Ac] + Ac libre? [Ag-Ac]+ [Ag*-Ac] <= medir (previo lavado) 2º) Añadir el Ag*: Con este método de dos pasos, puede unirse al Ac una cantidad mayor de Ag no marcado que en la prueba simultanea, especialmente a concentraciones bajas del antígeno, lo que incrementa la sensibilidad. 19 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. Técnicas de anticuerpo marcado: --> Métodos inmunométricos. Ag fijados a fase sólida + [Ag muestra?] + Ac* => [Ag-Ac*] + [Ag-Ac*] => lavar para que quede sólo los complejos Ag-Ac* unidos a la fase sólida <= medir Los Ac* están márcados con una enzima y en cantidad limitada, con lo que los dos Ag competirán por los Ac*. Se determina la actividad enzimática (la señal) que será inversamente proporcional a la concentración de antígeno presente en la muestra. 20 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 5.2. Fluoroinmunoanálisis (FIA). Emplean los compuestos fluorescentes para el marcaje del Ag ó del Ac. Las principales características que deben poseer los compuestos fluorescentes para su uso en el FIA son: - Poseer una intensidad de fluorescencia elevada. - Que sea posible diferenciar su fluorescencia de la de fondo, producida los especímenes biológicos (Ag ó Ac). - Que su unión al Ag ó al Ac no afecte de forma adversa a sus propiedades. Los compuestos fluorescentes más utilizados son los derivados de fluoresceína (emite una luz verde) o rodamina. Existen numerosas técnicas de FIA, entre las que destacamos: • FÍA homogéneos: - fluoroinmunoanálisis con sustrato marcado (SLFIA), - inmunoanálisis de fluorescencia polarizada (FPIA) e - inmunoanálisis de transferencia de la energía de fluorescencia (FETI). • FIA heterogéneos: - además del FIA directo, FIA indirecto y tipo sándwich, - destaca el “FIA de disociación aumentada por lantánidos” (DELFIA). 1. FIA con sustrato marcado (SLFIA): Es un ensayo “competitivo simultáneo homogéneo”, donde se utiliza un ligando marcado (Ag*) y otro no marcado (Ag de la muestra); se basa en una reacción de enlace competitivo, porque el Ac está en número limitado para enlazar y formar complejos Ag-Ac. Ag* + [Ag muestra?] + Ac => [Ag*-Ac] + [Ag-Ac] + Ag* libre Sólo da señal el Ag* libre => por lo que cuanto más [Ag-Ac] se haya formado, más Ag* queda libre y por tanto, más fluorescencia hay, siendo proporcional a la [Ag muestra] La aplicación de este inmunoanálisis es principalmente para cuantificar fármacos terapéuticos, detección de anticuerpos IgG e IgM frente a infecciones virales y para la determinación de algunas hormonas. 2. Inmunoensayo de fluorescencia polarizada (FPIA): Es un ensayo "competitivo simultáneo homogéneo", donde se utiliza un ligando marcado (Ag*) y otro no marcado (Ag de la muestra) que combina la reacción Ag-Ac y la fluorescencia polarizada, para la determinación cuantitativa del analito. Ag* + [Ag muestra?] + Ac => [Ag*-Ac] + [Ag-Ac] + Ag* libre Sólo da señal el Ag* unido al Ac => por lo que cuanto más [Ag-Ac] se haya formado, más Ag* queda libre y menos Ag*-Ac hay: por tanto la intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a la [Ag muestra] Las aplicaciones principales del FPIA es la cuantificación de fármacos terapéuticos, 21 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. abuso de drogas y algunas hormonas. 3. FIA directo: Es un ensayo "no competitivo", en la que la cantidad de fluorescencia (Ac*), es directamente proporcional a la cantidad de Ag presente, que debe tener dos epítopos; suele usarse un ensayo en dos etapas: 1ª Ac (fijado a fase sólida y en exceso) + [Ag muestra ?] => [Ac-Ag] 2ª Añadir el mismo Ac, pero marcado con un fluorocromo (ej. fluoresceína): Ac* => [Ac-Ag] + Ac* => [Ac-Ag-Ac*] <= medir Se utilizan curvas estándar de [Ag] conocidas. 4. FIA indirecto: En la prueba indirecta, en una primera fase, se hace reaccionar el Ac*en exceso, con el Ag en la muestra del paciente (fase líquida) => ensayo "no competitivo"; se forman complejos Ag-Ac* y queda Ac* libre. La solución se incuba entonces con Ag adsorbido en una fase sólida, para que se adhiera todo el exceso de Ac* que quedó libre; se mide entonces la fluorescencia, que será inversamente proporcional a la concentración de Ag en la muestra. 22 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 5.3. Radioinmunoanálisis (RIA): Utiliza compuestos radiactivos para el marcaje. Pueden ser de dos tipos, según la radiación que emitan: • Radiación beta: tritio (3H), carbono 14 (‘4C) y fósforo 32 (32P). • Radiación gamma: Iodo 125 (125 I), yodo 131 (131I) y cobalto 58 (5~Co) Los isótopos utilizados en el RIA deben tener las siguientes características: • Actividad específica alta (emisión de gran actividad) • Una producción de energía alta. • Vidas medias adecuadas. • Fácil obtención. • No afecten a la reacción Ag-Ac. Los aparatos utilizados para detectar la radioactividad se llaman contadores: contador gamma, para la radiación gamma y contador de centelleo para la radiación beta. Existen dos métodos fundamentales de RIA: 1. RIA clásico: Es un inmunoanálisis “competitivo simultáneo heterogéneo”, en el cual una cantidad fija de Ag marcado radiactivamente y Ag de la muestra compiten por un número limitado de Ac. Sus aplicaciones principales son: la cuantificación de hormonas de alto y bajo Pm, proteínas plasmáticas normales y anormales, factores de coagulación, Ac frente a Ag virales, vigilancia del nivel terapéutico de fármacos, etc. 23 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. 2. Análisis radioinmunométrico (IRMA): Es un inmunoanálisis “no competitivo heterogéneo”, en el cual se usa un Ac marcado (Ac*) para determinar la presencia del analito en líquidos biológicos. Se utiliza el Ac* en exceso para detectar todo el analito presente, lo que lo hace un análisis más sensible que el RIA clásico. Las aplicaciones principales son la determinación de proteínas séricas, factor de coagulación VIII, ferritina, Ag carcinoembrionario, a-fetoproteína, IgE, fosfatasa ácida prostática, Ag prostático especifico y hormonas como la GH, gonadotropina coriónica en suero y orina, etc. 5.4. Enzimoinmunoanálisis (EIA): El marcador es una enzima, por lo que utilizamos las propiedades catalíticas de las enzimas para detectar y cuantificar las reacciones inmunológicas (Ag-Ac). Una sola molécula de enzima puede catalizar la conversión de millones de moléculas de sustrato, en millones de moléculas de producto. Esta capacidad de amplificación hace posible detectar la presencia de una pequeña cantidad de enzima (que está unida al Ac) al añadir el sustrato y, como consecuencia, de pequeñas cantidades de complejos marcados. Î Los EIA constan de dos etapas: • 1ª etapa: se produce la reacción entre el Ag y el Ac* marcado con el enzima. • 2ª etapa: se añade el sustrato y se determina la actividad de la enzima marcadora. Î Características de las enzimas para su uso como marcadores: Ser de fácil obtención, con elevado grado de pureza y bajo costo. Poseer un recambio enzimático alto (moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo). Ser estables en las condiciones de la prueba. Ser de medida sencilla, sensible y rápida. No encontrarse en el medio en que se van a medir (fluidos biológicos), ni ser inhibidas por sustancias presentes en los líquidos biológicos. Esto es decisivo, sobre todo, en ensayos homogéneos (no hay lavado). No perder actividad con la conjugación (acoplamiento al Ag ó al Ac). Conservar la actividad en las condiciones de la prueba. Î Las principales enzimas utilizadas en los EIA son: Fosfatasa alcalina, Peroxidasa de rábano, Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, beta-galactosidasa; la beta-lactamasa y la pirofosfatasa se están investigando. Las enzimas se fijan (acoplan) mediante conjugación con compuestos que presentan dos lugares reactivos, uno por el que se fija al Ac y otro a la enzima. El más utilizado es el glutaraldehído. Î Determinación de la actividad enzimática: Inicialmente se utilizaban sustratos de las enzimas que producían compuestos 24 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. medibles fotométricamente (cromógenos). En los últimos años se utilizan sustratos que dan compuestos fluorescentes o luminiscentes, lo que ha incrementado la sensibilidad de las pruebas. Esta sensibilidad de los EIA se ve incrementada, además, mediante la amplificación de la actividad enzimática. Por ejemplo, que el producto de la enzima marcadora sea el sustrato de una segunda enzima, que genera una gran cantidad de producto (que es lo que se mide). Î Tipos de Enzimoinmunoanálisis: EIA homogéneos: EMIT y CEDIA EMIT: La técnica de inmunoanálisis mediada por enzimas (EMIT), es un método "competitivo simultáneo homogéneo". En ella se marca la sustancia que se desea determinar (AgE). Cuando el AgE se une a un Ac específico contra ella (AgE-Ac), se produce la inhibición de la actividad enzimática, al impedirse el acceso del sustrato al centro activo del enzima. El procedimiento sería: AgE + [Ag muestra ?] + Ac => [AgE -Ac] + [Ag-Ac] Cuanto mayor sea la cantidad de Ag de la muestra, menos cantidad del AgE se une al Ac y la actividad enzimática es mayor. Por consiguiente, la actividad enzimática es directamente proporcional a la [Ag] que hay en la muestra. 25 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. CEDIA: Cloned Enzyme Donor Immuno Assay, es el primer tipo de EIA diseñado y desarrollado con técnicas de ingeniería genética. Es un método "competitivo simultáneo homogéneo". Su fundamento es el siguiente: - Se preparan fragmentos inactivos (Ea y Ed) de beta-galactosidasa por manipulación del gen que controla su síntesis en el Escherichia coli. - Estos fragmentos se unen espontáneamente para formar el enzima activo (Ea+d), aunque el fragmento Ed esté unido al antígeno. - Sin embargo, cuando se produce la reacción AgEd~Ac, ya no pueden unirse los dos fragmentos y no se forma el enzima activo. Ag Ed + [Ag muestra?] + Ac => AgEd~Ac + Ag-Ac La competición entre el antígeno de la muestra y el que va unido al fragmento Ed determinará la cantidad de enzima activo que se forme y, por lo tanto, la actividad enzimática medida será proporcional a la concentración de antígeno libre presente en la muestra. Las aplicaciones de los EIA homogéneos son, principalmente, la detección de fármacos y hormonas de bajo peso molecular como, por ejemplo, la tiroxina, ya que debe existir un estrecho contacto entre el anticuerpo y el enzima marcador para que 26 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. quede afectada su actividad. EIA heterogéneos: Son adecuados, tanto para compuestos de bajo Pm como para sustancias de Pm elevado como las proteínas. Estas técnicas están reemplazando al RIA, entre otros motivos, por los menores riesgos en el manejo de los reactivos y un mayor tiempo de conservación de los mismos (la actividad enzimática dura años). Entre los EIA heterogéneos más utilizados en el laboratorio esta la técnica ELISA (Enzyme linked inmunosorbent assay: análisis inmunoabsorbente con la enzima ligada). En esta técnica uno de los componentes de la reacción (Ag ó Ac) se adsorbe (se une) a la superficie de una fase sólida (placa de microtitulación, una partícula magnética o una bola de plástico). Los ELISA pueden ser de dos tipos: 1. ELISA competitivos: La señal obtenida (color) tras la actividad enzimática es inversamente proporcional a la concentración del Ag de la muestra. 2. ELISA no competitivo: La señal obtenida (color, fluorescencia...) tras la actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la sustancia que se cuantifica. Existen dos métodos: • ELISA indirecto: se utiliza para medir la concentración de anticuerpo en las muestras de líquidos biológicos. La aplicación más frecuente es la medición de los anticuerpos IgG e IgM en diversas infecciones (sarampión, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, V1IH, etc) y en enfermedades de causa inmunológica. 27 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. • ELISA tipo “sándwich”: se conoce también como análisis inmunoenzimométrico. Son los métodos ELISA más empleados para detectar antígenos que tienen por lo menos dos determinantes antigénicos (bivalentes o polivalentes). Permite la cuantificación de marcadores tumorales (Ag carcinoembrionario, alfa-fetoproteína, etc), CK-MB, ferritina, FSH, HCG, prolactina, PAP (fosfatasa ácida prostática), PSA (antígeno especifico de la próstata), TSH, y muchos otros antígenos incluidos proteínas y virus. Un ELISA tipo “sándwich” es el MEIA (inmunoensayo enzimático de microparticulas), muy utilizado en algunos autoanalizadores (en concreto, en el “AXSYM” de los laboratorios Abbott). 5.5. Luminoinmunoanálisis: electroquimioluminiscencia. La quimioluminiscencia, es la emisión de luz que acompaña a ciertas reacciones químicas, como por ejemplo, la oxidación de un compuesto orgánico. El luminoimnunoanálisis (LIA) utiliza los compuestos quimioluminiscentes (luminol, derivados de acridinio, etc.) como marcadores para detectar la reacción Ag-Ac. Un tipo especial de LIA es la electroquimioluminiscencia (ECL). • La ECL difiere de la quimioluminiscencia típica en el hecho de que la especie quimioluminiscente activa es generada electroquimicamente en la superficie de un electrodo, a partir de precursores estables, como el quelato de rutenio, es decir, que no se consumen en la reacción de emisión de la señal (la lucigenina emite luz al ser oxidada, pero se consume). 28 IES Ponce de León - Utrera CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 6. INTRODUCCIÓN A LOS METODOS INMUNOQUÍMICOS. La ECL es una técnica inmunológica en fase "heterogénea" (requiere lavados) que combina la reacción inmunológica convencional Ag-Ac, con la reacción electroquímica sobre la superficie de un electrodo, para generar luminiscencia. Se pueden realizar con la ECL todo tipo de inmunoensayos, "no competitivo" (indirecto, etc.) y "competitivo". Esta tecnología tiene gran capacidad de amplificación de la señal, lo que permite obtener inmunoensayos de una gran sensibilidad (podemos detectar concentraciones de analitos muy bajas). Ventajas de la ECL en relación a otros inmunoensayos con marcador son: - Se amplifica mucho la señal, lo que permite ensayos muy sensibles. - No se consume el marcador, cosa que si ocurre en la “quimioluminiscencia”, donde no se puede obtener más que un fotón por molécula marcadora. La “quimioluminiscencia” es, con el método indirecto, directamente proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra. # 29 IES Ponce de León - Utrera
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