Unidad Didáctica 7LA MICROTOMÍA INTRODUCCIÓN La Microtomía es la disciplina que se ocupa de la obtención de finos cortes seriados a partir de tejidos incluidos en bloques de parafina para su posterior estudio a microscopía óptica y/o electrónica, lo que la convierte en uno de los pilares básicos de las técnicas procedimentales de Anatomía Patológica. El microtomo (o micrótomo) es un aparato mecánico que permite la obtención de secciones de tejido de espesor micrométrico que pueden ser empleadas posteriormente para su estudio al microscopio. Los microtomos poseen cuchillas de metal y mecanismos para regular el grosor de los cortes y el avance de la muestra que se coloca en él. Se utilizan para estudiar secciones de tejidos potencialmente patológicos de los que se pretende obtener un diagnóstico. COMPONENTES DE UN MICROTOMO Aunque pueden variar de unos modelos a otros, los componentes fundamentales de un microtomo son: • Portabloques: en el que apoyamos el casete con la muestra. Avanza de forma discontinua sobre una cuchilla gracias a un mecanismo regulable de cremallera. Propiamente se denomina portabloques al dispositivo donde colocamos el material tisular sumergido en algún medio de inclusión, generalmente parafina. Los actuales portabloques llevan un sistema de pinzas que se adaptan a cualquier tipo de base o molde. A su vez, el portabloques lleva un sistema de orientación que permite conseguir la posición en paralelo entre el bloque y la cuchilla. • Portacuchillas: consiste en un dispositivo de fijación basado en una pinza que sujeta y orienta adecuadamente la cuchilla. Esta pinza permite variar el ángulo de inclinación de la cuchilla, así como su grado de aproximación al portabloques. • Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes sucesivos de tejido a partir del bloque. Actualmente se consiguen cortes de hasta 1 µ. • Base: sirve para sustentar el microtomo a la mesa. • Caja: también llamada carcasa, aloja el mecanismo de engranajes de precisión y el mecanismo para seleccionar el espesor de la sección. • Manivela: está situada a la derecha del aparato; consiste en un volante con una manilla y un freno. En el volante hay una flecha pintada que indica la dirección en la que se debe mover la manivela. • Freno: es un tornillo que, accionándolo hacia afuera y/o girándolo sobre sí mismo un cuarto de vuelta, libera la manivela. • Manivela de recuperación: está situada a la izquierda del microtomo. Una vez utilizado el microtomo es conveniente hacerle volver a la posición de inicio. Para ello se acciona la manivela en sentido antihorario hasta que la base del brazo portabloques esté cercano a la caja de engranajes. 1 Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA TIPOS DE MICROTOMO MICROTOMO DE OSCILACIÓN, BALANCEO O DE CUCHILLA VIBRANTE Es un tipo de microtomo que hoy día se utiliza específicamente para el control de calidad de materiales en industria y en determinados tipos de estudios histológicos. Es el equipo ideal para aplicaciones de alta precisión en neurofisiología, neuropatología y patología experimental, ya sea para la realización con gran precisión de cortes de tejido previamente fijados a fin de realizar exámenes neuropatológicos, o para cortar tejidos en fresco, aunque también puede formar parte del sistema de corte del criostato. Posee un mecanismo de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio de palanca que realiza el portabloques sobre la cuchilla al bascular sobre ella apoyándose en un pivote intermedio, de tal forma que no permite obtener secciones seriadas. Es un sistema barato y simple. 2 Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO Se basa en el deslizamiento, bien de la cuchilla, bien del portabloques, sobre unas guías metálicas, produciendo el corte al avanzar y retroceder. Existen tres tipos: 1. Microtomo Leitz o de portabloques deslizante: El portabloques se desliza sobre la cuchilla, la cual es estable. Es más inalterable y proporciona mejor calidad ya que, al estar fija la cuchilla, ésta no vibra. 2. Microtomo Reichert-Jung o de cuchilla móvil: La cuchilla se desliza sobre el portabloques, presentando una excesiva vibración. 3. Microtomo Tëtrander: Es un tipo de microtomo Reichert-Jung específico que se utiliza para obtener secciones macro o microscópicas de órganos completos. 3 de la que se extraen pasando el dedo sobre ella e introduciéndolo acto seguido en un cristalizador con agua.Regulación exacta de la presión de la cuchilla.Depende de dióxido de carbono para la congelación.…).Elevada propensión a accidentes.Dificultad para el estiramiento de las secciones.Proceso de corte lento (los cortes se obtienen uno a uno). Dando salida al gas carbónico se produce una disminución de la temperatura. 15. . 20. como en el caso de algunas técnicas para el sistema nervioso.Las grandes dimensiones de la cuchilla permiten seccionar bloques tisulares de gran tamaño. congelando la pieza. Las láminas que se obtienen se quedan adheridas a la cuchilla. extrayéndose del agua con ayuda de una aguja histológica y procurando que la lámina no se pliegue.Dificultad para obtener secciones de espesor inferior a 8 µ.Los cortes obtenidos tienen un espesor superior a 5 o 10 µ. El material se congela haciendo pasar por el interior del portabloques hueco una corriente de anhídrido carbónico.Escasas averías. .Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y no deshidratado.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Ventajas de la Microtomía de Deslizamiento .Económica. . . Este microtomo consta de una cuchilla que se desliza sobre una platina conectada a una botella de gas carbónico que asciende en cada corte las micras indicadas previamente (5. . . Inconvenientes de la Microtomía de Congelación . Inconvenientes de la Microtomía de Deslizamiento . 10. . . Se utiliza cuando se necesitan secciones de gran espesor para un estudio simultáneo arquitectural e histoquímico. 4 . MICROTOMO DE CONGELACIÓN Se utiliza para la realización de cortes de tejido congelado no deshidratado. donde los cortes se “pescan” mediante un portaobjetos que se introduce debajo de cada uno de ellos. Existen dos tipos de ultramicrotomo: 1. .Sistema óptico con microscopio estereoscópico de visión tridimensional.Control para el avance macro y micrométrico y regulación de la amplitud y velocidad de movimiento del brazo. 2.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA ULTRAMICROTOMO Son los microtomos empleados para obtener cortes ultrafinos. Porter-Blum: con avance mecánico. El avance del bloque es regulable y.Sistema de iluminación múltiple con luz incidente sobre el bloque.01 µ.Movimiento del brazo regulable por motor.Platina portacuchillas regulable y apta para cuchillas de vidrio o diamante. Su base es la de un microtomo de rotación pero dotado de numerosas mejoras técnicas que permiten efectuar secciones más finas. Todos ellos tienen en común que la cuchilla está fija. siendo el portabloques el que se mueve. permite obtener cortes a partir de 0. . .Avance térmico o mecánico controlado por un procesador que permite el ajuste digital en pasos de 1 nm. . 5 . LKB o Reichert: el avance se debe a la dilatación térmica de una barra metálica maciza unida al portabloques. . transiluminación de éste y campo oscuro. El ultramicrotomo suele incorporar los siguientes elementos: . por lo tanto. el portamuestras y el cubremuestras. aunque una temperatura excesivamente baja produce un enfriamiento excesivo de la pieza y la cuchilla bota sobre ella sin cortar. Imposibilidad de cortar órganos completos. CRIOSTATO Se trata de un microtomo introducido en una cámara frigorífica especial a una temperatura de entre –15 y –20 ºC. El gran peso del aparato y el sistema de movimiento le confieren gran precisión. - - Ventajas de la Microtomía de Rotación Sistema de cortes finos. Presentan una pinza porta-casete para adaptar el bloque de parafina incorporada al cabezal del microtomo. El desbastado y el tallado se pueden hacer de forma automática y manual. El portabloques se coloca en posición vertical y se mueve arriba y abajo. además. de vidrio o de diamante. en la cual la congelación de la muestra se produce de forma instantánea mediante el enfriamiento con una placa a –60 ºC por circulación forzada de gas freón o nitrógeno líquido. Sistema de avance muy complicado. de carburo de tungsteno. La pieza se corta más firmemente cuanto menor sea la temperatura. Las cuchillas pueden ser desechables.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA MICROTOMO DE ROTACIÓN O MINOT Es el tipo de microtomo más utilizado en los laboratorios de Anatomía Patológica. Este sistema de microtomía consta por tanto de una serie de cámaras frías dentro de las cuales se localizan el microtomo propiamente dicho. permitiendo obtener secciones seriadas muy finas. estándar. Inconvenientes de la Microtomía de Rotación Elevado precio. la cuchilla. cuando el movimiento de rotación del brazo del microtomo se convierte en lineal se produce. delante del filo de la cuchilla. semifinos y gruesos. 6 . Para aumentar la temperatura de la pieza pasaremos un dedo sobre ella. el avance automático y constante del portabloques. permitiendo obtener cortes de entre 2 y 4 µ. Los portacuchillas pueden ser móviles o fijos. 7 . éste queda extendido y se extrae colocando el portaobjetos sobre la cuchilla sin tocarla. El corte se adhiere al portaobjetos por efecto de la diferencia de temperaturas. de forma que los cortes que obtendremos no serán seriados. una vez que se tiene ya dentro del cono el corte. se recogen uno a uno y llevan un sistema de antienrollado (antiroll) incorporado consistente en una lámina de material plástico transparente montado sobre un eje y un pivote orientable en los tres ejes espaciales. Gracias al antiroll.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA El uso del criostato se destina a cortes no fijados y no incluidos. esta lámina se aplica paralelamente a la superficie de la cuchilla y forma en ella un túnel en el que se introduce el corte. Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA El criostato se utiliza para procesar biopsias intraoperatorias y en estudios histoenzimáticos o inmunohistoquímicos que se practican sobre tejido congelado. 2. Bicóncava: se utiliza para cortar bloques de parafina en el microtomo de balanceo y en el de rotación. siempre se hace otra muestra por inclusión en parafina y corte con microtomo de rotación. En el caso de las biopsias intraoperatorias. 8 . 3. por su parte. Biplana con faceta: se emplean para cortar los tejidos congelados en microtomos de gas carbónico. Plano-cóncava: también denominadas A y B según sea mayor o menor la concavidad de la cara no aplanada. Características técnicas del criostato Leica CM1900 CUCHILLAS DE MICROTOMO Las cuchillas de microtomo se fabrican en acero inoxidable y actualmente son desechables. su principal inconveniente es que vibran demasiado. La A se emplea para cortar bloques de parafina en el microtomo de deslizamiento mientras que la B se utiliza sobre tejidos incluidos en celoidina. o bien cuando trabajamos con un tejido muy duro. las muestras de estudios especiales siempre son complementarias al procesado por inclusión en parafina. pero si el tejido es blando se consiguen cortes excelentes. podemos encontrarnos cuatro tipos de diseño: 1. para lo cual podemos utilizar dos opciones: el afilado y el pulimentado. por lo que se puede utilizar para casi cualquier tipo de tejido. Biplana: también llamada en cuña o de tipo C.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA 4. Es un tipo de cuchilla polivalente. se utilizan para cortar bloques de parafina en microtomos Minot o tejidos congelados en el criostato. y un protector en forma de anilla semicircular para mantener. AFILADO. Como superficie de afilado se utilizan diversas piedras naturales (amarilla de Bélgica). entre el filo y la superficie de afilado. El afilado puede realizarse de forma manual o automática. un contacto homogéneo que evite irregularidades en el ángulo de bisel. sintéticas (carborundo) o incluso una placa de vidrio a la que se añaden diversos abrasivos en forma de pasta (óxido de aluminio y derivados). CONSERVACIÓN Y RENDIMIENTO DE LA CUCHILLA El filo de la cuchilla debe tener una calidad inmejorable. En el primer caso necesitamos dos accesorios: un mango con tornillo que se inserta en el orificio situado en el borde de la cuchilla para tal fin. 9 . razón por la cual se impone como la más frecuente en la práctica. reservando la zona central para la confección de los cortes finos. Como regla general. en su defecto. con uno de los extremos de ésta. puesto que en la técnica de corte y en el mantenimiento de la cuchilla se siguen pautas muy personales. Suavizado: cuya finalidad es perfeccionar el filo empleando una cinta o disco de cuero a la que se añade una grasa especial para suavizado. para ello. Afilado: se desgasta acero del filo para eliminar sus porciones dañadas (muescas y mellas). pues de lo contrario el filo de la cuchilla se deteriora muy rápidamente. . 2. si no se dispone de un afilador automático de última generación. Devastado: se eliminan las pequeñas irregularidades y partículas de acero levantadas tras el proceso anterior mediante piedras de grano más fino que giran a menor velocidad o mediante abrasivos. deberá enviarse la cuchilla a la casa comercial que la suministra.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Los sistemas automáticos de afilado se basan en el empleo de máquinas de afilar provistas de piedras giratorias a las que se agregan abrasivos y aceites minerales. A fin de preservar el filo de las cuchillas durante el mayor tiempo posible. .Mantenerlas siempre guardadas en su correspondiente caja. el desbastado de los bloques (eliminación de las capas de medio de inclusión que se interponen hasta alcanzar en su totalidad la superficie del tejido) debe realizarse con una cuchilla destinada especialmente a este menester o. se ha progresado hasta modernos instrumentos que permiten controlar y modificar exactamente el ángulo de bisel según las necesidades del caso (generalmente entre 15 y 80º). 10 . Desde los primitivos modelos en los que el ajuste se realizaba manualmente.Limpiar con xileno el filo de la misma antes y después de su uso.Procurar no prestarlas. 3. El proceso de afilado de una cuchilla consta habitualmente de tres fases: 1. Otras precauciones convenientes para conservar en buen uso las cuchillas del microtomo son: . Tras realizar varios afilados manuales de una cuchilla es conveniente reacondicionar el ángulo de bisel. no deben desbastarse bloques realizando cortes de espesor superior a entre 20 y 25 µ. Por lo común. la cuchilla debe incidir sobre la pieza formando un ángulo de entre 25 y 30º. Disponer de una cuchilla correctamente afilada. y suponiendo un procesamiento histológico adecuado del tejido. por tanto. cuanto más agudo y rectilíneo sea el filo. a pesar de que su coste puede resultar muy alto. 3. en la calidad de la técnica. Para garantizar el proceso son necesarias tres condiciones básicas: 1. 2. el ahorro es sustancial al eliminar aparatos como el afilador y el pulidor. la profundidad y exactitud del diagnóstico histopatológico que se realice sobre un determinado material depende fundamentalmente de la calidad y espesor de los cortes obtenidos en el microtomo. Así. son mucho más cómodas y prácticas y. Esta condición resulta crucial. Que el personal posea la formación y experiencia necesarias (la histotecnología clásica define la microtomía como un Arte). de tal forma que su incumplimiento provoca que numerosos servicios de Anatomía Patológica. simplificando y evitando posibles errores en la técnica de afilado que pueden repercutir en los cortes y. TÉCNICAS DE CORTE DE BLOQUES DE PARAFINA CON MICROTOMO En Anatomía Patológica. por otro lado. 11 . Contar con un microtomo moderno y con un adecuado mantenimiento. RENDIMIENTO DE LAS CUCHILLAS El rendimiento de las cuchillas dependerá de su filo y orientación.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA En la actualidad se utilizan cuchillas desechables. lo que elimina las operaciones de afilado y pulido. presenten serios problemas en cuestiones de calidad. más finos y con menos mellas saldrán los cortes. la obtención de secciones adecuadas de tejido incluido en parafina es una de las labores de mayor trascendencia de entre las que debe realizar el técnico. dotados con el instrumental más avanzado. en la confección habitual de los bloques de parafina se emplean sistemas comerciales dotados de soportes plásticos (casetes) de forma paralelepipédica directamente adaptables a la pinza portabloques del microtomo. el bloque de parafina se va calentando y los cortes van empeorando su calidad de forma progresiva.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA La confección de los cortes de bloques de parafina consta de seis maniobras: 1. 5. A continuación. Realización de las secciones. Fijación del portabloques. Orientación del bloque. El casete se coloca de forma vertical u horizontal en el portabloques. resquebrajándose el bloque y apareciendo artefactos en los tejidos. Orientación de la cuchilla del microtomo. RETALLADO Y ENFRIADO DEL BLOQUE Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusión existente en su periferia con la finalidad de disminuir la superficie total en contacto con la cuchilla. Si no se dispone de casetes. 6. FIJACIÓN AL PORTABLOQUES Hoy en día. 3. Durante el corte. se preserva el filo y se consigue que el bloque oponga solamente la resistencia al corte propia del tejido. Mediante esta maniobra. y debido a la fricción. La temperatura ideal de la parafina en el momento de realizar los cortes se encuentra entre 5 y 10ºC. por lo que el enfriamiento más adecuado se obtiene almacenando los bloques en una cámara frigorífica a unos 4ºC. debe procederse a su enfriamiento para conseguir una consistencia óptima de la parafina. y antes de colocar el bloque sobre el microtomo. antes de iniciar el corte es imprescindible fijar el bloque de parafina a un soporte metálico de superficie estriada mediante parafina líquida que se deja solidificar. No deben colocarse los bloques a temperaturas inferiores a 0ºC. esto se soluciona frotando la superficie de corte del bloque de parafina con un cubito de hielo. 4. 12 . 2. ya que la parafina y sus derivados sintéticos tienden a cristalizar. Retallado y enfriado del bloque. Selección del espesor del corte. que se realiza con una hoja de bisturí. Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA ORIENTACIÓN DEL BLOQUE Una vez colocado el bloque en el portabloques se hace descender el brazo del microtomo hasta que la cara inferior toque la cara interna de la cuchilla. restableciéndolo en caso necesario mediante los tornillos del portabloques. En ese momento se comprueba el paralelismo entre ambas. 13 . ángulo de corte (C) y ángulo libre (L). ángulo de arrastre (A). 14 .Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Para orientar correctamente la cuchilla de un microtomo Minot hay que tener en cuenta que existen cuatro ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la cuchilla: ángulo de inclinación (I). todos los ángulos de control sobre la inclinación de la cuchilla pueden variar hasta hacer imposible la obtención de cortes. El ángulo libre es el formado entre el plano que pasa por la faceta inferior de corte de la cuchilla y la superficie del bloque. es decir. Una vez desbastado el bloque. El desbastado se realiza mediante cortes sucesivos de 11 µ. 15 . se procede al desbastado. el desbastado es simplemente la eliminación de las capas de parafina que estén sobre el tejido. linfoides y linfopoyéticas. si se modifica la aproximación de las dos facetas de corte del filo. su valor es siempre el complementario al ángulo de corte (en torno a 30º). pero son imprescindibles para estudiar patologías renales. y termina cuando se obtiene corte de tejido en el corte de parafina. El ángulo de corte es el determinado por el plano que se apoya sobre la faceta superior del filo de la cuchilla y la superficie del bloque. para el estudio del SNC los cortes se realizarán en secciones de entre 10 y 20 µ. Una vez orientada la cuchilla sobre el bloque. Los cortes menores de 4 µ son difíciles de obtener por la fragilidad de la lámina. seleccionaremos un espesor de entre 4 y 6 µ. si el valor del ángulo de bisel de la cuchilla no se mantiene constante.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA El ángulo de inclinación es el formado por el plano que discurre por la cara inferior de la cuchilla y el plano de corte sobre el bloque. su valor se sitúa en torno a los 60º. La cuchilla debe estar inclinada y atacar la pieza de forma que se consiga un corte plano y adherido al precedente. SELECCIÓN DEL ESPESOR DE LOS CORTES Antes de seleccionar el espesor de los cortes tenemos que desbastar el bloque. debe encontrarse entre 10 y 15º. su valor debe oscilar entre 5 y 8º. El ángulo de arrastre es el formado por el plano superior de la faceta de corte de la cuchilla y la perpendicular al plano del bloque. y teniendo en cuenta el tipo de tejido y la tinción a realizar. el cual sirve a su vez para colocarlas sobre el portaobjetos. así como la velocidad de corte. REALIZACIÓN DE LOS CORTES Una vez desbastado el bloque se cambia la cuchilla para iniciar un movimiento rítmico que se transmite al brazo del microtomo y genera una cinta continua de cortes. 16 . Este ritmo. Para evitar el fraccionamiento de las cintas del corte es conveniente sujetarlas con un pincel. pues los cortes se arrollarían de forma irreversible. En caso de que sean necesarios estos cortes la inclusión se hará en celoidina.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Hay que tener en cuenta que el tejido incluido en parafina no puede ser seccionado a más de 20 µ de grosor. va a depender de la naturaleza del bloque y de la del tejido (la velocidad es inversamente proporcional a la dureza del tejido). se eliminan posibles pliegues. gracias a las fuerzas de tensión superficial que se generan en la lámina de parafina y tejido al hacerla flotar sobre el líquido.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA A continuación se pasa el corte de tejido hasta un baño con agua a una temperatura de entre 45 y 50ºC donde. Al terminar el montaje de las preparaciones vaciamos el baño y eliminamos cualquier vestigio de contaminación con papel de filtro. Hay que tener cuidado de que no se formen burbujas bajo la lámina. 17 . Si la orientación o la disposición del corte no es la adecuada. El procedimiento para recuperar los mejores cortes del baño se denomina coloquialmente “pesca” y consiste en introducir un portaobjetos en el baño hasta tocar la sección en uno de los lados del corte. Un método adicional de estiramiento consiste en aplicar alcohol a 70º sobre el porta que utilizamos para trasladar el corte al baño de flotación. con lo que conseguimos que este corte ya esté prácticamente estirado al meterlo en el baño. éste se puede volver a reflotar y orientar. Cuando empieza la adherencia de la sección sobre el cristal se extrae poco a poco el portaobjetos del baño. ya que son difíciles de eliminar. dejando drenar el agua por gravedad. Una temperatura elevada (valores próximos a 100ºC. Esto se hace metiendo la preparación en la estufa a 60ºC durante 10/20 minutos.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Una vez montados los cortes sobre el porta. como suelen hacer algunos técnicos de mayor edad) puede deteriorar de forma irreversible la mayor parte de los componentes bioquímicos y antígenos tisulares. 18 . o a 37ºC durante 24 horas. y antes de la tinción. las preparaciones deben ser secadas meticulosamente para evitar su desprendimiento. Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA PROBLEMAS QUE PUEDEN SURGIR DURANTE EL CORTE Defectos Causas Soluciones Juego en las correderas del Engrasar correderas microtomo Fijar bien la cuchilla y el Soporte mal fijado portabloques Enfriamiento del Cortes de diferente grosor Portabloques caliente portabloques y el bloque Aumentar la inclinación de Inclinación incorrecta de la cuchilla aflojando los tornillos Cuchilla muy usada Cambiar la cuchilla Vibraciones en partes del Bloquear los tornillos del microtomo portacuchillas Reglar o hacer reglar el Juego en las correderas Cortes de espesor irregular microtomo Cambiar la cuchilla por una Vibraciones en la cuchilla menos alta o de cabeza más larga Las aristas del bloque no La cinta se curva Retallar el bloque son paralelas Cortar cerca de un foco de calor Los cortes se enrollan y no La temperatura ambiente es Reducir el espesor del corte forman tira baja o la parafina muy dura Disminuir la inclinación de la cuchilla Probar otra zona de la Cuchilla desafilada Los cortes están cuchilla comprimidos Temperatura ambiente alta Enfriar el bloque Disminuir la inclinación de Cuchilla muy inclinada la cuchilla Los cortes se resquebrajan y pulverizan Cortes muy finos Cortes más gruesos Tejido con sangre Cortar deprisa Probar otra zona de la Cuchilla mal pulimentada cuchilla Cortes con estrías Entre tira y tira limpiar el Presencia de polvo sobre el bisel con una gasa corte empapada en xilol 19 . el filo tiende a introducirse profundamente en la parafina del bloque. 20 . De esta forma no es posible obtener una sección hasta que el bloque ha avanzado lo suficiente como para salvar la faceta de corte de la cuchilla. Cuando el ángulo de inclinación es mayor de 15º. arrancando parte de ella e induciendo una fuerte vibración de la cuchilla. Cuando el ángulo de inclinación es menor de 10º. sino que la faceta inferior de corte se desliza sobre él. Ello se traduce en la obtención de cortes discontinuos de gran espesor. Por lo general. Todo ello origina pequeñas ondulaciones en la superficie del bloque y cortes de grosor muy irregular. el filo de la cuchilla no incide sobre la superficie del bloque. a un técnico con suficiente experiencia le basta la simple observación de la superficie del bloque para reorientar la cuchilla si fuese necesario.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Los mayores problemas que plantea la obtención de secciones en el microtomo de rotación derivan de una inadecuada orientación de la cuchilla. y por tanto el ángulo libre es superior a 8º y el de corte a 60º (cuchilla excesivamente perpendicular al bloque). el ángulo libre es negativo y el corte menor de 60º (cuchilla excesivamente paralela al bloque). Soplar al portaobjetos o se sobre la preparación La parafina ha fundido despegan muy rápidamente durante la extensión Si la parafina ha fundido completamente el corte se ha perdido Secar rápidamente después del escurrido El corte ha sido mal Colodionar los aplanado portaobjetos con albúmina 21 . pues Los cortes no se adhieren se resquebraja. que hace que la parafina funda antes de que hayan desaparecido los Vigilar la temperatura del pliegues (40-45ºC) agua Los cortes no se despliegan Agua de la extensión demasiado fría. debajo de los cortes durante su calentamiento. Usar agua hervida retenido debajo de los cortes durante el secado Usar portaobjetos Portaobjetos mal adecuados. pasados por desengrasados alcohol clorhídrico y bien lavados con agua Si la parafina sólo ha fundido por los bordes enfriará rápidamente. que hace que no se reblandezca la parafina Desbridar el corte (se cortan los bordes de la La pieza es dura y fibrosa preparación a nivel de los pliegues con un punzón) Aplanar bien los cortes Cortes insuficientemente antes de eliminar el líquido pegados de la extensión Presencia de burbujas Aire procedente del agua.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA PROBLEMAS QUE PUEDEN SURGIR DURANTE LA EXTENSIÓN Defecto Causas Soluciones Uso de una cuchilla poco Rehacer los cortes en otra afilada zona de la cuchilla Agua de la extensión muy caliente. manteniendo durante unos minutos la presión. formado por la cara inferior de ésta y la superficie del bloque. que es plano-cóncava. sin embargo. no es necesario realizar un enfriamiento previo al corte. 22 . Se deja secar al aire y se coloca al menos 30 minutos más en etanol de 70º para conseguir un adecuado endurecimiento. preferentemente de tipo Leitz. CARACTERÍSTICAS DEL MICROTOMO Por la especial manipulación que requiere el tejido incluido en celoidina es necesario realizar las secciones en un microtomo de deslizamiento. Como en el caso de los bloques de parafina. ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Y DESBASTADO DEL BLOQUE En el microtomo de deslizamiento se consideran los mismos ángulos de influencia sobre el plano de corte que en el Minot. TALLADO Y FIJACIÓN DE LOS BLOQUES A diferencia de los bloques de parafina. Antes de fijarlos sobre el microtomo han de ser pegados sobre un portabloques de madera o vulcanita (roca volcánica porosa). por lo que el ángulo libre decrece hasta situarse entre 0 y 5º. CONSERVACIÓN. En este caso el ángulo pasa de oscilar entre 10 y 15º a ser ligeramente inferior a 15º. aunque con matices específicos.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA MATERIAL INCLUIDO EN CELOIDINA La realización de secciones histológicas sobre material incluido en celoidina comprende varias operaciones sucesivas análogas a las referidas para tejidos incluidos en parafina. los de celoidina no conservan sus propiedades de consistencia y ductilidad en el ambiente habitual del laboratorio. Para su conservación y grado óptimo de dureza es necesario mantenerlos inmersos en alcohol etílico al 70%. ya que no es posible emplear para su confección las estaciones convencionales con casetes como portabloques estándar. es conveniente el retallado del bloque con una hoja de bisturí para eliminar el exceso de medio de inclusión en su periferia. La variación de mayor trascendencia afecta exclusivamente al ángulo de inclinación de la cuchilla. lo que hace engorroso su manejo. Para montar el bloque se cubre la superficie del portabloques con una cantidad adecuada de celoidina al 8% y se coloca sobre ella el bloque correctamente orientado. El desbastado del bloque se realiza igual que en el caso de los bloques de parafina. en este tipo de microtomo la cuchilla suele estar dispuesta oblicuamente en el eje transversal del bloque.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Debido a la mayor dureza y rigidez de la celoidina en comparación con la parafina. Los cortes se obtienen de uno en uno haciendo incidir el portabloques móvil sobre la cuchilla a través de su deslizamiento sobre las guías del microtomo. para evitar su natural tendencia a enrollarse. e incluso los propios cortes conforme se van obteniendo. Se estiran directamente con el pincel mojado en etanol de 70º sobre la propia superficie de la cuchilla. 23 . de forma que las secciones se realizan oblicuamente con una declinación de hasta 160º. donde quedan retenidos. facilitar su estiramiento y contribuir a mantener la más adecuada consistencia del bloque. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE LOS CORTES Para obtener secciones adecuadas es imprescindible pincelar con etanol al 70% de forma continua tanto la cuchilla como la superficie del bloque. lo que es más frecuente. Estas técnicas requieren una preservación absoluta de la estructura de las proteínas y del fenotipo celular. una vez realizados los cortes. Sin embargo. 24 . MATERIAL CONGELADO La obtención de secciones histológicas a partir de material congelado es de sumo interés en biopsias intraoperatorias. por lo que se ha impuesto la necesidad de realizar anualmente miles de secciones en congelación como complemento del diagnóstico convencional. en el diagnóstico morfológico es cada vez mayor el empleo de técnicas histoenzimáticas e inmunohistoquímicas para determinar tanto antígenos de superficie como actividad funcional. para obtener secciones gruesas (superiores a 20 µ) necesarias en histoquímica del sistema nervioso. pero en la práctica dicho instrumento ha sido desplazado por el criostato o criotomo. Este hecho ha desplazado la responsabilidad de las decisiones desde el cirujano hacia el patólogo. para conseguir un enfriamiento más rápido y homogéneo se sitúa sobre el portabloques una pequeña cazoleta que disminuye notablemente la cámara aérea que se va a enfriar y hacer recircular hacia el tejido parte del gas que sale por los orificios de expansión del portabloques. de forma que al expandirse en su interior se produce el enfriamiento progresivo de la superficie donde se coloca el tejido. En teoría. Por otra parte. MICROTOMO DE CONGELACIÓN CLÁSICO CONGELACIÓN DEL BLOQUE El portabloques del microtomo de congelación está hueco y permite la circulación de gas carbónico procedente de una bombona de presión a su través. por ello. para garantizar un diagnóstico en congelación que resulte prácticamente definitivo es imprescindible poseer una técnica adecuada de biopsia con secciones de una calidad equivalente a las de parafina.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA A continuación los cortes se hacen flotar en un baño de alcohol de 70º. es conveniente situar un papel de filtro húmedo entre el tejido y la superficie estriada del portabloques. A partir de ese momento se inicia el proceso de congelación. abriendo a pequeños intervalos la espita de la bombona de gas carbónico a presión. la tinción se realiza habitualmente por flotación previa al montaje sobre el agente colorante deseado. las secciones histológicas sobre material fijado por congelación se pueden realizar con el microtomo de congelación clásico (de gas carbónico). el conocimiento de la técnica de corte con el microtomo de gas carbónico puede ser útil en caso de avería del criostato o. que en la actualidad constituye la base del tratamiento quirúrgico en numerosos campos de la Oncología. en la cual es imprescindible poder seguir el recorrido de las prolongaciones neuronales el mayor trayecto posible. debido tanto a la gran delgadez de los cortes que se obtienen como a la mayor sencillez de su manejo. Para facilitar el despegamiento posterior de éste. pero se puede efectuar sobre el propio bloque antes del corte. tiende a ser machacado por la cuchilla y a desprenderse del portabloques. Esto es debido al calor por rozamiento producido por la cuchilla. por el contrario. Los cortes se realizan con un espesor próximo a 10 µ y en el preciso momento en el que el tejido comienza a deshelarse. sino en secciones independientes). si esto pasara el tejido debe volver a ser congelado. Si. Si el tejido se ha congelado en exceso los cortes suelen ser difíciles y se astillan con facilidad. lo que puede apreciarse con facilidad a simple vista. en este caso puede ser muy útil calentar la superficie del bloque pasando la yema del dedo.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA OBTENCIÓN DE LOS CORTES Tras el proceso de congelación se aproxima manualmente el tejido a la cuchilla empleando el sinfín del portabloques y se inicia el desbastado del tejido hasta obtener secciones que comprendan su superficie total. se recogen de la superficie de la cuchilla con un pincel y se hacen flotar en un baño de agua a 40º del que se pescan de forma similar a los cortes de parafina. el tejido no se ha enfriado suficientemente. CONFECCIÓN DE LAS PREPARACIONES Una vez obtenidos los cortes (no una tira. 25 . La realización de los cortes se facilita si antes de ser congelado el tejido se coloca en el interior de una gran gota de medio sintético como el OCT (10. 4. CONGELACIÓN DEL MATERIAL Para la realización de técnicas histoenzimológicas o inmunohistoquímicas es imprescindible que el tejido no haya sido fijado y que su congelación no se haya realizado lentamente en la cámara fría del criostato. se empleará isopenteno enfriado en nitrógeno liquido hasta alcanzar esta temperatura. De ambas formas se consigue que el tejido ya se encuentre suficientemente congelado cuando se coloque en la cámara de corte del microtomo. incluso puede ser necesario aguardar algún tiempo hasta que se alcance la temperatura idónea para efectuar los cortes.5% excipientes). Además. el medio de imbibición actúa produciendo la fijación del tejido al portabloques del criostato e. pero podemos obtener cortes de hasta 2 µ. se trata de un microtomo de rotación situado en el interior de una cámara congeladora. lo habitual es entre 4 y 6 µ. debido a la gran formación de cristales intratisulares de hielo que esta práctica provoca.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA CRIOSTATO Por las especiales características técnicas de este instrumento. 26 . incluso. en caso contrario.26% polietilenglicol y 85. engastando el material en este medio de imbibición. Si el criostato dispone de sistema de congelación ultrarrápido (placa y contenedor para isopropano a –50ºC) puede utilizarse éste. puede actuar como agente congelante. que. es posible obtener secciones tisulares extremadamente delgadas.24% alcohol de polivinilo. en torno a –20ºC. como ya sabemos. impide el enrollamiento de los cortes sobre sí mismos. consistente en una delgada lámina de material plástico que. La única diferencia es la existencia en el criostato de un dispositivo antiroll.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA REALIZACIÓN DE LAS SECCIONES Tras la congelación. se capturan directamente de la superficie de la cuchilla empleando el propio portaobjetos identificado con el mismo número que la muestra. y si es excesivo el bloque tropieza con él al oscilar sobre la cuchilla. La técnica de corte es muy similar a la de la parafina. 27 . Si la temperatura de la cámara de corte no es suficientemente baja puede forzarse el mantenimiento de la congelación empleando algún nebulizador comercial de gas freón aplicado sobre la cuchilla. el portabloques se sitúa en la pinza del criostato y se realiza la orientación de la cuchilla y del portabloques al igual que hacíamos con el microtomo de parafina. La mayor dificultad a la hora de obtener los cortes estriba precisamente en la regulación del avance del antiroll sobre la cuchilla: si es insuficiente. obteniéndose cortes seriados. al apoyarse directamente sobre el filo de la cuchilla. las secciones no se introducen entre el dispositivo y la cuchilla. nunca directamente sobre la muestra para evitar el cuarteamiento y la génesis de artefactos sobre el tejido. Una vez obtenidos los cortes. tradicionalmente se han venido utilizando sustancias naturales como la albúmina de huevo o diversas fórmulas de gelatina. resinas plásticas o congelación.7 mm es la distancia desde el objetivo de 40x al cubre). que. este lápiz era causa de una elevada tasa de accidentes oculares por proyección e incrustación de partículas cristalinas durante el proceso de marcaje. los que se empleaban eran de vidrio liso en su totalidad.5 cm y un espesor de entre 1 y 1. si bien son de mayor costo. aunque progresivamente están siendo sustituidas por otros agentes y fórmulas comerciales como las resinas araldita o la poli-L-lisina. pero hoy en día se realizan numerosas técnicas histoquímicas de base inmunológica y de biología molecular sobre las preparaciones histológicas obtenidas en parafina.6 x 2. ya que 1. Como estas técnicas tienden a causar con gran frecuencia el desprendimiento progresivo de los cortes. imprescindible en Biología Molecular.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA SOLUCIONES ADHERENTES PARA PORTAOBJETOS Habitualmente los portaobjetos utilizados en Histopatología rutinaria tienen un tamaño de 7. proporcionan la máxima adhesividad. es imprescindible impregnar los portaobjetos con sustancias fijadoras que dificulten este fenómeno. por lo que en la actualidad se han generalizado los portaobjetos con una zona marginal de vidrio deslustrado (esmerilado) que permite la identificación con un simple lápiz de grafito. por lo que la identificación debía hacerse utilizando un lápiz de punta de diamante. Para los procedimientos más rutinarios la adhesión del tejido al portaobjetos queda garantizada con el proceso de desengrasado anteriormente expuesto (problemas que pueden surgir durante la extensión). Antiguamente.7 mm de espesor los más gruesos. 28 . a espesores superiores es imposible identificar estructuras a 40x.2 mm (hasta 1. A tal fin. en la actualidad se está generalizando su empleo con la adición de alumbre de cromopotasio y otras sustancias que mejoran la adhesividad. Dejar secar al aire.5 g de gelatina molida. . 4. Solución A: . Lavar los portaobjetos en la solución de alcohol-clorhídrico. en que son más recomendables las soluciones gelatinazas). PNT DE LA SOLUCIÓN DE GELATINA-ALUMBRE DE CROMOPOTASIO REACTIVOS 1. como ciertas impregnaciones argénticas. tras la completa disolución de la gelatina. PNT DE LA SOLUCIÓN DE ALBÚMINA GLICERINADA DE MAYER REACTIVOS . GELATINA Sustituye con gran ventaja a la albúmina en la impregnación argéntica e inmunohistoquímicas. aunque existen diversas formas de preparación. . 5.1000 ml de etanol 96%. sigue siendo el adhesivo de elección para las técnicas convencionales que requieren una adhesión más fuerte que la proporcionada por el secado de los portaobjetos (técnicas histoquímicas en general. Por este motivo. 2. Calentar progresivamente hasta 75ºC en termoagitador y. Calentar en horno de desecación a 60ºC para coagular las proteínas. pues la fuente principal de albúmina no es otra que la clara de huevo.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA ALBÚMINA Constituye el adhesivo más clásico y barato. . salvo aquéllas que utilizan álcalis fuertes. 6. La adhesión con albúmina es incompatible con las modernas técnicas inmunohistoquímicas que incorporan la metodología de la avidina-biotina.1000 ml de agua destilada.1 ml de ácido clorhídrico 100%. 50 ml de glicerol y 1 g de salicilato sódico en agitador magnético. dejar enfriar hasta 50ºC. .50 ml de clara de huevo recién extraída. PROCEDIMIENTO 1. Filtrar. Preparar la solución albuminosa mezclando 50 ml de clara de huevo. Impregnar los portaobjetos lavados con alcohol-clorhídrico con una fina película de solución albuminosa. 29 .50 ml de glicerol.4. 3.1 g de salicilato sódico. 7. Preparar la solución de alcohol clorhídrico disolviendo 1 ml de ácido clorhídrico absoluto en 1000 ml de etanol de 96º. . 1 g de merthiolate { C9H9HgNaO2S} PROCEDIMIENTO 1. ya que ésta depende principalmente del estado general de la cuchilla. aunque son de difícil manejo. sobre todo. La resina polimeriza a lo largo del proceso de hidratación proporcionando la adhesividad deseada. ULTRAMICROTOMO ESPESOR DE LOS CORTES ULTRAFINOS La observación mediante microscopía electrónica exige un espesor de corte del orden de algunas decenas de nanómetros debido a la baja capacidad de penetración del haz de electrones. Mezclar con la solución B. 2. Preparar la solución A.1 ml de ftalato de dibutilo { C6H4(COOC4H9)2} . Cuchillas de Vidrio: Son las que se emplean habitualmente debido a su bajo coste y a que son desechables. 30 . por lo que es el agente de elección para técnicas inmunohistoquímicas combinadas con múltiples pasos y. oscilando las secciones normales entre 30 y 120 nm. proporcionan la máxima adhesión.38. Habitualmente se utiliza una solución de resina en acetona en proporción 1:10 que se aplica sobre el portaobjetos inmediatamente antes de su uso. donde se requieren incubaciones prolongadas a una temperatura de 100ºC. Podemos distinguir dos tipos de cuchilla para ultramicrotomo: 1. El vidrio que se utiliza es un vidrio cuya cristalización se lleva a cabo en condiciones especiales de temperatura para evitar las tensiones intramoleculares del mismo para que. Su principal inconveniente es que se deterioran con facilidad y sólo sirven para un número limitado de cortes. para Biología Molecular.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA 2.5 ml de alumbre de cromopotasio {KCr(SO4)2·12H2O} . se dé origen a un filo muy nítido y cortante. CUCHILLAS DEL ULTRAMICROTOMO Son fundamentales para la calidad del corte. RESINAS Y OTROS ADHESIVOS DE GRAN POTENCIA Las resinas acrílicas. La poli-L-lisina constituye la base de todos los portaobjetos comercializados con el adhesivo incorporado. cuando este vidrio se rompa para fabricar la cuchilla.0. 3. Proporciona una adhesividad excelente con una mínima impregnación por los colorantes y reactivos inmunoquímicos en general. Por este motivo deben poder obtenerse cortes de grosor inferior a 1 µ. Impregnar los portaobjetos lavados con alcohol-clorhídrico con la gelatina de alumbre de cromopotasio. Solución B: . tipo araldita o epoxi. por lo que es algo más imperfecto que el de las cuchillas de vidrio. como los tejidos que están calcificados o impregnados metálicamente.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA Este vidrio se obtiene de forma comercial en forma de barras de 40-50 cm de longitud y 4-5 cm de anchura. Este método no se utiliza habitualmente porque es más dificultoso y porque sólo sirven las cuchillas que salgan con un filo desprovisto de irregularidades. Cuchillas de Diamante: Son de tipo multiuso y mucho más caras que las cuchillas de vidrio (unos 3. Su filo se obtiene mediante pulimentación.A mano. rayándolas con un diamante y quebrándolas con tenazas especiales. y la cuchilla se fabrica en el laboratorio a la hora de usarlas. Antes de fijar la cuchilla al soporte del ultramicrotomo deberá colocarse sobre ella un pequeño baño de flotación para recoger los cortes (si no lo trae incorporado). Se emplean sobre todo para cortar tejidos muy duros. Cuando exista suciedad en el borde la limpieza se realizará con acetona concentrada.Con un instrumento que corta la barra de vidrio en paralelepípedos de superficie rectangular para seccionarlos posteriormente por su diagonal y obtener prismas de cristal dotados de un filo con ángulo de corte de 45º. Su precio es mayor y podemos encontrar cuchillas con baño de flotación incorporado a continuación del filo. con una altura de 0. 31 . También podemos comprar cuchillas de vidrio ya cortadas.5 cm. Se sellan los filos de la cinta con parafina.000 €/unidad). Podemos fabricarlas de dos formas: . debiendo observarse como una línea brillante no aserrada en el fondo oscuro del campo. El cuidado del filo es fundamental. su estado puede controlarse con la lupa binocular del ultramicrotomo. se coloca la cuchilla y se llena el pocillo con el líquido de flotación para recoger los cortes. así como algunos tejidos no animales y diversos minerales. 2. . Este baño puede realizarse con una cinta adhesiva (cinta plateada impermeable) que se coloca justamente sobre el filo de la cuchilla con el fin de obtener una balsa o pocillo junto a su cara interna.4-0. Esta maniobra es equivalente al desbastado de los bloques de parafina.5M si es de metacrilato. por tanto.5 mm2 para la resina epon. Debe estar en un lugar donde no se produzcan vibraciones. o una solución de cloruro de bario 0. . Para facilitar esto. PREPARACIÓN DEL BLOQUE La inclusión definitiva del tejido en resina se presenta como un pequeño fragmento tisular de 1 mm3 inmerso en un cilindro de plástico. es importante que el aparato se sitúe sobre una mesa antivibraciones y protegido por una mampara. Si la superficie es mayor el corte saldrá vibrado de forma sistemática. para facilitar la obtención de las secciones. Como líquido de flotación se utilizará agua acetonaza (5-10%) si el bloque es de epon o araldita. el filo de la cuchilla ha de estar casi perpendicular al plano de corte (ángulo que forma la cuchilla con la vertical entre 3 y 5º). para prevenir en este último caso una excesiva hidratación de los cortes. 32 . En este segundo caso. Como condiciones para realizar un corte correcto destacamos las siguientes: .Es importante que la superficie tallada no tenga una amplitud superior a 1 mm2 en el metacrilato y a 0. dependiendo de que el bloque a cortar sea de metacrilato o de resina epon. es imprescindible ir tallando este cilindro hasta conseguir que el plástico que rodea de forma más inmediata al tejido quede en forma de pirámide truncada. deberá revisarse la velocidad del brazo del ultramicrotomo para disminuirla al mínimo. ORIENTACIÓN DE LA CUCHILLA Es variable. la inclinación de la cuchilla suele ser mayor.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA EMPLAZAMIENTO DEL ULTRAMICROTOMO Es una condición esencial. Si el bloque es de metacrilato. con temperatura constante y ausencia de corrientes de aire.Si el corte sale vibrado a pesar de que la superficie sea la adecuada y el filo de la cuchilla esté bien. se procede a conectar el movimiento del brazo. Una vez teñido.5 g de azul de toluidina en 100 ml de borato sódico al 1% en agua destilada. ello ocurre debido a que el corte es más delgado que la longitud de onda de la luz que lo atraviesa. REALIZACIÓN DEL CORTE ULTRAFINO Las secciones ultrafinas deben tener un espesor de entre 30 y 90 nm. aclarado y montado. El mecanismo de obtención es análogo al de la obtención de los cortes ultrafinos.5 y 1 µ de espesor que es teñida con una coloración estándar de microscopía óptica (generalmente azul de toluidina alcalino) o bien es observada directamente al microscopio de contraste de fase con la finalidad de comprobar previamente la naturaleza de las estructuras contenidas en el tejido.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA OBTENCIÓN DE CORTES SEMIFINOS Reciben también el nombre de cortes control. colocando a continuación el porta sobre una llama o placa caliente hasta que comience a emitir vapores sin llevar a ebullición. el corte puede ser deshidratado. por lo que se generan fenómenos de interferencia entre los rayos R reflejados por la superficie del líquido de flotación. 33 . AZUL DE TOLUIDINA ALCALINO Se disuelven 0. esta observación no es posible en el caso de los cortes para microscopía óptica convencional. Paradójicamente. y regulado el espesor deseado del corte. obteniéndose una cinta de cortes que flotarán en el pocillo. siendo suficiente para la mayoría de las aplicaciones un espesor de 80 nm. ya que sirven para seleccionar la zona que preferentemente se pretende observar en el corte ultrafino. Una vez movilizada la cuchilla para situarla en una zona de filo virgen. Se trata de una sección de entre 0. SELECCIÓN DE LOS CORTES ULTRAFINOS En microscopía electrónica es posible apreciar el grosor de los cortes mediante un sistema bastante preciso que se basa en el fenómeno de interferencia de las ondas luminosas reflejadas por el corte y la superficie del líquido de flotación. Una vez seco el corte se le añaden unas gotas de esta solución colorante. cumpliendo estos requisitos. 120-150 nm: Dorado intenso. donde se encuentra flotado el corte. los cortes ideales serán los grises y los plateados. . ya que se ve sometido a una baja tensión superficial.La luz debe proceder de una lámpara de hendidura (microscopio de bajo poder combinado con una fuente de luz de alta intensidad que puede enfocarse para alumbrar con un rayo delgado). 60-90 nm: Plateado. Al recibir los vapores del líquido el corte se extiende bruscamente. al iluminar el corte con una luz blanca de incidencia especial. 280-320 nm: Amarillo. Para extender cortes en epoxirresina sólo es necesaria la pericia del técnico. . 150-190 nm: Púrpura. 190-240 nm: Azul. Para extender cortes en metacrilato se acerca al pocillo situado sobre la cuchilla. 90-120 nm: Dorado pálido. Estructuralmente consiste en un entretejido de hilos de cobre de 50 µ de diámetro entre los cuales quedan espacios con un tamaño de unas 150 µ. como el benceno o el cloroformo. Para poder observar los colores que reflejan los cortes son necesarios ciertos requisitos fundamentales: .El ángulo de incidencia de la luz sobre el tejido debe estar en torno a los 45º.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA El mecanismo descrito anteriormente determina que. 240-280 nm: Verde. MONTAJE DE LOS CORTES Por lo común el montaje se realiza sobre una rejilla con un baño electroquímico metálico (formwar) de unas dimensiones de 3 x 2. con el fin de obtener un fondo oscuro donde contrasten los cortes. y en función del espesor de corte. 34 .3 mm. se produzcan interferencias entre los rayos que refleja el tejido y el reflejado en la superficie del líquido flotador. ya que se realiza prácticamente como el extendido en los baños de parafina. EXTENSIÓN DE LOS CORTES El procedimiento será diferente en función de si el medio de inclusión es metacrilato o resina epon. Dependiendo del color del corte se procederá o no a su selección. tendremos los siguientes colores: <60 nm: Gris. Así. utilizando microinstrumentos. un papel de filtro humedecido o impregnado en un líquido volátil de baja tensión superficial.El líquido de flotación no debe estar iluminado directamente. lo que origina la aparición de una gama de colores que depende del grosor que posea el corte. el corte se adhiere a la rejilla por fuerzas de tensión superficial y se deja secar. sino sales de metales pesados para contrastar el tejido. se puede pasar a impregnación del corte. 35 . En el microscopio electrónico no se utilizan colorantes. que es esencial en los cortes realizados en metacrilato. Una vez seco. es decir. obteniendo una imagen en escala de grises. el método de Reynolds (1963) consiste en la impregnación del corte con citrato de plomo y acetato de uranilo.Unidad Didáctica 7 LA MICROTOMÍA La técnica de montaje sobre rejilla es semejante a la de la microscopía óptica.