TEMA 3.TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS CONCEPTO DE ANTIGENO Y ANTICUERPO TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS Tema 3. REACCIONES INMUNOLÓGICAS Y TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS Concepto de antígeno y anticuerpo Reacciones antígeno-anticuerpo Técnicas inmunoquímicas: - El anticuerpo como reactivo: reactivos policlonales reactivos monoclonales - Título, Afinidad y Especificidad del anticuerpo como reactivo - Reactividad cruzada - El antígeno como variable analítica Fases de la reacción antígeno-anticuerpo - Primera fase - Segunda fase o fase indicadora: Inmunoprecipitación Inmunoelectroforesis Inmunonefelometría Inmunoanálisis con indicadores marcados Ensayos de unión competitiva ANTÍGENO: Sustancia que induce una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser un anticuerpo (respuesta humoral) o la generación de células sensibilizadas (respuesta celular). Los HAPTENOS son antígenos incompletos que no producen una respuesta inmune por sí solos, pero sí reaccionan con anticuerpos. El DETERMINANTE ANTIGÉNICO es la porción de antígeno que interviene en la reacción con un anticuerpo. ANTICUERPO: Proteína que se combina específicamente con un antígeno TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO Afinidad del anticuerpo: Fuerza de unión de un anticuerpo con un único determinante antigénico. Es función de la suma de fuerzas intermoleculares, no covalentes y de corto alcance (fuerzas electrostáticas, uniones de H2, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas. La unión antígeno-anticuerpo es una reacción reversible: K1 Ag + Ac ↔ Ag.Ac K2 [Ag.Ac] K1 ------------------ = ------ = Ka (cte de asociación) [Ag] [Ac] K2 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO 1 Título: cantidad de anticuerpo disponible para su reacción en un método inmunológico específico.Afinidad: fuerza de unión de un anticuerpo con el antígeno en una reacción antígeno-anticuerpo.Segunda fase o fase indicadora: . enzimáticos y fluorescentes El antígeno como variable analítica TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS El anticuerpo como reactivo: reactivos policlonales reactivos monoclonales . . TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS INMUNOELECTROFORESIS INMUNOELECTROFORESIS 2 . TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3.Reactividad cruzada: reacción residual entre el reactivo-anticuerpo y un antígeno no superfluo estrechamente relacionado FASES DE LA REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO . Inmunoprecipitación . Inmunoanálisis con indicadores marcados: marcadores radiactivos.TEMA 3.Primera fase . Inmunonefelometría . .Especificidad: designa la capacidad del anticuerpo para restringir su reacción a un grupo específicamente definido de moléculas. . Inmunoelectroforesis . Es la máxima dilución de anticuerpo que da una reacción detectable para un método específico y varía con el procedimiento inmunológico. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. * marcadores radiactivos. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS INMUNOELECTROFORESIS “ROCKET” DE LAURELL INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS CONTRAINMUNOELECTROFORESIS INMUNOANALISIS CON INDICADORES MARCADOS NO COMPETITIVOS. TIPO SANDWICH.TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. enzimáticos y fluorescentes Ag + Ag Ag Ag * * * Ag Ag Antígeno (variable analítica) Anticuerpo unido a una superficie sólida * Anticuerpo marcado Respuesta * [Ag] 3 . Ejemplos: ac. rodamina. umbeliferona. fosfatasa alcalina. ac. de una molécula pequeña o ligando con una proteína de unión específica proteína de unión + ligando ↔ proteína de unión : ligando ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA Ac + L* + L ↔ AcL + Ac L* Ac + L* AcL* Ac + L* + L AcL* + AcL (50%) (50%) Ac = anticuerpo L = Ligando (antígeno) L*= Ligando marcado Ac + L* + 3L AcL* + AcL (25%) (75%) Ac + L* + 2L AcL* + AcL (33%) (66%) Ac + L* + 4 L AcL* + AcL (20%) (80%) anticuerpo-reactivo antígeno (hapteno) (100%) variable analítica Hapteno: molécula pequeña que no puede por sí sola provocar una respuesta inmune. fluoresceína. RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA) AcL Ac + L + L 125I ↔ Ac-L AcL 125I AcL* [Ligando] L* Ensayos heterogéneos: requieren que el ligando marcado unido al anticuerpo (AcL*) sea separado físicamente del ligando marcado libre (L*) Ensayos homogéneos: no requieren separación física del ligando marcado unido al anticuerpo (AcL*)y el ligando marcado libre (L*) HETEROGÉNEO [Ligando] 4 . Ejemplos: peroxidasa. Suposiciones ideales: Anticuerpos y Antígenos son homogéneos y su interacción reversible alcanzará el equilibrio El marcador del antígeno no interfiere en la interacción antígeno-anticuerpo Sólo se pueden formar complejos 1:1 Los complejos formados se pueden separar físicamente del antígeno libre marcado L* (50%) AcL* L* (66%) L* (75%) L* L* (80%) CURVA DOSIS-RESPUESTA L L TEMA 3. glucosa oxidasa. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA Métodos analíticos in vitro basados en la unión reversible. pero puede generar anticuerpos cuando se acopla con moléculas grandes. Enzimas: deben poseer una elevada actividad específica y debe acoplarse fácilmente al ligando sin que haya pérdida significativa de su actividad. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. Marcadores fluorescentes: pueden unirse al ligando y seguir emitiendo fluorescencia con un mayor grado de eficiencia. glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Ejemplos: 125I. 57Co. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA Marcadores radiactivos: las marcas radioisotópicas sólo pueden utilizarse en sistemas de inmunoanálisis heterogéneo. titrio. MARCADORES RADIACTIVOS. 1-anilino-8-naftalensulfónico.TEMA 3. 14C. no covalente. El radioisótopo debe acoplarse fácilmente al ligando y su emisión debe ser fácil de detectar. dimetilamino-naftalensulfónico. Es útil que las λ de excitación y emisión estén bien separadas. ELISA INMUNOMÉTRICO MARCADORES ENZIMÁTICOS. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS MARCADORES RADIACTIVOS. ENSAYOS INMUNORADIOMÉTRICOS (IRMA) MARCADORES ENZIMÁTICOS. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS MARCADORES ENZIMÁTICOS. ENZIMOINMUNOANÁLISIS HOMOGENEO (EMIT) L + L + Ac ↔ L-Ac + L-Ac S P HETEROGÉNEO HOMOGÉNEO 5 . TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. ENZIMOINMUNOANÁLISIS CON INMUNOADSORBENTES (ELISA) HETEROGÉNEO Ac-L Ac-L AcL* Ac + L + L ↔ Ac-L S P HETEROGÉNEO L + L + Ac ↔ L-Ac + L-Ac 125I 125I TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3.TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS MARCADORES FLUORESCENTES.TEMA 3. FLUOROINMUNOANÁLISIS DE POLARIZACIÓN (FPIA) HOMOGÉNEO HOMOGÉNEO TEMA 3. FLUOROINMUNOANÁLISIS CON SUSTRATO MARCADO (SLFIA) MARCADORES FLUORESCENTES. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS TEMA 3. TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS CARACTERÍSTICAS DE LOS ENSAYOS DE UNIÓN COMPETITIVA 6 .
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