CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO.TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. __________________________________________________________________________ TEMA 1. INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA 1. Concepto de Bioquímica Clínica. 2. Etapas de un Análisis Bioquímico. 3. Técnicas y métodos de Análisis Bioquímico. 4. Control de Calidad en el Laboratorio. 5. Automatización en el Laboratorio. ____________________________________________________________________________________ 1. CONCEPTO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA. Introducción: Los seres vivos se caracterizan por contener multitud de moléculas complejas y por su alto grado de organización. Además presentan la capacidad de extraer y transformar la energía de su entorno, a partir de materia primaria sencilla y emplearla para mantener sus propias estructuras. Pero el atributo más extraordinario de los seres vivos es su capacidad de producir una réplica exacta de sí mismos. --> La bioquímica es una ciencia muy joven que deriva de 2 líneas matrices: 1·- De la medicina (anatomia, fisiología, patología,..) 2·- De la química orgánica (estructura de los compuestos orgánicos). La bioquímica clínica se ocupa del estudio de los aspectos químicos de la vida humana, en la salud y en la enfermedad, mediante la aplicación de los métodos químicos de laboratorio para el diagnóstico (Dx), el seguimiento, el control del tratamiento (tto), la prevención y la investigación de la enfermedad. Los aspectos químicos de la vida humana comprenden el estudio de los procesos metabólicos en relación a los cambios fisiológicos, patológicos e inducidos por maniobras terapéuticas. Los objetivos de la bioquímica clínica son: • Diagnóstico: es una hipótesis que se confirma en función de los resultados obtenidos en una analítica de laboratorio: un aumento de la enzima GOT indica, por lo general, afectación del hígado. • Seguimiento y evolución: se establecen valores de referencia a los que se les hace un control periódico. • Control del tto: valorar la eficacia de determinados fármacos según sus niveles en sangre, su toxicidad, efectos secundarios, etc. • Prevención de enfermedades: se establecen “señales de alarma” que suelen preceder a los signos y síntomas clínicos; también los programas de detección precoz de enfermedades como la diabetes, la fenilcetonuria etc. • Investigación de enfermedades: ¡imprescindibles! Los conceptos de salud y de enfermedad son relativos; por ello los datos clínicos han de interpretarse comparándolos con unos que se toman de referencia. En este proceso de interpretación clínica por comparación se puede actuar de forma más o menos formalizada; algunos diagnósticos pueden hacerse de manera intuitiva, basándose en la experiencia clínica, pero generalmente se recurre al uso razonado de los avances de la tecnología sanitaria. Para los análisis clínicos es muy importante disponer de valores de referencia para cada prueba bioquímica que se solicita. Antes se utilizaba el término “valores normales” y actualmente usamos el de “valores de referencia”, de los que existen dos tipos: 1. 2. Basados en un individuo: son datos previos del mismo individuo obtenidos cuando se encontraba en un determinado estado de salud y que sirven para valorar la evolución de ese paciente. Basados en una población: se obtienen por procedimientos estadísticos a partir de una población de sujetos bien definidos (edad, sexo, estado de salud establecido mediante determinados criterios, etc). Estos son los valores a los que se alude en las técnicas de laboratorio como “índices de intervalo” en el que se considera que los individuos son saludables con respecto a ese dato clínico. 1 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. El futuro de la bioquímica clínica pasa por: • Disminución de la demanda de análisis generales y aumento de los específicos. • Aumento de los programas de detección precoz de enfermedades, sobre todo en el recién nacido. • Aumento de la automatización de los laboratorios. • Aumento de las analíticas a la cabecera del enfermo con el avance de la llamada “química seca” mediante el uso de tiras reactivas. Es importante que el TEL realice su trabajo con: ♦ Ciencia: para la comprensión suficiente del trabajo y su disciplina, es necesario formación teóricopráctica. ♦ Conciencia: los “tubos” son pacientes y de un resultado puede depender su salud. ♦ Paciencia: ser meticulosos y críticos con el método clínico. ♦ Instrumentación: desarrollando un conocimiento básico de aparatos e instrumentos cada vez más sofisticados acortando el tiempo y aumentando la sensibilidad. 2. ETAPAS DE UN ANÁLISIS BIOQUÍMICO. Repasar los apuntes de MBH; aquello de petición de pruebas y su documentación, la extracción de sangre, los colores de los tubos, la toma de muestras de orina, etc. 3. TÉCNICAS Y MÉTODOS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. En el laboratorio clínico se realizan diferentes tipos de análisis en diferentes muestras biológicas para detectar la presencia de determinadas sustancias (llamadas analitos) y establecer siempre que sea posible su cuantificación; como los resultados se aplican a un paciente han de ser estudiados antes de implantar un determinado método, para tener la garantía de que los datos que proporciona son fiables. ¿Cuáles son esos métodos y sus características? 3.1. Por el tipo de medida que realizan: a) Métodos cualitativos: sólo detectan la presencia o no del analito; por ej: sangre oculta en heces. b) Métodos semicuantitativos: indican el rango aproximado de concentración del analito; ej: tiras reactivas de orina que utilizan una escala de color. c) Métodos cuantitativos: expresan la concentración del analito en la muestra, con > ó < exactitud ; ej: determinación de glucosa en suero. 3.2. Por el procedimiento Físico-Químico que utilizan: Unas emplean métodos mas o menos mecánicos para separar sustancias y otras utilizan procesos de análisis mas específicos: a) M. mecánicos: algunos de ellos son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Filtración, ultrafiltración y diálisis: dependen de la exclusión por el tamaño a través de los poros de determinadas membranas. Centrifugación y ultracentrifugación, flotación y decantación: se separan las sustancias según el tamaño, la masa, la densidad. Destilación: separa por evaporación. Electroforesis: las partículas según su carga eléctrica y su masa, emigran cuando son sometidas a un campo eléctrico. Cromatografía: los componentes de la muestra, son separados entre dos fases. Extracción con disolventes, etc. b) Técnicas ópticas: detectan la radiación lumínica y entre ellas están las de uso más común: 1. Espectroscopia de absorción: se usa para Ca, Mg, Zn, Cu, Pb y otros metales y se basa en la absorción de luz por lo que la radiación emitida será de < intensidad que la inicial y % a la concentración de la sustancia en la muestra. 2 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. Dentro • • • • de ella tenemos: E. de absorción molecular UV-V e IR, según la zona del espectro de REM en la que trabaje. E. de absorción atómica. Resonancia magnética Nuclear: se coloca la muestra en un campo magnético externo y se irradia con determinada radiofrecuencia; parte de los núcleos de E inferior la absorben; el aparato de Resonancia magnética Nuclear detecta esta absorción de E. Etc. 2. Espectrofotometría o espectroscopia de emisión: cuando un átomo es excitado por una fuente de energía, sus electrones pueden alcanzar niveles orbitales de energía mayor; cuando el electrón vuelve a su estado de reposo emite una REM. Dentro de ella tenemos: • Espectroscopia de emisión atómica o fotometría de llama: determina Na, K y Li en líquidos biológicos; se basa en la emisión de luz; cuando se ponen en contacto con la energía calorífica de una llama cada elemento de una muestra, desprende una luz con una longitud de onda diferente, típica de cada uno, y con una intensidad luminosa directamente proporcional al nº de átomos, lo que es proporcional a la concentración en la muestra. • Espectroscopia de fluorescencia o fluorimetría: la fluorescencia es la capacidad que tienen las sustancias de emitir una luz visible cuando se las iluminan con radiación UV; una molécula absorbe luz de una determinada longitud de onda (energía) y emite luz de una longitud de onda superior (< E); la intensidad de la radiación es % a la cantidad absorbida que a su vez es % a la cantidad de moléculas que absorben. • Quimioluminiscencia: emisión de luz de diferentes sustancias al oxidarse; no precisan aporte externo de luz. • Espectroscopia de fosforescencia o fosforimetría, espectroscopia de rayos X, • etc. 3. Espectrofotometría de dispersión: son principalmente dos técnicas que se basan en el hecho de que cuando un haz d luz choca con una partícula en suspensión, parte de la luz es dispersada, parte reflejada, parte absorbida y parte transmitida. Distinguimos: • Turbidimetría: disminución de la intensidad de un haz de luz incidente cuando pasa a través de una suspensión de partículas; se usa sobre todo para la determinación de proteinas en orina. • Nefelometría: medida de la luz dispersada en ángulos diferentes al de incidencia; uso principal es en determinación de proteínas específicas. 4. Espectroscopia de reflexión o reflexometría: es la llamada “química seca”. 5. “ de refracción o refractrometría. 6. “ de difracción: difracción de Rayos X etc. c) Técnicas imnuno-químicas: siempre sobre la base de una reacción Ag-Ac. Detectan señales de color, de radioactividad, etc. Las más importantes son : RIA, EIA, Inmunofluorescencia, inmunonefelometría etc. d) Métodos térmicos: como la osmometría, que detecta cambios en el punto de congelación de una solución. e) Técnicas electroquímicas: detectan señales eléctricas, como la Potenciometría, Conductimetría, etc. f) Técnicas de Biología molecular: basadas en: - técnicas de hibridación de bandas de ADN, por ejemplo - técnicas de amplificación, mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). 3.3. Por el uso al que se destinan: a) Métodos definitivos: se usan para calibrar materiales; tienen un error sistemático muy bajo (gran exactitud) y alta precisión. b) Métodos de referencia: son realizados por personal altamente cualificado en laboratorios clínicos o industriales y con materiales calibrados para obtener valores estándar con los que comparar resultados obtenidos con otros métodos. c) Métodos de elección: son los que utiliza un laboratorio determinado para su trabajo de rutina. 3 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. 4. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO: 4.1. Conceptos relacionados con el Control de Calidad. Se entiende por Control de Calidad a un conjunto de medidas sistemáticas encaminadas a observar y a conservar la fiabilidad de un método analítico. Esto incluye una detección de los errores cometidos y una prevención de la aparición de los mismos; su objetivo principal, es asegurar que los valores obtenidos con un determinado método, presentan una adecuada exactitud y precisión y que por tanto, son científicamente válidos. Algunos conceptos relacionados con el mismo son: 1. Exactitud: es el grado de concordancia entre el valor de concentración de la sustancia problema, que se ha determinado con una técnica analítica, y el valor real (el obtenido con una técnica de referencia) de esa concentración. Puede calcularse mediante la siguiente fórmula: E %= V – VR / VR . 100 E %= Exactitud en %; V= el valor q yo obtengo; VR= Valor real. A + cerca d 0 + exacta. Suele aceptarse una E % < 10% para sustancias no enzimáticas y < 20% para las enzimáticas; de todos modos en los protocolos, vienen indicados dichos límites. Cuando la inexactitud es constante y de similar cuantía, se conoce como sesgo. 2. Precisión: es el grado de dispersión encontrado entre los valores obtenidos al repetir una misma determinación sobre la misma muestra; en el laboratorio clínico se usa más el término contrario, es decir, imprecisión, que se define como la variabilidad que se obtiene al repetir las medidas de una muestra. Para calcularla se utiliza principalmente el “Coeficiente de Variación”. CV = DE / X x 100 de unas 20 o 30 determinaciones de la misma muestra y que no debe ser > del 5%. 3. Sensibilidad: es la capacidad para diferenciar dos señales muy parecidas del mismo analito; también se define como la capacidad de un método para producir un cambio en la señal ante un cambio definido de la cantidad. No sólo depende de la técnica sino del equipo instrumental, del tipo de analito y de la muestra. Relacionado con este concepto: Límite de detección: es la más pequeña concentración de analito que puede ser detectada por un método. Límite de cuantificación: es el resultado más pequeño que puede diferenciarse del blanco. Sensibilidad también es la capacidad que tiene un método analítico para detectar el analito (o sea, dar un resultado positivo verdadero) en todas las muestras que realmente lo contengan. 4. Especificidad o Selectividad: es la capacidad de un método para determinar exclusivamente el analito en cuestión sin reaccionar con otras sustancias similares que se pueden encontrar en la mezcla; por ej, un método para determinar glucosa, será específico si solo determina glucosa aunque en la muestra se encuentren otras hexosas. Las técnicas inmunoquímicas, son las más específicas, siempre y cuando el Ac no de reacciones cruzadas apreciables con moléculas parecidas. La especificidad analítica puede verse afectada por sustancias que se encuentran normalmente en suero o plasma, como bilirrubina, Hb, lípidos etc que pueden interferir por su color, turbidez o por sus características fisico-químicas. 5. Rango analítico o linealidad: es el valor máximo de la concentración de un analito para el que la señal registrada por el aparato y la concentración son directamente proporcionales; es el rango de concentración de las muestras sobre el que se puede aplicar el método, sin tener que hacer ninguna modificación. Para determinar el rango, se analizan una serie de muestras, normalmente patrones de varias concentraciones y determinamos la curva de calibración correspondiente. 4 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. El ICA o intervalo de concentración aplicable o intervalo de medición, es el intervalo de valores en el que el procedimiento de medida se aplica sin modificaciones y está comprendido entre el Límite de detección o cuantificación y el Límite de Linealidad. 6. Medidas del blanco: son señales o lecturas (cantidad de absorbancia) observadas durante el proceso de medida del analito, que se deben al reactivo o a los componentes de la muestra que se está observando, pero no al analito. Pueden obtenerse experimentalmente midiendo lo siguiente: Un blanco de reactivo: es decir, los reactivos sin la muestra y hacemos una lectura inicial. Un blanco de muestra: la lectura inicial se hace con el suero diluído en la misma % que se le va a echar al reactivo, en un solvente inerte con el que no reaccione (es más complicado). En espectrofotometría UV-V estas medidas pueden anularse utilizando los blancos para calibrar la absorbancia a valor cero, o utilizándolos en un sistema de doble haz. Como es de esperar, cuanto más bajos sean los valores del blanco de un método, mejor será la exactitud y la precisión que se obtienen con ese método. Es importante que el TEL tenga en cuenta la magnitud de las medidas del blanco ya que éstas contribuyen al error total del proceso de medida. 7. Interferencias: son el efecto producido por uno o más compuestos sobre un analito, alterando la exactitud de su medida. 4.2. Líquidos de referencia: Concepto: Son aquellas soluciones que contribuyen a asegurar la calidad de un procedimiento analítico; pueden presentarse de forma líquida o liofilizado (ha de reconstituirse). Los líquidos de referencia suelen tener las siguientes funciones: 1. Calibrar los instrumentos de medida. 2. Obtener resultados analíticos, como las curvas de calibración, sobre las que extrapolar nuestros resultados. 3. Demostrar y controlar la fiabilidad d los resultados obtenidos en el lab, por ej, al ser analizadas junto con las muestras. 4. Evaluar la validez de los procedimientos de medida. Además deben poseer las siguientes características: 1. Homogeneidad: ha de tener una composición uniforme dentro de todo el envase que lo contiene y en todos los envases que componen un lote. 2. Estabilidad: el/los analito/s que contienen deben mantener sus valores de concentración estables cuando éstos se almacenan en condiciones adecuadas durante el tiempo especificado por el fabricante. 3. Reactividad: ha de contener los analitos que se pretenden evaluar y a la concentración adecuada al empleo que se le va a dar a tal líquido. 4. Conmutabilidad: los analitos que contienen deben comportarse de manera similar a los contenidos en las muestras. 5 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. Los líquidos de referencia puede ser destinados a diferentes usos: 1. Como patrón o estándar: se usa para obtener resultados analíticos ya que contiene el analito a una concentración conocida; se usa sobre todo en las determinaciones espectrofotométricas a punto final, para calcular la concentración de los analitos en las muestras, por comparación de las diferentes absorbancias obtenidas en éstas y en el estándar. También se pueden utilizar varios patrones, que contienen el analito a diferentes concentraciones de valor conocido, para construir curvas patrón que sirvan posteriormente para interpolar los valores de absorbancia medidos en las muestras y determinar las concentraciones que les corresponden. 2. Como calibrador: se emplea para ajustar los resultados proporcionados por los aparatos de medida a los que teóricamente debieran dar, según la información facilitada por el laboratorio comercial que prepara el calibrador utilizado; esta calibración debe hacerse diariamente y antes de comenzar las determinaciones de las muestras. 3. Como control: es un líquido biológico (suero, plasma o sangre total) procesado por un laboratorio comercial y del que se conocen las concentraciones de cada uno de los analitos que contiene; puede ser “normal” si contiene los analitos a unas concentraciones fisiológicas, o “patológico” si están por encima o por debajo de lo que se considera fisiológico. El control puede ser utilizado para las siguientes funciones: ♦ Evaluar la validez de un procedimiento de medida. ♦ Validar los resultados obtenidos en el control de calidad interno del laboratorio; para ello se introducen junto con las muestras y se procesan igual que éstas; así verificamos los resultados, ya que si los ofrecidos por el control son precisos y exactos, los de las muestras procesadas con él, también. ♦ Estudiar comparativamente los resultados obtenidos en el control de Calidad externo en diferentes laboratorios. Los criterios para la elección de la muestra control son: a. b. c. d. Las muestras control deben ser semejantes a las muestras de los pacientes (muestras problema). Si vamos a utilizar un método en suero, el control debe ser lo mas semejante al suero posible (suero humano o animal liofilizados o preparados artificiales de proteinas), si se va a analizar Hemoglobina, el control debe ser sangre total, etc. Actualmente los controles se compran en el mercado a empresas que los fabrican a partir de grandes cantidades de suero; suelen venir de forma liofilizada, lo que alarga su periodo de caducidad, aunque existe alguna presentación en forma líquida. Deben utilizarse por lo menos dos sueros para el control de cada analito, uno dentro de los valores de referencia (Control normal) y otro fuera de estos valores (Control patológico); por lo general un 20% de las muestras procesadas son controles. Es conveniente contar con cantidad suficiente del mismo lote de controles para aproximadamente 1 año; las mediciones al inicio de cada lote se hacen estableciendo los “rangos blanco” o “estadísticos de referencia” con los que se hacen las gráficas de control; se analizan durante 1 mes (1 vez al día o 1 vez por turno) y se establece la media y la desviación estándar y se elabora una gráfica base sobre la que se anotarán los resultados del resto del año. Deben estar fraccionados para su uso diario, en alícuotas en tubos Eppendorf o similares. Clasificación de muestra control: Dependiendo del conocimiento que el analista tenga de la muestra control, los controles se clasifican en: a. b. c. Ciegos: cuando la muestra control pasa completamente desapercibida para el analista, quien no conoce la muestra control ni sabe el valor de los constituyentes de la misma. Semiciegos: conoce la muestra control, pero no sus valores. Abiertos: conoce el control y sus valores. Con estos controles el laboratorio puede validar sus resultados para un parámetro, una técnica y unas condiciones analíticas concretas al demostrar, que si el análisis de la muestra control da lugar a resultados exactos y precisos, las concentraciones de las muestras problema, realizadas en las mismas condiciones, también serán reales. 6 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. 4. Pool: consiste en la mezcla de diversos sueros o plasmas, realizada en el propio laboratorio analítico; los valores son desconocidos, pero se aproximan a los que se consideran normales; es el líquido de referencia mas parecido a las muestras. 4.3. Gráficas de control: Para hacer el seguimiento de la precisión en el laboratorio de Química Clínica se utilizan fundamentalmente procedimientos estadísticos que se reflejan en varios tipos de gráficas: de Levey-Jennings, de Youden . 1. Gráfica de Levey-Jennings: consiste en una curva de distribución normal dibujada de lado, en la que se marcan puntos específicos correspondientes a los valores de la media más y menos una, dos y tres desviaciones estándar, que se prolongan hacia la derecha formando la gráfica en la que se representarán más tarde los valores obtenidos cada día para el control Cuando se utilizan estas gráficas para el control de calidad, hay que preparar una para cada control de cada parámetro bioquímico. 7 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. En una hoja de papel milimetrado, dispuesta de forma apaisada, se traza un eje de coordenadas, de manera que en el eje de ordenadas se sitúan los valores de concentración del analito (muestras cobtrol) y en abscisas los días correspondientes al periodo de seguimiento. La escala de unidades de concentración se traza de manera que queden dentro del ancho del papel los valores comprendidos entre la media (que se sitúa en el centro de la hoja) y cuatro desviaciones estándar por arriba y por debajo del valor de la media. Se marcan los trazos correspondientes a los valores de la media, en línea contínua, y ±1DE, ±2DE, ±3DF, -1DE, -2DE y -3DE, en líneas discontínuas. Una vez que se ha preparado la gráfica, se anota el resultado del control diario y se aplican los criterios que haya adoptado el laboratorio para aceptar o rechazar los resultados del análisis. 2. Gráfica de Youden: es el resultado de superponer dos gráficas de Levey-Jennings de forma perpendicular entre sí. En este tipo de gráficas se pueden reflejar los valores de dos controles de diferente concentración de un mismo analito, utilizando, por ejemplo, el gráfico horizontal para valores clínicamente normales y el vertical para valores patológicos. 8 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. Cuando se establece en un laboratorio clínico un programa de control de calidad, lo que se pretende es tener un instrumento que haga posible tomar decisiones inmediatas con respecto a la validez de los resultados obtenidos para las muestras de los pacientes, basándose en la observación de que los valores del control permanecen dentro de unos límites previamente establecidos. Si el valor del control se encuentra dentro de esos límites, se supone que los resultados de las muestras de los pacientes que se analizaron en el mismo lote que éste, son valores correctos. El límite que se acepta con más frecuencia es que los valores del control han de encontrarse comprendidos dentro del intervalo de confianza del 95,5%, es decir, estos valores han de ser prácticamente iguales al 95,5 % de los datos obtenidos con el control durante el periodo en el que se estableció el valor medio. De acuerdo con este criterio se considera que un valor de control es aceptable si se encuentra dentro del área comprendida entre la media y ±2DE en la gráfica de Levey—Jennings, o en la de Youden. Si un valor del control no cumple esta condición, los resultados de los análisis del lote no se aceptan. Aunque las gráficas de Levey-Jennings son fáciles de interpretar y proporcionan una buena representación visual de la precisión, tienen el inconveniente de que se necesita mucho tiempo para anotar todos los resultados día a día en ellas, ya que son necesarias dos o tres para cada parámetro bioquímico (una por control). Modificaciones frecuentes en los gráficos de control: 9 Dispersión: cuando los errores aleatorios o la imprecisión aumentan 9 Tendencia: es la desviación sistemática de los valores observados cuando el método analítico sufre un problema en desarrollo progresivo. 9 Desviación: es una modificación abrupta o brusca con respecto al valor medio establecido. Para hacer de forma más práctica la toma de decisiones, se han ideado otras alternativas. La más utilizada es el sistema de reglas múltiples de Westgard: 1: 3 SD una observación supera la media ± el límite de 3SD 2: 2 SD dos observaciones consecutivas superan la misma media ± 2SD R: 4 SD dos observaciones consecutivas se diferencian más de 4SD 4: 1 SD cuatro observaciones consecutivas superan la media ± 1SD 10: MEDIA diez observaciones consecutivas caen a un mismo lado de la media. Las reglas 1:3SD y R: 4SD generalmente sugieren un error aleatorio. Las reglas 2:2SD, 4:1SD y 10: MEDIA suele ser un error sistemático. 4.4. Protocolo de búsqueda de errores. Hasta en los laboratorios más experimentados y capacitados se producen en ocasiones, situaciones en las que los resultados de los controles se encuentran fuera de los límites permitidos. En estos casos lo importante es averiguar las causas y resolverlas rápidamente, por lo que si se tiene establecido un protocolo de búsqueda de errores la tarea se facilita considerablemente. A continuación, de forma esquemática y sin pretensiones de haber abarcado todas las situaciones posibles se indica un ejemplo de cómo se puede establecer una pauta a seguir en estas situaciones que en la práctica, no resultan nada fáciles de investigar. El ejemplo se centra en la preparación y desarrollo técnicas espectrofotométricas U V— V: 1. Búsqueda de errores en la preparación del análisis: 1.1. Reactivos: ♦ en la conservación: 9 ¿se ha sobrepasado la fecha de caducidad o la estabilidad? 9 ¿se han guardado herméticamente cerrados, en ausencia de luz y a la temperatura adecuada? 9 si no se está seguro de que todo esto se ha hecho bien, desechar el kit y coger uno nuevo. 9 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. ♦ en 9 9 9 9 9 el tratamiento: ¿se ha utilizado agua de calidad apropiada para su preparación? ¿los reactivos preparados han pasado x material volumétrico sucio? ¿se han diluido con la cantidad correcta de diluyente? ¿dejan residuo sólido? ¿se han disuelto sin pérdida de sustancia? 1.2. Controles: ♦ en la conservación: lo mismo que en los reactivos. ♦ en el tratamiento: 9 ¿se ha utilizado agua de calidad apropiada para su preparación? 9 ¿se han disuelto con la cantidad adecuada de agua? 9 ¿se han disuelto sin pérdida de sustancia? 9 ¿se ha esperado el tiempo de reactivación antes de usarlos? 9 ¿se han congelado correctamente las fracciones? 9 ¿se han congelado y descongelado reiteradamente? 9 ¿se ha evitado la formación de espuma? 2. Búsqueda de errores en la realización del análisis: 2.1. Uso de pipetas: ♦ ¿se han utilizado pipetas sucias o desportilladas? ♦ ¿se han utilizado pipetas demasiado grandes para volúmenes muy pequeños? (por ej, pipetas de 5 ml para medir 500 microlitros) ♦ ¿se han utilizado pipetas húmedas? ♦ ¿era correcto el nivel del menisco observado a la altura de los ojos? ♦ ¿se han vaciado o llenado demasiado deprisa las pipetas automáticas? ♦ ¿se ha ajustado correctamente el volumen en los dosificadores? 2.2. Temperatura y tiempo. ♦ ¿se han atemperado suficientemente los reactivos, controles y muestras? ♦ ¿se ha colocado correctamente la temperatura en el baño maría? ♦ ¿se ha tenido en cuenta que las cubetas de plástico necesitan más tiempo para atemperarse que las de vidrio? ♦ ¿se ha medido bien el tiempo de incubación? 2.3. Fotómetro: ♦ ¿se ha ajustado bien el cero? ♦ ¿ha estado la lámpara encendida el tiempo suficiente? ♦ ¿ha habido fallos en el suministro de corriente eléctrica? ♦ ¿ha entrado luz en el compartimento de pruebas? ♦ ¿ha envejecido la lámpara? ♦ ¿hace mucho tiempo que no ha sido revisado por el servicio técnico? 2.4. Cubetas: ♦ ¿se han utilizado cubetas sucias o rayadas? ♦ ¿se han situado por los lados correctos en el paso de luz? ♦ ¿han estado húmedas por fuera? ♦ ¿han estado suficientemente llenas? ♦ ¿había burbujitas en la cubeta? 2.5. Cálculos: ♦ ¿se han hecho correctamente las operaciones con decimales? ♦ ¿se ha utilizado correctamente el factor? ♦ ¿se ha tenido en cuenta la dilución? ♦ ¿se ha calculado en las unidades adecuadas? ♦ ¿se ha tenido en cuenta el blanco de reactivo o de prueba? En ocasiones, aunque los controles dan resultados correctos, el valor encontrado para la muestra de un paciente es incomprensible. Las causas suelen estar fuera del propio laboratorio, pero es a éste al que le corresponde establecer relaciones con los demás servicios del hospital o de la institución sanitaria en la que se encuentra ubicado, de manera que se puedan organizar programas conjuntos de garantía de calidad que aseguren que la obtención, traslado, conservación y preparación de las muestras se han hecho correctamente. 10 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. 4.5. Validación de resultados: Consiste en la revisión global de los resultados encaminada a comprobar que el sistema analítico está bajo control y que los resultados obtenidos con él, son coherentes o congruentes con las características clínicas del paciente. Para realizarla: 1º se ha constatado que el control interno de la calidad y la validación técnica no ha detectado anomalías analíticas y esto se hace en base a los intervalos de decisión fijados para cada analito y en: ♦ Información acerca del paciente: se conoce su procedencia (Atención Primaria o Atención Especializada), su diagnóstico y sus datos de filiación, así como si hubo incidencias en la toma de la muestra. ♦ Información acerca de la muestra: el TEL revisa la muestra antes de introducirla en el analizador y conoce los índices séricos y por tanto el grado de ictericia, hemólisis o lipemia de la muestra. ♦ Información acerca del método: diariamente se calibran los aparatos al comienzo de la jornada estableciendo el control de calidad analítico para todos los componentes. 2º se procede a la revisión de todos los informes de resultados que realiza el facultativo responsable del laboratorio, mediante un programa informático; se clasifican en tres grupos: ♦ Grupo I: informes estrictamente normales: todos los resultados de los parámetros estudiados están comprendidos en los límites considerados normales y, además, corresponden a sujetos que no padecen una enfermedad conocida que pueda alterar estos parámetros. ♦ Grupo II: informes anormales pero coherentes: los resultados están fuera de los límites normales pero son coherentes con el estado de salud del paciente. ♦ Grupo III: informes incoherentes: contienen resultados que por alguna razón no parecen tener conexión con el estado de salud del paciente. Terminado el proceso, el informe es enviado al peticionario. 5. AUTOANALIZADORES. 5.1. Antecedentes históricos La Química Clínica hospitalaria inició un cambio hacia principios de los años 60 por dos motivos fundamentales: - La mecanización de las determinaciones La producción industrial de los reactivos El primer autoanalizador se utilizó en los años 50 y era un autoanalizador de flujo continuo para la determinación de Glucosa y Nitrógeno Ureico. 5.2. Concepto de automatización Se aplica a aquellos procesos donde el instrumento lleva a cabo una serie de test con un mínimo de intervención de los técnicos. En el LDC los aparatos son regulados por los operarios, por lo tanto, se debería hablar se mecanización y no de automatización. El analizador automático es un aparato que mecaniza las diferentes etapas del análisis de la muestra. Las ventajas del autoanalizador son: • • • 5.3. Elimina el factor humano en etapas repetitivas y delicadas del análisis Aumenta la precisión y la exactitud de los resultados. Son de coste alto pero se compensa con el ahorro de personal y reactivos. Etapas del análisis de una muestra • • • • • • Identificación de la muestra Preparación de la muestra Sistemas de carga de la muestra Sistemas de dispensación de la muestra Reactivos y sistema de dispensación de los reactivos Sistema de mezcla de reactivos y muestra 11 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. • • • • Sistema de incubación Cubetas de reacción Sistema de detección Proceso de datos 1. Identificación de la muestra: hay dos sistemas: − Directo: La muestra se une a unos identificadores que permiten asociarla con el paciente en cualquier momento. Los identificadores más comunes son los códigos de barras, que permiten el marcado electrónico de la muestra. Las etiquetas con el código de barras se adhieren al tubo de extracción y también a los recipientes donde se coloca la muestra para el análisis. El problema de la identificación es el de la separación del suero en alícuotas, lo que requiere volver a marcar los tubos (más errores). Esto se puede solucionar utilizando el llamado “tubo primario”, que consiste en realizar el proceso analítico a la muestra en el mismo tubo de la extracción. − Indirecto: La muestra se relaciona con la posición que ocupa en una secuencia analítica según indicará una lista de trabajo previamente realizada. 2. Preparación de la muestra La muestra más frecuentemente utilizada es el suero, pero también se usan plasma, sangre total, líquido cefalorraquídeo, orina y otros líquidos biológicos (Ej. Sinovial). Todas ellas, menos la sangre total, deben ser manipuladas previamente mediante diluciones, centrifugación, etc. Es importante en la obtención del suero que la coagulación sea completa y la centrifugación la adecuada para que no quede fibrina, que obstruye los sistemas de toma de muestra. 3. Sistemas de carga de la muestra: Se suelen utilizar copas de plástico desechable, cuya forma y tamaño depende del tipo del analizador. Se deben fabricar en material inerte, que no absorba ni desprenda ninguna sustancia. Se debe evitar la luz directa sobre las cubetas de carga porque pueden afectar a productos fotosensibles (Ej. Bilirrubina). Se pueden colocar en gradillas, en bandejas circulantes o en cadenas transportadoras. Actualmente es muy frecuente que se utilice el tubo primario en lugar de las copas de plástico. Existen dos tipos de carga de muestra: Se cargan las muestras en un dispositivo que se cambia cuando se han tomado todas las muestras. Se cambian continuamente los contenedores de las muestras, a medida que se van tomando. 4. Sistemas de dispensación de muestra De Flujo Continuo: La muestra, impulsada por una bomba peristáltica, es aspirada por una aguja hacia una corriente continua de reactivo. La proporción resultante entre muestra y reactivo viene dada por la velocidad de flujo. La cantidad de muestra depende del diámetro interno del tubo. Analizadores Discretos: La muestra es aspirada a través de una aguja llamada “jeringa de desplazamiento líquido positivo” y es colocada en una cubeta de reacción, junto con el reactivo. Las jeringas pueden ser de un volumen fijo o variable, dependiendo del autoanalizador. Si realizan poca variedad de pruebas se podrán usar de volumen fijo, pero si tienen múltiples determinaciones distintas, han de ser de volumen variable. 5. Sistemas de dispensación de reactivos Tipos de Reactivos: - Reactivos líquidos de reserva: Son los más empleados. Son reactivos en estado líquido que se adquieren de esta forma o en forma de polvos que se reconstituyen con agua o con buffers (tampones). Se manejan en contenedores de vidrio o plástico. El volumen del contenedor depende de la estabilidad del reactivo y de la capacidad de trabajo del autoanalizador. 12 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. - Reactivos de unidad: Se utilizan para una sola autoanalizadores nuevos y son mucho más caros. determinación. Se utilizan más en Dispensación: Cada prueba utiliza 1 ó 2 reactivos, aunque algunas permiten el uso de 3 ó más. Se pueden dispensar de forma continua ó discreta, igual que la muestra. 6. Sistemas de mezcla de reactivos y muestra - Analizadores de flujo continuo: Los reactivos y las muestras se mezclan por intersecciones en “Y” de los tubos transportadores. Una vez en el mismo tubo se mezclan por acción del flujo. - Analizadores discretos: La mezcla tiene lugar en las cubetas de reacción. El mezclado se puede hacer por distintos mecanismos: o o o o Por movimientos rotatorios de los contenedores Por inyección de aire a presión Mediante agitadores magnéticos Agitadores de barra, etc. o Analizadores centrífugos: La mezcla se lleva a cabo por acción de la fuerza centrífuga del rotor. o Analizadores de química seca: La mezcla se produce por la difusión de la muestra a través de los reactivos. 7. Sistemas de incubación La incubación pretende que la reacción tenga lugar en un determinado tiempo y a una determinada temperatura. - Flujo continuo: Los tubos en los que transcurre la reacción están inmersos en unos bloques de termostatización cuya temperatura se regula por la longitud del tubo y la velocidad del flujo. - Discretos: La temperatura se puede alcanzar por baños de agua ó aire caliente a temperatura controlada. En estos baños se encuentran introducidas las cubetas de reacción. - Centrífugos: Los rotores con las cubetas se reacción se encuentran inmersos en baños de aire caliente. - Química seca: Las tiras de reacción se encuentran en contacto con superficies metálicas calientes. 8. Cubetas de reacción y lectura - Flujo continuo: La reacción se produce en los tubos y la lectura se produce en las cubetas de lectura o de flujo. Por estas cubetas van pasando las soluciones para ser leídas. - Discretos: Las cubetas de reacción pueden ser desechables o reutilizables. La lectura se realiza en las mismas cubetas de reacción. 9. Sistemas de detección El sistema de detección más frecuente es la espectrofotometría de absorción. También se pueden usar medidas nefelométricas y turbidimétricas, medidas de fluorescencia, electroquímica, química seca (reflexión ó electroquímica), etc. 10. Procesamiento de datos El detector crea una señal analógica que se transforma después en digital. Transforma los datos digitales en resultados que luego se imprimen. 13 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. 5.4. Tipos de autoanalizadotes: Hay que definir una serie de conceptos para después conocer los distintos tipos de autoanalizadores que hay: REPERTORIO DE PRUEBAS: Son las pruebas que puede llevar a cabo un autoanalizador. Hay que distinguir entre: - Número de pruebas totales que el autoanalizador puede realizar. - Número de pruebas que puede realizar de forma inmediata, es decir, pruebas programadas en una serie ó tanda de análisis sin necesidad de cambiar reactivos ni otras condiciones del aparato. TIEMPO DE RETARDO: Es el tiempo mínimo requerido para obtener un resultado después del procesamiento inicial de la muestra. Depende de la determinación solicitada y del número de determinaciones. CAPACIDAD: Es el número de determinaciones que se pueden procesar en 1 hora. Dependerá del tiempo de retardo. Los tipos de Autoanalizadotes son: ¾ Analizadores Selectivos: También se llaman analizadores de acceso al azar. Pueden seleccionar para cada paciente las pruebas que se deseen del repertorio total sin tener que ejecutar en una muestra todas las determinaciones. ¾ Analizadores Discretos: Cada muestra es transportada en contenedores individuales. Los reactivos se adicionan discontinuamente por medio de dispensadores y utilizan para dispensar las muestras “jeringas de desplazamiento líquido positivo”. Hay tres tipos: ¾ • Analizadores monoclonales por lotes: Realizan una única determinación de forma simultánea sobre varias muestras. • Analizadores monoclonales selectivos: Realiza varias pruebas distintas, seleccionables sobre cada muestra, pero solo tienen un sistema de muestra y un solo canal de lectura espectrofotométrica. • Analizadores multicanales: Realizan varias determinaciones simultáneas en una misma muestra. Analizadores de Flujo Continuo: Son instrumentos que bombean continuamente reactivos a través de tuberías para formar una corriente de flujo, bombeando después la muestra a esta corriente. Para ello se utilizan bombas peristálticas. # 14 CFGS LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO CLINICO. TECNICAS DE ANALISIS BIOQUIMICO. TEMA 1. INTRODUCCION A LA BIOQUÍMICA. TEMA 1. INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA. 1. Concepto de Bioquímica Clínica. 2. Etapas de un Análisis Bioquímico. 3. Técnicas y métodos de Análisis Bioquímico. 4. Control de Calidad en el Laboratorio. 5. Automatización _____________________________________________________________________ 1. Concepto de Bioquímica Clínica: Introducción: aspectos generales que justifican la importancia y la esencia de la Bioquímica. Concepto de Bioquímica Clínica en sí, de su futuro y de la concienciación del trabajo del técnico. 2. Etapas de un análisis bioquímico. 3. Técnicas y métodos de Análisis Bioquímico. 3.1. Por el tipo de medida: cuali, cuanti o semi. 3.2. Por el procedimiento físico químico: o Métodos mecánicos: filtración, centrifugación, electroforesis, cromatografía, etc. o Técnicas ópticas: E de absorción: Absorción molecular (UV-V), Absorción atómica, RMN, etc Espectrofotometría de emisión: fotometría de llama, fluorescencia, fluorimetría, etc. E de dispersión: turbidimetría, nefelometría. E de reflexión: QS. E de refracción o refractometría. E de difracción: con Rx, etc o Técnicas inmunoquímicas. o Metodos térmicos. o Técnicas electroquímicas. o Biología Molecular. 3.3. Por el uso al que se destinan: métodos definitivos, de referencia, de elección. 4. Control de Calidad en el Laboratorio. Conceptos relacionados con el Control de Calidad: − exactitud − precisión − sensibilidad (límites de detección y de cuantificación) − especificidad − rango analítico o linealidad. − Medidas del blanco. − Interferencias. Líquidos de referencia: concepto y funciones, características y usos (patrón, calibrador, control y pool). Gráficas de control: − Levey-Jennings. − Youden. − Toma de decisiones. Protocolos de búsqueda de errores. Validación de resultados. 5. Automatización en el Laboratorio: 5.1. Antecedentes históricos. 5.2. Conceptos: automatización y autoanalizador y ventajas 5.3. Etapas del análisis: 1. Identificación de la muestra 6. Sistem. de mezcla de reactivos y muestra 2. Preparación de la muestra 7. Sistema de incubación 3. Sistemas de carga de la muestra 8. Cubetas de reacción y lectura 4. Sistemas de dispensación de la muestra 9. Sistemas de detección 5. Sistemas de dispensación de los reactivos 10. Procesamientos de datos 5.4. Tipos de autoanalizadotes: selectivos, discretos y de flujo continuo. 15