TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS• Rta inmune adaptativa mediada por linfocitos es estudiada mediante: Aislamiento → Separación poblaciones-subpoblaciones → comportamiento • No es posible diferenciar los linfocitos T de los B por microscopía ordinaria, ni en la sangre ni en los órganos linfoides, aunque sí se observan algunas diferencias por microscopía electrónica de barrido. No obstante, se disponen de varios métodos que permiten diferenciar y cuantificar los linfocitos, sus diferentes subpoblaciones e incluso su capacidad de responder a distintos antígenos. Los métodos para el estudio de los linfocitos, más utilizados en la actualidad, los podemos agrupar en: .- Determinación de marcadores y receptores de membrana. .- Determinación de antígenos de membrana. .- Pruebas funcionales. TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS • Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque (Boyum 1968) Humanos: Sangre Periférica – Organos M. experimental : bazo, NL, timo Importante conocer si se requiere esterilidad . Rendimiento: 1-2 x 106cel / ml TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS 1.- Marcadores y receptores de membrana. Estos métodos han sido tradicionalmente utilizados para diferenciar y cuantificar poblaciones de linfocitos B y T. Estos marcadores convencionales, están basados en las características específicas de ciertos receptores de membrana, presentes en ambas poblaciones de linfocitos. Los principales marcadores son: Principales receptores utilizados tradicionalmente para diferenciar los linfocitos T de los B Linfocitos B: Inmunoglobulinas de superficie Linfocitos T: Rosetas con eritrocitos de carnero Linfocitos B Linfocitos T .- Para los linfocitos B: inmunoglobulinas de superficie que pueden ser detectadas con suero policlonales o Acs. monoclonales marcados con fluorescencia (isotiocianato de fluoresceína). En el microscopio de fluorescencia se puede observar que en la membrana aparece una reacción fluorescente positiva. .- Para los linfocitos T: Rosetas con los eritrocitos. Los linfocitos T presentan la característica de formar Rosetas cuando se unen a los eritrocitos de carnero.Actualmente se usan métodosen los que GRC se tratan con neuroaminidasa o AET( 2-aminoethylisothiouronium bromide) para aumentar la unión de las cel. T. Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el marcaje con naranja de acridina y la posterior observación al microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se marcan con la naranja de acridina, presentando los linfocitos T rosetas mientras que los B se marcan con la naranja de acridina pero no forman rosetas. E E E Rendimiento: > 95% cel. T, < 1% cel. B y ~ 2% monocitos Población no T: < 2% cel. T, 40% cel. B y 60% monocitos E E E E E E 2.- Antígenos de membrana : Expresión diferencial de marcadores de superficie y disponibilidad de AcMo con especificidad deseada Técnicas: .- Lisis Ac/Complemento .- Panning .- S. Magnética .- Análisis por citometría de flujo. .- Inmunohistoquímica. Identificación Separación - positiva Panning: - negativa Ag Ag+ Ag Ag Rendimiento: > 90% pureza y viabilidad Ag Ag - Ag - Ag+ Ag+ Ag+ Wysocki y Sato,1978; Mage y col,1977 Engleman y col,1982; Payne y col, 1981 Placa sensibilizada Ac Subpoblaciones de linfocitos pueden ser separados fisicamente usando Acs acoplados a perlas magnéticas Ventajas: pureza, reproducibilidad, manejo de cantidades variables de células ( 106 a 1010 células). Rendimiento: > 98% pureza Análisis por citometría de flujo. • El citómetro de flujo es un aparato que permite caracterizar e incluso separar las diferentes poblaciones linfocitarias “in vitro” mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína, PE,etc; frente a los marcadores de superficie específicos de cada subpoblación que se desee estudiar. • Las células, sobre las que se adicionan los monoclonales (se pueden valorar varios a la vez) frente al marcador objeto de estudio (CD2, CD4, CD8, etc.) pasan a través de un haz de un láser que detecta su capacidad para dispersar la luz (tamaño de las células) y la fluorescencia que emiten (tipo de célula). Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de cada población. Costoso... Exacto, rápido y fácil en manos experimentadas Citometrí a de Flujo Side scatter G L E M Forward scatter (size) • Inmunohistoquímica. Utilizando anticuerpos monoclonales, marcados con fluorescencia o con peroxidasa, frente a los diferentes linfocitos, se puede valorar la situación de estas células en cualquier tejido. Incluso utilizando dos anticuerpos monoclonales, cada uno frente a una población linfocitaria distinta, y cada uno marcado con una enzima diferente (doble marcaje) (peroxidasa – fosfatasa alcalina) se pueden estudiar dos poblaciones celulares a la vez en cualquier tejido . 3.- Pruebas funcionales: • Estos métodos de estudio se basan en valorar la capacidad que tanto los linfocitos T como los B tienen para reconocer a un antígeno determinado. Las técnicas más utilizadas son: · Estimulación blástica o Blastogénesis · La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+) • • La utilización de la transformación linfocitaria, blastogénesis o proliferación es actualmente una de las técnicas más precisas y difundidas para el estudio de la capacidad de estimulación específica y no específica de los linfocitos “in vitro”. Esta técnica se basa en la capacidad que los linfocitos tienen para responder frente a un antígeno (respuesta específica) que por vacunación o por sufrir una infección, ha inducido linfocitos memoria. Los linfocitos al estar de nuevo en contacto con el antígeno inducen una proliferación, la cual puede ser inducida de forma no específica gracias a la capacidad de los linfocitos de reaccionar con diferentes tipos de lectinas o mitógenos. Los mitógenos inducen una estimulación blástica de tipo inespecífico tanto en los linfocitos B como en los T. • TECNICAS: a.- Incorporación de 3H dentro del ADN de las células. b.- FACS → contenido de ADN-ARN (proliferación de células individuales) c.- Ensayos colorimétricos: MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)2,5diphenyltetrazolium bromide) y SDS • Funciones efectoras de cel. T . ¿ Qué podemos medir ? Secreción de citoquinas en Sn de cultivo. Efectos regulatorios sobre cel. B ( por ej. cuantificar niveles de Ig) Actividad citotóxica. La actividad citotóxica de los linfocitos T(CD8+) La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+) frente a una célula blanco se puede estudiar, midiendo la capacidad de destrucción, que un determinado número de linfocitos T tienen para destruir un determinado número de células blanco, al estar ambas poblaciones en contacto. Hay varios métodos para poder valorar el porcentaje de lisis o muerte celular que expresan las células blanco, aunque el más utilizado por su precisión, sensibilidad y reproducibilidad, es el de la liberación de cromo 51 procedente de las células blanco. Este método consiste, brevemente, en lo siguiente: Las células blanco (que expresan los antígenos determinados en su membrana) son marcadas con Cromo 51 y puestas en contacto en una proporción adecuada con las células efectoras (linfocitos T). Tras incubar ambas poblaciones celulares conjuntamente por un periodo de incubación determinado, se centrifugan y seguidamente una parte del sobrenadante resultante es medido mediante un contador de partículas gamma para conocer el porcentaje de cromo 51 liberado al medio. A mayor cantidad de cromo liberado mayor actividad citotóxica. Producción de citoquinas in vitro: a.- Inmunoensayos. b.- Bioensayos • INMUNOENSAYOS: ELISA Ventajas: Especificidad, rapidez y facilidad Desventajas: sensibilidad (10-50 pg /ml) <<< Bioensayo. No diferencia citoquinas activas de fragmentos inactivos. ELISPOT ASSAY BIOENSAYOS: Ensayos muy sensibles ( 1 pg/ml) → bioactividad y potencia. TECNICAS: a.- Proliferación → Crecimiento cel. Blanco susceptibles ( IL1,2,3,4,5,6,7). b.- Citotoxicidad → Muerte o inhibición del crecimiento de cel. Blanco susceptibles ( TNF → L929, IL-1 → A375). c.- Diferenciación de cel. Blanco susceptibles ( CSF, IL-3 → crecimiento sobre agar suave; INF- γ ( expresión de MHC clase II, fagocitosis macrófagos). Cel. Viables Desventajas: Dificil de realizar, Multiples Citoquinas compartiendo actividad y mayor tiempo( dias a semanas) <<especificidad. Cuidadosos controles