Técnicas Microbiológicas Parte 2

MICROCULTIVO Los mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposición de la materia orgánica y al reciclado de materiaorgánica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas, manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo. Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los champiñones) e indirectamente en la elaboración de cerveza, vino y pan (Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas con ésta). Además el queso Roquefort se produce inoculándolo con Penicillium roquefortii durante su elaboración y otros quesos suaves como el camembert se producen inoculando Penicillium camemberti. El moho crece sobre la superficie produciendo una proteasa que descompone la estructura del queso. Otros ejemplo es el interés en la producción de proteína de origen unicelular a partir de mohos, ya sea apara alimento del hombre o del ganado, por ejemplo el uso de Candida utilis y la levadura desecada Saccharomyces cerevisiae Además de la producción de alimentos, los mohos producen ácido cítrico para bebidas embotelladas, se basa en el crecimiento de Aspergillus niger, el descubrimiento de penicilinas como productos metabólicos de Penicillium notatum revolucionó la medicina moderna, hoy en día se produce con una variedad denominada Penicillium chrysogenum. Existen otros antibióticos producidos por mohos estos son las cefalosporinas, griseofulvina, ácido fusídico Algunas características de los mohos. • • • • • • • • • • Los mohos tienen las siguientes características: Son eucariontes, presentan un núcleo rodeado de membrana No contienen clorofila Se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza Los filamentos se llaman hifas y al conjunto de hifas se le llama micelio El interior de la hifa puede estar septada o no Son inmóviles, aunque existen esporas móviles La mayoría son esporulados La espora se forma por la fusión de los núcleos de dos células Si las esporas asexuales están contenidas en un saco, este recibe el nombre de esporangio, a la hifa que lo sostiene, esporangióforo, y a las esporas esporangiosporas. Si se forma fuera de un saco, se les designa conidiosporas. Las esporas sexuales que se forman dentro de un saco (ascas) se denominan ascosporas Muestran requerimientos nutricionales mínimos y su pH es cercano a 5,6 Los límites de temperatura para su desarrollo es de -6 > 70° Se multiplican abundantemente a humedades elevadas La mayoría de los mohos son aeróbicos Son heterótrofos, pero crece bien en cultivos simples Algunos son termodúricos Algunos producen micotoxinas • • • • • • • • Las levaduras se distinguen de los mohos en que son unicelulares, no suelen formar filamentos y se reproducen por fisión binaria o gemación. Generalmente son de forma ovalada La identificación de los mohos, unicelulares o filamentosos se realiza a través de: • • Morfología colonial Microcultivo 68 • • • • • • • Morfología microscópica Pruebas metabólicas (levaduras) Composición de la pared celular Respiración Nutrición Reproducción Genética molecular. Morfología colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscila entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de bordes lisos. Morfología colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares. Morfología microscópica: La morfología microscópica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte mediante la realización del microcultivo, observándose las siguientes estructuras: 1.- Según su nivel de organización celular pueden ser: Unicelulares (levaduras) Pluricelulares (mohos) Dimórficos (posee ambos tipos de micelio) Fig. 71 a.- Unicelular Por su tamaño b.- Pluricelular Fig. 71 Macroscópicos Microscópicos 69 Por su forma Fig. 72 Amorfos (masa algodonosa) Definida (crecimiento circular) Fig. 73 Por su ausencia o presencia de septos Aéreo fuera del sustrato Profundos dentro del sustrato 70 aterciopelados. por una estructura llamada esporangióforo. terrosos.Fig. que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo. Blastospora: Se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula ya preexistente. Por su función: Micelio vegetativo: se encarga de la captación de nutrientes. c) Su sistema de reproducción es asexual y sexual: Las esporas asexuales son: Talosporas. Esporangiosporas Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios. 74 Por su localización Por su aspecto Algodonoso. Ascosporas: esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes. Las esporas sexuales son: Zigosporas: esporas contenidas en cigosporangios en los Zimomycetes. seco. Micelio aéreo o reproductor: producción de esporas (sexual y asexual) b) De acuerdo al color de las hifas: Hialino: cuando no está pigmentado. Basidiosporas: esporas contenidas en basidios correspondientes en Basidiomicetes. Conidiosporas a) b) Microconidias: Son esporas unicelulares Macroconidias: Son esporas multinucleadas. a) b) c) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentación de las hifas. Oosporas: esporas contenidas en oosferas correspondientes a los Oomycetes. Morfología colonial de mohos y levaduras 71 . húmedo. Clamidospora: Estas esporas son redondas y tienen doble pared gruesa que les confieren resistencia. Dematiáceo: cuando posee color café oscuro. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri (previamente esterilizada). producción de pigmento difusible y anotar los días de incubación. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE MOHOS. aspecto. Determinar: Tamaño. color. Fig. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril y caliente.76 Forma en que se cortan los cuadros de agar par el microcultivo 2.Fig. A continuación se muestran dibujos de mohos filamentosos. Una vez realizada las observaciones las cepas se pueden sembrar en tubo para su conservación o para la realización del microcultivo Sembrar por punto en tubos con PDA y ADS Fig. 75 Conservación de cepas de mohos. 72 . IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO) 1. forma. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio. REALIZAR OBSERVACIONES MÍNIMO CADA 12 h PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTÍFEROS. Adicionar 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15 minutos. 78 Inoculación del cubo de agar.Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar 3. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar. Fig. 1. retirar el glicerol con una pipeta Pasteur. Tomar con el asa él inoculo del moho previamente seleccionado. Fig. Incubar la caja a 28° C durante 48 h. 5. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri. 7. 73 . Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar. 4. y colocación del glicerol para mantener la huemdad 6. 79 Observación del crecimiento del hongo y retiro del glicero para su inactivación 2. Fig. 80.- Inactivación del moho 3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente. 4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón, colocar un cubreobjetos sobre el colorante y sellar la preparación. Observar las preparaciones a 10X y 40X. Fig. 81.- Realización de la preparación en fresco del microcultivo 5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía realizar la comparación de las estructuras reproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por ejemplo: Rizopus sp Fig. 82 Aspergillus Penicillium Alternaria 74 Fig. 83 Rhizopus sp OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LEVADURAS Para la identificación de levaduras utilizamos generalmente reacciones de fermentación de carbohidratos. Observar las levaduras que pueden aparecer sobre la superficie o en el seno del agar. En el primer caso son circulares y de diámetro mayor al de las bacterias; en el seno del agar suelen aparecer estrelladas y algo más pequeñas, son de aspecto húmedo y pueden ser coloridas. Fig. 84 Crecimiento de levaduras OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS. 1. De una placa de PDA incubada a 35°C seleccionar una colonia de levadura. 2. Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria. 3. Teñir la preparación con cristal violeta, lavar y dejar escurrir. 4. Observar la preparación en 10X y 40X y dibujar. 75 Fig. 85 Observación microscópica de levaduras 76 . a) Conservación por congelación. teniéndose varios métodos para su conservación pero es necesario tomar en cuenta las características del microorganismos. en algunos pleomórficos e incluso en algunos más sencillos. Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son: Que el cultivo a conservar sea puro. Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay programas de congelación bien estandarizados para determinados casos o circunstancias. A. por lo que para descongelar conviene poner las células a 37ºC.- 77 . pues sucede que nuestras cepas tipo pueden en un momento sufrir las siguientes daños como la deshidratación. se recuperan subiendo la temperatura. métodos alternativos y métodos restringidos.Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento. al no disponer las células de agua en forma líquida. pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas. que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo. Fig. no hay crecimiento. evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación. De esta forma. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método preparatorio en si mismo. 2º. y este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación para los microorganismos. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método son los siguientes: 1º. por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados. es preferible alcanzar este estado. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas. tanto para la congelación como para la descongelación. Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células. Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas. pero el tercero puede presentar dificultades. pero éstas no han muerto. en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas. y Que estas células permanezcan genéticamente estables. cambios genéticos o perdida de la viabilidad y finalmente la muerte celular. Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica. con lo que el agua se congela.Métodos de elección o de conservación a largo plazo. los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método. 91 Deshidratación del medio en tubo con tapón de algodón.Métodos de conservación de cepas En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que conservar. pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización. pero a veces no tanto como en la congelación.- Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método. no son aconsejables. Sin embargo. primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío.- Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. como por ejemplo el glicerol. Respecto a los crioprotectores. su punto de congelación baja. la primera sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. sumergidos en nitrógeno líquido. y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células microbianas. En su elección influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar. ya que al estar las células en una superficie hay un mayor contacto con el oxígeno y puede afectarse la viabilidad. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Este método no se debe emplear para la conservación de microorganismos anaerobios. este es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas. a los que habrá que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados. El daño que se produce en las células es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. como por ejemplo el género bacteriano Clostridium. lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasión. 78 . Por lo tanto. la leche descremada y carbohidratos como glucosa. las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente). Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores. La congelación puede hacerse rápida o lentamente. como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas. Con ello la estabilidad genética es alta. ya vimos que se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo. Por lo tanto. puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilización. pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. con una temperatura de –140ºC. que tiene una temperatura de –195ºC. porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. a una concentración del 15 al 20%. especialmente los no esporulados. lactosa. Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación. para la liofilización se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos. Si se añade un crioprotector no iónico. Sin embargo. antes de pasar a explicar éstos. pero el que se utiliza con más frecuencia es el glicerol. b). con lo cual su envío es muy cómodo. que contengan las células microbianas. Algunos mohos filamentosos. entre otras cosas porque debido a la gran concentración de solutos que existen en la suspensión celular. debido a su elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad. Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilización son lógicamente los mismos que influyen en la congelación. 4º. Para la conservación en congeladores. pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores.3º. Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación son: 1. que es un proceso suave. o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido. sacarosa o inositol. Conservación por liofilización. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentración iónica. pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol. Aquellos congeladores que sólo alcanzan temperaturas entre –20ºC y –40ºC. porque es algo tóxico. no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros métodos. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. como ocurre con la mayoría. mezclas de glucosa con caldo hígado o chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias. pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC). Tipo de microorganismo. tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la congelación. También se pueden utilizar el dimetilsulfóxido.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo más baja posible. que provoca que los liófilos queden muy viscosos. sin que haya necesidad de subir la temperatura. y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características.Métodos alternativos. estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo. tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo. Debe ser lo más baja posible. puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones. la suspensión se hace en agua de mar diluida. y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC. provocando el envejecimiento y muerte celular. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en el caso de bacterias y levaduras. Para demostrar la eficiencia de un método en nuestras cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidad en diferentes periodos. Condiciones de almacenamiento. Debe ser lo más alto posible. Para los mohos filamentosos que no esporulan. Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos. como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum. La temperatura debe ser constante. Rhodospirillum. B. ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos. pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación. Las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar. como el oxígeno que puede dañar a las células. sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos. aunque la concentración de solutos puede conllevar una pequeña cantidad de agua remanente que no es perjudicial. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de 108-109 células /ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de mohos filamentosos y levaduras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inoculo. En el caso de microorganismos marinos.. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios. Concentración celular. Los liófilos se deben guardar en la oscuridad. o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos. La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. b). Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. preferentemente a 18ºC y sin bajar de los 0ºC.. 4. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo. porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan. por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección. etc. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. 3. sin subir por encima de –50ºC. 5. 6. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar.Métodos restringidos. a).. Atmósfera de oxígeno en el tubo. Grado de deshidratación alcanzado. determinar la estabilidad morfológica y fisiológica. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo. como por ejemplo los mohos filamentosos. En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente. tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. bien por carecer de los equipos necesarios. bioquímica y la virulencia. C. inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos. 79 .2.Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. Por último. Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética.Conservación por transferencia periódica. Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos. Los cuatro métodos que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células. rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo. Sin embargo. que podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Temperatura durante la sublimación. no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente.Desecación en suelo. etc.- Desecación en papel de filtro. pero sin que haya habido congelación previa de las células. pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible. Este es un método que se está utilizando incluso para la conservación de algas y células vegetales. Debido a la higroscopicidad de la sal. Fig. También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador. este método es barato y de fácil conservación. 93 Conservación de esporas en aceite mineral y arena estéril Desecación en bolitas de alginato. El vacío producido por el liofilizador deseca las células. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método. 92 Deshidratación del medio para generación de esporas en mohos Fig. Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). b). Éste es un procedimiento bastante eficaz. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC. c).Desecación en sal para halobacterias. 80 . arena. pero hay que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado. silicagel. pudiéndose guardar incluso a –80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. la desecación no es total. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua.a). ocasionando la congelación incontrolada de las células. cuando éstas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas.Por último. CULTIVO EN TUBO INCLINADO PARA CONSERVACIÓN DE CEPAS POR REFRIGERACIÓN 1. La mayoría de microorganismos de interés sanitario pueden conservarse a largo plazo con los métodos generales de congelación y/o liofilización. o será necesario tomar precauciones especiales en su conservación. (El aceite se puede esterilizar en autoclave o en el horno) 3. etiquetar el tubo perfectamente. colocarlo dentro de un bote y guardarlo en el refrigerador. Como ya dijimos al comienzo.. es decir.. cultivándolas en medios selectivos cuando sea necesario.. 95 Una de las formas más usuales de conservar las cepas es en congelación 81 . cada microorganismo soportará determinados métodos de conservación mejor que otros. se recomienda no utilizar directamente las células que se han estado guardando.Tomar un tubo con agar de soya y tripticaseína y sembrarlo por estría simple 2. y a modo de resumen.. 94. Fig.Adicionarle 3 ml de aceite mineral estéril.Diferentes formas de conservación de cepas Fig. y para periodos cortos pueden mantenerse vivos. no existe un método general de conservación de los microorganismos. aunque no resulta difícil determinar el más aconsejable en cada caso.Cerrar el tubo con el tapón. unas consideraciones finales. porque éstas vienen de una situación de estress más o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilización) y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de prueba. un medio que asegure lo más posible el crecimiento. Cualquiera que haya sido el método empleado en la conservación de las cepas microbianas. y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas. Igualmente hemos de tener presente que. Primero habría que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrándolas en un medio no selectivo. dada la enorme diversidad microbiana. lactosa. etc. salicina. pues existen algunas marchas ya descritas las cuales nos son de gran valor para la Identificación. además haremos una tinción de Gram para determinar el grupo al que pertenece. Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad. ramnosa. adonitol. producción de ácido sulfhídrico y producción de gas) LIA ( Descarboxilación de la lisina) MIO (movilidad. Una vez conocido el Gram podremos realizar la Identificación del microorganismo y para ello es necesario elegir las más adecuadas acorde a lo que tenemos y a lo que nos sugiere la bibliografía. ramnosa. Los siguientes pruebas de Identificación para bacterias están agrupados por bacterias Gram (-) y +). PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Fermentación de carbohidratos (glucosa. sacarosa. sorbitol. a estas les realizaremos la morfología colonial previamente revisada.) TSI (fermentación de glucosa. salicina. aunque es posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario. rafinosa. etc. La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias. sacarosa.PRUEBAS BIOQUÍMICAS Aislamiento Una vez transcurrido el tiempo de incubación del cultivo. dulcitol. selectivo o diferencial. observamos la placa de Petri. producción de ácido sulfhídrico) Catalasa 82 . escogeremos las colonias que estén separadas. rafinosa. lactosa. xilosa. sorbitol. manitol. Descarboxilación de la ornitina y la producción de indol) SIM (movilidad. dulcitol. producción de ácido sulfhídrico) Rojo de metilo Producción de urea Reacción de Voges Proskauer Utilización de Malonato Utilización del citrato Licuefacción de la gelatina Crecimiento en caldo nutritivo Utilización de la esculina Utilización del gluconato Requerimientos de oxígeno Catalasa Oxidasa Reducción de nitratos Fermentación O/F PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Fermentación de carbohidratos (glucosa. manitol. adonitol. por medio de las cuales podemos identificarlas hasta especie.) TSI (fermentación de glucosa. producción de ácido sulfhídrico y producción de gas) LIA ( Descarboxilación de la lisina) MIO (movilidad.85 p/v para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas. xilosa. es realizando un subcultivo de la colonia pura. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 ml de solución salina fisiológica 0. .Proskauer Prueba de la fosfatas Prueba de la DNAsa Incubación a 10 y 45 °C Reducción con azul de metileno Hidrólisis del hipurato Formación de cápsula Hidrólisis del almidón Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura para hacer una selección de pruebas recomendable y lograr el objetivo lo más rápido posible y sin perdida de tiempo y de pruebas.HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN Fundamento. Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.En una caja con agra almidón se procede a inocular por estrías simple la placa b..Negativo....Incubar la caja a 35°C durante 24 h. UTILIZACIÓN DE CARBOHIDRATOS 1.FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL 83 . 10 y 15 % Crecimiento en bilis al 40 % Coagulasa Licuefacción del a gelatina Hidrólisis de la esculina Voges . a.Después de la incubación añadir unas gotas de lugol cubriendo la superficie de la placa. Fig. las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.. 96 Siembra en agar almidón y realización de la prueba con lugol 2. c.Oxidasa Reducción de nitratos Hemólisis Crecimiento en NaCl al 5. . RESULTADOS: + Positivo.No se forma un halo claro alrededor de la estría..Si se forma un halo claro alrededor de la estría. Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18. Fundamento: Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa.Negativo. Indicador de pH: rojo de fenol pH ácido: Color amarillo 84 .Si hay cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham . el agar esta preparado en pico de flauta.Al tubo con campana de Durham y caldo rojo de fenol más el carbohidrato por ejemplo sacarosa.Observar el tubo RESULTADOS: + Positivo. para esto hay que utilizar el asa recta... La formula del TSI y del KIA son idénticas.Si hay no cambio de color de rojo a amarillo y formación de gas en la campana de Durham Fig. El tiempo de incubación es de 24 h a. salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de glucosa y lactosa (triple azúcar).FERMENTACIÓN DE AZUCARES EN MEDIO TSI.. la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática.Incubar a 35 °C de 24 a 48 horas c. b. es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es relativamente anaerobia.. sacarosa y lactosa además de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con el hierro. Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro (TSI). 97 Fermentación de un azúcar con campana de Durham 3.1 ml de la suspensión microbiana. de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio.. de tal manera que se tienen 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo. a fin de conservar este efecto de las dos cámaras.. además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno.24 h. produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham. primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. inocular 0. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta. La porción inclinada. “pico de flauta” expuesta en toda su superficie al oxígeno. el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol por lo que: Indicador de pH: rojo de fenol pH ácido: Color amarillo pH alcalino: Color rojo Prueba positiva: da una coloración amarilla y con la producción de gas (aerogénica) Prueba negativa el color se mantiene de color rosa-rojiza. para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta. Producción de CO2 y H2: Burbujas. 4 K/A sin producción de gas y H2S negativo. 6K/A con producción de H2S y sin producción de gas. ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio del fondo dejando un espacio libre. a. 3 A/A sin producción de gas. 5: K/A con producción de gas y H2S positivo y móvil y Tubo 6: A/K 85 .pH alcalino: Color rojo RESULTADOS: Prueba positiva: La fermentación de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis.. sin cambio.Inocular con el asa recta por picadura y después por estría abierta en forma de “S” sobre el pico de flauta en un tubo con agar TSI a partir de la suspensión.. Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla Sacarosa y lactosa negativas: superficie roja Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta. b. 5 A/A y H2S positivo sin producción de gas. Fig 99 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: A/A sin producción de gas y H2S negativo. 2: K/K y H2S negativo sin producción de gas. Lactosa negativo: De color rojo en el pico de flauta.Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar los cambios en el tubo.. por lo cual la prueba se lee en el fondo del tubo. Producción de H2S: Presencia de una coloración negra. 3 K/K sin producción de gas y H2S negativo e inmóvil . Fig 98 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: Tubo sin inocular2. 4 K/A con producción de gas y H2S negativo.A/A con producción de gas. Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo Glucosa negativa: Fondo alcalino. .PRUEBA DE ROJO DE METILO Fundamento: El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4. Dado que existen muchos microorganismos que producen ácidos.Inocular con 0.Después de la incubación.PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER Fundamento: La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo por acción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico. añadir al tubo 2 gotas de la solución de rojo de metilo y observar. RESULTADOS: Prueba positiva: El cultivo cambia a color rojo. colocando 4 ml del medio de RM – VP y se inocula con el cultivo puro del organismo en estudio.. sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h).Incubar el tubo a 35°C durante 48 h.. esta prueba es cualitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico.naftol actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo. añadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo. en todo el tubo. contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. o fórmico a partir de la glucosa.4. 100 Resultados del medio rojo de metilo 5. b. Controles Prueba Rojo de metilo Control negativo Escherichia coli Control positivo Enterobacter aerogenes a.. Indicador de pH: Rojo de metilo 86 . por la vía de la fermentación mixta.4 (rojo). acético. Prueba negativa: El cultivo no cambia de color.1 ml de la suspensión al caldo rojo de metilo. Indicador de pH: Rojo de metilo Rojo de metilo positivo: Color rojo estable en la superficie del medio que indica la producción de ácido suficiente como para bajar el pH a 4.4. La preparación de este medio se hace en tubos de 13 X 100. c. finalizando este período. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 – 72 h (no menos de 48 h.. Rojo de metilo negativo: dado que algunos microorganismos produzcan cantidades menores de ácido puede producirse un color entre el amarillo y rojo lo que indicara que la prueba es negativa. la acetoína se convierte en diacetilo el α . Fig. . Klebsiella. Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. c. a. junto con la eliminación del citrato (ácido)..Observar los resultados RESULTADOS: Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter.Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h.Prueba Voges .Incubar el tubo a 35°C durante 24 h. 101. tubo 2 positivo y tubo 3 medio sin inocular UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS 6. Shigella. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que. Fig.Después de incubar. RESULTADOS: Prueba positiva: Color rojo ladrillo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetoina) Prueba negativa: No hay cambio en el color del medio.-CITRATO DE SIMMONS Fundamento Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo. b. dejar en reposo 10-15 minutos y observar los cambios en el medio.Resultado de la prueba de VP. c.. de verde a azul. Controles Control positivo: Enterobacter aerogenes Control negativo. 87 . Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Escherichia. provocando una alcalinización del medio. generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH. agregar 6 gotas de solución de alfa-naftol y 2 gotas de solución de KOH.Proskauer Control negativo Escherichia coli Control positivo Klebsiella sp a.1 ml de la suspensión b. Serratia. Escherichia coli. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons.Inocular por estría abierta en forma de “S” un tubo que contenga agar Citrato de Simmons a partir de la suspensión.Inocular un tubo que contenga caldo Voges Proskauer con 0.. Negativa: No hay desarrollo (medio de color verde).. en ese orden estricto y agitar suavemente. Sin embargo. tubo 1 negativo. 103.Fig. el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal. el ácido succínico. 102 Prueba del citrato de Simmons 7. como el ácido fumárico. el ciclo de Krebs deja de funcionar. El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico. entonces. En el ciclo de Krebs. Fig. Si se ha suprimido la formación de un ácido. y no es reemplazado.. mediante un proceso de inhibición competitiva.Prueba negativa y prueba positiva 88 . recurre al ciclo del ácido glioxílico para la producción de intermediarios. cada compuesto ácido es influido independientemente por enzimas específicas. inhibiendo la acción catalítica de la enzima succínico deshidrogenasa. Esto ocasiona un bloqueo en la oxidación del ácido succínico Según la concentración del malonato. se consume una molécula y se forma otra en un proceso por etapas..Inocular con 0.1 ml de la suspensión microbiana un tubo que contenga caldo malonato b.. RESULTADOS: Positivo: Desarrollo abundante. por lo tanto la célula bacteriana. con la consiguiente alcalinidad. cambio de color verde a azul intenso Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color. para ulterior biosíntesis en el metabolismo continuo de esa manera poder regular la cantidad de acetil coenzima A introducida en el ciclo.-CALDO MALONATO Fundamento Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono. Indicador de pH: Azul de bromotimol Controles Prueba Caldo malonato Control negativo Salmonella sp Control positivo Alcaligenes faecalis a.Incubar el tubo a 35°C durante 24 h y observar. .Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h. Negativa: Sin cambio de color en el medio Fig. El catabolismo de las proteínas por las gelatinazas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (método del tubo) Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que. Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños.8. gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. Estas enzimas que son capaces de gelatinólisis.. Controles Prueba Ureasa Control positivo débil Control positivo rápido Klebsiella sp Proteus sp Control negativo Escherichia coli a.Hidrólisis por producción de ureasa Positiva: Color rosa fucsia en el medio. 104 Prueba negativa y prueba positiva HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS: 9.. Indicador de pH: Rojo de fenol.. Inocular un tubo con caldo urea con una asada de la suspensión microbiana a estudiar. las enzimas exocelulares de tipo proteolítico.Inocular 0. La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea que esta presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco reaccionan en solución para formar carbonato de amonio. RESULTADOS . Listeria monocytogenes a. produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio. a su vez son detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente.Inocular por picadura un tubo que contenga gelatina nutritiva a partir de la suspensión 89 . si se utiliza agar urea se estría la superficie del medio e incubar el medio a 35 ° C durante 24 h. se denominan gelatinazas. CALDO UREA Fundamento La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de amoníaco y dióxido de carbono. Controles Control positivo: Staphylococcus aureus Control negativo.1 ml de la suspensión microbiana a un tubo que contenga caldo urea b. . Cada tubo debe de contener 4 ml del medio utilizando 90 ..Incubar a 35 °C durante 24 h c. Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro.Inocular por picadura con el asa recta un tubo con medio SIM a partir de la suspensión b.. Fig.106Tubo 1 SIM äcido sulhidrico positivo y movilidad (+). c.. tubo dos Indol negativo. Tubo 3 microorganismo inmóvil.. Descartar la prueba negativa hasta los 14 días Fig. 105 Tubo de arriba negativo y el de abajo positivo 10.MEDIO MIO Fundamento Es un medio semisólido. producción de Indol y descarboxilación de la ornitina. en el caso de que la prueba sea negativa hay que volver a incubar.Después de incubar observar el tubo. tubo 5 äcido sulfhídrico (+) e indol (-) y tubo 6 H2S (-).En cada revisión de la prueba sacar de la incubadora y colocar el tubo en el refrigerador por cinco minutos junto con el testigo para verificar el resultado d.. Sirve para leer la movilidad. e indol (+) 11. tubo 4 tubo sin inocular. Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.MEDIO SIM a.. RESULTADOS: Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.. se siembra por picadura y se incuba 24 h a 35 °C.Incubar a 35 °C durante 24 h..Observar si hay licuefacción de la gelatina. una coloración negra indica la formación de ácido sulfhídrico y posteriormente añadir 3 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich al tubo para observar la presencia o ausencia de indol.b. Incubar a 35 ºC durante 24 h y observar si hay descarboxilación de la ornitina c. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: indol. la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad. con la siguiente alcalinidad del medio. 91 . Control Sustancia Indol Movilidad Descarboxilación de la ornitina Control positivo Escherichia coli Enterobacter sp Enterobacter cloacae Control negativo Klebsiella pneumoniae Klebsiella sp Klebsiella sp a. La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es irreversible. La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina. La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la molécula de triptófano. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto se denomina “triptofanasa ” . el fosfato de piridoxal. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina.Después de observar adicionar 3 gotas del reactivo de Kovac´s y observar la presencia de indol. por lo tanto la prueba solo se lee en el fondo del tubo. escatol e indolacético. RESULTADOS pH ácido: vire de color a amarillo (Desaminación) pH alcalino: vire del color a púrpura o morado (descarboxilación) Movilidad positiva: El medio se enturbia y se ve crecimiento en todo el tubo Movilidad negativa: El crecimiento es sólo a lo largo de la picadura.. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol. Indol positivo: Anillo de color rojo Indol negativo: Anillo incoloro o café. Descarboxilación de la Ornitina negativa: Fondo del tubo amarillo. Para esta prueba también se puede inocular la muestra en caldo triptosa o nutritivo incorporado con triptófano al 1 %.Inocular por picadura un tubo con medio MIO a partir de la suspensión. b. no oxidativo y requiere de una coenzima común. La descarboxilación de la ornitina se lleva a cabo en condiciones anaeróbicas. El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhídrido carbónico. la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa..tubos de vidrio de 13 X 100 mm con tapón de rosca para evitar la entrada de aire y el medio se deja solidificar en forma vertical... Para llevar a cabo la prueba del indol se adiciona a el medio 5 gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovac´s y se deja durante unos 2 minutos. Descarboxilación de la Ornitina positiva: El fondo del tubo debe alcalinizarse y presentar un color púrpura o morado. . Fundamento: En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la Desaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico.Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h y observar RESULTADOS: . b. a fin de conservar este efecto de las dos cámaras.24 h.. El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina cadaverina y anhídrido carbónico..DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. 107 Medio MIO con producción de indol + y 12. cada uno. La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina. el fosfato de piridoxal. Al Preparar el medio es importante que se deje solidificar en pico de flauta.. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es irreversible. no oxidativo y requiere de una coenzima común.Desaminación de aminoácidos: Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.Inocular por picadura y estría un tubo con medio LIA a partir de la suspensión. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol. Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo 92 . Los tubos inoculados se incuban a 35 ºC durante 18. primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. para esto hay que utilizar el asa recta. Controles: Aminoácido Descarboxilación de la Lisina Desaminación de la Lisina Control positivo Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Control negativo Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes a. ..Descarboxilación de aminoácidos: Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura. con la siguiente alcalinidad del medio. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta. para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Negativa: La superficie no tiene cambios. la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa . que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm.Fig. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 segundos de añadir los reactivos y dado que los reactivos solo detectan nitritos. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo α .α . 109 Prueba positiva y prueba negativa 93 . excepto ciertos biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos...Después de incubar. 108 Prueba de LIA DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO 13. por lo tanto es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos.REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS Fundamentos La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para la identificación y diferenciación de muchas especies. Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción.naftilamina.. determinar la presencia de nitritos. y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera. Fig.Reducción de nitratos a nitratos Positiva: Aparición de un color rojo en 30 s Negativa: Sin cambio de color.Inocular 0.Fig. este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa. añadiendo al tubo 3 gotas de alfa-naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico. todas las enterobacterias.naftilamina y ácido sulfanílico. Los iones Zn reducen los nitratos a nitritos.1 ml de la suspensión a un tubo con caldo nitrato b. Controles: Prueba Reducción de nitratos Control positivo Escherichia coli Control negativo Acinetobacter calcoaceticus a. Observar si hay cambios de color en el medio: Anotar las observaciones RESULTADOS: . con la formación de un color rojo de diazonio. Indicador de pH: No tiene indicador. p – sulfobenceno – azo . ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden no producir cambios de color durante varios días. Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente: a. La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o más. Este medio es también apto para determinar la movilidad de un microorganismo. En cambio. que se pueden detectar en un medio de fermentación convencional. a partir de la suspensión. Tipo de metabolismo Oxidativo Fermentativo No sacarolítico Controles Prueba OF Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa Escherichia coli No sacarolítico Tubo abierto Ácido – amarillo Ácido – amarillo Alcalino .. el asa debe ser introducida hasta llegar casi al fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida.verde Tubo cubierto Alcalino – verde Ácido – amarillo Alcalino – verde Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp a. facilitando la visualización del viraje del indicador de pH.La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1. a un tubo se le agrega 0. los subproductos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes.4 ml de aceite mineral. c. La prueba OF presenta limitaciones.La concentración de agar está disminuida de 1.14.Incubar a 35 °C y observar a las 24 h y anotar el color del tubo después de la incubación y comparar con el siguiente cuadro: Color del tubo Tubo con sello Tubo sin sello Tipo de Metabolismo de aceite de aceite + + + Fermentativo Oxidativo Amarillo Amarillo 94 ..5 al 0. como el medio OF. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical. y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles. La concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido. b. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se difundan por todo el medio.5 % al 1 %. dejando el otro tubo abierto al aire.. Interpretación. se inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar.. los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación mas sensible.5 a 0..DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO DE HUGH Y LEIFSON Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente. b.25.. confundiendo así la interpretación final.Inocular por picadura dos tubos con medio de Hugh Leifson. Indicador de pH: Púrpura de bromocresol.2 %. con lo cual su consistencia es semisólida.La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0. observar si hay crecimiento o no en el medio. con formación de agua.. Controles Control positivo: Klebsiella Control negativo.Verde + + No asimila glucosa Fig. transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno. al aceptor de hidrógeno final. 110’Metabolismo oxidativo y metabolismo fermentativo 15. Escherichia col. durante 24 a 48 h b. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación – reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado. El sistema citocromo 95 . 111 Crecimiento en KCN 16.Inocular por asada un tubo con caldo cianuro de potasio (KCN) a partir de la suspensión e incubar a 35 °C..PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA Fundamento Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria. a. el mismo trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones.Después de incubar.. según la especie bacteriana y su sistema enzimático. RESULTADOS: Positiva: Presencia de crecimiento (turbidez) Negativa: Ausencia de crecimiento (medio claro) Fig. el oxígeno molecular.PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO Fundamento: Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio.. que actúa como aceptor final de electrones.oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos. Se recomienda no emplear alambres de acero inoxidable. Controles: Prueba Citocromo oxidasa Control positivo Pseudomonas aeruginosa Control negativo Escherichia coli a.PRODUCCIÓN DE CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. pero en presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol. Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+.Tomar una asada del cultivo de TSI y frotarla en el papel y observar.. La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son: 1. Originariamente. en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que se han desarrollado en la placa. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas) Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina. de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. 112 Prueba de oxidas positiva y negativa 17. 2. RESULTADOS: Positiva: Color azul violeta. sustituyendo al oxígeno.N-tetrametil-p-fenilendiamina). La principal excepción es Streptococcus. 3.haemolyticum. ambos -) de Erysipelothrix (-) Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas: Método del portaobjetos (recomendado): 96 . Bacillus (+) de Clostridium (-).Impregnar un pedazo de papel filtro con el reactivo de oxidasa (N. En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros: • • • Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+)...N..Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos. b. en la que se añaden unas gotas del reactivo y.N. Negativa: No hay cambio de color. la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido..La técnica indirecta en tiras de papel filtro. Fig..La técnica directa en placas.pyogenes y C. dado que los productos de la oxidación de la superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas. con las excepciones de C. se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo Fundamento. Fig. químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina. Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno. negativa y positiva de la enzima peroxidas 97 . 113 Prueba positiva. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.• • • • • Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Streptococcus sp RESULTADOS: Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno. Controles Control positivo: Staphylococcus aureus Control negativo. Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre. La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Determinar la presencia de la enzima catalasa. Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Después de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse. son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. MANEJO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS En el análisis microbiológico de alimentos. bajo condiciones específicas de procesamiento. muestra que queda en poder del interesado y en disposición de la autoridad competente. conserva las características sanitarias que debe de reunir para su consumo. 4. 2. Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado. tiempo comprendido entre la recolección de la muestra. su vida útil es de hasta 30 días.. esto no es representativo del lote y el resultado final puede ser erróneo. la adecuada selección de la muestra. si existe alguna duda sobre la veracidad de estos.PROCEDIMIENTO PARA MICROBIOLÓGICO LA TOMA. los medios de conservación y su transporte al laboratorio. Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los alimentos perecederos.. Si la muestra esta recolectada en forma impropia.Toma de muestra. Esto es especialmente cierto en los alimentos perecederos... forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio. Sin embargo los alimentos. la toma correcta.. Una muestra representativa es esencial cuando se buscan microorganismos patógenos o toxinas. ya que la población microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos. grupo de alimentos que por su naturaleza biológica y físico-química.Muestra representativa. que han sido seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote del que procede. es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida. PARÁMETROS QUE PUEDEN AFECTAR EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO a. Si los microorganismos continúan su metabolismo y aumentan el pH el número puede disminuir VOCABULARIO 1. SIGNIFICADO SANITARIO La adecuada toma de muestra para el análisis es de primordial importancia.. 6.. 7. Si no es la adecuada el número de microorganismos se eleva o disminuye según la temperatura a la que se transporte o almacene. es un número de unidades tomadas de un lote. ya que para. La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa. lo que da como consecuencia que la Secretaría de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio que ésta señale en presencia dé las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Las condiciones de conservación y transporte. 98 .Tiempo de transportación.. así como la realización del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos.Asépticamente.Temperatura.Productos perecederos. la naturaleza de las muestras y la cantidad. pueden sufrir cambios significativos en sus características biológicas y/o fisicoquímicas. c. almacenado en las condiciones sugeridas por el fabricante. su entrega al laboratorio. la cual debe ostentarse en su etiqueta o envase. fines oficiales la Ley General de Salud señala claramente que después de la notificación de los resultados del análisis practicado. el tamaño o el volumen.Fecha de caducidad. fecha limite en que se considera que un producto. el particular puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley. 5. es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidad sanitaria aceptable para su consumo. en lo posible.. dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad.pH.Vida útil o vida de anaquel. Si es muy largo y no se mantiene en condiciones adecuadas el número de microorganismos puede aumentar o disminuir. envasado y almacenamiento.. Esto implica precisar el objetivo del estudio. tanto ambiental como humana para asegurar la integridad de la misma. a fin de que el laboratorio lo tome en consideración. aún en condiciones apropiadas de conservación.Muestra testigo. provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes. serán representativos del producto y del lote o partida de donde provienen. b. 3. se indica el tamaño mínimo de muestra que se debe tomar. botes. No.5 l 0. legumbres 1 kg ó 5 Un 2 Un o 500 g 2 Un ó 200 2 Un o 200 g g 1 Un o .5 l 0. no pasteurizada Leche ultrapasteurizada Leche evaporada Leche condensada azucarada Leche deshidratada Leche rehidratada Quesos Mantequilla Grasa butírica Sueros Crema Yogurt Jocoque Cajeta Flan Helado Leche reconstituida Cremas vegetales Imitación de quesos Helado de crema vegetal Carne Productos de carne Aves Productos de la pesca (pescados y mariscos) Productos industrializados de la pesca Productos derivados de la pesca Huevo Huevo y sus derivados Aceite comestible Manteca de cerdo Sebo Manteca vegetal Grasas compuestas Aditivos para alimentos frescas procesadas 1l 1 kg 1l 1l 1 Un * * * 250 g 250 g * * * * * * * * * * * 250 g Pieza completa 1l 1 kg 1l 1l 2 Un 1 Un 250 g * 250 g 250 g 250 g 250 g 250 g 500 g 250 g 1l 250 g 250 g 250 g 1 kg 250 g 1l 1 kg 2l 2l 2l 2 Un 2 kg 2 UN o 2l 1kg Radioactivo 1 kg 1 kg 1 kg 2 kg 1 kg 1 kg 2l 2l Biológico 500g 1 kg 1 kg 1 kg Biológico 250 g 250 g 500 g 1 kg 500 g 0. fisicoquímicos y algunas veces biológicos.5 l 1 Un o . Producto Cantidad mínima Básico 2 Un o 2 l 2 Un o 2 g 2 Un 2 l 2 Un 2 l 2 Un o 25 g 3 Un o 250 g 2 Un o 500 g 2 Un o 2 l 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 250 g 3 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 2 l 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 1 kg 2 Un o 250 g 1 Un o 250 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 4 Un o 200 g 4 Un o 200 g Microbiológico Fisicoquímicos Cantidad adicional especial Metales pesados Plaguicidas Otros 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Agua purificada Hielo Leche pasteurizada. kilogramos (kg) o litros (l).MUESTREO Y ALMACENAMIENTO En la siguiente tabla se enlistan los productos competencia del control Sanitario de Bienes y Servicios. cajas. hortalizas. etc. latas.5 l 500 g 2 kg 500g 500 g 500 g 500 g 500 g 1 Un o 1 l 1 Un o 1l 1 Un o 1 l 1 Un o 1 l 1 Un o 1 kg 200 g Frutas. así como el tamaño mínimo de muestra necesario para la realización de un análisis básicos y especiales.5 l 1 Un o . Según sea la presentación comercial del producto). Nivel de análisis y mínimo tamaño de la muestra para su entrega al laboratorio. Para el análisis básico que comprende microbiológicos. como en masa o volumen: gramos (g).5 l 0.5 l 500 g 500 g 250 g * * 250 g Fórmulas para lactantes Alimentos envasados para 2 Un o 500 g lactantes y niños de corta edad 99 . tanto en unidades (frascos.5 l 1 Un o . 3 Un ó 200 g n 2 Un o 50 – 100 ml. 3 Un ó 200 g 2 Un o 50 – 100 ml.40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 Alimentos a base de cereales para lactantes Cacao y sus derivados Cocoa Café y sus derivados Café tostado Té y sus derivados Productos para infusiones Bebidas no alcohólicas Productos para regímenes especiales Productos para preparar bebidas no alcohólicas y refrescos Bebidas no alcohólicas congeladas Cereales Harinas de cereales Harina de leguminosas secas y sus derivados Productos de harina de cereales Productos amiláceos y frituras Edulcolorantes nutritivos Gelatinas y sustitutos Golosinas Condimentos Sal Aderezos Conservas y enlatados ácidos Alimentos preparados deshidratados Conservas y enlatados de baja acidez Alimentos preparados refrigerados o congelados Bebidas alcohólicas Bebidas alcohólicas fermentados Bebidas destiladas Licores 2 Un o 500 g 250 g 250 g 250 g 250 g 500 g 500 g 5 Un 5 Un * * * * 500 g 500 g 500 g 500 g 500 g 500 g 3 Un 3 Un 1 l ó 250 g 2 kg 2 kg 2 kg 2 kg 2 kg 2 kg 2 Un. 3 Un ó 200 g 5 Un o 1 envase (tabaco de pipa) Biol Un Biol Un Biol Un 1 1 1 Productos para manos y 4 Un uñas 100 . 1 l ó * 500 g 2 Un ó 500 g * 500 g * 500 g * 2 Un o 1 kg 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 3 Un ó 750 g 4 Un o 400 g 1 l o 250 g * 500 g 500 g 500 g 250 g 3 kg 3 kg 3 kg 3 kg 500 g 3 kg 3 kg 3 kg 3 kg 500g 500 g * * 2 Un o 500g 250 g 250 g * * 250 g 500 g 1000 g 2 Un ó 500 g * 6 Un del * mismo lote 2 Un ó 200 g * 200 g 2 Un o 500 g 6 Un del * 1 Un del mismo lote mismo lote 1 Un o 250 g 1 Un o 250g * 2 Un o 1500 ml 1 Un o 250 g 2 Un o 1500 ml * * * * 1 Uno 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un 750 ml 1 Un 750 ml 1 Un 750 ml 1 Un 750 ml o o o o 2 UN o 1500 ml Bebidas alcohólicas 2 Un o 1500 preparadas y envasadas ml Tabaco. 1l ó * 500 g 2 Un. sus productos y sucedáneos Productos para modificar el 2 Un o 50 – olor del cuerpo 100 ml Productos para el cabello 5 Un Productos para el cuerpo 4 Un 1 Un o 750 ml 5 Un o 1 envasa( tabaco pipa) 2 UN 50 – 100 ml 2 Un o 50 – 100 ml. y de recipientes irrompibles esterilizados.. cucharillas. plumas. Bolsas limpias de polietileno estériles de varias medidas para submuestras. lápices. Papelería: plumones marcadores de agua. Hielo seco para las muestras congeladas. hielo o recipientes con líquido precongelados para la refrigeración. deberán ser lisos. Todo el equipo para el muestreo deberá estar limpio y seco cuando vaya a utilizarse. cucharas. maquillajes. el analista debe seguir el siguiente procedimiento: lavarla perfectamente en la pila de lavado del equipo de la empresa. previamente esterilizadas. diurex. Biol Un Biol Un Biol Un 3 Un Biol 1 1 1 79 5 Un * 2 Un 80 81 5 Un 250 g * 250 g 2 Un 3 Un Biol Tomado de: HERRAMIENTAS PARA EL MUESTREO Las herramientas de que puede disponer un analista varia desde instrumentos comunes para fines de carácter general hasta herramientas especiales. es esencial disponer herramientas de muestreo. malla para pelo o cofia. aceites. cubrebocas. hielo o líquidos precongelados. 3 Un ó 200 g n 2 Un o 50 – 100 ml. cortar sacos y vaciar los productos alimenticios. En zonas polvorientas como molinos harineros o elevadores de grano. la herramienta puede enfriarse con alcohol. o unas pinzas para manipular los cortes hechos en los sacos.76 77 78 Productos para el aseo de 6 Un la persona Productos de aseo Productos repelentes a insectos (que se aplican directamente sobre la piel) Faciales cremas. deberá utilizarse una linterna a prueba de explosiones. mascarillas. etiquetas adhesivas. Las herramientas tales como los espátulas. envueltos individualmente y esterilizados en la autoclave antes de llevarlos al lugar donde van a utilizarse. Bata. - - 101 . secarla con una toalla limpia. masking tape. Se pueden utilizar unas tijeras para cortar los embalajes de tela. Puede disponerse de una herramienta especial para abrir las cajas de cartón que se utilizan para el transporte. destornilladores y cuchillos. termómetro con un intervalo de 0 a 100 grados centígrados. etc. etc. ocasionándoles daños mínimos. espátulas.) Alimentos preparados listos para servirse 200 g 4 Un n 2 Un o 50 – 100 ml. delineadores. rubores. y enfriarla antes de utilizarla. que han de utilizarse en determinadas situaciones para hacer exámenes específicos de productos alimenticios especiales. tijeras. Para la toma de muestras para análisis microbiológico.) Para niños (talcos. envueltas individualmente. Herramientas comunes como alicates. etc. 2 Un o 50 – 100 ml. Pinzas. son útiles para abrir los envases. 3 Un ó 200 g n 2 Un o 50 – 100 ml. flamearla después con la llama de una lámpara de alcohol. 3 Un. Una lámpara sorda de luz brillante es muy útil cuando hay que trabajar en zonas poco iluminadas. INSTRUMENTAL Y EQUIPO BÁSICO DE MUESTREO Recipientes isotérmicos: Cajas de material aislante equipados con tapas y espacios suficientes para colocar los refrigerantes y las muestras que deberán permanecer en la temperatura deseada hasta su ingreso al laboratorio. cuchillos afilados. sin ningún diseño en la superficie. totalmente de acero inoxidable. Cuando sea necesario esterilizar una herramienta de muestreo en la fábrica. manejo y transporte de muestras. para cerrar de nuevo herméticamente las zonas de las que se han tomado las muestras. para desinfectar las herramientas de muestreo. con intervalos de graduación no superiores a 2 grados centígrados. 5. Termómetros metálicos (dos si es necesario) para toma de temperatura de alimentos intervalos de -40 a 100°C.. se envolverá en forma individual debidamente identificado. Preparación del Material para la Toma de la Muestra. 4. Guantes estériles - - - - - - EQUIPO Autoclave equipada con termómetro de mercurio calibrada 121 ° C ±1 ° C Horno que alcance una temperatura de 170 ± 5°C. y después se la hace girar para cortar un trozo cilíndrico. heces de roedores y otras materias extrañas. Termómetro completamente metálico. 2. La probeta se clava en el material estático del equipo. estéril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos. 6. Algodón. la leche en polvo y los productos lácteos en polvo. Puede utilizarse también un cucharón adecuado de acero inoxidable o aluminio.. que el muestreador puede llevar en una botella de plástico. y después se saca para su examen. Su precisión deberá calibrarse regularmente con los laboratorios de metrología oficiales. Podrán utilizarse indicadores de papel para determinar si existen residuos de cloro y tomar el pH del producto. Un tamiz metálico o un recogedor se utilizan para controlar si los cereales a granel tienen insectos. con intervalos no superiores a 1 °C. Lámparas de alcohol.. Sondas o probetas especiales se usan para el muestreo de la mantequilla y el queso.Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma. Papel estraza. Se hace penetrar la probeta en el producto. Para la toma de muestras de queso solamente. Se usará alcohol isopropilíco o etílico al 70 %. se necesitará un compuesto obturante hecho a base de parafina o cera de abejas.Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminación posterior. Podrán utilizarse también guantes de cirujano de látex o PVC para poder manipular los instrumentos de muestreo sin introducir microorganismos en la muestra. con papel de Kraf antes de esterilizado. Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio para la toma de muestra Hielo o bolsas refrigerantes. Esta probeta no deberá usarse para la toma de muestras microbiológicas.El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C durante 15 minutos o en homo a 170°C por dos horas. 102 .El material para la toma de muestra que requiera esterilización. Se emplean cucharas y pipetas de plástico desechables esterilizadas para un muestreo aséptico destinado al análisis microbiológico. pero este ensayo no debe constituir un sustituto de determinaciones precisas de pH. Un manguito o probeta para harina sirve para el muestreo de las tolvas (fondos) de los elevadores de molinos harineros u hornos de pan de grandes dimensiones. 1. o dos si es necesario para abarcar la escala de temperatura de -35 a 100 grados centígrados. debe estar limpio.. que van a estar en contado directo con el alimento. Usualmente habrá que sacar el producto de la probeta con una espátula.Colocar cinta testigo en el material a esterilizar.. 3..La tapa de los frascos se protegerá con papel de estraza o aluminio fijándolos adecuadamente. de acuerdo a su naturaleza. Papel aluminio.- Una taladradora seca tubular puede emplearse para la harina. Cerillos o encendedor. en productos perecederos. 10.Cuando se requiera tomar muestras asépticamente. se determinará la fecha de caducidad. tomándose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus análisis. pero cuidadosamente. PROCEDIMIENTO El procedimiento para la toma de muestra... no requieren precauciones estrictamente asépticas. como no perecederos.De ser necesario. 8. 4. si se requiere mayor número de utensilios. limpiar los que hayan sido usados y empaparlos con etanol o isopropanol al 70%. enviándose al laboratorio tal como se presentan al consumidor. 11... 4.. la toma de muestra subsecuente la llevará a cabo personal autorizado tomando como muestras en forma aleatoria del lote existente o la cantidad o número estipulado en la norma correspondiente del producto. la muestra que se utilice para tal fin deberá ser diferente de la que se envía para su análisis...Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no está definida su vida útil o de anaquel. la 103 . 3. debe muestrearse con ayuda de utensilios estériles como sacabocados..La toma de muestra debe hacerse con rapidez. 3. cucharas y o cuchillos. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto deberán usarse guantes estériles. 7. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse únicamente al momento de introducir ésta y cerrarlos de inmediato. de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeración.Tratándose de productos envasados en recipientes grandes. se recomienda que la persona que elabora los alimentos. posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estériles para evitar su contaminación o inmediatamente utilizarlos.. Para muestreo aséptico debe utilizarse bata. éstas no deben tomarse en áreas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminación de las mismas. dependerá del tipo de producto y de la finalidad del examen: OBTENCIÓN 1.En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.La toma de muestra de productos envasados con presentación comercial para venta al menudeo se llevará a cabo en forma aleatoria y no aséptica. tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa.En productos a granel..Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria será únicamente por duplicado. con base en productos de características similares. 2.. cofia y cubreboca.Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad.Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel.Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones.. PRODUCTOS PERECEDEROS 1.Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato. antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. esto únicamente si el traslado es menor a una hora. la primera se enviará al laboratorio oficial para su análisis y la segunda se quedará en poder del interesado para su análisis particular si es necesario.Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar éste. se consideran para fines de esta norma. 2.. sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estériles con los utensilios que emplea normalmente. 6. 5... 12..En caso de impugnación presentada en los términos que señala la Ley General de Salud.. es preciso abrir éstos y extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación microbiana. 9. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon.En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto.Cuando sea necesario tomar la temperatura.7. Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente. y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas..1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada 125 ml de capacidad de los mismos. b. mediante rótulo o etiqueta (indelebles). representante y/o distribuidor.Si la muestra de agua posee cloro residual los frascos se deben esterilizar en estufa a 170º C. evitando su exposición a la luz solar directa. siempre y cuando ésta no exceda de 45°C 6. manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico MUESTRAS PARA AGUA 1 Frasco para muestra de agua. con los siguientes datos: 2. número de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede. 104 . las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. b.. CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE 1. Los alimentos perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C. 7. 2...Clave única que permita la identificación del domicilio del fabricante.. así como la marca comercial y cualquier otra información que se considere importante. hora del muestreo.La etiqueta deberá colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco la caja... 3. alteración o contaminación. evitar que se dañen...El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida su ruptura. en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. En caso de alimentos congelados. Procedimientos para la toma. El número de submuestras del total que determinen el cumplimiento serán tres de cinco o lo que estipule la norma correspondiente.Lavar y secar perfectamente un frasco de boca ancha de 500 ml con tapa. a.cual será analizada por el laboratorio acreditado para realizar tercerías y el resultado obtenido será el que definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas..Fecha. durante el transporte de las muestras no está permitido el empleo de sustancias químicas.Para la conservación. humedezcan o contaminen con otras.Indicar nombre genérico y específico del producto.. por una hora o en autoclave a 120º C durante 15 min.. a. por una hora o a 121º C durante 15 min. Tomado de: NOM-109-SSA1–1994..Las muestras que se entreguen al laboratorio de preferencia deberá acompañarse de un informe y el número de unidades y/o cantidad. los cuales deben contener 0.. 3. IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA 1. d. 5.. lugar.En el caso de muestras no perecederas.Si la muestra proviene de agua que no ha sido clorada esterilizar el frasco en estufa a 170º C. en donde se señale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algún otro dato que sea significativo para determinar los análisis microbiológicos que sean necesarios. empleando para conservarla hielo seco. c.En el caso de muestras individuales blandas..La muestra testigo podrá eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnación. c. evitar que la presión que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. la temperatura no debe ser mayor de 0°C. inmediatamente antes o después de colocar en él la muestra. Bienes y servicios.-Observaciones. Para la refrigeración es recomendable el empleo de recipientes con liquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible.En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente. 4. en caso de no utilizar frascos de vidrio de boca ancha de 500 a 1000 ml de capacidad... Deben removerse los accesorios o aditamentos externos como mangueras.Cerca del orificio de salida. ya que el agua puede correr por la parte exterior del grifo y contaminar la muestra. sacar el frasco del agua y colocar el papel de protección.En captación de un cuerpo de agua superficial o tanque de almacenamiento. evitando que se contaminen el tapón.Efectuada la toma de muestra. dejar enfriar y colocarlo en una bolsa de plástico nueva g. a.1 2.Debe dejarse correr el agua aproximadamente 3 min o hasta asegurarse que el agua que contenían las tuberías ha sido vaciada totalmente. evitando que se contaminen el tapón.. c. Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapón. y desenrollando el cordel lentamente. No debe efectuarse toma de muestra en grifos que presenten fugas entre el tambor y el cuello.Para muestrear hielo... o el papel de protección. a.Debe mantenerse el tapón hacia abajo para evitar contaminación y procederse a tomar la muestra sin pérdida de tiempo y sin enjuagar el frasco. Efectuada la toma de muestra.Deben quitarse simultáneamente el tapón y el papel de protección. si no es posible la toma de muestra como se indica en este punto.4 En pozo somero o fuente similar.5.Si el pozo cuenta con grifo para toma de muestra..2. d.... a.Esterilizar por medio de calor húmedo a 121ºC durante 15 minutos...2.Si el pozo no cuenta con grifo para toma de muestra. traer una bolsa si es posible. c.. bajando el frasco dentro del pozo.En bomba de mano o grifo del sistema de distribución.Manejo de Muestras 105 .Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodón impregnada de solución de hipoclorito de sodio con una concentración de 100 mg/l. y c.Deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabón.. Muestreo 2. deben quitarse simultáneamente el tapón del frasco y el papel de protección.Cuando no es posible tomar la muestra con la extensión del brazo. dejarse correr el agua por un mínimo de 3 min.1.El agua de los grifos debe provenir directamente del sistema de distribución. se debe dejar el espacio libre requerido para la agitación de la muestra previa al análisis (aproximadamente 10% de volumen del frasco). 2. debe abrirse la válvula de una tubería de desfogue.. d.d. manejándolos como unidad. abrir y enderezar a continuación con el cuello hacia arriba (en todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superficial o del fondo.2.. si existe corriente en el cuerpo de agua.Debe quitarse el papel de protección evitando que se contamine. b. y a continuación se procede como en el oinciso d y e del 4.. donde puede haber nata o sedimento y en el caso de captación en cuerpos de agua superficiales. f.. debe procederse como en inciso b del 4..Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm.3. debe atarse al frasco un sobrepeso usando el extremo de un cordel limpio. deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco. evitando que el frasco toque las paredes del pozo. la toma de muestra debe efectuarse con la boca del frasco en contracorriente. 2.En pozo profundo. a. o el cuello del frasco.. o el papel de protección.1 b..Cubrir la tapa la boca del frasco con papel Kraft y asegurando con una liga. e. b. 2.Debe mantenerse el cuello del frasco hacia abajo y se procede a tomar la muestra.Después de esterilizar.En el caso de tanques de almacenamiento. o el cuello del frasco.. b. d. debe procederse como se menciona a continuación. deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco. boquillas y filtros de plástico o hule antes de tomar la muestra. e. no deben tomarse muestras muy próximas a la orilla o muy distantes del punto de extracción). manejándolos como unidad... 2. cuidando de no congelar las muestras. g. el periodo máximo que debe transcurrir entre la toma de muestra y el análisis microbiológico es de 6 horas.. c..6 Identificación y Control de Muestras Para la identificación de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente información: a.Si el tiempo de llegada es largo la muestra debe colocarse en hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al laboratorio.Número de registro para identificar la muestra..pH f.Tipo de análisis a efectuar Tomado de: NORMA OFICIAL MEXICANA. de preferencia a una temperatura entre los 4 y 10ºC... b.. NOM-014-SSA1-1993 "Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano en sistemas de abastecimiento de agua públicos y privados 106 .Fecha y hora de muestreo..Temperatura ambiente y temperatura del agua e. 2.Cloro residual si es posible.Identificación del punto o sito de muestreo d. mantenido a 45°C.DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS MESOFÍLICOS AEROBIOS EN ALIMENTOS. saprofitos. hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. etc. psicrotróficos. oxígeno disponible. Gram negativos.Después de la incubación. así como un amplio grupo de especies como: cromógenos. 6 en el sentido contrario y 6 de atrás a adelante.3.Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda. donde la técnica ni pretende poner en evidencia a todos los microorganismos.Realizar diluciones hasta 10-4 en frascos que contengan 90 mL del diluyente. del agua potable. 7. aunque dependiendo de la naturaleza de los ingredientes. 2. También llamadas bacterias indicadoras ya que se utilizan como indicadores de la calidad sanitaria. así como indicadores de la posible presencia de microorganismos patógenos. proteolíticos. usando el contador de colonias. lipolíticos. así como de las condiciones higiénicas en las que se prepararon y conservaron los alimentos se puede predecir la vida de anaquel. Colocar 1 mL de la dilución que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado. En muchos alimentos este grupo de microorganismos arroja los máximos recuentos.. patógenos.Dejar solidificar el medio e incubar a 35 °C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas. la técnica comúnmente utilizada es la cuenta por vaciado en placa.8. 5. Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estándar. temperatura requerida para su crecimiento. contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a 250 colonias.El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas. de 24 a 48 ± 2 horas. etcétera. en agar cuenta estándar o en agar triptona extracto de levadura. pues tenemos una variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales. 6 en el sentido de las manecillas del reloj. 6.Pesar 10 g del alimento en condiciones de esterilidad y tratarla como indica la NOM-110-SSA1–1994. equipo y otros productos. Colocar una Placa de Petri como testigo de esterilidad del medio 9. PROCEDIMIENTO 1. Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento. sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculo en el medio. Las bacterias mesofílicas aerobias son las que crecen a 35 ± 2°C. este grupo esta formado por cocos o bacilos Gram positivos.4. no debe exceder de 20 minutos. cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja. Para los casos no contemplados seguir las recomendaciones de la NOM 092 107 . del valor nutricional de alimentos perecederos. Bienes y servicios. fermentativos. Las placas de al menos una de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. RESULTADOS 108 . de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar. reemplazar el tercer dígito con cero y el segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400): INFORME DE LA PRUEBA Reportar como: Unidades formadoras de colonias. Para redondear. elevar el segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo 128 redondear a 130). multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. incubadas a _________ horas a _______ ° C._________ UFC/g o ml.Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas. Si el tercer dígito es cuatro o menos. 109 . Dejar que solidifique.Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C. generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares. La evaluación de la calidad microbiológica de un producto. Las colonias típicas son de color rojo oscuro. contar las colonias con el contador de colonias.1994. El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra.0 mm.. aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario. El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para: La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos. utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h. verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 °C en la superficie del medio inoculado. 110 .Después de que está el medio completamente solidificado en la caja.Después del periodo especificado para la incubación. Los organismos coliformes son bacilos Gram negativos. durante 24 ± 2 horas... Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo y la calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes areas del procesamiento de alimentos. 7. la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 3. 1. 4.. seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj. los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.Vertir de 15 a 20 ml del medio agar de bilis rojo violeta fundido y mantenido a 45 en baño de agua. 6. ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares. manejo y transporte de muestras en alimentos para su análisis microbiológico.Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes..5 a 2. no debe exceder de 20 minutos. Procedimientos para la toma. el cual es de color rojo claro o rosa. puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales. 5. aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan la lactosa con formación de ácido.Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias.DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES POR LA TECNICA DE VACIADO EN PLACA El grupo de los microorganismos coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la dilución realizada por lo menos de dos diluciones 2.DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.. MUESTREO.. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Seguir las indicaciones de la NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de las muestras de muestras en alimentos para su análisis microbiológico y la NOM-109-SSA1.Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda. seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante.. dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo. 8. no esporulados. sobre una superficie lisa y nivelada. En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento.Expresión de resultados INFORME DE LA PRUEBA Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis. RESULTADOS 111 . En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por ml". informar utilizando como referencia la dilución más baja utilizada. incubados a 35°C durante 24 ± 2 h. 112 . DESARROLLO EXPERIMENTAL Preparación de la muestra La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994.-Tomar tres tubos de concentración sencilla de caldo lactosado. Incubar los tubos a 35 ± 0. No obstante en la práctica. en consecuencia..DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios. Esta última.. En caso de que la muestra sea sólida hay que licuar la muestra con el diluyente y realizar diluciones hasta las que se consideren las necesarias y sembrar las ultimas tres. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Seguir las indicaciones de la NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de las muestras de muestras en alimentos para su análisis microbiológico y la NOM-109-SSA1.3. en los siguientes 3 tubos 1 ml y en los ultimos 3 tubos con caldo lactosado 0.1 ml de la muestra. El primero. usando una pipeta para cada dilución y transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra o de la dilución 4. Procedimientos para la toma. Estos determinantes extracromosomales son fácilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes. es que Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme. proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.Tomar otros 3 tubos de concnetración sencilla y colocarle 1 ml de la dilcuión 5. por lo que no se les identifica por medio de esta técnica. que pueden. 2. aerobios o anaerobios facultativos. 1.Si la muestra es líquida se inocula en los primeros 3 tubos 10 ml. Existe poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico.. la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente asociada a genes localizados en plásmidos. la especie contiene variantes que no producen gas de la lactosa o lo hacen después de 48 horas.Incubación. prolongar la incubación por 48 ± 2 horas..5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas. tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación que es el caldo de bilis verde brillante e incubar a 35 ± 0. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.3 Inoculación. manejo y transporte de muestras en alimentos para su análisis microbiológico. Segundo. Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formación de gas. Procedimiento para la cuenta de organismos coliformes totales Para alimentos. La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. no esporulados. en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Procedimiento para la cuenta de organismos coliformes fecales 113 . Los organismos coliformes son bacilos Gram negativos. 3.5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo. MUESTREO. que a 35 °C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones de la NOM-112 –SSA-1994. la técnica ha demostrado su efectividad. Preparar diluciones según el criterio de tal forma que aseguremos el conteo Prueba presuntiva serie 3. Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes tales en Placa) o el uso de la técnica del número más probable. también llamada técnica de dilución en tubo. ser recuperadas en la etapa inicial del análisis. Usar una pipeta estéril para tranferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial. El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias (NOM-113SSA1-1994.1994. .Si la muestra es líquida se inocula en los primeros 3 tubos 10 ml.Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento que el el caldo lauril sulfato triptosa Usar una pipeta estéril para tranferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial.3 Inoculación. 114 .Para alimentos.1 ml de la muestra. 1. prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. 3. 2.Incubación. usando una pipeta para cada dilución y transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra o de la dilución 4.-Tomar tres tubos de concentración sencilla de caldo lauril sulfato triptosa. Preparar diluciones según el criterio de tal forma que aseguremos el conteo Prueba presuntiva serie 3. Incubar los tubos a 35 ± 0....5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este tiempo. Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formación de gas.3.5 ± 0.Tomar otros 3 tubos de concnetración sencilla y colocarle 1 ml de la dilcuión 5. tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación que es el caldo EC e incubar en baño maria a 44. en los siguientes 3 tubos 1 ml y en los ultimos 3 tubos con caldo lactosado 0. en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas. En caso de que la muestra sea sólida hay que licuar la muestra con el diluyente y realizar diluciones hasta las que se consideren las necesarias y sembrar las ultimas tres. INFORME DE LA PRUEBA Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes. De la NOM 112 .e Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra".. RESULTADOS 115 . fundido y mantenido a 45 en un baño de agua. Sin embargo. Después de 5 días. seis en el sentido de las manecillas del reloj. dando como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos. cuando se presenta un desarrollo excesivo de hongos. para seguir la eficacia de su tratamiento germicida y en determinadas circunstancias para los riesgos que pueden resultar en la formación de toxinas al incrementar su número. examinar microscópicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias. no debe exceder de 20 minutos. seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante. 8. simultáneamente con el recuento de mohos puede realizarse el de las levaduras. acidificado a un pH 3. 2..Preparar una caja control con 15 mL de medio. 4 y 5 días de incubación. 116 . Desarrollo 1. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución y el momento en que es vertido el medio de cultivo. considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días.Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la dilución correspondiente 3. y la NOM-109-SSA1.. ALMACENAMIENTO Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Seguir las sugerencias de la NOM110-SSA1-1994 Preparación y dilución de las muestras de muestras en alimentos para su análisis microbiológico. 7.. Procedimientos para la toma. informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis.Mezclar la muestra y el medio con seis movimientos de derecha a izquierda.Verter de 15 a 20 mL de PDA. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.Repetir el procedimiento para las dos ultimas diluciones..Realizar diluciones de la muestra hasta la que consideremos que nos registra un conteo de entre 15 a 150 UFC.5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C. manejo y transporte de muestras en alimentos para su análisis microbiológico. la importancia de determinar a los mohos es la producción de toxina.. ya que el medio de cultivo les proporciona también buenas condiciones para su desarrollo. Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento.. sobre una superficie lisa...Contar las colonias de cada placa después de 3.DETERMINACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS El recuento de mohos y levaduras tiene importancia como recurso para apreciar algunos aspectos de la higiene aplicada durante el procesamiento.Si es necesario. difícilmente puede efectuarse el recuento de las colonias de las levaduras. utilizar una pipeta estéril diferente para cada dilución. MUESTREO. En este caso. los mohos generalmente causan deterioro en el producto alimenticio originando mal olor o coloración en el producto. 5. El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo específico.1994. Dejar que solidifique el agar 6. PROCEDIMIENTO Preparación de la muestra La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994. o como agentes contaminantes. para verificar la esterilidad e invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25. 4. cuando la morfología colonial no sea suficiente. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas. En general. Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa acidificado. incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.dextrosa acidificado. incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días. 117 .INFORME DE LA PRUEBA Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa . Recuento Dilución 10-3 Mohos 10 UFC en la placa Levaduras 184 UFC en la placa Cálculo. tomando en cuenta las consideraciones de la NOM 092 Mohos 11X103 / ml en la muestra 180X103 / ml en la muestra 118 . Realizar un Gram y determinar el número de células por campo 119 .Incubar a 35 °C por 24 -48 horas. A partir del yoghurt se han desarrollado un gran número de productos obtenidos por modificación del medio de fermentación y/o cambiando la presentación final del producto lo que conduce a una diversificación de las formas de utilización ofrecidas a los consumidores: desayuno. la producción inicial de ácido se debe. 4. de esta manera.Agregar a un matraz de 500 ml estéril 300ml de leche pasteurizada.. Así pues... 6. Algunas cepas producen polisacáridos a partir de la lactosa. agregar 4 litros de leche pasteurizada y 500 gramos de leche en polvo descremada a cada uno y homogeneizar muy bien. 3. 4. glucanos que contribuyen a la viscosidad del producto. los cocos proliferan mucho más aprisa que los bacilos y al acabar la primera hora de incubación a 45ºC a menudo su número es superior al de los últimos en proporción de 3 ó 4 a 1.Incubar a 35 °C por 48 horas. No se sabe bien cuál es la función de Streptococcus thermophilus en el cultivo para yoghurt aparte del hecho de que prolifera más aprisa que Lactobacillus bulgaricus y que. Para lograr los mejores resultados. postre helado. su número es otra vez aproximadamente el mismo que el de los cocos. en gran parte.PREPARACIÓN DEL INOCULO.. de no ser así. CONTROL MICROBIOLÓGICO DE MATERIA PRIMA Y PRODUCTO TERMINADO. Los cultivos pueden obtenerse ya sea de colecciones microbianas o aislándose de un buen cultivo para yoghurt. auxiliar para la cocina. La leche contiene los factores de crecimiento y los elementos minerales necesarios para el desarrollo de las dos bacterias. bebida. etc. Algunos investigadores afirman que los cocos contribuyen al sabor y aroma del producto final. La leche contiene aminoácidos y péptidos directamente utilizables por las dos bacterias. La producción de ácido durante la última parte del periodo de incubación la llevan a cabo Lactobacillus bulgaricus. La peculiaridad de este producto reside en la utilización de dos bacterias lácticas termofílicas. Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgarícus los propagan por separado y luego los mezclan para la preparación del yoghurt final..Marcar los recipientes con A y B. 1. 5..ELABORACIÓN DEL YOGHURT.Determinar pureza con una tinción de Gram.Inocular con 200 ml de inoculo cada recipiente y homogeneizar..Lavar muy bien dos matraces de 6 litros y esterilizar por calor seco 2. Las bacterias esenciales en los cultivos para yoghurt son Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus. el yoghurt carecerá de la consistencia. PROCEDIMIENTO A. lo cual sólo permite satisfacer las necesidades de las bacterias al principio de la fermentación. 3.. propagados por separado y mezclándolos luego para la preparación del yoghurt final. es decir.. Cuando se inocula la mezcla en la leche. el sabor y el olor más deseable. 1. B.Frente a la flama del mechero realizar el sembrado de las cepas ATCC de los dos microorganismos en placas de agar nutritivo. La legislación francesa especifica que el yoghurt debe contener después de la fabricación un mínimo de cien millones de bacterias lácticas por gramo... pero en cantidades limitadas.ELABORACIÓN DE YOGHURT..Pasado este tiempo en dos matraces estériles colocar 200 ml de leche (de la misma que se va a utilizar para la fermentación) y colocar la misma cantidad de inoculo de las dos cepas para aumentar la población. da comienzo a la producción de ácido. a la actividad de Streptococcus thermophilus Los bacilos van aumentando paulatinamente en número hasta que al final del período de incubación. INTRODUCCIÓN El yoghurt es la leche fermentada de mayor consumo y mejor conocida. lo que justifica que se le dedique una especial atención. 2. estos organismos deben hallarse en el cultivo en número aproximadamente igual. Determinación de acidez al yogurt. a) Color b) Olor c) Sabor. ANÁLISIS DE LA MUESTRA Y MATERIA PRIMA a..El matraz A dejarlo intacto y dar por terminada la fermentación cuando se alcance un pH de 4. hacer la determinación por duplicado. para cumplir con la NOM 093 . Disposiciones y especificaciones sanitarias. aureus..Al producto terminado realizarle la cuenta microbiana de mohos y levaduras u coliformes totales. OMA y OCT en punto de venta Realizar a la leche en polvo los análisis que indica: NOM-130-SSA1–1995. adicionar 50 ml de agua destilada y unas gotas de fenolftaleína. por lo menos. 1. titular con NaOH 0. Bienes y servicios.Determinación de coliformes totales mohos y levaduras para el yogur.Colocar los matraces en baño María a 35 °C. Observar el aspecto y textura del yogurt del matraz A y B. Bienes y servicios. c. S.. e) Acidez. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico. d.. d) Consistencia y textura.1 N...5. 120 . 8.Tomar 5 ml de leche del recipiente B cada 2 horas (agitando previamente) y medir pH. hacer la prueba por duplicado. Disposiciones y especificaciones sanitarias.. 1) En un matraz de 250 ml colocar 10 ml de muestra. b.Realizar a la leche pasteurizada la determinación de: Realizar los análisis de la NOM-091-SSA1–1994. el matraz A debe permanecer inmóvil y el matraz B es de donde se tomará muestra para realizar las pruebas 7.. Leche pasteurizada de vaca. CARACTERÍSTICAS DEL YOGURT ELABORADO.Determinación de pH al yogurt: Tomar 10 ml de la muestra y medir con un potenciómetro el pH ajustando previamente con una solución reguladora con pH = 7.. 121 . 122 . Practicas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos. Leche rehidratada y reconstituida. Bienes y servicios. a) Alimentos con pH>4. Bienes y servicios. PASTEURIZADA Y ULTRAPASTEURIZADA Especificaciones Mesofílicos aerobios Mesofílicos anaerobios Termofílicos aerobios Termofílicos anaerobios Limite Máximo Negativo Negativo Negativo Negativo 123 . LECHE REHIDRATADA Y RECONSTITUIDA. Bienes y servicios.La siguiente lista es de NOM en donde se establecen los intervalos de microorganismos permitidos por la Secretaria de Salud. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Cuenta total de mesolíticos Coliformes Mohos Levaduras aerobios UFC/g totales UFC/g UFC/g UFC/g Yoghurt ----------10 10 10 NOM-130-SSA1–1995. NOM-091-SSA1–1994. Leche pasteurizada de vaca. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y sometido a tratamiento térmico. Bienes y servicios. pasteurizada y ultrapasteurizada.6 esterilizados comercialmente Microorganismos Mesofílicos anaerobios (UFC/g) Mesofílicos aerobios (UFC/g) Termofílicos anaerobios (UFC/g) Termofílicos aerobios (UFC/g) Límites máximos Negativo Negativo Negativo Negativo NOM-144-SSA1–1995. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Disposiciones y especificaciones sanitarias. en 25 ml. S. Especificaciones Mesofílicos aerobios Salmonella spp. aureus en 25 ml Listeria monocytogenes en 25 ml Coliformes totales en planta Coliformes totales en punto de venta Limite Máximo 30000 UFC/g Ausente Ausente Negativo 10 UFC/ml 20 UFC/ml NOM-093-SSA1–1994. SOLUCIÓN REGULADORA DE FOSFATOS (SOLUCIÓN CONCENTRADA).0 L Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7. Formula: Fosfato de sodio monobásico Agua 34. Cuando se indique el agua debe entenderse como agua destilada.0 N.SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO AL 40 % Formula: NaOH Agua destilada 40 g 100 ml Colocar el recipiente en baño María para controlar la generación de calor y disolver los 40 g del NaOH en los 100 ml con agua.SOLUCIÓN DE ÁCIDO CLORHIDRICO 1. Tomar 1.0°C durante 15 minutos y después de la esterilización. 3.SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE SODIO 1.0 g 100 ml Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua. mezclar y aforar a 100l ( Nunca hacer lo contrario) 4.AGUA PEPTONADA Formula: Peptona 1. el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.0 g 124 .25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo) Y Distribuir en porciones de 99. 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar a 121° ± 1.2 con solución de hidróxido de sodio 1. Llevar a un litro con agua.0°C Y Conservar en refrigeración (solución concentrada).0 N Formula: NaOH Agua destilada 4. 2. 1. 5.0 g 1.0 N Formula: HCl Agua destilada 10 ml 100 ml Colocar en un matraz aforado de 100 ml.PREPARACIÓN DE REACTIVOS Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1. aproximadamente 50 ml de agua y vetir el ácido con mucho cuidado. N-Tetrametil-p-Fenilendiamino0. Esterilizar a 121 ± 1.FENOLFATALEÍNA AL 1 % ( C20H14 O4) 1g 100 ml Formula: Fenolftaleína Etanol al 95% volumen o composición.5 g Agua destilada 100 ml Conservar en frasco oscuro a 5 – 10 °C.N. Distribuir en porciones de 99.2 % ( C14 H15N3 O2) 0. Formula: Alfa naftol Alcohol etílico absoluto 10. el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.OXIDASA Formula: N. El reactivo se conserva durante 14 días. 6..0 L Disolver los componentes en un litro de agua y ajustar el pH a 7 ± 0.2 g 100 ml Formula: Rojo de metilo Etanol al 95% 9.2 g 100 ml Formula: Rojo de metilo Etanol al 95% volumen o composición. en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.2 % ( C19 H14 O5S) 0. Si este diluyente no es usado inmediatamente.0°C durante 15 minutos y después de la esterilización. 5g 100 ml Disolver los 5 gramos de alfa naftol en los 100 ml de alcohol etílico 125 .N.5 g 1. Disolver el rojo de metilo en el alcohol 8.- ROJO DE METILO AL 0.Cloruro de sodio Agua 8. almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes. Disolver el rojo de metilo en el alcohol 7. 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.ROJO DE FENOL AL 0.VOGUES-PROSKAUER Disolver el rojo de metilo en el alcohol Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.1 con hidróxido de sodio 1.0 N. REACTIVO DE KOVAC Formula: Alcohol amilico o isoamilico p-dimetil amino benzaldehido Ácido clorhídrico concentrado 150 ml 10 g 50 ml Disolver el aldehído en el alcohol y agregar lentamente el ácido a la mezcla 12..0 L Ácido acético 5N (una parte de ácido acético glacial a 2..NAFTOL 16..SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 40 % Fórmula: Hidróxido de potasio Agua destilada Formulación en g/100 ml: Fenol Ácido láctico Glicerina 20 20 40 40 g 100 ml 5g 100 ml 5.SOLUCIÓN DE ÁCIDO SULFANÍLICO Fórmula: Ácido sulfanílico 13.REACTIVO DE EHRLICH 18.SOLUCIÓN DE α-NAFTIL AMINA Fórmula: Dimetil α.5 partes de agua) 15. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.naftil amina Ácido acético 5 N Fórmula: Alfa naftol Etanol Fórmula: p-dimetil amino benzaldehído 2 g Alcohol etílico absoluto 190 ml Ácido clorhídrico concentrado 40 ml 17.11...AZUL DE ALGODÓN LACTOFENOL 126 ..SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA 1:10 Preparar momentos antes de usarla.0 L 8.0 g 1.SOLUCIÓN DE α.. 14..0 g 1. CRISTAL VIOLETA Formulación en g/100 ml: Cristal violeta Agua destilada Etanol al 95% Oxalato de amonio 2 80 20 0.Agua destilada Azul algodón 20 0.8 Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%..FUCSINA FENICADA Formulación: SOLUCIÓN A Fucsina básica 0..SAFRANINA Formulación en g/100 ml: Agua destilada Safranina 100 0. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.. hasta su uso.Moler el I2 y el KI en el mortero y disolver en 5 ml de agua. Agregar el ácido láctico. Después aforar a 100 ml con agua destilada. Guardar en frasco herméticamente cerrado.3 127 . 22.05 Disolver el fenol en el agua calentando en baño maría. Mezclar perfectamente 19. 21..8 g de oxalato de amonio en 80 ml de agua. 20. Posteriormente disolver 0. luego llevar a 240 ml. agregar los 60 ml de la solución de NaHCO3 y conservar en un frasco ámbar.5 Disolver los 0.YODO (LUGOL) Formulación en g/100 ml: Yoduro de potasio Yodo Agua destilada 2 1 240 ml Solución de bicarbonato de sodio al 5 % 60 ml 1..ALCOHOL ACETONA Formulación en g/100 ml: Acetona Alcohol etílico 50 100 Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado.. la glicerina y el colorante. 23.5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Definición Cantidad en gramos de soluto en 100 ml de solución b..AZUL DE METILENO Formulación: Azul de Metileno Agua destilada 1g 100 ml Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml.VERDE DE MALAQUITA Formulación: Verde de malaquita Agua destilada Preparación: Disolver el colorante en el agua..Para preparar una solución porcentual de este tipo utilizar la siguiente formula (p/v %) (Volumen deseado) gramos de soluto deseado = ---------------------------------------100 27. 24.SOLUCIÓN MOLAR Definición: peso formula de un compuesto en gramos 1 mol = Peso molecular gramo Ejemplo 1 mol de NaOH = 40 g de NaOH Milimol (mmol) Definición: 1 /1000 128 .. Mantener la solución en un frasco ámbar. 10 g 100 ml 26.. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2.. Guardar el colorante en frasco ámbar. 25.SOLUCIONES PORCENTUALES Solución porcentual (%) p/v a. de agua destilada. 2..Alcohol etílico al 95% SOLUCIÓN B Cristales de fenol Agua destilada 10 Mezclar hasta disolución completa 5 95 Combinar las dos soluciones A y B. protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 129 .04 g Definición: Cantidad de peso molecular gramo de un compuesto por litro de solución o cantidad de moles por litro de solución final o cantidad de moles de silito por decímetro cúbico de solución Existen dos fórmulas básicas (objetivo) Determinación del peso de un compuesto requerido para preparar una solución de una molaridad y un volumen deseado (Peso molecular) (Molaridad deseada) (volumen final en ml) gramos de reactivo = -----------------------------------------------------------------------------------------1000 (Objetivo) Determinación de la cantidad de mililitros de un reactivo concentrado p/p requerida para preparar una solución de una molaridad y un volumen deseado. Estándares de sulfato de bario Tubo No. para darnos diferentes densidades. Determinación del peso de un compuesto requerido para preparar una solución de una normalidad y un volumen deseado..= 30 g (1000) 29.Ejemplo 1 mol de NaOH 0 40 g 1 nmol de NaOH = 0. (PM) (Normalidad deseada) (V final en ml) Gramos requeridos =----------------------------------------------------------------(Valencia positiva total )(1000) Por ejemplo: preparar 250 ml de una solución 2 N de MgSO4 PM 0 120 g (60) (2N) (250 ml) Gramos requeridos =--------------------------------------------.SOLUCIÓN NORMAL Definición: Cantidad de ésos equivalentes gramo por litro de solución o la cantidad de miliequivalentes por mililitros. (PM) (Molaridad deseada) (V final en ml) ml del reactivo conc a usar =----------------------------------------------------------------1000 28. para producir un cultivo con la densidad deseada.Preparación del nefelómetro de McFarland Método para determinar la turbidez bacteriana en un cultivo líquido. Se utilizan diferentes concentraciones de cloruro de bario al 1 % y ácido sulfúrico al 1 %. BaCl2 al 1 % 0. De células en millones/ml MEDIDAS DE SEGURIDAD En este Manual se han tomado las características de un laboratorio básico.2 9. transporte. Publicada por la Secretaría de Salud 1993. envasado. publicada por la Secretaría del Medio Ambiente.7 9.0 30 3000 3 300 Densidad aprox. la NOM-087-ECOL–2002.9 9. almacenamiento.9 (ml) Densidad aprox. recolección.1 (ml) H2SO4 al 1 % 9. Recursos Naturales y Pesca.7 9 900 0.8 9.6 9. 130 .3 21 2100 0.0 9.8 6 600 0. que establece los requisitos para la separación.6 12 1200 0.4 18 1800 0.5 9.4 9. células (X108 /ml De 0. tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico–infeccioso que se generan en establecimientos que presten atención Médica y la Ley General de Salud.1 27 2700 1.3 9. en donde se toman las sugerencias propuestas por la OMS.2 24 2400 0.5 15 1500 0. Conviene tener muy en cuenta que una buena práctica de laboratorio es condición indispensable para la seguridad y no puede suplirse con material especializado. NORMAS GENERALES O HÁBITOS PERSONALES Las normas generales para el laboratorio básico que aquí se exponen constituyen un conjunto completo y detallado que el personal deberá seguir en toda clase de laboratorios. los clientes sólo tendrán acceso a la sala de espera y al interior del laboratorio siempre y cuando lo soliciten por escrito y no se permitirá la entrada de niños en las zonas de trabajo del laboratorio. en un momento dado.. 7. este código puede elevarse a la categoría de reglamento de los trabajos de laboratorio. establece que los residuos peligrosos biológico–infeccioso en los establecimientos que prestan atención médica constituyen un gran problema nacional... 131 .Los miembros del personal se lavarán las manos después de haber manipulado cualquier muestra. Código práctico: Este código es una recopilación de los procedimientos de laboratorio más esenciales que constituyen la base de una práctica segura de laboratorio.Debe limitarse las visitas al laboratorio.. En muchos laboratorios y programas nacionales de laboratorio.. los materiales contaminados que se vayan a esterilizar en autoclave deberán introducirse en recipientes resistentes e impermeables. 10.No se permitirá pipetear pipetas sin el tapón de algodón..La NOM-087–ECOL–2002.Debe haber un programa de lucha contra los insectos y los roedores. pueden causar daño a un individuo.No se permitirá la entrada en el laboratorio de animales.. En las presentes normas se puntualizarán y explicarán diversas partes de este código práctico. 3. 4. un grupo de personas o al medio ambiente. ya que se manejan ciertos residuos que. beber.. así como al abandonar el laboratorio. 8.Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite en lo posible la formación de aerosoles. 2.. 11... 12.Sólo se autorizará el paso a la zona de trabajo del laboratorio a los empleados. que no pasa de ser un complemento de aquella. retirando del mismo cualquier material que no tenga relación con el trabajo. LAS REGLAS MÁS IMPORTANTES SE ENUMERAN A CONTINUACIÓN (PERO NO EN ORDEN DE IMPORTANCIA): 1. guardar alimentos ni aplicar cosméticos.Habrá que mantener el laboratorio ordenado. Si se permite la entrada a una persona al laboratorio. limpio y aseado. 6.En la zona de trabajo del laboratorio no se permitirá al personal comer. por lo que es necesario el establecimiento de los requisitos para su control. no se llevará ropa de laboratorio fuera de éste. que se cerrarán antes de sacarlos del laboratorio. durante el trabajo se mantendrán cerradas las puertas del laboratorio. fumar.-Todos los líquidos o sólidos contaminados se descontaminarán antes de eliminarlos o de volver a utilizarlos. cofia y cubrebocas. 5.En el laboratorio se utilizará bata.Las superficies de trabajo se descontaminarán al iniciar y terminar el trabajo de siembra. se debe acompañar de un miembro del personal y provista de una bata. 9. Debido a esto los laboratorios básicos que presten atención deben de seguir los lineamientos contemplados en dicha norma a fín de evitar riesgos a la salud. 15.Debe proporcionarse recipientes adecuados para la basura. 27. 14. 132 .... o bien colocarla en un frasco que contenga benzal.No utilizar reactivos que carezcan de etiquetas 32.Todos los accidentes y exposiciones a material infeccioso se notificarán inmediatamente el jefe del laboratorio. si se necesitan instrucciones especiales para su lavado..Utilizar una espátula a1 manipular las sustancias sólidas que proteger el platillo de la balanza con un vidrio de reloj o pesar sobre un papel aluminio previamente tarado..-Los hombres deben evitar la barba.Todos los recipientes para almacenar sustancias deben estar etiquetados. 21. vidrios rotos..Tapar de inmediato los frascos de reactivo y medios de cultivo. 26. 19. el personal de limpieza debe ser informado.. 20.Utilizar una pipeta diferente para medir cada líquido y enjuagarla si ya no se va a utilizar..El jefe del laboratorio se ocupará de que el personal reciba una formación apropiada sobre la seguridad en el laboratorio. 23. los frascos sin etiquetas son automáticamente desechados. Los guantes se deben quitar asépticamente y esterilizar en autoclave con otros desechos de laboratorio antes de proceder a su eliminación. 24. 16..Debe destruirse el material de vidrio astillado o quebrado.13.El agua para beber debe estar localizada fuera del laboratorio. separando los que reciban papel.. paraguas y bolsas. 22. sombreros.Emplear reactivos sólo después de cerciorarse de que son los requeridos 30.. Habrá que llevar un protocolo escrito de estos episodios y poner una vigilancia apropiada...Los artículos personales como abrigos.Revisar que las llaves de agua y gas estén bien cerradas al final de cada práctica 29.Debe usarse pañuelos desechables en lugar de pañuelos de tela cuando se necesiten para uso personal.Los escritorios deben mantenerse en orden.. 25.. 18. Si no se dispone de guantes de un solo uso se utilizarán guantes reutilizables limpiándolos y desinfectándolos después de haberlos usado y antes de volverlos a utilizar. 34. o bien usarla muy corta.... 28.Poner atención a las indicaciones de riesgo impresas en las etiquetas 31.Habrá que utilizar guantes en muestras de alto riesgo. 33.. deben ser guardados en el armario correspondiente y no deben usarse ni introducirse al laboratorio..Se requiere que las personas con el cabello largo lo amarren atrás o se cubran la cabeza con la cofia. 17. Habrá que adoptar el presente manual de seguridad para reducir al mínimo o eliminar tales riesgos. A1 personal se le informará sobre la existencia de riesgos y se le pedirá que lea y observe las instrucciones sobre las prácticas y los procedimientos establecidos..Se prohíbe probar muestras y los olores solamente deben ser verificados con cuidado.Debe usar carteles precautorios apropiados cuando puedan ocurrir condiciones peligrosas. limpiar el platillo después de utilizarla..El material de vidrio usado debe ser vaciado de soluciones y solventes y enjuagado con agua antes de ser entregado para su lavado regular y. NOM-005-STPS-1998. hay que solicitar el apoyo del técnico. hay que realizarlo de una en una. placas. que no sean útiles. 41.Extinguir todas las flamas cercanas y retirar rápidamente los materiales inflamables. NOM-008-STPS-1998. transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas..Al preparar una solución hay que anotar de inmediato en el frasco el nombre del reactivo. almacenamiento y manejo de explosivos en los centros de trabajo. la fecha de almacenamiento y el nombre de la persona que lo ha almacenado.35... TÉCNICAS DE MANEJO. Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo. 36. matraces.. 40. agua..No deben guardarse nunca soluciones inflamables en el refrigerador que presenten algún riesgo de explosión. limpiarse a fondo y deshelar periódicamente para eliminar todos los tubos. NORMAS DE LA SECRETARIA DEL TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL En un lugar de trabajo debemos de tomar en cuenta las normas oficiales que se estan ejerciendo a fin de homogenizar criterios y respetar nuestra reglamentación. 2. 133 . Guantes..Cuando es más de una solución la que se va a desechar. 3.. la fecha de preparación y el nombre de la persona que lo preparo.Si no sabemos utilizar un equipo. verter siempre el ácido sobre el agua y nunca al revés. 3. ALMACENAMIENTO DE REACTIVOS Debe existir un inventario actualizado periódicamente de tal manera que se conozca la cantidad de sustancia existente. 39. en especial si son infecciosos o tóxicos..Todas las muestras.Asegurarse que las instalaciones de luz. etc.. drenaje y aire estén funcionando correctamente 42. Ropa de protección Batas o mandiles de laboratorio. 38. 37. TRATAMIENTO. la concentración. en especial cuando se trate de un ácido. para ello nos podemos auxiliar de estas NOM. que se almacenen en el refrigerador deben llevar la etiqueta correspondiente.Manejar con cuidado la cristalería. se sugiere una etiqueta como: EQUIPO DE SEGURIDAD DE USO ESTRICTO Y OBLIGATORIO 1. Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para la producción.El refrigerador debe inspeccionarse. EMPLEO Y CONSERVACIÓN DEL REFRIGERADOR 1. Los residuos peligrosos biológico-infecciosos deberán ser tratados por métodos físicos o químicos y deben: garantizar la eliminación de microorganismos patógenos.Cuando ocurra un pequeño incendio debemos de apagarlo con una franela húmeda y si el fuego se extiende utilizar el extintor y recubrirlo con arena. 2.Al preparar una solución de un ácido o una base fuerte... Colores y señales de seguridad e higiene. Sistema para la identificación y comunicación de riesgos por sustancias químicas en los centros de trabajo. NOM-114-STPS. NOM-018-STPS-1993. NOM-020-STPS-1993. materiales de curación y personal que presta los primeros auxilios en los centros de trabajo. 134 . Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para el almacenamiento. vestidores y casilleros en los centros de trabajo. NOM-026-STPS-1998. e identificación de riesgos o fluidos conducidos en tuberías. irritantes y tóxicas en los centros de trabajo.NOM-009-STPS-1993. Relativa a los requerimientos y características de los servicios e regaderas. transporte y manejo de sustancias corrosivas. Relativa a los medicamentos.