1PRINCIPAIS TÉCNICAS E MÉTODOS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL 1 INTRODUÇÃO Os métodos de enumeração de microrganismos viáveis podem ser divididos, de acordo com sua maior ou menor precisão, em dois grupos, os estimativos e os quantitativos diretos. Do mesmo modo, esses microrganismos podem ser determinados através da visualização direta de suas células, como na contagem microscópica direta, ou indiretamente, através de seu crescimento na forma de colônias ou, ainda, através de produtos de seu metabolismo, como será vista nos métodos discutidos em seguida. Em microbiologia de alimentos às vezes se faz necessário a determinação de microrganismos ou grupos microbianos com população tão reduzidas ou injuriadas, que se tornam inviáveis as técnicas de quantificação. Para esses casos pode ser adotado o teste de presença/ausência. 2 MÉTODOS ESTIMATIVOS 2.1 Método do número mais provável (NMP) A concentração de células viáveis pode ser estimada pelo método do número mais provável (NMP), o qual envolve uma dedução matemática da contagem de microrganismos viáveis, de uma fração do inóculo, capazes de crescer numa série de tubos contendo um meio apropriado (KOCH, 1981). O método consiste em se inocular diversas diluições (quantidades conhecidas da amostra), em baterias com tubos repetidos, contendo o meio que permitirá o crescimento. Após a incubação, os tubos podem ou não apresentar crescimento e as diluições que não apresentarem, presumivelmente não receberam nenhum microrganismo capaz de crescer. O método do NMP, do ponto de vista estatístico, não é uma medida precisa da população microbiana, porque cada tubo corresponde a uma pequena fração da superfície de uma placa de Petri. Consequentemente, o NMP tem maior precisão quanto maior for o número de porções examinadas em cada diluição, principalmente nas diluições críticas, onde se devem encontrar resultados tanto positivos quanto negativos (APHA, 1992). As diluições empregadas deveriam, idealmente, serem tais que as mais baixas dessem resultado positivo na maioria ou em todas as porções e as mais altas resultados negativos também para a maioria ou em todas as porções inoculadas. O valor numérico estimado para o conteúdo bacteriano é obtido pelas diluições, considerando os tubos com resultados positivos e negativos. 1 e 0. 1992. Em resumo. 2. e foram organizadas tabelas apropriadas de NMP. Estas tabelas trazem os NMP correspondentes às diferentes combinações de resultados obtidos em diversas séries de volumes inoculados. combinações de resultados para três diluições ou volumes diferentes e. Ele é particularmente importante nos procedimentos padrões de determinação de coliformes a partir de água e de diferentes tipos de alimentos.0. desde que se utilize meios adequados e se realize a pesquisa do microrganismo a partir de séries de volumes ou diluições diferentes. já que as tabelas de NMP trazem. Este método pode também ser utilizado na enumeração de Staphylococcus. Vibrio parahaemolyticus. Geralmente as tabelas são para séries de 3 ou 5 porções dos volumes de 10. porções de 1.1 ml ou. para escolher quais as três significantes a regra geral manda que se tome a diluição mais alta que de todos os resultados positivos (sem que nenhuma diluição mais baixa apresente nenhum resultado negativo) e as duas diluições seguintes (mais altas). também chamada tabela de Hoskins. SILVA e cols. que podem ser obtidos quando se usam diferentes diluições em diferentes séries de inoculações. 0. As aplicações do método do NMP são inúmeras. Salmonella e Bacillus cereus (APHA. a partir daquela mais alta que tenha dado todos os tubos com resultado positivo. no máximo. para alimentos sólidos.0 e 0. NMP/100 ml ou = grama número de tubos + x 100 ml ou g da amostra nos tubos negativos ml ou g da amostra em todos os tubos O NMP foi calculado para as diferentes combinações possíveis de resultados. 1.2 FÓRMULA MATEMÁTICA QUE PERMITE O CÁCULO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) ATRAVÉS DO MÉTODO DOS TUBOS MÚLTIPLOS.2 Aplicações mais comuns do método do NMP . 1997). Quando se empregam no exame mais de três diluições. deve-se escolher três diluições consecutivas. se deverá tomar os resultados de apenas três delas..01 g. dependendo do tipo de alimento.3 2. ♦ Cepa padrão negativa: cultura de E. ♦ Estufa bacteriológica regulada a 35-37oC.0 e 2. APHA (1992) estabelece 45.2oC para amostras de água. Teste presuntivo ♦ Meios de cultura: 9 ou 12 tubos com 6 a 8 ml de caldo lauril sulfato triptose (LST) ou caldo LST suplementado com 50 mg/litro de 4-metil-umbeliferil-Β-D-glucuronídio (LSTMUG) com tubos de Durhan. ♦ Tubos de diluição: 3 a 5 com 9 ml de H2Op/tubo.2 Determinação do NMP de coliformes totais. ♦ Pipetas: 3 a 5 de 1.2oC para alimentos de uma forma geral e 44. ♦ Tubos com ágar nutriente inclinado.2. 1992. pescado e moluscos. ♦ Sacos plásticos ou frasco para a diluição.. ♦ Banho-maria com temperatura controlada a 45. fecais e Escherichia coli (APHA.0±0. esterilizadas. ♦ Alça de níquel-cromo. ♦ Cepa padrão positiva: cultura de Escherichia coli. ♦ Tubos com 4 ml de ágar citrato de Simmons.0 ml. Determinação do NMP de coliformes totais ♦ Meio de cultura: Aproximadamente 9 tubos com 6 a 8 ml de caldo lactosado bile verde brilhante.5±0. . ♦ Alça de níquel-cromo Determinação do NMP de coliformes fecais ♦ Meio de cultura: Aproximadamente 9 tubos com 6 a 8 ml de caldo Escherichia coli (EC).2oC em laboratórios que analisam diferentes tipos de produtos. ♦ Tubos com 4 ml de caldo MR-VP.5±0.1% (H2Op). 1997).2. ♦ Tubos com caldo triptona a 1%.1 Material requerido para a análise Preparação da amostra e diluições seriadas: ♦ Diluente: 225 ml de água peptonada 0. com tubos de Durhan. SILVA e cols. com tubos de Durhan. aerogenes. Determinação do NMP de Escherichia coli (método tradicional) ♦ Placas com ágar eosina azul de metileno. 2. de 1 ou 2 ml. principalmente cravo.Incubação Incubar os tubos de LST a 35oC/24 horas e observar se há crescimento com produção de gás. Determinação do NMP de E. • Na análise de espessantes (gomas. ♦ Solução de vermelho de metila para o teste do VM. de acordo com as seguintes situações: • Amostras com populações estimadas elevadas deve-se inocular diluições maiores. Em populações reduzidas inocular 10. reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura. o que elimina a necessidade de neutralização.Inoculação – teste presuntivo Selecionar três ou mais diluições adequadas da amostra e.2..2 Procedimento aPreparação das amostras e diluições seriadas (discutido no ponto sobre amostragem) b. com uma pipeta. recomenda-se neutralizar a acidez da amostra com NaOH 1N estéril. alho e cebola. como diluente. pectinas) a diluição inicial deve ser maior.0 – 1. ♦ Reagente de Barritt para o teste do VP (sol. canela. Em caso positivo. deve-se iniciar com diluições mais elevadas. depois da homogeneização e antes da inoculação nos tubos de LST. coli – método LST-MUG ♦ Câmara escura com lâmpada ultravioleta 365 nm (luz negra) 2. • Na análise de produtos ácidos. de alfa-naftol a 5% e solução de KOH a 40%). passando para os itens subseqüentes em caso de crescimento com produção de gás. em função da viscosidade do material. Em caso negativo. mostarda.0 – e 0. c. inocular cada uma das séries de três tubos de caldo LST. em alguns casos a inoculação de 10 ml em LST dupla concentração.2. Quando a população for reduzida deve-se inocular 10 ml da diluição 1/100 em três tubos de LST dupla concentração. passar aos itens subseqüentes. 1/100 por ex. Por outro lado. . com populações com reduzidas as diluições devem ser mais baixas e até.1ml da diluição 1/100. tendo em vista a presença de compostos antimicrobianos. • Na análise de condimentos. como maionese e outras coberturas para salada. As diluições escolhidas vão variar em função da amostra.4 ♦ Reagente Kovac’s para o teste do indol. Alternativamente pode-se utilizar tampão fosfato pH 7. confirmativo da presença de coliformes fecais e determinar o NMP/g ou ml em uma tabela adequada às diluições inoculadas. moderno de determinação. confirmativa da presença de E. f. com ou sem produção de gás e observar sob lâmpada de luz ultravioleta (3 a 6 w). coli – método LST-MUG – este método aparece como um método Tomar todos os tubos de LST-MUG com crescimento em 24 horas ou 48 horas. numa cabina escura. Anotar o número de tubos com gás.NMP de Escherichia coli – método tradicional De cada tubo com produção de gás em 24 horas. tendo a marca comercial denominada de “colilert”. Quando o MUG é degradado pela Β-glicuronidase. Incubar as placas a 35oC/24 horas e observar se há desenvolvimento de colônias típicas E. o produto resultante (4-metilumbeliferona) é fluorescente sob luz ultravioleta. coli (nucleadas com centro negro. estriar uma alçada da cultura em placas de ágar eosina azul de metileno (EMB). transferir duas delas bem isoladas. Considerar como positivo todos os tubos que apresentarem fluorescência azul. exceto Shigella (44%) e Salmonella (29%). A partir das culturas puras. fazer coloração de Gram e inocular os meios teste para a realização de provas bioquímicas de indol. . confirmativo da presença de coliformes totais e determinar o NMP por grama ou ml em uma tabela apropriada às diluições inoculadas. Nota: O MUG é um composto não fluorescente. com ou sem brilho metálico). Havendo colônias típicas. Incubar a 35oC por 24 a 48 horas e observar se há crescimento com produção de gás. VP e citrato (IMViC). Incubar em banho-maria a 45.NMP de coliformes fecais – teste confirmativo Tomar os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo E. coli (96% das cepas). coli.NMP de coliformes totais – teste confirmativo Tomar todos os tubos com produção de gás e transferir uma alçada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo lactosado bile verde brilhante.5 d. VM. para tubos contendo ágar nutriente ou PCA inclinados e incubar a 35oC por 24 horas. Anotar o número de tubos de EC com produção de gás. ondas longas (365nm). e. Anotar o número de tubos positivos e determinar o NMP em uma tabela adequada às diluições utilizadas.5oC (com as ressalvas já apresentadas) por 24 horas e observar se há crescimento com produção de gás. mas não pelos seus acompanhantes habituais na análise de água e alimentos. de cada placa. Essa enzima é caracteristicamente produzida pela E. utilizado como substrato para indicar a presença da enzima Β-glicuronidase. gNMP de E. coli (EC). Todas são similares. multiplicado pela recíproca do volume em mililitro (fator de cada câmara) é igual a concentração de microrganismos no diluente. além do que. A principal desvantagem dos processos de contagem ao microscópio é a de não haver meios de se determinar a viabilidade das bactérias contadas. 3.6 Os tecidos de ostras. Este problema pode ser minimizado com a utilização de uma solução de alta força iônica ao invés de água ou pelo uso de uma solução de formaldeído neutralizada com fosfato ácido de potássio acrescida de traços de detergente aniônico.2 Contagem a partir de esfregaço em lâmina. As contagens são normalmente realizadas em aumento de 400 X. O número de células contado em uma determinada área.1. vezes a profundidade. de Hawksley e a de Petroff-Hauser. mexilhões e mariscos apresentam atividade natural de Βglicuronidase. .1 Contagem em câmara Para este método existem algumas câmaras disponíveis. em suspensões demasiadamente diluídas são impraticáveis e em culturas muito densas são necessárias diluições (APHA. Outra alternativa para evitar grandes erros na contagem. 3. As vantagens desses métodos diretos é que são rápidos e que podem ser obtidas outras informações como morfologia e coloração. é a utilização de recipientes e pipetas de plástico apropriado. consistindo de uma lâmina quadriculada que é coberta por uma lamínula de vidro. principalmente pipetas. O volume do líquido colocado na câmara é igual à área da mesma. Os fatores geralmente são da ordem de 4x106 a 2x107. já que as quantidades de suspensão utilizadas são muito pequenas. que pode provocar resultados falso positivos. no preparo das diluições.1 CONTAGEM CELULAR DIRETA POR MICROSCOPIA Vários métodos microscópicos envolvendo contagem em câmaras e esfregaços em lâminas têm sido desenvolvidos para a enumeração de microrganismos em alimentos. pela aderência de células às paredes. entre eles a adsorção de bactérias na superfície de vidrarias. que se fixa a uma certa distância da superfície. muito embora a câmara de Hawksley permita o uso de lentes de imersão. incluindo a de Helber. A vantagem do formaldeído é que ele inibe o crescimento e motilidade das células enquanto que a solução fosfato ácida de potássio-detergente previne possíveis agregações.1. 3 MÉTODOS QUANTITATIVOS DIRETOS 3. Alguns fatores podem interferir diminuindo a precisão do método. 1992). 3 Contagem a partir de microscopia de fluorescência. uma das técnicas que mais rapidamente oferece resultados. pela epi-iluminação (fonte de luz colocada entre a lente ocular e a objetiva) e microscopia de fluorescência. foi possível criar o método da epifluorescência.7 Este método foi desenvolvido e amplamente utilizado na análise de leite. Assim. mas sua utilização tem sido recomendada para outros produtos também. A contagem no microscópio de fluorescência pode ser automatizada. microrganismos viáveis e não viáveis são enumerados por microscopia. causada principalmente pelo calor. é filtrada através de uma membrana de policarbonato que retém os microrganismos. O princípio geral consiste em se fazer um esfregaço de uma quantidade conhecida do alimento em uma área pré estabelecida da lâmina e. a amostra devidamente homogeneizada e tratada com enzimas e tensoativos se necessário. enquanto células mortas tem fluorescência verde. Consiste na técnica onde. células viáveis apresentam fluorescência laranjaavermelhada. resultante da concentração das células na superfície da membrana filtrante. após fixação e coloração do mesmo. através da utilização de um processador de imagem acoplado a um contador computadorizado. Essa membrana é então corada com um fluorocromo nucleofílico (alaranjado de acridina) e observada em um microscópio de fluorescência. A vantagem do método é o fato de ser rápido e da lâmina permanecer como referência futura e a desvantagem é o fato de poder ser aplicado somente em alimentos que contêm altas populações microbianas. Métodos similares foram aplicados para ovos e numerosos outros tipos de alimentos.1. Essa técnica tem sido utilizada satisfatoriamente para contagem de células viáveis e não viáveis em leite. Na sua realização. utilizando-se para tal a média dos campos contados e o fator do microscópio utilizado. realizar a contagem em campos microscópicos. Alguns autores consideram esta técnica muito cansativa. Nesta técnica. Há . o que pode prejudicar sua correlação com os métodos convencionais de contagem. 3. O corante permite a diferenciação das células viáveis das não viáveis. A epifluorescência tem boa sensibilidade. Esta é uma técnica rápida para contagem de microrganismos que não depende de seu cultivo e conseqüente formação de colônias. sendo. Além disso. com certeza. podem alterar a fluorescência das células. pois DNA e RNA corados apresentam fluorescência de coloração diferente em função da fase do crescimento microbiano. O valor final será obtido através de diferentes arranjos matemáticos. alguns fatores. O fator do microscópio consiste na área abrangida pela sua objetiva. como injúria das bactérias. Bacillus cereus. Clostridium perfringens. principalmente. A técnica de contagem de colônias é uma técnica geral.8 no mercado instrumentos que executam automaticamente todas as etapas (filtração. é possível selecionar o grupo. secagem e contagem) da técnica de epifluorescência. destinados. cadeias. no entanto. os bolores e leveduras e os clostrídios sulfito redutores. cachos. etc. 3. Para isto seria necessário um meio nutritivo universal em primeiro lugar. por volta de 1800. todos os microrganismos contidos em determinado alimento. no qual todas as exigências nutritivas dos microrganismos ali semeados fossem satisfeitas. não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células. 1997). como os aeróbios ou facultativos mesófilos. O custo elevado destes equipamentos. meio seletivo diferencial) e as condições de incubação (temperatura e atmosfera). psicrotróficos e termófilos. cada célula microbiana presente em um alimento pode formar uma colônia visível quando misturada a um meio sólido que lhe permita o crescimento. que pode ser utilizada tanto para a contagem de grandes grupos microbianos. como Staphylococcus aureus. A relação correta é feita entre o número de . Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares. como também para a contagem de gêneros e espécies em particular. A contagem de aeróbios em placa é uma das maiores aplicações da técnica de contagem de colônias. torna o seu uso limitado a laboratórios de grande porte (FRANCO. tendo-se em vista que o termo total é muito amplo e abrangeria. através da contagem de colônias. Esses métodos têm sido utilizados de forma extensiva na determinação da população de microrganismos viáveis em alimentos. porém as condições ambientais peculiares a cada grupo não seriam resolvidas. Há também aparelhos altamente especializados que associam a técnica de epifluorescência à técnica de citometria de fluxo. meio seletivo. Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento. por exemplo (SILVA e cols. o que é praticamente impossível ao levarmos em conta os diferentes nutrientes e condições ambientais que cada um necessitaria. termo que foi abandonado. O número de microrganismos tem sido um dos indicadores microbiológicos da qualidade das águas e alimentos mais comumente utilizados. teoricamente.). gênero ou espécie que se deseja contar. Esses métodos de contagem são baseados no fato de que. permitiu o desenvolvimento de métodos de quantificação microbiana. Inicialmente esta contagem era denominada “contagem total”. coloração. tétrades. utilizando-se com mais propriedade “contagem padrão”. 1995). à análise de leite e laticínios.2 MÉTODOS DE CONTAGEM DE COLÔNIAS A introdução dos meios a base de ágar. lavagem.. e de condimentos. em função da viscosidade. partindo da diluição inicial.0 ml da diluição 10-2. Após a colocação da amostra diluída nas placas. para facilitar a posterior homogeneização com o meio de cultura. no sentido de aumentar a precisão das contagens. deve-se plaquear 10. deve-se verter 15 a 20 ml do meio sólido. O recomendado é que sejam inoculadas no mínimo três diluições.9 colônias e o número de “unidades formadoras de colônias” (UFC). em função da presença de inibidores. ♦ Contagem pelo método de plaqueamento em gotas calibradas. em uma superfície plana. de forma a obter placas com 25 a 250 colônias. As diluições devem ser selecionadas em função do nível de contaminação estimado da amostra. em movimentos na forma de oito ou em círculos. esterilizadas e vazias. distribuídos em 5 placas. A forma de movimentar as placas para a mistura .0 ml de diluições adequadas em placas de Petri separadas. ♦ Método de contagem através de petrifilm. como novos métodos de análise microbiológica de alimentos. 8 a 10 vezes no sentido horário e anti-horário. próximo a bico de Bunsen.2. o que vai variar com o grupo microbiano estudado. consiste na inoculação de 1. recomenda-se então inocular mais do que três diluições. sendo algumas tradicionalmente conhecidas e outras denominadas. abrindo a placa apenas o suficiente para inserir a pipeta. também denominado de “pour plate”. Quando não for possível estimar previamente o nível de contaminação da amostra. Quando as contagens iniciais forem muito baixas pode-se inocular 10 ml da menor diluição em cinco placas (2 ml/placa). Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. em duplicata ou triplicata. ♦ Método de contagem em filtro-membrana com grade hidrofóbica (HGMF) 3.1 Método da contagem através de plaqueamento em profundidade. ♦ Contagem pelo método da membrana filtrante Dentre os métodos ditos modernos tem-se como os mais comuns: ♦ Método de contagem pelo plaqueamento em espiral. que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos. Nesses casos. Na análise de espessantes. ♦ Contagem pelo método de plaqueamento em superfície. Este método. O inóculo deve ser depositado fora do centro da placa. atualmente. previamente fundido e resfriado a 45oC. A técnica de contagem de colônias pode ser utilizada através de diferentes metodologias. quando as populações esperadas forem muito baixas. pode ser necessário inocular diluições mais elevadas. Dentre as técnicas tradicionalmente conhecidas tem-se: ♦ Contagem pelo método de plaqueamento em profundidade. assunto que será discutido individualmente para cada um deles. A movimentação das placas deve ser feita cuidadosamente. As condições de incubação serão variáveis de acordo com o grupo microbiano pesquisado. ♦ Meio de cultura: ágar padrão para contagem (PCA)fundido e resfriado a 45oC. ♦ Tubos de diluição: 3 a 5 com 9. Os psicrotróficos podem ser afetados pela temperatura do ágar utilizado no plaqueamento.1 Aplicações mais comuns do método de contagem em profundidade Muito embora a contagem em profundidade seja utilizada de forma rotineira na determinação da população microrganismos psicrotróficos e bolores e leveduras. psicrotróficos e termófilos viáveis ♦ Placas de Petri: esterilizadas e vazias. reguladas a 35 e 55oC. não se devendo alternar ora uma prática.10 do inóculo deve ser mantida pelo analista durante toda a análise. para evitar a multiplicação microbiana ou a aderência do inóculo no vidro das placas. ora outra. Nos dois casos é recomendado a utilização da técnica de semeadura em superfície (SILVA e cols. é na contagem dos mesófilos e de clostrídios sulfito redutores que ela tem sua maior aplicação. psicrotróficos e termófilos viáveis. ♦ Pipetas: 3 a 5 de 1. 3.Material requerido para a análise Preparação da amostra e diluições seriadas ♦ Diluente: 225 ml de água peptonada a 0. Após a solidificação do ágar.0 ml.1. ♦ Incubadora: tipo BOD. Contagem padrão em placas de microrganismos heterotróficos mesófilos. pela necessidade de oxigênio. Esta metodologia é utilizada de forma rotineira na contagem padrão de microrganismos heterotróficos mesófilos. . A mistura do meio de cultura com o inóculo deve ser feita imediatamente após a adição do meio. enquanto que os bolores e leveduras se desenvolvem melhor na superfície do ágar. inverter as placas e incubar.0 ml de H2Op. contagem de bolores e leveduras e contagem de clostrídios sulfito redutores. regulada a 7oC.. O tempo decorrido entre a preparação da amostra e a inoculação do ágar não deve ultrapassar a 20 minutos.0 ou 2. 1997). para não haver risco de solidificação do ágar.2. a. para evitar respingos de meio nas bordas ou nas tampas das placas.1% (H2Op). ♦ Estufa bacteriológica: duas. após a solidificação do ágar homogeneizado com a amostra.11 Contagem de bolores e leveduras ♦ Placas de Petri ♦ Meio de cultura: ágar padrão para contagem. Contagem de clostrídios sulfito redutores ♦ Placas de Petri ♦ Meio de cultura: ágar sulfito polimixina sulfadiazina (SPS).Procedimento As condutas utilizadas nas determinações dos grupos microbianos foram apresentadas na descrição do método. No caso de produtos lácteos recomenda-se a incubação a 32oC/48 horas. ágar batata dextrose ou ágar extrato de malte. com a finalidade de aumentar as condições de anaerobiose. Nos dois casos em anaerobiose. Algumas literaturas recomendam a incubação a 46oC/18 a 24 horas. fundido e resfriado a 45oc. ♦ Psicrotróficos: 7oC/10 dias. psicrotróficos e termófilos. regulada a 22-25oC.5 ou acrescentados de cloranfenicol na proporção de 100 mg/litro. b. d.Contagem das colônias e cálculo dos resultados Para a leitura dos resultados devem ser selecionadas placas que contenham entre 25 e 250 colônias na contagem padrão de microrganismos mesófilos. ♦ Bolores e leveduras: 22-25oC/3 a 5 dias. após a exaustão do ar e introdução de 90% de gás nitrogênio e 10% de CO2 ou em jarras com o uso de “GasPak Anaerobic System” (BBL) ou “Anaerocult A” (Merck). Como particularidade. ♦ Clostrídios sulfito redutores: 35-37oC/18 a 24 horas. inverter as placas e incubar em temperatura e tempo adequados aos diferentes grupos microbianos estudados. acidificados a pH 3. ♦ Termófilos: 55oC/48 horas. quais sejam: ♦ Mesófilos: 35-37oC/24 a 48 horas. fundido e resfriado a 45oC. ♦ Incubadora: tipo BOD. ♦ Sistema gerador de anaerobiose. . que pode ser obtida em estufa própria. entre 20 e 200 colônias na contagem de clostrídios sulfito redutores e de 10 a 150 colônias na contagem de bolores e leveduras. c. na determinação de clostrídios sulfito redutores deve ser acrescentado uma segunda camada de ágar.Incubação Após a solidificação completa do meio de cultura utilizado. 2 Contagem pelo método de plaqueamento em superfície Para o plaqueamento em superfície as placas devem ser previamente preparadas. Antes da utilização a superfície do meio deve ser secada.1% (H2Op). Nesta técnica algumas cuidados devem ser tomados. em quantidade de 0.12 3. ou 10 UFC/ml no caso de amostras líquidas. conforme já explicado.0 ml para a transferência do inóculo de 0. distribuindo esse volume por várias placas. 3. que devem ser escolhidas no sentido de permitir a contagem no momento da leitura. entre os quais: • • • Usar pipetas de. . Não assoprar a pipeta nem mudar de posição para liberar a última gota. o que pode ser feito em estufa (50oC/2 horas ou 30-35oC/1 noite) ou em câmara de fluxo laminar (0.1 Aplicações mais comuns do método de plaqueamento em superfície O método de semeadura em superfície tem sua maior aplicação.1 ml.2. o limite de detecção do método passa para 100 UFC/g. Devem ser inoculadas diluições adequadas da amostra. a título de exemplo. no máximo. na contagem de Staphylococcus sp.2.1 ml.1 ml. A seguir. dentro da pesquisa de microrganismos indicadores.. deve-se inocular um volume maior da primeira diluição. A inoculação é realizada na superfície das placas previamente preparadas e o inóculo deve ser espalhado através da utilização de uma alça de Drigalski ou um bastão em forma de “L”. 1. Este método é também utilizado na contagem de Bacillus cereus e tem sido recomendado também na contagem de microrganismos psicrotróficos e de bolores e leveduras.3 ml e uma placa com 0. para amostras sólidas. será descrito a utilização deste método na contagem de Staphylococcus sp. com 15 a 20 ml do meio adequado ao grupo microbiano que se objetiva quantificar. A distribuição mais comumente utilizada é três placas com 0. Como o volume de inóculo utilizado no plaqueamento em superfície é de 10 vezes menor do que o usado no plaqueamento em profundidade.2.5 a 1 hora. ou Staphylococcus aureus. a. Caso o nível de contaminação esperado esteja abaixo dessa faixa.Material requerido para a análise Preparação da amostra e diluições seriadas ♦ Diluente: 225 ml de água peptonada a 0. com as tampas parcialmente abertas). Fazer o espalhamento da placa de maior diluição para a placa de menor diluição. ♦ Tubos de diluição: 3 a 5 tubos com 9 ml de H2Op. lisas. ♦ Tubos com caldo infusão de cérebro e coração. Se as contagens estimadas de estafilococos na amostra forem menores que 100/g ou ml. prepara-se e seca-se as placas com o meio próprio ao grupo em estudo e deposita-se sobre a superfície gotas calibradas (micropipetas) de 0. distribuindo o volume por quatro placas. . com bordas perfeitas. colônias atípicas podem apresentar-se negras ou cinzentas. d. Após a inoculação as placas devem ser mantidas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Cada placa pode ser dividida em quatro partes.Procedimento Selecionar três diluições adequadas da amostra.Contagem das colônias presuntivas Selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar colônias típicas de estafilococos quais sejam: colônias circulares. 3. para que as gotas sejam absorvidas e somente após este tempo é que as placas devem ser invertidas e submetidas à incubação.01 ou 0. até que todo o excesso de líquido seja absorvido.0 ou 2. b. das placas de maior para as placas de menor diluição. ♦ Estufa incubadora regulada a 35oC. Eventualmente. rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca. sem um ou ambos os halos típicos. no sentido de se obter placas que contenham 20 e 200 colônias.3 Contagem pelo método de plaqueamento em gotas calibradas Neste método.1 ml de cada uma delas em superfície de placas com ágar de Baird-Parker.0 ml. previamente preparadas e secas. a 35oc por 48 horas. pequenas. com apenas 2 placas pode-se semear oito diluições em duplicata.0 ml da primeira diluição. convexas.2. Espalhar o inóculo com uma alça de Drigalsky.3 ml e uma com 0. Esta deve ser pelo tempo e na temperatura adequada ao grupo estudado.Incubação Aguardar que as placas sequem completamente e incubar invertidas. ♦ Tubos com ágar tripticase soja. de tal modo que podem ser inoculadas duas gotas de cada diluição em cada uma das partes.1 ml. e inocular 0. negras. inocular 1. Contagem em placa ♦ 3 a 6 placas com ágar de Baird-Parker. Desta maneira. ♦ Plasma de coelho para a realização da prova da coagulase.02 ml da amostra diluída.13 ♦ Pipetas: 3 a 5 de 1. 3 com 0. c. na área circunvizinha a ela. A grande vantagem do método baseia-se na economia. Como vantagens desse método é o fato de que até 10 diluições de uma ou mais amostras podem ser acomodadas em uma única placa de Petri. 3.000 UFC/ml. etc. o qual retêm a membrana filtrante. porém. que é fundamental.). A maior desvantagem é a sua pouca precisão. no sentido de aumentar a eficiência. o que possibilita que as contagens sejam superestimadas. 1 litro. imprimindo-se um leve movimento rotatório à placa. As membranas utilizadas podem ter poros de diferentes diâmetros. 3.4 Contagem pelo método da membrana filtrante Este sistema tem como princípio a utilização de uma membrana de éster de celulose. O sistema utiliza um aparelho de filtração. Como desvantagem ainda tem-se o fato de que ele se aplica apenas a líquidos não viscosos com população acima de 2500 UFC/ml ou para os viscosos ou alimentos sólidos com populações superiores a 25.1 Aplicações mais comuns da técnica da membrana filtrante . por 50 ou 100. dependendo da quantidade inoculada e pelo fator de diluição. particularmente naqueles casos em que o grupo microbiano encontra-se em número reduzido.22 micrômetros para a esterilização de soluções e o de 0. já que permite a análise de quantidades maiores (500 ml.2. Para o resultado final em UFC/g ou ml da amostra multiplica-se a média do valor obtido na gota.4. Quando utilizada na quantificação de microrganismos estas membranas são colocadas diretamente na superfície do meio de cultura específico ao grupo estudado. com poros capazes de permitir a passagem de substâncias líquidas e de reter partículas. Este sistema tem grande utilidade na análise de amostras de água. iniciando-se na calibragem da gota.14 Contar todas as colônias nas diluições que apresentarem um número inferior a 20 colônias por gota.2. acoplado a uma bomba de vácuo que tem como objetivo forçar a filtração. inclusive microrganismos em suspensão. particularmente naqueles casos em que não se tem idéia da contagem de microrganismos em uma determinada amostra e pode-se utilizar muitas diluições para achar a que melhor possibilitaria a contagem. na dificuldade de se contar mais que 20 UFC/gota e no fato de que os microrganismos podem estar se dividindo antes da gota ser totalmente absorvida pelo ágar. Normalmente deve-se deixar a gota secar em repouso.45 micrômetros para retenção e quantificação de microrganismos. sendo o mais comum o diâmetro de 0. pode-se espalhá-la. 3. compilados no Bacteriolgical Analytical Manual editado pelo FDA ou no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Forma-se um gradiente de concentração (UFC/cm2) que é maior no centro da placa e diminui à medida que se aproxima das bordas. editado pela APHA. homogeneizada em diluente quando necessário. A quantidade de amostra inoculada decresce à medida que se aproxima da extremidade da placa. através de um instrumento denominado plaqueador em espiral. À medida que a placa gira. transferindo-a para a superfície de uma placa de Petri com o meio de cultura. Esse problema pode ser evitado através da filtração do produto homogeneizado ou de seu tratamento com enzimas e/ou tensoativos especialmente recomendados para este fim. a cânula se locomove do centro da placa para suas bordas. Assim. o qual relaciona a sua área e a quantidade de amostra inoculada é usado para a contagem das colônias em uma área apropriada da placa. succiona uma alíquota da amostra em análise. 1993). ela vem sendo utilizada na determinação de coliformes totais. posicionada sobre uma plataforma giratória. é a necessidade de se ter um alimento bem homogeneizado e perfeitamente fluido para que a cânula não venha a entupir durante a semeadura. O inconveniente do sistema. sendo considerado como um dos novos métodos de análise microbiológica de alimentos.2. a alíquota escoa pela cânula. coliformes fecais. . computadorizados. O Brasil somente admite como oficial os métodos aprovados pela AOAC e FDA (Food and Drug Administration). além do custo do equipamento. após a sua inclusão como novo método em 1977. o mesmo recebeu recomendação oficial da AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) em 1981 (ADREWS. Este método tem sua maior utilização na contagem de microrganismos heterotróficos. Deste forma.5 Método de contagem pelo plaqueamento em espiral Consiste em um sistema em que um conhecido volume da amostra é dispensado sobre uma placa de Petri. o que resulta em um plaqueamento segundo uma espiral (espiral de Archimedes). Um sistema quadriculado (molde no qual esta impresso o desenho de uma placa subdividida em segmentos). permitem a obtenção imediata do número de UFC por grama ou mililitro de produto. que. estreptococos fecais (enterococos) etc. A contagem de colônias obtidas através do plaqueamento em espiral pode ser feita manualmente ou através de contadores automáticos. O plaqueador em espiral é provido de uma cânula de teflon que. através de vácuo. Durante o escoamento. em movimento rotatório na forma de uma espiral de Archimedes.15 O uso mais comum da técnica da membrana filtrante está na determinação de microrganismos indicadores em amostras de água. principalmente em produtos processados. reidratáveis. em apenas um frasco com o meio de cultura favorável ao microrganismo ou grupo estudado. pode ser utilizado em trabalhos de campo. salmonelas e outros tipos de microrganismos em alguns alimentos. O inóculo deve ser espalhado com um espalhador. coli. que na face voltada para o filme inferior é revestido por géis e um corante indicador.2. na detecção de Staphylococcus aureus. Como vantagens do método são citados a inexistência de qualquer trabalho de preparação de meios. com populações reduzidas e provável incidência de células injuriadas. bolores e leveduras. . coliformes totais e Escherichia coli. O filme inferior. por ex. em seguida. Este método vem sendo utilizado na determinação de microrganismos aeróbios mesófilos. Para cada um destes o meio de cultura e as condições de incubação e leitura são variáveis. é composto de um papel quadriculado revestido de polietileno. de polipropileno. composto por dois filmes estéreis. colônias azuis com gás. Os coliformes totais apresentam colônias vermelhas com bolhas de gás e a E.6 Método de contagem através de petrifilm O petrifilm é uma modificação da contagem de células viáveis em placas. a inoculação é extremamente rápida e simples. recoberto de nutrientes desidratados e géis hidrossolúveis a frio.. impregnados pelo meio de cultura específico ao grupo estudado e por substâncias geleificantes solúveis em água. por leve pressão manual.16 3. 4 TESTE DE PRESENÇA/AUSÊNCIA Este teste é uma modificação simplificada da técnica de tubos múltiplos (NMP). Na sua realização usa-se um volume maior da amostra ou de suas diluições. além de um contador tradicional de colônias. este é coberto com o filme superior. o espaço ocupado para incubação é mínimo e não exige equipamentos de leitura. Este teste tem sua aplicação na avaliação da presença de alguns microrganismos. Neste filme é inoculado 1 ml das diluições da amostra e. ♦ Contagem de mesófilos – o meio utilizado é similar ao ágar padrão para contagem e a incubação nas mesmas condições do método tradicional. ♦ Coliformes totais e Escherichia coli – o meio utilizado é o violet red bile ágar. Tem sido aplicado. com substrato cromogênico para a ação da Β-glicuronidase. 9-12.E. Update on validation of microbiological methods by AOAC International.A. Biochemical tests for identification of medical bacteria. 434p. 701p. N. . JUNQUEIRA.925-931.F. SCHELEIFER. 1986. B. São Paulo: Varela. 295p. V.77. BRASIL. 1993. p.H. KLOOS.1013-1036. 312p. SILVA. v. 1976. 1997. 9ed. n.C. 1978.. The Williams & Wilkins Co.2 Baltimore: Williams & Wilkins. 2ed.H. Coordenadoria do Sistema de Laboratórios. N. Ministério da Agricultura. v. INTERNATIONAL COMMITTEE ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATION FOR FOOD (ICMSF) Microrganisms in food. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. Mac FADDIN. Secretaria nacional de Defesa Agropecuária. Novas técnicas de análise microbiológica de alimentos. SILVEIRA.. 1995. Higiene Alimentar.4.A. Washington: American Public Health Association. W. FRANCO.M. W. 1981. V..17 6 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION Committee on microbiological methods for foods. Arlington.. p.9. Bergey’s manual of systematic bacteriology. Toronto: University Press. Brasília: Laboratório Nacional de Referência Animal. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. P. ANDREWS.. 1992.Their significance and methods of enumeration. n.F. 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Report "Técnicas e Métodos Utilizados Na Avaliação"