TECNICAS DE INPORTANCIA EN EL INMUNODIAGNOSTICO.Información recopilada de interés veterinario. Por; Alba Miriam Poche Ceballos LCV. UDCA 1. AGLUTINACIÓN. Son técnicas más sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia de Ac específicos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos a sus Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve a simple vista. Esta técnica puede ser: - Cualitativa: resultado positivo o negativo. - Cuantitativo: sí se hace una dilución seriada del suero y se calcula el título de Ac. Título de Ac es la inversa de la máxima dilución del suero que da positiva la reacción de aglutinación. Dependiendo de la conformación del Ag, se pueden distinguir dos tipos básicos de aglutinación: 1.1.1. AGLUTINACIÓN DIRECTA. Se utilizan Ag formes o particulados en suspensión (bacterias protozoos o esporas). Todos ellos exhiben determinantes antigénicos o epitopos en su periferia. Cuando esta suspensión antigénica se enfrenta a un suero problema: - REACCIÓN POSITIVA: Los Ac frente a esos epitopos producirán la correspondiente aglutinación y formación de IC, evidenciándose mediante la aparición de un velo malla característico en el medio. - REACCIÓN NEGATIVA: sí no hay Ac, no se formaran los IC y en consecuencia los Ag particulados sedimentan formándose un anillo o botón bien definido en el fondo del tubo o pocillo de reacción. 2.1.2. AGLUTINACIÓN INDIRECTA. Para esta técnica se utilizan Ag particulado soluble sensibilizado (epitopos sobre un soporte sólido inerte en solución). Se usan bolas de látex, carbón activo, bentonita, etc. 1.1.2.1. AGLUTINACIÓN INDIRECTA EN PORTA. Se suele efectuar sobre un porta y no en tubo o placa, mezclándose una gota de látex sensibilizado y una gota de suero, verificándose la reacción en un tiempo muy corto (2-10 minutos). La reacción positiva se evidencia por la aparición de un moteado característico, ausente en la negativa. Normalmente la técnica es cualitativa, con resultado +/-; pero puede convertirse en cuantitativo, si la reacción se efectúa con diluciones seriadas. 1.1.2.2. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA. Cuando en lugar de partículas inertes se usan eritrocitos convenientemente tratados (hematíes de carnero tanizados), como soporte de los Ag (hematíes sensibilizados), se denomina HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI). Se efectúa en placa de microtitulacion, con diluciones seriadas de los sueros y la lectura es similar a la de la aglutinación directa. Esta prueba es un desarrollo directo de la prueba de Coombs que se usa para determinar Ac contra Ag de la superficie de los eritrocitos. - PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA: detecta Ac contra el Ag Rh en la madre gestante. - PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: detecta la presencia de IC sobre la superficie de los eritrocitos del recién nacido. 1.1.3. INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN. Una variante es la INHIBICIÓN DE LA HAMAGLUTINACIÓN (IHA), en la que los posibles Ac existentes en la muestra problema son neutralizados previamente, por lo que la lectura de resultados se interpreta en sentido contrario a la hemaglutinación: - REACCIÓN POSITIVA: presencia de botón. - REACCIÓN NEGATIVA: aparición de velo. Esta técnica se usa para diagnosticar microorganismos que por sí solos son capaces aglutinar glóbulos rojos, como el virus de la rubéola. Sí en el suero del enfermo hay contra el virus de la rubéola, se produce un bloqueo de los virus y se inhibe aglutinación. La ausencia de aglutinación se interpreta como POSITIVO, porque hay contra el virus de la rubéola. de Ac la Ac 1.2. REACCIONES DE LISIS. Las reacciones inmunológicas que utilizan el complemento se basan en su capacidad lítica. Esta capacidad lítica esta disminuida en enfermedades autoinmunes, deficiencias congénitas y enfermedades infecciosas. La formación de IC conlleva en muchos casos la fijación de complemento. Esta fijación no es visible, pero puede revelarse al manifestarse alguna de las reacciones biológicas del complemento (hemolisis). 1.2.1. REACCIONES PARA MEDIR EL COMPLEMENTO. 1.2.1.1. CAPACIDAD HEMOLÍTICA (CH50). Es la principal prueba en el screning de los déficits del complemento Se determina la concentración de suero que es capaz de producir la lisis del 50% de un preparado estándar de eritrocitos sensibilizados con Ac antieritrocitos. La prueba se efectúa en tubos o placas, de acuerdo con la siguiente metodología: a) Sensibilización de hematies de carnero, previamente lavados, por incubación con hemolisina de carnero (Ac antieritrocitos de carnero). b) Preparación de los sueros: se disponen tubos con diferentes cantidades de suero, a los que se añade un volumen determinado de hematies de carnero sensibilizados. Como control se dispone un tubo de lisis total, que contiene sólo hematies sensibilizados y agua destilada. Después de la incubación se efectúa la lectura en el espectrofotómetro. c) Interpretación de resultados: - Cada lectura se divide por la correspondiente a la lisis total y se multiplica por 100. - Se representa gráficamente los ml de suero (ordenadas) frente a los porcentajes calculados (abcisas) en un papel semilogarítmico. - Se determina por extrapolación el valor correspondiente al 50%, que será la cantidad de suero necesaria para lograr una capacidad hemolítica 50. 1.2.1.2. HEMOLISIS RADIAL SIMPLE. Es similar a la inmunodifusión radial simple, pero aquí se produce hemolisis (se forma un halo de hemolisis). Mide la actividad total de la vía clásica o CH100. 1.2.1.3. OTROS MÉTODOS PARA MEDIR EL COMPLEMENTO. Se usan para medir los componentes individuales del complemento por separado: - Nivel total: RIA, ELISA, nefelometría, turbidimetría. - Nivel funcional: hemolisis de eritrocitos sensibilizados o reacción enzimática con un sustrato que genera calor. 1.2.1.4. REACCIONES QUE UTILIZAN EL FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (RFC). COMPLEMENTO: REACCIÓN DE - Esta prueba se usa para detectar Ac o Ag. - El principio básico de una prueba de fijación de complemento es la activación y el consumo (fijación) del complemento en presencia de una reacción Ag:Ac específica. - El sistema de detección usado es la lisis de GR en la presencia del antisuero específico para los GR (sistema hemolítico) si el complemento no se consume en la reacción Ag:Ac inicial. - En la mayoría de las reacciones Ag-Ac, el complemento se une al complejo y es usado o fijado. Este proceso puede usarse para detectar cantidades muy pequeñas de Acs. La concentración que detecta es de mgr/ml. - Su ejecución requiere de gran cuidado y buenos controles. - Se hace en dos etapas: la fijación del C’ y el revelado de la reacción con el sistema hemolítico. c) Se añade el sistema revelador de la reacción o sistema indicador. En caso contrario. . b) Se añade el complemento a la mezcla.REACCIÓN NEGATIVA: hay hemolisis porque el complemento no se consumió en la reacción inicial. el complemento quedara libre.Las fases de la técnica: a) Se añade una cantidad determinada del Ag específico de aquellos Ac que se pretende detectar. Indica la ausencia de Ac en el suero problema. Sí hay IC. d) Lectura de la prueba: . . Hay que realizar controles porque los IC y algunos Ag bacterianos pueden fijar el complemento. constituido por una mezcla de células indicadoras (eritrocitos de carnero) y una cantidad de Ac subaglutinante (Ac antieritrocitos de carnero). si hay Ac en el suero problema. Indica que hay Ac en el suero problema.REACCIÓN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumió en la reacción inicial. se unirán a los Ag y se forman IC. éstos fijaran el complemento y se consumirá. La prueba suele efectuarse en placas de plástico y realizando un banco de dilución para hallar el título de Ac (ultimo pocillo en el que la reacción es positiva). A causa de la disipación de energía durante el estado excitado. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA . . Consecuencias: La energía de S1’ es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia. sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente molecular. aunque también de la fuente de excitación (comúnmente un láser de ion argón. . – La intensidad de la señal depende de los mismos parámetros que la absorbancia. .Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de absorción del fluoróforo. existen otros procesos. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del espectro de excitación a la longitud de onda de excitación. la energía de este fotón es menor.El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia.2. Para moléculas poliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por un espectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión. 3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite.Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están próximos (l más cortas y l más largas respectivamente). lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S0.El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita. pasando a un estado electrónico excitado S1’ 2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito (típicamente 1-10 x 10-9 segundos). FLUORESCENCIA Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas (fluoróforos) 1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe. 2. La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (h?EX – h?EM) que es fundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia.1. ya que la emisión del fluoróforo permite distinguirse del background. . El ancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dos fluoróforos son detectados simultáneamente. Esto es importante en la elección de los filtros. . . El derivado triazínico de la fluoresceína. tiene un alto rendimiento cuántico y es relativamente hidrofílico. . Es un proceso de desexcitatción no radiativa provocado por una molécula ajena al fluoróforo (compuestos no fluorescentes).El segundo fluorocromo más popular es el isotiocianato tetrametil de rodamina (TRITC).longitud de 488 nm) y de la eficiencia de recolección del detector.2. . La intensa fluorescencia roja del TRITC es fácilmente distinguible de la verde del FITC.La detección de autofluorescencia puede ser minimizada por la selección de filtros adecuados que reduzcan la transmisión de E2 respecto de E1. que es mucho más fluorescente que el isotiocianato de rodamina. El FITC es barato.La elección de un fluorocromo dependerá de una serie de factores. . ELECCIÓN DEL FLUOROCROMO . sin embargo estos reactivos son tóxicos para células vivas. Al proceso se lo denomina “quenching” de la fluorescencia 2. Otras señales ópticas (como S2) quizás correspondan al background o a una segunda sonda fluorescente. La rápida pérdida de la fluorescencia bajo una intensa iluminación ultravioleta puede ser solucionado por el añadido al preparado de fenilen diamina o n-propil galato. Debido a ello por varios años fueros los dos fluorocromos de elección para experimentos con fluorescencia combinada.Las muestras biológicas marcadas con fluorescencia contienen típicamente más de una especie fluorescente. que recibe el nombre de quencher. el diclorotriazinilamino fluoresceína (DTAF) posee propiedades ópticas muy similares al FITC pero es mucho más estable. Si se necesita un único color el fluorocromo de elección será el FITC. haciendo que el aislamiento de la señal sea compleja. La pérdida de la fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC.Quenching de fluorescencia: En muestras biológicas el fluoróforo está en solución y puede interaccionar con otras moléculas. Como consecuencia de esta interacción se puede producir una perdida de emisión fluorescente. o cultivo de tejidos en capa única. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l más largas. exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos.1. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Se realiza un acople a un . .3. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia.La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que sólo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. FUNDAMENTO. Se coloca entre el objeto y el observador. Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos. Barrera: Transparente a l largas bloqueando l cortas. . las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Que no llegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA . Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra. 2.2.3. frotis de microorganismos o de células.Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIÓN DE ANTICUERPOS POR SUSTANCIAS FLUORESCENTES A) Conjugados Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados Un buen conjugado debe tener: .Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople También influyen: .Calidad y concentración de los Acs en el suero .Homogeneidad de marcación .Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas B) Anticuerpos .Verificar título de anticuerpos .Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar .Fluorescencia intensa .Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.3.anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia 2. Disponibilidad filtros D) Intensidad de marcación . mayor intensidad .Purificar la fracción de Ig a marcar .Propiedades de la sustancia fluorescente .Intensidad de marcación .Mayor intensidad de marcación.2.Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente .Alteraciones en las propiedades inmunológicas de los anticuerpos (6 ó 7 moléculas de fluoresceína/ molécula de Ac es el límite máximo) .Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales .Disminución del PI de las proteínas . .Fluorocromo puede ser conjugado en un número variable a cada molécula de proteína.Reacción específica con los antígenos Depende de: . C) Fluorocromos -El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtración en geles. resultando diferentes grados de marcación.Marcación excesiva: . INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.Altamente marcadas: Fluorescencia inespecífica . 2. parásitos o cortes de parásitos.4. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA 2.3.Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa 2. . Los Ag utilizados son formes o partículas (cortes de tejidos.3. Es una técnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac específicos en el suero. etc).Quenching de fluorescencia rendimiento de emisión) (disminución del E) Homogeneidad de marcación .3.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE. que recibe el nombre genérico de conjugado fluorescente. En esta técnica la visualización del IC no es directa. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).4. bacterias. Ac Policlonal Fuerza de señal Especificidad Excelente Ac Monoclonal Regular a Buena Pool de monoclonales Excelente Excelente pero con posible reacción cruzada Excelente Ventajas Buena. sino que se lleva a cabo por intervención de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac..Medianamente marcadas: Resultados más satisfactorios .1. pero a veces el background es alto Señal fuerte Específico Señal fuerte Desventajas No renovable Baja señal Específico Background Se titular Ac Disponibilidad necesita 2. . los IC formados se ponen de manifiesto por observación del porta en un microscopio provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). En la práctica se emplea la palabra para designar el método junto con el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME). En el segundo paso. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI). Es una técnica mucho más sensible. A. se lava y se leen los resultados. se lavan y se leen los resultados. que se revelan con Ac anti C3b fluoresceinado. después de añadir el Ac.3. se añade complemento fresco. se incuba. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME . En los tres casos. que se fija alrededor de donde se han fijado los Ac.2. INMUNOFLUORESCENCIA COMPLEMENTO. 2. una molécula de Ac puede fijar muchas moléculas de C3b al Ag. PRINCIPIOS BÁSICOS.4. El patrón de fluorescencia es característico de cada Ag. 2. 3. previamente fijado en un porta o placa. Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con enfermedades autoinmunes.Se añade la solución de Ac fluorescente sobre el Ag. INDIRECTA AMPLIFICADA POR Se usa para detectar Ac fijadores del complemento.4. se lava y luego se añade el anti-Ac fluoresceinado contra la región Fc del primero. Debido a los pasos de amplificación de la vía clásica del complemento. HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA Histoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método de análisis empleado. Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicos en las células y tejidos. El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado. Hidrólisis del DNA con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas y dejar en libertad los grupos aldehídicos del azucar. 3. ÁCIDOS NUCLÉICOS. LÍPIDOS. Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN NEGRO. 3 . .EL MÉTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECÍFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO QUÍMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. Los fijadores más utilizados son: .Glutaraldehído para el ME. 2. . .EL ión férrico se demuestra por la reacción con la mezcla de FERRO.1. DEBEN SER Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por medio de la fijación del tejido. EL PRODUCTO DE LA REACCIÓN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusión .Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muy liposolubles y debilmente solubles en alcohol. DE INTERÉS BIOLÓGICO DEMOSTRABLE 1.En este caso se puede medir dicha sustancia con un histofotómetro. PRINCIPALES SUSTANCIAS HISTOQUÍMICAMENTE. ÁCIDO NUCLÉICO DNA DETERMINACIÓN Se usa la reacción de FEULGEN que consiste : . En algunas reacciones la intensidad del color producido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada.Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias hidrosolubles como el glucógeno. Esta reacción se usa para el estudio del hueso. QUE LOS COMPUESTOS QUE ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES. B.El reactivo de SCHIFF (fuchsina básica con anhídrido sulfuroso) reacciona con el aldehído y forma un precipitado rojo.Esta reacción se usa para localizar los macrófagos del SRE y diagnosticar enfermedades en las cuales hay depósitos de hierro en los tejidos . FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Se usa para el diagnostico de enfermedades metabólicas que producen depósitos intracelulares. . IONES IÓN HIERRO DETERMINACIÓN . .CIANURO POTÁSICO Y ÁCIDO CLORHÍDRICO que forma un precipitado azul oscuro de ferrocianuro férrico. 2.Formaldehído para el MO .Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico. . Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre.Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en DNA del núcleo. . ENZIMAS.Reacción de Sakaguchi que detecta la arginina de las proteínas básicas como las histonas y protaminas. 7. 4. . POLISACÁRIDOS. . La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff).Glucoproteínas. PEROXIDASA Promueve la reducción de ciertos sustratos. Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos.Reacción de aminobenceno. Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN. . De este modo se demuestra la presencia de: . transfiriendo iones . El ácido oxida a los azucares en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivo de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere los azucares. CATECOLAMINAS. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo compuestos fluorescentes. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertemente coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática. Se usa para detectar mitocondrias. DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos.Después se añade sulfito de amonio que da color negro y electro denso al precipitado.Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas. En el caso de ser un polímero. Se usa para localizar lisosomas. ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA DETERMINACIÓN Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 . La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un precipitado insoluble. RNA Tiene gran afinidad por los colorantes básicos (basofília) lo que hace que se tiña intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.El tetrazol es reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN. 6. .Glucógeno en el hígado y músculo. 5. PROTEÍNAS. B. . Es la método más usado para la detección de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.DNA: fluorescencia verde amarillenta. Inclusión 3º. Fijación 2º.Compuestos naturales constituyentes de las células: vitamina A.hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se reduce. FIJACIÓN.Los tejidos deben ser tratados inmediatamente después de ser cortados.Tiene por fin endurecer los tejidos. INMUNOCITOQUÍMICA (INMUNOFLUORESCENCIA). Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el tetraclorato 3. riboflavina(B2) y las porfirinas. COMPUESTOS FLUORESCENTES. Al Ac se le puede marcar con un compuesto fluorescente. siendo pocas las estructuras que se examinan directamente (mesenterio. Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cáncer (células ricas en RNA).RNA: fluorescencia roja amarillenta. sin fijar y teñir. volviéndolos mas resistentes a las etapas subsiguientes de la técnica histológica. FLUORESCENCIA. Coloración A. .Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que se une a los ácidos nucléicos: . . cola de renacuajo) y que pueden ser observadas “in vivo”. .3diamino-bencidina que cuando se reduce forma un compuesto coloreado.Hay que conservar la morfología y la composición química de los componentes de los tejidos.Se hace a fin de evitar la autolisis y destrucción celular. Sirve para identificar proteínas especificas. . 1. Los pasos que se siguen para obtener una preparación permanente son: 1º. como sucede en las preparaciones permanentes. . Corte con microtomo 4º. Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y emite luz en otra longitud de onda mayor. PREPARACIONES PERMANENTES Describiremos primero las preparaciones histológicas permanentes (laminas) para el estudio al microscopio óptico. 2. En microscopía se suele usar la excitación con luz ultravioleta. . Con este instrumento los objetos se examinan por transparencia. insoluble y electrodenso. Se basa en la reacción Ag-Ac. Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de: .Se usa xilol.Es la más usada en Histología.Debido al calor . como en el criostato. a los tejidos para que se puedan obtener cortes . B.Tetraóxido de osmio. el xilol o toluol se evaporan y los espacios que dejan libre son ocupados por la parafina. La fijación puede ser realizada por procesos: MÉTODO FÍSICO CARACTERÍSTICAS .Frió. puesto que las proteínas son las principales responsables de la estructura celular y se degrada después de la muerte celular. . Mezclas fijadoras: . Fijadores: . .. .Cloruro de mercurio y ácido pícrico precipitan proteínas.Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC en el interior de una estufa. tetraóxido de osmio y glutaraldehído apenas causan coagulación y se usan en ME.Glutaraldehído. como en bacterilogía. benzol o toluol que dejan a la pieza translúcida.Formaldehído. CELOIDINA. INCLUSIÓN.Liquido de BOUIN: pícrico/formol/acético glacial . . QUÍMICO (uso de fijadores que inmovilizan las proteínas de los tejidos). Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la inclusión: TRATAMIENTO DESHIDRATACIÓN ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN CARACTERÍSTICAS Se extrae el agua de los tejidos con baños de concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a 100%). .Da consistencia firme suficientemente finos.Calor. .GELATINA. Sustitución del etanol por un liquido miscible en etanol y parafina.Liquido de HELLY: mercurio/formol dicromato potásico/cloruro de Este paso es ESENCIAL. PARAFINA para la MO. . .Las sustancias más usadas para este fin son: .Suele durar unas 12 horas.RESINA EPOXI para la ME. ACIDÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes ácidos). . COLORANTE BÁSICO (azul de toluidina y azul de metileno. El criostato es también muy útil en histoquímica .Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES.La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden a formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.02 a 0. Se congela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES. EJEMPLOS Nucleoproteínas y glicoproteínas ácidas.MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática.CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtención rápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores. .Los componentes de los tejidos pueden ser: SUSTRATO BASÓFILO (tejidos que se tiñen fácilmente con colorantes básicos).Eliminan compuestos liposolubles C. hematoxilina). .Inconvenientes: . .Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se deja solidificar. D. . COLORACIÓN. .Destruyen muchas enzimas . pues no inactiva las enzimas. El material se incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante. . cuando se usa parafina. ya que los solventes orgánicos los eliminan. La doble coloración por la hematoxilina y la eosina es la más utilizada en la técnica histológica. .Son muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un material patológico. .Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables unos de otros. obteniéndose cortes de 3 a 8 micras de espesor. pero dificulta la difusión de las moléculas. Estos cortes son extendidos en agua caliente y después se llevan a un portaobjetos. CORTE CON MICROTOMO..Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo. . eosina y la fuschina ácida).1 micra. . ÁQCIDO (orange G. Usa nieve carbónica para congelar el tejido. Proteínas básicas del citoplasma. Se usan colorantes relativamente no venenosos que son retenidos selectivamente por algunas células del organismo. A este fenómeno se le denomina metacromasia. . fuertemente ácidos de la matriz cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo. Hay ciertos tejidos. TÉCNICA COMPONENTE S NÚCLE O CITOPLASM A Hematoxilina -eosina Hematoxilina Azul Eosina Tricromo Masson Fuchinaresorcina Impregnación argéntica FIBRAS ELÁSTICA S Irregular RETICULIN A - FIBRAS COLÁGENA S - - Rosa Rosa Irregular - Hematoxilina férrica Fuchina-ácida y Panceau Verde luz Negro - - - - - Rojo - - - - - Verde - - Fuchina y resorcina Sales de plata - - - Púrpura - - - Castaño - Negro - Los factores que influyen en la tinción son: .OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza química de los componentes a los que se unen. se modifica el color azul por unión al tejido.Nucleoproteínas. Las técnicas de tinción pueden ser: . Los colorantes metacromáticos suelen ser básicos. son principalmente: .SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las células o tejidos que permanecen vivos después de ser separados del organismo. F. E. denominados cromotropos. que al usar colorantes como el azul de toluidina. como la matriz cartilaginosa. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente. .VITALES: no provocan la muerte. pasando a púrpura. como el azul de toluidina y tionina.Tiempo.pH y temperatura. MANIPULACIÓN EXPERIMENTALES DE CÉLULAS VIVAS. METACROMASIA.Glucosaminoglicanos sulfatados. . Ejemplos: . Se inyecta al animal vivo.Pureza y concentración del colorante. . ..Se sumergen las preparaciones biológicas en la emulsión calentada y fundida. . . Hacer una réplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de carbono. Fracturar con una cuchilla de metal afilada.Retirar las láminas y queda sobre su superficie una fina película de emulsión. generalmente a baja temperatura. Llevar la muestra a presión atmosférica normal y destruir el tejido por una sustancia que no ataque el molde (ácido fuerte.El carmín y azul tripán se usan para el estudio de la fagocitosis. Poner un corte de órgano en contacto con la película de emulsión fotográfica. El tejido fracturado se mantiene a muy baja temperatura y en alto vacío. Los puntos negros que aparecen corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo. hipoclorito sódico). G. así se elimina el agua por sublimación. .El verde jano tiñe las mitocondrias. . La superficie fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas estructuras de los tejidos. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un aspecto sombreado. Sirve para el examen de cortes ultrafinos. Colocar la réplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.Secar y guardar al abrigo de la luz. Permite el estudio de la ultraestructura de las células sin los posibles artefactos producidos por la fijación y la inclusión (ej: membrana plasmática). 5º. 3º. 3º. CRIOFRACTURA. Dejar un período de exposición y revelar la película.El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos. Los cationes de plata que son alcanzados por la radiación se transforman en plata metálica que aparece negra al microscopio óptico (MO). 6º. Fases: 1º. La cantidad de gránulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y así permite también la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia. a) Técnica de emulsión liquida: . 4º. Inyectar el isótopo radiactivo al órgano en estudio. Fases: 1º.La alizarina se une a la matriz ósea recién formada y se ha usado para el estudio de la formación del hueso. Congelar el tejido a temperatura muy baja. RADIOAUTOGRAFIA Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas que contienen bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). 2º. 2º. . Proceso de revelado semejante al usado para placas fotográficas en una cámara oscura. P. 3.1. a la vez que dispersa la luz. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo. S. Los parámetros que típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son: 1.2. valor proporcional al tamaño celular. FUNDAMENTO La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula. cada célula.Llevar al microscopio (ME ó MO). emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas: . pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. 2. En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter). H. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter). 5. 5.. CITOMETRÍA DE FLUJO. . como la secreción de gránulos de zimógeno. es posible marcar las moléculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De esta forma se localiza el proceso metabólico y su velocidad. b) Aplicaciones: con el uso de isótopos radiactivos de C. 5. las células pueden estar vivas o fijadas. N. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Los FILTROS OPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.A) El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células. . Estos pueden ser: . De éstos hay tres tipos: .DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas).La óptica de excitación. compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz.La óptica de lectura. .Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm) . Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: . B) Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente. se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células individuales.DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). y en los separadores celulares o “cell sorters”. INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO Básicamente podemos obtener los siguientes datos: .Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión: -La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente. o sobre pocillos de cultivo de tejidos.. FL3 . La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio.Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm) C) El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada y. el núcleo y el material granular del interior de la célula. la membrana. llamada FSC (Forward Scatter).El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC) .etc. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por cada muestra.La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC) . llamado complejidad.. se consigue la carga electrónica de las gotas que contienen las células de interés para poder someterlas a deflección y recogerlas en tubos específicos para tal fin.Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm) . FL2.FL4….) A través de dos tipos de señales: A) Señales de dispersión. Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.3. bajo el control del ordenador.. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular. . y representar los resultados gráficamente. 5. así como la ineracción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas). 5.Histograma: según un parámetro. cromosomas. (WWW. .5. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Debido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células.Gráficos de puntos: Cualquier combinación de dos parámetros de los datos obtenidos para la población de células. etc).-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Frente a este inconveniente la CMF presenta múltiples ventajas frente al microscópio de fluorescencia y las técnicas citoquímicas. 5.4. núcleos. para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobre la arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células. como: .COM) B) Señales de Fluorescencia. Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.CITOMETRIADEFLUJO. ANÁLISIS DE DATOS En general todos los citómetros presentan los datos en algunos formatos standard. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula. . Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares. Esto permite llevar a cabo estudios más sofisticados de una población de células similares.Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular. antígenos. . Finalmente. Cuando el citómetro detecta una célula o cromosoma de interés para clasificar. sino que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capaz de analizar al menos 1000 células en solamente un segundo! Los citómetros de flujo de mayor complejidad son también capaces de clasificar a las células que resulten de interés para el investigador.Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad. Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes tipos de células o cromosomas excede los objetivos de esta introducción.) se amplía enormemente sus posibilidades de detección. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separación de los citómetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos tipos de cromosomas de la especie humana u otras especies.Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y la microscopia de fluorescencia. el sistema direcciona dicha gota con la célula hacia un . se logra que cada gotita contenga una célula o cromosoma. contenido de ADN. Dichas sustancias fluorescentes.Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basófilos. etc. Lo interesante de esta metodología es que no sólo aporta muchos datos en forma simultánea. Luego de ajustes apropiados. Entendemos por clasificar la posibilidad de separar del resto a un conjunto de células que comparten una o varias propiedades y recolectarlas en un tubo. . Basta mencionar que para lograrlo se fragmenta la columna líquida en pequeñas gotitas haciendo vibrar la boquilla a más de 20. QUÉ DATOS PODEMOS OBTENER DE LAS CÉLULAS UTILIZANDO UN CITÓMETRO DE FLUJO? A QUÉ VELOCIDAD? La iluminación de las células con luz LASER nos permite conocer el tamaño y la complejidad de los diferentes tipos de células. 5. viabilidad celular y presencia o ausencia de antígenos). emiten señales lumínicas en diferentes longitudes de onda (que son captadas por diferentes detectores) con lo cual podemos obtener valiosa información de las propiedades de una población celular.000 veces por segundo!. . La obtención de suspensiones cromosómicas de elevada pureza mediante citometría de flujo ha permitido formidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la obtención de sondas moleculares aplicables a diagnóstico citogenético de diversas patologías. el aparato carga eléctricamente la columna liquida de forma tal que sólo la gota que contiene el evento de interés (célula) queda cargada. Si agregamos el uso de moléculas fluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. al ser iluminadas por la luz LASER. En un citómetro convencional logramos información sobre al menos 5 parámetros (por ejemplo tamaño. complejidad.Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia. etc. ácido ribonucleico o ARN.6. . . .. placa de cultivo o portaobjeto. ácido desoxirribonucleico o ADN. iniciar cultivos de un mismo tipo celular.Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo (5000 partículas/segundo). QUÉ APLICACIONES TIENEN LOS INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA? CITÓMETROS DE FLUJO EN LA El campo de aplicación de este tipo de instrumentos crece rápidamente día a día ya que son numerosas las áreas de la biología y medicina que se benefician de su uso. A su vez.tubo recolector al ser desviada por un intenso campo eléctrico. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS. es decir la tasa con que las células se multiplican. El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas aplicaciones.Medición de pequeñas cantidades de componentes en los líquidos biológicos. Entre otras aplicaciones. En el campo de la biología. la citometría de flujo se ha tornado el método más empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada especie. . La presencia de estos cambios tiene importancia en el prónostico de la enfermedad maligna.Localizar los constituyentes celulares. El citómetro es capaz de cuantificar el grado de proliferación celular. y el conjugado mantiene tanto su actividad inmunológica como enzimática. se encuentra la tipificación de las leucemias y los linfomas que permite alcanzar un diagnóstico preciso. en la que el complejo inmune formado se mide por una reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los reactivos. así como evaluar su nivel de proliferación ya que con frecuencia las células malignas crecen con mayor rapidez que las normales. se pueden realizar estudios del nivel de ploidia. evolutivos y biotecnológicos. de capital importancia para el seguimiento de la evolución de la infección y el tratamiento adecuado para el paciente. . También es posible estimar si las células han sufrido cambios relevantes en el ADN. lo cuál es de suma importancia para estudios genéticos. Los métodos inmunoenzimáticos (ELISA) se han desarrollado en tres direcciones: .El Ag o el Ac se pueden unir a un soporte en fase sólida reteniendo su actividad inmunológica. análisis cromosómicos y estudios del daño del ADN. 6.Tanto el Ag como el Ac pueden unirse a una enzima. Dado el elevado número de células a analizar para realizar estos diagnósticos. Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reacción Ag-Ac específica. permitiendo un tratamiento y seguimiento más adecuado y eficaz. se emplea para evaluar si existen cambios genéticos en poblaciones de células tumorales. el citómetro de flujo es la herramienta indicada para este tipo de estudios. Otra aplicación muy importante es el estudio de las poblaciones linfocitarias afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permite conocer en los individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria.7. 5. . En medicina. El ELISA se basa en dos supuestos: . en presencia del sustrato adecuado. más específicos y sensibles Instrumentación menos costosa Admiten mayor tamaño de muestra. 6. El reactivo complementario difunde hacia él y se le une específicamente. Para ello.Detección de precipitados inmunes inmovilizados sobre papeles de nitrocelulosa. se llevan a cabo sin entrenamiento especial A2) Desventajas: Son más costosos en reactivos En general sólo sirven para fármacos B) HETEROGÉNEOS: se requiere separación entre el reactivo libre y el unido. el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. ENZIMOINMUNOANÁLISIS El ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la reacción de un Ac o de un Ag acoplado de forma covalente a una enzima. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra. Más versátiles en cuanto a tipo de analito B2) Desventajas : Más difíciles de automatizar Mayor tiempo de análisis Los métodos de ELISA HETEROGÉNEOS dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos: . Tipos de ELISAs: A) HOMOGÉNEOS: son en medio líquido y no se requiere la separación de los reactivos .– Competitivos: En este método. para detectar finalmente la actividad enzimática con ayuda de sustratos específicos. La reacción sigue la ley de acción de las masas. A1) Ventajas: Más precisos En general automatizados. . el Ag o el Ac están inmovilizados.. así disminuye el límite de detección.1. con un Ag o un Ac inmovilizado (fijado sobre un soporte). B1) Ventajas : Menos interferencias. que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reacción (Ag o Ac). Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el posillo.– No competitivos: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida.2. 3.– Los indirectos que detectan anticuerpos. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo 2. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo 8. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido 6. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albúmina sérica bovina. Dentro de los no competitivos tenemos: . 5.. PASOS GENERALES DE UN ELISA 1. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida .– Los directos que detectan antígenos . Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos 4. 6. con la diferencia del sustrato de la enzima utilizada: d) Puede generar espectrofotometría. Métodos de detección: a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la aparición de un cromóforo. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR. productos coloreados y solubles que se miden por . Generación de la señal.En presencia de agua oxigenada.2.Se mide la aparición de un producto luminiscente. betaglucosidasa. 12. Lectura del color en un lector de placas. La última parte de un inmunoensayo en que la marca es enzimática es la cuantificación de la enzima. b) Fluorométrico. o- .1. los cromógenos usados para la peroxidasa se reducen y dan productos solubles y coloreados. fosfatasa alcalina. Cuantificación en ELISA: curvas standard 6. glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs. Unión del sustrato a la enzima 11.Se mide la aparición de un producto fluorescente c) Quimioluminiscente. Los sustratos son la o-dianazina.9. Adición del sustrato 10. 13. Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. podemos usar una sal de tetrazolio. que generan un precipitado de color café. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.Puede generar precipitados coloreados insolubles y estables en el mismo lugar de la enzima (ELISA-DOT y Western-blot sobre papel de nitrocelulosa) y localizar constituyentes celulares (inmunohitoquímica).3. Se puede parar la reacción si se desea.La fosfatasa alcalina y la beta-glucosidasa utilizan como sustrato a el paranitrofenilfosfato y el ortonitrofenil-beta–D-galactopiranosido.Cuando queremos un precipitado.2. ELISA DIRECTO Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. TIPOS DE ELISAS 6. Sí queremos un precipitado. 6.fenilenodiamina (OPD). el complejo quedará solubilizado.1. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. . . o bien se le ha añadido). La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de . Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado. tetrametilbencidina (TMB). Se incuban con anticuerpos marcados.sulfónico (ABTS). El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno. 6.3. Los controles positivos y negativos son los mismos. los cuales son hidrolizados por la enzima y se libera el nitrofenol soluble. ácido. y uno secundario marcado contra el primario. . Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. ELISA INDIRECTO Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. se usa para revelar la reacción a la peroxidasa y diaminobenzidina. • Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima.2.La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta por una mezcla de peroxidasa y un cromógeno. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. …) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. orina. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. si los anticuerpos reaccionan con los antígenos. .2-acino-di-(3-etil)benzatiazolina-6.3. • Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario.3. de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo. los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado.3. que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. al menos. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. 6. . Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos. ELISA SANDWICH Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo antiantígeno. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Es el ensayo más popular. Se puede parar la reacción si se desea. como lo es la inmunofluorescencia indirecta. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. • Adición del suero problema. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. que lo marca. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. sangre. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.A) ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich). plasma. sangre. de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno). Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. • Adición de la muestra problema (extracto vegetal. suero. los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. etc. • Adición de la muestra problema (extracto vegetal. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. • Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte). Se puede parar la reacción si se desea. los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. etc. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Se puede parar la reacción si se desea. suero. de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno). B) ELISA Sándwich “HADAS”. • Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. • Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.). • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. .). plasma. Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. 7. ELECTROFORESIS. La velocidad de las particulas depende de: La carga de las mismas La intensidad del campo eléctrico y Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio TIPOS DE ELECTROFORESIS . REACCIONES DE PRECIPITACIÓN: Electroforesis.1.7. Separación de proteínas del suero en función de su comportamiento en el campo eléctrico. EQUIPO DE ELECTROFORESIS Fuente de alimentación Soporte para las tiras de acetato de celulosa o Aplicador o Cubeta y puente . . éste es fijado en una solución ácido-alcohol y se tiñe con un colorante de proteínas. Sirve para: .Calcular la fracción gamma. en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el cátodo. .2.Detectar hipergammaglobulinemias. INMUNOELECTROFORESIS (IEF). .4).Detectar paraproteínas (componentes monoclonales) en el suero..o Las tiras de acetato de celulosa o Reactivos Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampón barbital (pH 8. Después de correr el gel. y por ultimo se hace un densitometrado. Es una técnica CUALITATIVA. 7. Ag y Ac reaccionan y precipitan. RADIOINMUNOELECTROFORESIS. Formación del precipitado. 3. Electroforesis de los antígenos de acuerdo a su carga. linfomas). . Precipitación por difusión. . Migración de antígenos por carga (Separación). 5. hay 5 fases: 1. Útil para determinar mezclas complejas de Ag o Ac (Ac´s monoclonales clásicas en mieloma. Prueba CUALITATIVA. En esta técnica. Difusión.3. El pH se elige de modo que unos Ags se carguen positivamente y migren hacia el cátodo. 4. Interpretación de las bandas. 7. Método combinado de precipitación. después se hace una autorradiografía de las bandas obtenidas (se visualizan mejor). Se prepara un gel de agarosa sobre un porta y se hace un pocillo para el suero y un canalillo para el anticuerpo específico. El canalillo se llena con el Ac específico y se deja reposar para conseguir la difusión. 2. y otros Agsse carguen negativamente y migren hacia el ánodo. formando arcos de precipitación. Los Ag del suero se separan primero en base a su carga eléctrica.Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF. El Ag debe estar cargado negativamente para que se desplace hacia el ánodo. . puesto que la mayoría de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. 7. El pH del gel se elige para que el Ac tenga carga neutra y permanezca inmóvil. y el Ag tenga carga negativa y se desplace hacia el ánodo.2. Consiste en acelerar la formación de la banda de precipitación por la acción de un campo eléctrico. Es una técnica CUALITATIVA.5.1. ELECTROFORESIS CRUZADA DE LAUREL. 7.4. . ELECTROINMUNODIFUSIÓN ROCKET.Después se corta una tira con el Ag separado y se aplica sobre otro gel que contiene Ac específicos.Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.4. . Estas técnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pH seleccionado. Es muy importante que la carga neta del Ag sea (-) y Ac sea (+) y que sean colocados en el lugar adecuado en el campo eléctrico (que viajen uno al encuentro del otro). INMUNOFIJACIÓN.4. El Ag difunde y se forman bandas de precipitación con forma de cohete (cuanto menor es la concentración del Ag.4.Se forman bandas de precipitación. . se puede modificar la molécula químicamente. . Es una IDD acelerada por el paso de una corriente eléctrica. ELECTROFORESIS DE CONTRACORRIENTE. La sensibilidad es de 10-20 veces mas que en el Mancini. En un extremo del gel se perforan los pocillos donde se pone el Ag a distintas concentraciones. 7. 7. ELECTROINMUNODIFUSIÓN.3. menor es el tamaño del rocket).. 7.Primero se hace una electroforesis para que los Ag se separen (como en la IEF). Con estas técnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20 mgr/ml. Si las cargas sobre el Ag y Ag apenas difieren. CUANTITATIVA O ELECTROFORESIS Es un Mancini acelerado por un campo eléctrico.Se hace una electroforesis cruzada como en la IEF. . Es una técnica CUANTITATIVA en la que se puede construir una curva estándar representando altura frente a concentración de Ag.Es una técnica CUALITATIVA con la que podemos reconocer Ag. Las proteínas del carril de referencia son fijadas con una solución fijadora. Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gel mediante un blotting y un lavado. La precipitación del complejo antígeno-anticuerpo queda fijada en la matriz del gel. IgG. Es fácil de realizar (provee resultados en 2 o 3 horas) y permite lograr mayor sensibilidad que una inmunoelectroforesis. . ESQUEMA DE LA TÉCNICA La inmunofijación es una electroforesis de proteínas seguida de una inmovilización de las mismas al enfrentarse a un antisuero específico formando un complejo insoluble que luego se revela por coloración. como en una electroforesis normal. Se realiza en cuatro etapas: 1-Separación de proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa. 7.2. mediante la formación de un complejo insoluble con su anticuerpo. específicamente la identificación de componentes monoclonales u oligoclonales . CARACTERÍSTICAS La inmunofijación es una técnica de laboratorio que permite el estudio de proteínas en sangre y orina. IgA. . así como una interpretación mas sencilla. Se hace una incubación del gel con antisueros específico (IgM.7. durante 30 minutos a 30-40 ºC. 3-Prensado y lavado. 2-Inmunofijación (inmunoprecipitación) de las proteínas separadas. in situ. Los carriles de migración electroforética apropiados son recubiertos con los antisueros individuales. y por lo tanto son un indicio de gammapatías monoclonales. cadenas lambda) en cada calle del gel.5.5. Las bandas anormales en las corridas electroforéticas de proteínas de sueros u orinas.1. cadenas kappa.La electroforesis seguida de inmunofijación es una técnica sencilla que permite que una proteína sea retenida después de la electroforesis. principalmente aquellas situadas en las fracciones de beta globulinas y de gamma globulinas son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales. Se separan las proteínas plasmáticas en un gel de agarosa que tiene 5 calles. los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antígenos correspondientes cuando estan presentes. Variantes de Mieloma: . Amiloidosis Primaria II. Plasmocitomas localizados .5. componente monoclonal que puede ser benigno o maligno. Gammapatía Monoclonal de Significado Indeterminado 2. llamado también paraproteína o disglobulinemia o refiere a una producción excesiva de un tipo de en la proliferación de un clon específico de linfocitos B genera una población homogénea de inmunoglobulina Tipos de gammapatías monoclonales: I.3. se inmunoglobulina.1.Hiperproducción selectiva de inmunoglobulina monoclonal ( G. Macroglobulinemia de Waldenström 5.MALIGNAS: 1. generalmente asociado a hipogammaglobulinemia (GAM).Hiperproducción de cadenas pesadas libres o llamada también enfermedad de cadenas pesadas 8.7. seropositividad . TIPOS DE COMPONENTES MONOCLONALES . El aumento hiperestimulados o malignos monoclonal.Mieloma No Secretor .Esto es el incremento excesivo en la biosíntesis de cadenas livianas Kappa o Lambda libres.5. Mieloma Múltiple 2.NO MALIGNAS: 1.4.. gammapatía monoclonal.POEMS 3.Plasmocitoma Óseo Solitario . USOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS DE LOS ANTICUERPOS Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del organismo por técnicas “in vitro” algún parámetro ELISA enzima inmunoensayo mediadores. 8. GAMMAPATÍAS MONOCLONALES El componente monoclonal. Gammapatías secundarias 7. . ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Y LA CLÍNICA.Plasmocitoma Extramedular 4. ..Mieloma Quiescente . Dicha anormalidad es encontrada exclusivamente en mieloma de cadenas livianas maligno.Hiperproducción de cadenas livianas libres monoclonales (aproximadamente el 5% de los casos).A.Leucemia de Células Plasmáticas .M y en menor frecuencia D y E). biopsias. 8. localizar o medir. Tratamiento antineoplásico destrucción células tumorales Tratamientos antiinflamatorios.2. Separación y purificación molecular y celular. Ytrio) I-antiCD45 leucemias mieloides agudas Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90 Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131 . Unión a soportes (magnéticos o de plástico) por región Fc. Estroncio. enzimatico. Neutralización de mediadores proinflamatorios Inmunoestimulación con citocinas o vacunación con antígenos 8. TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES 1. Posibilidad de marcaje: radioactivo. inmunodetección IMMUNOHISTOQUIMICA.. determinación Ig séricas CITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemias Técnicas terapéuticas: diseñadas para curar. con puente biotina-avidina. Detección y medida.3. Yodo. WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas. USO DE ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de reconocer específicamente y a las que nosotros podemos sujetar. Especificidad en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo.RADIOCONJUGADOS (Fósforo. a) CONJUGADOS: . fluorescente.ANTITUMORAL. anatomía patológica NEFELOMETRIA turbidometría. AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por selección inmunomagnética. AntiCD40 induce AICD en linfomas. El antígeno CD33 se endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.. enfermedad mínima residual. b) NO CONJUGADOS: . Conjugados con partículas magnéticas. 2. Se emplea en leucemias mieloides agudas. AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis. .ACCIÓN ANTITUMORAL AntiCD20 (Rituximab) para linfomas y Leucemias de células B.QUIMIOCONJUGADOS. . enfermedades autoinmunes.SELECTIVA.. Permite purificar células madre a partir de sangre periférica. . rechazo de órganos e injerto contra huésped.TERAPIA ANTI-INFLAMATORIA.ELIMINACIÓN DE CÉLULAS. AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas. AntiCD52 (Campath 1H) tumores de células B. Artritis reumatoide. • Separación de poblaciones celulares en función de su tamaño y complejidad interna Contenido de ADN: Estudio de la fase de ciclo celular en la que se encuentra la célula • Separación de células que han iniciado el proceso de muerte por apoptosis.Receptores solubles de TNF Etanercep También neutralizan TNF pero tienen vida más corta. de células viables y células necróticas . • Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en función de las combinaciones de parámetros seleccionados.1. • Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el contenedor de fracción deseado. . nivel de calcio • Separación de células que expresan un gen reporter (proteínas fluorescentes) • Separación de poblaciones celulares en función de expresión de diferentes antígenos (intra o extracelulares) a los que se unen anticuerpos con marcaje fluorescente. IgG. alargan vida media del receptor soluble 9. IDENTIFICACIÓN.Anticuerpos anticitocina Anti-TNFa Infliximab Neutralizan mediadores proinflamatorios Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio Se usan en Enfermedad de Chron. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS 9. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING) • Anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de cada célula. estado redox. • Se pueden clonar células de características específicas: • Características Metabólicas de las Células: Nivel de pH. ..Quimeras con región Fc. 9. MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) . CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS.9. Lavado y elución por eliminación del campo magnético.Este método está basado en la especificidad de la interacción de los anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos de la superficie celular. 9. Panning: Se realiza la fijación de los Ab a plástico. . con un enriquecimiento de la subpoblación inicial de hasta 10. . .3. MÉTODOS DE FASE SÓLIDA Fijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida.4.Tiene capacidad para separar hasta 4 x 10 9 células en 5 minutos y realizar diferentes procesos de separación secuencialmente.Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son retenidos en una matriz ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético.El sistema autoMACS (Miltenyi Biotec) permite la separación automatizada de células mediante bolas paramagnéticas adheridas a la superfície celular mediante anticuerpos monoclonales. .2.000 veces. Las células portadoras del antígeno se unen al soporte. después se realiza un lavado y por último la separación mecánica o química. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN. Prueba utilizada para detectar inmunidad frente a virus. El principio básico de la prueba de Nt es la inhibición (neutralización) de la infección viral a la célula (cultivo o animal) por medio de los Acs específicos.. El método de evaluación puede ser midiendo la absorbancia a través de la densidad óptica (DO). se adiciona un suero sin descomplementar. La neutralización (Nt) mide actividad biológica del virus por lo tanto requiere de virus vivos para poder realizarse. se realiza en un sistema vivo.Posteriormente. 10. 10.2. REACCIONES DE NEUTRALIZACIÓN. o sea una DO mayor a la línea de corte.1. Igualmente. El título de Ac es la mayor dilución que da una respuesta POSITIVA. . 10. TÍTULO DE ANTICUERPOS. El compelemto se activa y hay eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico. por lo tanto se neutraliza la acción del virus sobre el hospedero. Hay precipitación de Ag y Ac cuando se combinan en proporciones de equivalencia o cercanas a ella. .3. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN. La precipitación se efectúa sobre geles de agarosa. Estos métodos se utilizan para examinar la relación entre diferentes Ag y/o Ac. Lectura de la placa 10. Placa de gel de agar con suero específico en la matriz. Inmunoglobulinas. C3 y C4. formando un anillo de precipitación. Esquema de la técnica: . factores de coagulación. .10.1. . INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (RID) O TÉCNICA DE MANCINI. .Se hacen pocillos en el gel de agarosa y en ellos se depositan volúmenes estándar de suero con el Ag que se quiere detectar (Ig o proteínas plasmáticas). Se deja en reposo 24 horas para que difunda y reaccionen Ag y Ac (punto de equivalencia). Se incorpora el Ac específico en el gel de agarosa.Método de cuantificación de antígenos. . .Fenómeno de difusión.Útil en inmunología clínica para cuantificar fracciones plasmáticas humanas como ASH. 10.. . .Se puede usar azul cromassie para teñir las bandas.Se interpola en la curva el valor de cada muestra. se produce una banda de precipitación. . .2. Se representa gráficamente el cuadrado del diámetro del anillo frente a la concentración de Ag. Es una prueba CUANTITATIVA. Se mide el diámetro del anillo. de antígeno. . .Si en la solución existen dos Ag reconocidos por el Ac.3. . habrá dos bandas. INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO I (IDD-I). y sí las concentraciones son adecuadas.Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 78. Halo proporcional a la conc.Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.Para el calculo de resultados hay que construir una curva patrón a partir de unos estándares que se ponen en el gel junto con las muestras problemas.Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos. . .Cuantificar.Prueba CUALITATIVA.5). b) No identidad (se trata de Ag distintos): se forman bandas de precipitación independientes y no dan un arco continuo. . INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO II (IDDII) U OUCHTERLONY. y nos podemos encontrar con tres patrones básicos: a) Identidad (los dos Ag tienen los mismo epitopos reconocidos por el suero): se forma una banda de precipitación con forma de arco continuo. Se enfrenta a un suero con dos o más Ag.3. Se puede utilizar para determinar la relación Ag/Ac (prueba CUALITATIVA). Aparece una figura con forma de aspa. También es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).3.10. .c) Identidad parcial (los dos Ag comparte un epitopo. pero uno de ellos tiene un epitopo extra que es reconocido por el suero): se forma un arco de precipitación al que le sale un espolón.