UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASKaren Fulchini de Oliveira AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO GLIFOSATO-ROUNDUP® NO COMPORTAMENTO SOCIAL DE RATOS WISTAR. São Paulo 2013 Karen Fulchini de Oliveira AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO GLIFOSATO-ROUNDUP® NO COMPORTAMENTO SOCIAL DE RATOS WISTAR. Monografia apresentada ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos exigidos para a conclusão do Curso de Ciências Biológicas. Orientadora: Profª. Ms. Esther Lopes Ricci São Paulo 2013 Agradecimentos Agradeço, primeiramente, aos meus pais por me darem sempre todo o apoio necessário, força e por esse amor incondicional. Absolutamente tudo o que eu já realizei e que ainda vou realizar eu devo a vocês dois e são vocês a minha inspiração de vida. À minha avó Maria, que é a minha segunda mãe, e a minha tia Pedrina. Vocês duas sempre foram essenciais na minha vida e são a base dela. Ao meu avô João que nunca deixou de acreditar em mim e foi quem mais me incentivou a seguir essa carreira e ter força de vontade pra chegar até o fim. E hoje eu tenho certeza que é ele a estrela que mais brilha no céu. À Universidade Presbiteriana Mackenzie pelo ensino e, principalmente, ao curso de Ciências Biológicas que me proporcionou momentos únicos de aprendizagem. À todos os funcionários e técnicos do biotério que sempre estiveram dispostos a ajudar. Ao veterinário Alexandre que nunca deixou de passar o seu conhecimento. À minha orientadora Esther, quem me confiou este trabalho e sempre esteve presente oferecendo um apoio incondicional, além de todo o aprendizado que me foi dado graças à ela. Por respeitar a individualidade de cada um dos seus alunos e por incentivar, cada um deles, a trilhar seus próprios caminhos. Por cada reunião cheia de bom humor, onde as horas passavam voando e por cada esclarecimento de dúvidas. Pelo exemplo de professora, pesquisadora e amiga. À professora Maria Lucila, que foi importantíssima para a realização deste trabalho, oferecendo todo o seu conhecimento sobre a área comportamental e dando ideias pertinentes. Às meninas do laboratório já formadas, Lúcia e Giuliana. À Natália e Maysa, que me auxiliaram durante meus experimentos. Às minhas amigas e parceiras de faculdade e de laboratório: Bárbara e Giselle, vocês duas foram pessoas maravilhosas comigo, sempre ajudando, conversando, me fazendo rir, animando os dias em que logo cedo tínhamos um milhão de coisas pra fazer no biotério. Vocês são sensacionais e merecem todo o sucesso do mundo. Aos meus colegas e amigos destes 4 anos de faculdade, em especial a Ana Zaia, André, Andressa, Cessa, Carol, Lais, Luiz, Maria Helena, Rafael e Renata. Vocês tornaram esse último semestre de faculdade muito mais fácil, mais leve, embora complicado, mas com certeza, foi muito melhor com vocês do meu lado todas as manhãs. Aos meus amigos ciências sem fronteiras: Álvaro e Vinícius, agora australianos. Todos os dias com vocês dois na faculdade e fora dela foram incríveis, cada viagem se tornou inesquecível (grande Nando!). Vocês me tiravam sorrisos o dia inteiro, topavam ir comigo em qualquer lugar, fazer qualquer coisa e esse ano eu fiquei morrendo de saudades. Vocês fazem muita falta! E ano que vem estou esperando os dois com meu canguru de pelúcia. Á Maiara, agora irlandesa, minha primeira amiga da faculdade. Você é uma amiga ótima, sempre feliz, sempre tentando animar todo mundo e essa tua alegria eu vou levar sempre comigo. Volta logo. À Natália, minha parceira, minha amiga, minha maior companheira, minha dupla de dois durante esses 4 anos de curso e agora virando uma italianinha. Você é uma pessoa incrível, e eu sou muito grata à Deus por ter tido uma amizade como a sua durante esse tempo. Eu torço muito pro teu sucesso, você merece demais tudo de bom que vem acontecendo na sua vida. E claro que ano que vem, no meio do ano, eu estou te esperando, porque a gente tem uma viagem marcada. A saudades já está bem forte. E o que melhor define a nossa amizade: “os verdadeiros eu sei quem são!”. Ao Danilo, meu melhor amigo, o irmão que eu escolhi pra mim e ser humano maravilhoso. Eu sou muito grata por todo o incentivo que você sempre me deu, pela força, pelo quanto você me animou pra continuar e não desistir. Por toda essa amizade de anos e que só se fortalece com o tempo. Eu tenho orgulho de te ter como amigo. E eu agradeço à Deus por te ter na minha vida. De você eu não abro mão nunca. Ao corintiano da minha vida, Dante, por sempre me ensinar a ver o lado positivo das coisas, me escutar, me oferecer um apoio incondicional, por ser essa pessoa incrível que só me oferece coisas boas. Por conseguir me distrair do meu “mundinho” e me fazer pôr os pés no chão sempre que necessário. Eu não existo longe de você. Ao Gustavo por toda a amizade que só vem a crescer, por me “obrigar” a estudar, por pensar no meu futuro e por ser esse amigo sensacional que eu tive a sorte de conhecer e de ter por perto. Ao Rômulo por me suportar quando nem eu me suporto mais, por ser esse amigo, esse parceiro que ele é pra mim, por conseguir me fazer bem com os mínimos detalhes e por estar comigo, por mais difícil que isso seja. À Érika, por ser essa amiga ímpar, por toda a irmandade, por todos os conselhos, por me arrancar sorrisos quando eu não estou bem, por se manter tão presente. “É nóix que voa!” Sempre. À Gabrielle e à Camila, por serem amigas maravilhosas e lindocas. Ao Leonardo que mesmo com a distância é uma das melhores pessoas que eu conheço e de quem eu tenho muito orgulho. Aos animais, meus ratos do laboratório, que são a parte mais importante deste trabalho, seres incríveis que me proporcionaram momentos de alegria a cada dia do experimento. E por fim, agradeço à Deus, pelo conforto durante todos os momentos difíceis. Resumo O uso dos herbicidas vem aumentando progressivamente no mundo, em decorrência da crescente demanda populacional. Dentre estes e um dos mais importantes encontra-se o glifosato, um herbicida não-seletivo, sistêmico e pósemergente utilizado na agricultura. É considerado um dos maiores poluidores de rios e águas de superfície e sua presença na cadeia alimentar aponta para a possibilidade da contaminação não só de animais, como de seres humanos. Devido ao fato de o glifosato ter baixa solubilidade em água, este é formulado, muitas vezes, em herbicidas comercias como sais monoiônicos, que são mais solúveis, como o Roundup®. Inúmeros estudos sugerem que este herbicida é um desregulador endócrino, sendo assim, o glifosato pode afetar o metabolismo de diversos hormônios e por consequência afetar o comportamento animal, tanto em filhotes, quanto em animais adultos. Assim, o presente trabalho teve por objetivo analisar o comportamento de brincar de ratos juvenis machos e fêmeas, assim como, a interação social de ratos adultos machos e fêmeas da linhagem Wistar, ambos foram expostos a doses de 50mg do glifosato – Roundup® durante a fase perinatal. Para isto, ratas prenhes receberam a dose de 50mg/kg de glifosato ou seu veículo do 15° dia de gestação ao 7° dia de lactação. Após o nascimento da prole, em torno do 30º dia de lactação foi realizado o teste de play-fighting e após isto, entre o 90º e 95º dia de lactação foi realizado o teste de sociabilização. Os presentes resultados mostraram que a administração perinatal de 50mg/kg glifosato não alterou os parâmetros de comportamento de brincar dos ratos jovens, nem o comportamento e a interação social entre ratos adultos. Dessa forma, é visto que a dose de 50mg/kg de glifosato não apresenta um grau de toxicidade aparente, não ocasionando problemas nas proles de ratos. Palavras-Chave: Herbicida, Glifosato, Perinatal, Comportamento de brincar, Interação social. Abstract The use of herbicides has been increasing in the world, due to the increase on population demand. Among the herbicides the most important one is glyphosate, a non-selective, systemic and preemergent herbicide used in agriculture. This herbicide is considered one of the most polluter of rivers and waters, its presence indicate the possibility of contamination not only of animals, but of human beings as well. Because glyphosate has low solubility in water, it is generally formulated into commercial herbicides as mono-ionic salts which are more soluble, as Roundup®. Several studies suggest that this herbicide is an endocrine disruptor; therefore the glyphosate can affect the metabolism of several hormones which results in changes in the animal behavior of descendant and adults. The present work has as purpose to analyze the behavior of play of female and male juvenile rats and the social interaction between female and male adults Wistar rats both exposed to 50 mg of glyphosate - Roundup® during the perinatal period. The breeding rats received 50 mg/kg of glyphosate or its vehicle between the 15th of breeding and 7th day of lactation. After the rats were born, the test of play-fighting was performed about the 30th day of lactation, between the 90th and 95th day of lactation the socialization test was performed. The results showed that the administration perinatal of 50 mg/kg de glyphosate has not altered the play behavior parameters of juvenile rats, neither the behavior nor social interaction between adult rats. In conclusion, the results show that there is no apparent toxicity of glyphosate 50 mg/kg, in as much as there was no problem in rat’s descendents. Key-words: Herbicides, glyphosate, perinatal, play behavior, social interaction. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1 1.1 Herbicidas ................................................................................................. 1 1.2 Desreguladores Endócrinos ...................................................................... 5 1.3 Comportamentos Sociais .......................................................................... 8 1.3.1 Comportamento de Brincar .................................................................. 9 1.3.2 Comportamento Social dos Adultos ................................................... 12 2. OBJETIVO ................................................................................................... 14 2.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 14 2.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 14 3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 15 4. RESULTADOS ............................................................................................ 22 5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 34 6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 37 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 38 ANEXOS .......................................................................................................... 44 Anexo 1 – Comissão de Ética no Uso de Animais ........................................ 44 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Herbicidas. O crescimento constante da população mundial traz a necessidade de produzir quantidades cada vez maiores de alimento, o que exige aumento no suprimento global da produção de gêneros alimentícios. Isto torna necessário o desenvolvimento de práticas intensivas na agricultura e os agrotóxicos são muito utilizados, pois protegem as plantas, combatendo as pragas, e dessa forma otimizam a produção agrícola (CASTRO, 2005). No Brasil, de acordo com a lei nº 7.802, de 11 de julho de 1989, os agrotóxicos são: “Os produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento” (BRASIL, 1989). Os agrotóxicos podem ser classificados quanto a sua ação e grupo químico, e assim, são categorizados em Inseticidas, Fungicidas e Herbicidas. Os inseticidas são utilizados no combate à insetos, exterminando-os por ingestão ou contato, e competem aos quatros principais grupos químicos; organofasforados, carbonatos, organoclorados e piretróides. Os fungicidas agem somente sobre os fungos, impedindo sua colonização e germinação, e assim como os inseticidas, os fungicidas também cabem a quatro principais grupos químicos: etileno-bis-ditiocarbonatos, trifenil estânico, captan e hexanocloro benzeno. Já os herbicidas atuam sobre as ervas daninhas pré ou pósemergênciais e têm como seus principais representantes: paraguat, glifosato, pentacloofenol, derivados do ácido fenoxiacético e dinitrofenóis. Este grupo, nos últimos 20 anos vem sendo utilizado de forma emergente na agricultura (OPAS/OMS, 1996) 2 Os agrotóxicos também podem ser classificados de acordo com sua periculosidade ambientale estes dividem-se em quatro classes, sendo a Classe I: produtos altamente perigosos ao meio ambiente, como a maioria dos organoclorados; Classe II: produtos muito perigosos ao meio ambiente, como o malation; Classe III: produtos perigosos ao meio ambiente, como o carbaril e o glifosato; e Classe IV: produtos pouco perigosos ao meio ambiente, como os derivados de óleos minerais (BRAIBANTE; ZAPPE, 2012). Outro tipo importante de classificação dos agrotóxicos é em relação ao seu poder tóxico. E esta classificação torna-se fundamental para o conhecimento da toxicidade de um produto, em vista de seus efeitos agudos. No Brasil, esta classificação é realizada pelo Ministério da Saúde, como mostra o Quadro 1, que faz uma relação entre a dose toxicológica com a dose letal 50 (DL 50) (OPAS/OMS, 1996). A dose letal 50 consiste na dose média de uma determinada substância que irá expressar o grau de toxicidade aguda da mesma. Esta dose é capaz de matar 50% do lote de animais que serão utilizados em alguma experiência (CONCEITOS BÁSICOS DE TOXICOLOGIA, 2012). Quadro 1. Classificação toxicológica dos agrotóxicos segundo a DL 50. Classe Toxicológica I II III IV Toxicidade Extremamente tóxico Altamente tóxico Mediamente tóxico Pouco tóxico DL50 (mg/kg) ≤5 Entre 5 e 50 Entre 50 e 500 Entre 500 e 5000 Faixa Colorida Vermelha Amarela Azul Verde Fonte: OPAS/OMS, 1996. Considerando que a capacidade de determinada substância causar a morte ou algum efeito sobre os animais depende da sua concentração no corpo do indivíduo, a dose letal é expressa em miligrama da substância por quilograma da massa corporal. A toxicidade de uma substância também pode variar de acordo com o modo como será administrada (BRAIBANTE; ZAPPE, 2012). Atualmente, um dos mais importantes agrotóxicos é o glifosato (N(fosfonometil)glicina), um herbicida não-seletivo, sistêmico, pós-emergente, que 3 pertence ao grupo químico dos aminoácidos fosfonados e tal como seu precursor, a glicina, apresenta comportamento zwiteriônico, com separação de duas cargas em pH neutro, uma positiva no grupo amino e uma negativa no grupo fosfonato, com fórmula molecular C3H8NO5P e fórmula estrutural representada pela figura 1. O glifosato representa 60% do mercado mundial de herbicidas não seletivos e contabiliza, assim, um total de US$1,2 bilhão/ano com vendas do produto. Desde 1971, três tipos químicos de glifosato vêm sendo comercializados: glifosato-isopropilamônio, glifosato-sesquisódio (patenteados por Monsanto e vendido como Round-up), e glifosato-trimesium (patenteado por ICI, atual Syngenta) (JUNIOR, et al., 2002). Por apresentar solubilidade baixa em água, o glifosato é formulado, muitas vezes, em herbicidas comercias como sais monoiônicos, que são mais solúveis, como o Roundup, que é composto por 41% de sal de isopropilamina de glifosato e surfactante em água. (CASTRO, 2005; COUTINHO; MAZO, 2005). Figura 1. Fórmula estrutural do glifosato. Fonte: Castro (2005). O glifosato apresenta toxicidade baixa aguda em animais. Em ratos, por exemplo, de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o DL50 oral de glifosato puro é de 4.230 mg/kg considerado pouco tóxico, como visto no Quadro 1. Esta baixa toxicidade pode estar relacionada a forma como o glifosato atua bioquimicamente nas plantas, atuando na via do ácido chiquímico, inibindo a ação de uma enzima específica, a 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfatosintase (EPSPS), inviabilizando a síntese de 3 aminoácidos aromáticos essenciais: o triptofano, a fenilalanina e a tirosina (figura 2), os quais são precursores de outros produtos, como lignina, alcalóides, flavonóides e ácidos benzoicos. Devido à inibição da biossíntese destes aminoácidos a planta para de crescer e consequentemente, ocorre a sua morte por deficiência metabólica. Já em relação aos animais, eles não são afetados desta forma, pois não produzem a enzima EPSPS, e não sintetizam estes aminoácidos. Apesar disso, o glifosato 4 pode impedir a ação de outras enzimas. Alguns autores sugerem que este herbicida pode causar defeitos crônicos de nascimento em algumas espécies de animais quando administrado em doses elevadas por um período prolongado. Em ratos foi observada perda de peso, descarga nasal, morte de matrizes grávidas e desordens digestivas (BORGES FILHO, 2011; JUNIOR, et al., 2002). Figura 2 – Diagrama do chiquimato e da inibição do glifosato. Retirado de Nadula, 2010. Em seres humanos os efeitos agudos e crônicos do glifosato são: dermatite de contato; irritação, dor e queimação ocular, turvação da visão, conjuntivite e edema palpebral; irritação das vias respiratórias; lesões corrosivas na mucosa oral, esofágica, gástrica e duodenal após a ingestão, assim como náuseas, vômitos, diarreias, cólicas, pancreatite aguda, hipotensão arterial, tosse, falência respiratória, hipóxia, dentre outros (NORTOX, 2012). Vários estudos foram conduzidos para demonstrar a segurança e as limitações da utilização do glifosato, e sua marca comercial mais conhecida, o 5 Roundup®. Ensaios avaliando seus efeitos tóxicos sobre animais de laboratório, incluindo camundongos, ratos, coelhos, cães, macaco e galos; e outros in vitro em culturas celulares distintas vêm sendo realizados a partir da década de 70 (WILLIAMS et al., 2000). De acordo com Yousef et al. (1995, apud Dallegrave, 2003), já foram realizados estudos em coelhos com doses sub-letais de glifosato [1/100 DL50 (50mg/kg) e 1/10 DL50 (500mg/kg)] que causaram perda de massa corporal, redução do libido, redução da concentração espermática, sendo observado um aumento do número de espermatozóides mortos ou que apresentavam anomalias. Assim, os resultados mostraram que ocorreu uma toxicidade sistêmica e reprodutiva. As alterações hormonais, como redução dos níveis de testosterona atribuídos a queda dos níveis séricos de LH, mantiveram-se por longos períodos pós-tratamento, sugerindo que este herbicida apresenta um efeito de longa duração sobre a formação dos espermatozóides e de órgãos reprodutivos dos animais tratados. Em vista dos efeitos resultantes da ação do glifosato sobre a espermatogênese, ou indiretamente, sobre o eixo hipotálamo-hipofisáriogonadal, surge à necessidade da realização de mais estudos sobre a toxicidade reprodutiva desta substância, tanto em animais quanto no homem. Assim como estudos direcionados à produtos comerciais que contém o glifosato como meio ativo, como o Roundup® (DALLEGRAVE, 2003). 1.2 Desreguladores Endócrinos O sistema endócrino ou sistema hormonal é o responsável pela secreção dos hormônios, e está envolvido com o controle das funções metabólicas no organismo, como crescimento celular, velocidade das reações químicas nas células, transporte de substâncias, dentre outros. (GUYTON; HALL, 2002) Guyton e Hall (2002) afirmam que os hormônios são substâncias químicas transportadas através do sistema circulatório para células do corpo, onde encontram seu receptor especifico, ligam-se a ele e iniciam diversas reações. Alguns hormônios atuam em diferentes células do corpo, enquanto outros afetam 6 somente os tecidos alvos-específicos, pois estes apresentam os receptores para o hormônio. O termo endocrine disruptor (desregulador endócrino) foi proposto em uma conferência organizada pela Dra. Theo Colborn, na cidade de Wingspread (EUA) para se referir a substâncias exógenas, ou então, uma mistura de substâncias, naturais ou sintéticas, que podem danificar um órgão endócrino, alterar a sua função, interagir com um receptor de hormônios ou afetar o metabolismo de um hormônio em um órgão endócrino e, por consequência, causar efeitos adversos à saúde de um organismo, de sua prole, ou ainda de uma população (OLIVEIRA et al., 2008; BIANCO et al., 2010). Ainda de acordo com a “Environmental Protection Agency” (EPA) um desregulador endócrino é definido como: “Um agente exógeno que interfere com síntese, excreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento dos organismos” (US.EPA, 1997). São aceitas quatro hipóteses sobre os efeitos dos desreguladores endócrinos em diferentes espécies animais. A primeira hipótese afirma que as substâncias químicas destes desreguladores podem ter efeitos distintos no embrião, feto e no organismo perinatal, em relação ao adulto. A segunda hipótese diz que os efeitos vão se manifestar com maior frequência nos filhos do que no progenitor exposto. A terceira hipótese conclui que o momento da exposição do organismo em desenvolvimento é decisivo para determinar o seu caráter e potencial futuro, e por fim, a quarta e última hipótese afirma que a exposição critica ocorre durante o desenvolvimento embrionário, e assim, algumas manifestações podem não se produzir até a maturidade (SANTAMARTA, 2011). Santamarta (2011), ainda afirma que muitas populações animais já foram afetadas pelo glifosato, e este causou efeito desregulador endócrino, pois foram observadas disfunção da tireóide em aves e peixes; diminuição da fertilidade de aves, peixes, crustáceos e mamíferos, assim como a diminuição do sucesso da 7 incubação e deformidades no nascimento de tartarugas, aves e peixes. Foram observadas também anormalidades metabólicas em mamíferos, peixes e aves; comportamento anormal em aves e mamíferos; desmasculização e feminilização em aves, peixes e mamíferos machos e também desfeminilização e masculinização em peixes e aves fêmeas. Havendo ainda perigo para os sistemas imunológicos de aves e mamíferos. Por fim, segundo Romano et al., (2008), ocorreram alterações no desenvolvimento da puberdade em ratos (Rattus norvergicus) evidenciado pelo atraso da separação balanoprepucial e alterações no peso ponderal em exposição prolongada ao Roundup® em doses de 5, 50 e 250 mg/kg. Os desreguladores endócrinos podem alterar a homeostase dos hormônios esteróides e gerar prejuízos na diferenciação sexual e no sistema reprodutivo, causando danos à fertilidade. Alguns desreguladores podem prejudicar a esteroidogênese e assim, inibir enzimas específicas que estão envolvidas na biossíntese de certos hormônios, que não serão produzidos (OLIVEIRA et al., 2008). A esteroidogênese ovariana ocorre através da interação das duas células que compõem o folículo ovariano, que são as células da teca e da granulosa. E ambas expressam a proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR); a CYP11A1 e a 3b-HSD, que permitem a estas células produzir pregnenolona, que posteriormente será a testosterona, e progesterona a partir do colesterol. A proteína responsável pelo transporte do colesterol da membrana externa da mitocôndria para a interna, onde se localizam a maioria das enzimas envolvidas na esteroidogênese, é a proteína StAR, e consequentemente, é ela quem regula a produção dos hormônios esteróides em vários tecidos (YOSHIZUMI; LIMA, 2012). As células testiculares também vão produzir pequenas quantidades de estrógenos, e estes são produzidos a partir da conversão de androstenediona ou de testosterona, e é caracterizada pela perda de uma molécula de carbono. Esta conversão é realizada pela enzima aromatase. Os esteróides de maior ocorrência com atividade estrogênica são o estradiol, o estriol e a estrona (NORMAN; LITWACK, 1997). 8 De acordo com Richard et al. (2005), mesmo as concentrações não tóxicas de glifosato causam efeito de desregulação sobre a enzima aromatase em células de placenta humana in vitro. No momento em que o glifosato penetra na célula, o que é favorecido nas formulações de Roundup® com adjuvantes, a atividade da enzima aromatase, que é responsável pela conversão de androstenediona ou de testosterona, em estrógenos, é reduzida. O mecanismo de desregulação do glifosato estudado por Walsh et al., (2000) em cultivo celular de Leydig da linhagem tumoral MA-10, quantificou a expressão da proteína StAR e da enzima aromatase nos cultivos celulares submetidos a diferentes concentrações de Roundup® (Monsanto). Houve a redução de 90% dos níveis da proteína StAR, implicando que, de cada 100 moléculas de colesterol disponíveis para o transporte ao interior da membrana mitocondrial, apenas 10 atingiram o sistema enzimático P450scc. Em seguida, a conversão de colesterol em pregnenolona foi reduzida em 71% pela inibição da atividade de P450scc. Ao final das transformações bioquímicas observou-se a redução de 94% na esteroidogênese total. Portando, é inquestionável que grande parte do comportamento das espécies é possível graças à presença ou ausência de hormônios em determinados pontos do corpo (CARTHY; HOLMES 1980). E com esta síntese de hormônios prejudicada diversos comportamentos sociais em ratos podem sofrer algum tipo de alteração. 1.3 Comportamentos Sociais O termo comportamento animal é usado para designar a forma como um animal reage ao ambiente que o cerca e às condições internas de seu corpo. O estudo do comportamento é realizado a partir de observações dos movimentos, postura e outros aspectos relacionados ao animal. Assim, toda forma de comportamento, seja ele simples ou complexo, depende de estímulos endógenos ou exógenos (CARTHY; HOLMES, 1980). O comportamento social requer dois ou mais indivíduos e que estes animais tenham o instinto e motivação para permanecerem próximos. As 9 ligações sociais podem ocorrer entre pais e filhos, dois adultos ou entre outros membros do grupo, como os filhotes. Os comportamentos podem ser considerados positivos quando incluem afiliações onde haja benefícios mútuos ou podem ser considerados negativos, no qual ocorre o comportamento agressivo (CARTER; KEVERNE, 2002). Diversas espécies são capazes de realizar sinais sociais, que são estímulos liberados por um membro desta espécie que gera uma resposta em outro membro. Este estímulo foi denominado liberadores, por Lorenz e podem ser visuais, auditivos ou de qualquer outra forma ao qual o receptor seja sensível. Atualmente, este termo liberador é relacionado à qualquer tipo de sinal ao qual um animal responda comportamentalmente (CARTHY; HOLMES, 1980). O desenvolvimento social ocorre por meio do reconhecimento social no qual animais identificam e reconhecem indivíduos da mesma espécie, gerando um pré-requisito para vários tipos de comportamentos sociais, pois permite o estabelecimento de ligações e de hierarquias dentro de um grupo (CHOLERIS; KAVALIERS; PFAFF, 2004). As relações sociais são geradas através de interações entre indivíduos de um mesmo grupo, e o reconhecimento destes indivíduos são fundamentais para o funcionamento grupal. Existem benefícios em relação ao convívio em grupo, como, por exemplo, os animais quando estão agrupados são atacados com menor frequência por predadores; o desgaste físico para alcançar uma caça é menor, pois a caça será mais eficiente já que será realizada em grupo; e a convivência entre animais adultos e jovens gera uma relação de aprendizagem para os mais novos, através da imitação de tarefas, ou aprendizado sobre a caça e locais importantes para a sobrevivência. (SLATER, 2000). Em roedores o reconhecimento social apresenta-se como um comportamento que utiliza o instinto natural dos roedores em investigar indivíduos novos, avaliando o aprendizado e a memória do animal. Nestes animais, além da memória social de longo prazo, há também a presença da memória social de curto prazo na qual há o reconhecimento de animais que 10 foram apresentados durante um curto período de tempo (FERGUNSON; YOUNG; INSEL, 2002). 1.3.1 Comportamento de Brincar Um dos comportamentos sociais, conhecido em filhotes, é o comportamento de brincar que é bastante frequente na vida de animais jovens, principalmente em mamíferos. Visto que, a brincadeira demanda um alto gasto energético e se manteve evolutivamente, sua função aparenta ter significância e importância para os organismos, tanto adaptativamente, quanto para seu desenvolvimento e sobrevivência (VIEIRA; SARTORIO, 2002). Para Homberg, et al., (2007), o comportamento de brincar parece ser muito importante para o desenvolvimento social e cognitivo. Martin e Caro (1985), também faz uma relação entre a função da brincadeira e o desenvolvimento do animal, pois sabe-se que o comportamento lúdico é uma característica predominante em animais jovens e estaria envolvido na fase de desenvolvimento, período em que ocorrem as mudanças no comportamento e aquisição de habilidades que permitem a independência do indivíduo em relação à mãe, ocorrendo uma aprendizagem dos padrões comportamentais. Assim, a brincadeira seria importante para acelerar o desenvolvimento de habilidades adultas. Contudo, de acordo com Bekoff e Byers (1998), a brincadeira é uma preparação para o futuro. Em relação ao sistema motivacional para a realização do comportamento de brincar diversos autores citam que a brincadeira aumenta significativamente após um período de isolamento do animal, mas isto acaba gerando um processo de saciação (PANKSEPP; BEATTY, 1980). Além do mais, constatou-se que em ratos a frequência da brincadeira diminui com o passar do tempo (HOLE, 1991). Em relação aos aspectos causais que geram a brincadeira são observados fatores internos (endógenos e motivacionais) e externos (sociais) VIEIRA; SARTORIO, 2002). Os aspectos internos relacionam-se á diferenças que existem entre o sexo dos animais na brincadeira. É visto que na maioria das espécies o macho brinca mais do que a fêmea. Sendo poucas as espécies que 11 machos e fêmeas brincam na mesma quantidade e em nenhuma espécie, filhotes fêmeas brincam mais do que filhotes machos (MEANEY; STEWART; BEATTY, 1985). Além do mais, no caso dos roedores, os machos iniciam mais o comportamento de brincar do que as fêmeas (MEANEY; STEWART, 1981; THOR; HOLLOWAY, 1983), enquanto estas interrompem com maior frequência um episódio de brincadeira e tendem a ter eventos de brincar mais curtos do que os machos (HOLE, 1988). Conforme afirma Pellis et. al. (1997) umas das explicações para as diferenças sexuais no comportamento de brincar estaria relacionada com a concentração de hormônios esteróides no período perinatal do desenvolvimento, atribuindo-se tal conclusão ao fato da existência de experimentos que envolviam a castração de ratos do sexo masculino logo após seu nascimento e de outros que envolviam a administração de hormônios andrógenos nas fêmeas. Os dados obtidos evidenciaram que nos machos castrados a realização do comportamento lúdico foi reduzida aos níveis típicos femininos, enquanto que no sexo oposto, a androgenização levou ao aumento da frequência de execução do comportamento para níveis próximos aos masculinos. Por fim, de acordo com Vieira e Sartorio (2002), um fator social que influencia a brincadeira, é a idade do indivíduo. O comportamento de brincar é muito mais presente entre animais jovens do que em adultos, tendo nestes últimos uma frequência de brincar menor. Isto pode ter relação com o fato de que em adultos a brincadeira pode resultar em agressão. Um dos tipos mais conhecidos de brincadeira entre roedores é a brincadeira de luta (play fighting) que, comumente, envolve dois ou mais animais que se atacam e se defendem um dos outros. No play fighting os alvos são regiões específicas corporais, variáveis entre as espécies. E não só o ataque, mas também o contra-ataque apresenta estas regiões. Especificamente, nos ratos, a região mais atingida durante os ataques é a nuca. E quando isto não ocorre é devido ao fato do animal ter conseguido se defender antes de o parceiro ter conseguido alcançar a mesma (PELLIS; PELLIS, 1998). 12 O play fighting envolve, basicamente, o ataque e a defesa da nuca. Iniciase quando um dos animais, o atacante, aproxima-se por trás do outro para atingilo com seu focinho, na nuca. Em resposta, o defensor poderá reagir de cinco diferentes maneiras, determinando se haverá continuidade ao comportamento lúdico ou não. O defensor pode permanecer imóvel, e assim, o atacante realiza um breve contato com a nuca de seu companheiro e então salta para longe dele, podendo repetir o ataque após algum tempo. Outra resposta que não gera continuidade ao play é o movimento de esquiva, ou evasão, em que o defensor desvia lateralmente de seu parceiro, indo para longe dele (figura 3) (PELLIS, 1988, PELLIS et al., 1997). Figura 3. Respostas que não geram continuidade ao play fighting. (A) Imobilidade. Rato permanece imóvel após o ataque, com isso o atacante salta para longe dele. (B) Esquiva. Defensor desvia lateralmente do atacante. Fonte: Adaptado de Pellis et al. (1997). Caso o play fighting apresente continuidade, algumas sequências de movimentos, em resposta ao ataque, aparecem. Um destes movimentos ocorrem quando o atacante tenta atingir a nuca do parceiro, que realiza uma rotação parcial como defesa. Permanecendo sobre suas patas traseiras, o defensor gira a parte dianteira do corpo em torno do seu próprio eixo longitudinal, 13 de modo a afastar sua nuca do atacante. Outra resposta defensiva é o contraataque, o qual ocorre quando o defensor atinge a nuca do atacante após ter tido a sua nuca atingida. Por fim, após sofrer o ataque, o defensor pode realizar uma rotação completa em torno do seu eixo longitudinal. Neste movimento o defensor gira completamente seu corpo, permanecendo com o dorso apoiado no chão e o ventre voltado para cima. A partir desta posição, o defensor então pode usar suas patas para segurar o atacante, que está posicionado sobre ele, assim como também pode lançar ataques em direção à nuca de seu parceiro (figura 4) (PELLIS et al., 1997). Figura 4. Respostas que geram continuidade ao play fighting. (A) Contra-ataque. Defensor atinge a nuca do atacante após ter sido atacado. (B) Rotação parcial. Defensor rotaciona a parte dianteira do seu corpo em torno do seu eixo logitudinal, afastando sua nuca do atacante. (C) Rotação completa. Defensor atinge posição de supina, afastando sua nuca do parceiro e segurando-o com suas patas dianteiras. Fonte: Adaptado de Pellis et al. (1997). 1.3.2 Comportamento Social dos Adultos O comportamento social nos indivíduos adultos são regulados através do reconhecimento da identidade grupal, ou seja, o cheiro característico, por 14 exemplo, permite o reconhecimento mútuo entre os indivíduos. Caso um indivíduo perca seu cheiro característico que é reconhecido pelos outros membros do grupo, este pode acabar sendo atacado e morto pelos mesmos parceiros que minutos antes mantinham com ele interações amistosas (CARVALHO ALMEIDA, 1988). Conforme afirma Popik e Van Ree (1998), os comportamentos sociais para animais adultos podem ser classificados em quatro categorias principais, que incluem os comportamentos sociais de investigação, contato direto, comportamentos atentos (“attentive behaviors”) e comportamentos “do tipo” agressivo. O comportamento social de investigação é aquele no qual o rato obtém informações sobre o outro cheirando e lambendo-o, ou então, utilizando suas vibrissas para obter informações de natureza tátil. Os contatos sociais diretos incluem passar por cima ou por baixo do companheiro, montar e realizar o social grooming. Comportamentos atentos incluem aproximação e perseguição do co-específico. Enquanto os comportamentos do tipo agressivo incluem mordiscadas, “chutes” e posturas ameaçadoras. De acordo com Fergunson; Young; Insel, (2002), o sistema olfatório principal e o sistema olfatório acessório são ativados durante os encontros sociais nos ratos. O fato de o animal cheirar o corpo do outro indicam que não somente sinais olfatórios voláteis são utilizados para a discriminação, como também sinais feromonais não voláteis. Os neurotransmissores estão envolvidos na memória social e incluem a ocitocina, vasopressina e a dopamina. Estes são liberados em determinadas regiões do SNC e são de enorme importância para que ocorra o reconhecimento social. A ocitocina é liberada em regiões do SNC durante as interações, tanto sociais, quanto sexuais (CHOLERIS; KAVALIERS; PFAFF, 2004). E em ratas fêmeas o estrogênio regula a ação da ocitocina em relação à memória social (CARTER; KEVERNE, 2002). 15 2. OBJETIVO 2.1 Objetivo Geral Estudar os efeitos da exposição perinatal a uma formulação comercial do glifosato no comportamento social da prole de ratos Wistar. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar os efeitos no peso corporal da prole de ratas submetidas à 50mg/kg de glifosato-Roundup® na fase perinatal. Determinar o efeito da exposição à dose de 50mg/kg de glifosato-Roundup® administrado durante a fase perinatal no comportamento de play-fighting dos filhotes machos e fêmeas. Determinar o efeito da exposição à dose de 50mg/kg de glifosato-Roundup® administrado durante a fase perinatal na interação social dos ratos adultos machos e fêmeas. 16 3. MATERIAL E MÉTODOS Droga Foi utilizado Roundup Transorb® (Monsanto Co., St. Louis, MO) cuja composição é de 648 g/L de sal de isopropilamina de glifosato, 480 g/L de equivalente ácido de N-fosfonometilglicina (glifosato) e 594 g/L de ingredientes inertes. Como solução controle empregou-se a água. A administração da formulação comercial e da água foi feita por gavagem. Animais Foram utilizados 24 ratos da linhagem Wistar, fêmeas e machos adultos, obtidos do biotério do Departamento de Patologia (VPT) da Faculdade de Medicina Veterinária (FMVZ) - Universidade de São Paulo (USP), por meio de cruzamentos sucessivos. Os animais foram alojados em gaiolas de polipropileno mantidas em uma sala com temperatura controlada por meio de aparelhos de ar condicionado (20 ± 2oC) e com ciclo de luz de 12-12H começando 7:00, no biotério da Universidade Presbiteriana Mackenzie. Água e comida foram fornecidas ad libitum aos animais durante todo procedimento experimental. Diagnóstico de prenhez Para o acasalamento as fêmeas foram distribuídas duas a duas em gaiolas de polietileno, onde no final da tarde foi colocado um macho sabidamente fértil. Na manhã subsequente, os machos foram retirados, e os lavados vaginais coletados. A figura abaixo mostra a coleta do lavado vaginal realizado com 10 μL de salina a 0.9%. 17 Figura 5 - Coleta do lavado vaginal em rata Wistar, com 10 μL de salina. Fonte: Marcondes; Bianco; Tanno, (2002). Os fatores indicativos de prenhez foram: presença de espermatozóides e de células indicativas de estro (caracterizada como a fase estrogênica máxima, onde se encontram apenas células queratinizadas). Este foi considerado como o dia 0 de gestação (GD 0). Durante a gestação foi mantida uma fêmea por gaiola, sendo que estas foram pesadas para o controle de ganho de peso. A figura abaixo mostra uma lâmina do lavado vaginal das fêmeas com a presença de espermatozoides. Figura 6: Lavado vaginal positivo de ratas contendo espermatozóides, observado ao microscópio óptico em aumento de (A) 20x e (B) 40x. 18 Tratamento A dose de glifosato de 50 mg/kg foi escolhida baseada na NOAEL (50 mg/kg). As ratas controles receberam água via gavagem, a fim de serem submetidas ao mesmo tipo de estresse das ratas experimentais que receberam a droga. O período de administração, do 15° dia de gestação (DG 15) ao 7° dia de lactação (DL 7), corresponde ao período de desenvolvimento do sistema de nervos central dos ratos. Desenvolvimento Perinatal Avaliação do desenvolvimento ponderal dos filhotes Todos os filhotes de cada fêmea foram pesados, individualmente, no segundo dia de vida e sexados pelo método da medição da distância anogenital. Além disso, nas primeiras horas de vida foram avaliados fisicamente para observação da ocorrência ou não de malformações visíveis. Posteriormente, a ninhada foi padronizada para um número de oito filhotes em proporções iguais de sexo. As medidas de peso corporal foram realizadas do DL2 ao DL7, DL14 e DL21. Ao final foram observados os respectivos ganhos de peso dos animais controle e experimentais para avaliação indireta da toxicidade. Figura 7 - Padronização das Ninhadas em 4 machos e 4 fêmeas. 19 Os animais ficaram alojados em gaiolas de polipropileno mantidas em uma sala com temperatura controlada por meio de aparelhos de ar condicionado (20 ± 2oC) e com ciclo de luz de 12-12H começando 7:00, no biotério da Universidade Presbiteriana Mackenzie. Água e comida foram fornecidas ad libitum até que se iniciassem os testes comportamentais. Play Fighting O teste foi realizado com 24 filhotes, quando estes estavam com aproximadamente 30 dias de vida (entre 28 e 30 dias), durante o mês de Novembro de 2012 no laboratório de análise experimental do comportamento da Universidade Presbiteriana Mackenzie, no período da manhã (das 10h às 12h). A aparelhagem e a metodologia empregadas na realização do teste foram adaptadas de Pletnikov et al (1999). Após o desmame, e três dias antes das ninhadas atingirem os 28, 29 ou 30 dias de vida, dois filhotes de cada prole foram retirados de suas gaiolas (um macho e uma fêmea) e isolados cada um em uma nova gaiola limpa. Assim, por três dias, os animais foram submetidos a duas condições de alojamento diferentes: um animal em isolamento social e outro animal foi mantido agrupado, condição em que os filhotes permaneceram em gaiolas com até cinco indivíduos da mesma prole e do mesmo gênero. Antes da realização do teste, a gaiola de um indivíduo que permaneceu isolado e a de um que esteve agrupado, de ninhadas diferentes, foram levadas ao laboratório de análise experimental do comportamento, onde permaneceram por cinco minutos para aclimatação. Após a aclimatação, o filhote que permaneceu isolado foi colocado juntamente com um filhote agrupado, pertencente a outra ninhada que não a dele, em uma gaiola limpa e sem maravalha, e a interação entre ambos foi filmada durante dez minutos para posterior coleta de dados e análise. Testes comportamentais 20 A frequência dos comportamentos foram analisadas através das gravações de vídeos. Para cada par de ratos testados, foram avaliados 6 comportamentos: 1) ataque, ocorre quando o filhote atacante tenta acertar a nuca do outro filhote com o focinho; 2) esquiva, ocorre quando o defensor desvia lateralmente do atacante; 3) imobilidade, ocorre quando o filhote defensor permanece imóvel ao ataque; 4) rotação parcial, ocorre quando o defensor gira a parte dianteira do corpo em torno de si próprio, permanecendo sobre as suas patas traseiras, a fim de afastar a nuca do atacante; 5) contra ataque, ocorre quando o defensor consegue atingir a nuca do atacante e 6) rotação completa, na qual o defensor gira completamente seu corpo, permanecendo com o dorso apoiado no chão e o ventre voltado para cima. Figura 8. Experimento de Play Fighting. Sociabilização O teste comportamental foi realizado com 24 ratos adultos e iniciou-se entre 90 e 95 dias do pós-natal. Tanto ratos machos, quanto fêmeas foram utilizados no experimento. Os testes de sociabilização foram realizados durante o período das 10 horas da manhã até às 4 horas da tarde, durante o mês de Janeiro no laboratório de análise experimental do comportamento da Universidade Presbiteriana Mackenzie. A aparelhagem para realização do teste, assim como o método para sua realização, foi adaptada de Crawley (2007) e Yang (2011), posteriormente utilizada por Novaes (2012). 21 O aparelho usado foi uma caixa retangular de acrílico, com três compartimentos (39 cm de altura, 26 cm de largura e 41 cm de profundidade) com portas retráteis. A sociabilização é precedida por um período de habituação de 10 minutos, no qual o rato x (teste) se mantém no compartimento do meio, isolado e com as portas fechadas. Depois deste período de habituação um rato desconhecido, ou seja, que não é irmão do rato que será testado, é colocado em um dos dois compartimentos dentro de uma gaiola de metal, enquanto o outro compartimento recebe uma gaiola de metal vazia, assim as portas são abertas para o início do teste. Os lados em que ficam ambas as gaiolas são alternados em cada nova observação. Observa-se o rato x explorar o aparelho durante 10 minutos. A sessão é filmada, e é contado o número de vezes que o rato x entra com as 4 patas em cada compartimento, o tempo em que ele se mantém em cada compartimento e o número de vezes em que o rato x interage com o rato desconhecido realizando o comportamento de nose poke. A aparelhagem e as gaiolas são limpas depois do uso com álcool 5%. A frequência e a duração dos comportamentos foram analisadas através das gravações de vídeos. Para cada par de ratos testados, os seguintes comportamentos sociais foram avaliados: frequência da interação social entre os dois animais, por meio do comportamento de nose poke (focinho – focinho); duração do tempo, em segundos, em que o animal testado permaneceu em cada compartimento e o número de vezes em que o animal testado atravessa a porta de cada compartimento. Figura 9 - Teste comportamental de sociabilização 22 Análise Estatística Para a avaliação do peso dos filhotes foi realizado uma média de cada variável que foi analisada por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni. O nível de significância aceito foi de p<0,05. Para a avaliação do play fighting foi realizada a média de cada variável que foi analisada por ANOVA de uma via seguida pelo texto de Bonferroni. O nível de significância aceito foi de p<0,05. Por fim, para o teste de sociabilização foi realizado uma média de cada variável que foi analisada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni. O nível de significância aceito foi de p<0,05. 23 4. RESULTADOS Avaliação do desenvolvimento físico A figura 10 ilustra respectivamente os resultados obtidos do peso dos filhotes fêmeas e machos, realizado do dia DL2 ao DL21. Para os machos a ANOVA de duas vias indicou diferenças estatísticas com relação aos dias de observação [F(7/112)=724,6, p<0,0001); e quanto ao tratamento (F(7/112)=0,1330, p=0,7160), mas não havendo interação entre os fatores (F(7/112)=0,188, p=0,9874). Para as fêmeas a ANOVA de duas vias indicou diferenças estatísticas com relação aos dias de observação [F(7/112)=912,8, p<0,0001); e quanto ao tratamento (F(7/112)=5,20, P=0,0245), mas não havendo interação entre os fatores (F(7/112)=2,363, p=0,0273]. 24 Peso dos filhotes machos 60 Controle 50mg/kg Gramas 40 20 0 2 3 4 5 6 7 14 21 Dias Peso dos filhotes fêmeas 60 Controle 50mg/kg Gramas 40 20 0 2 3 4 5 6 7 14 21 Dias Figura 10. Peso (em g) dos filhotes machos e fêmeas de ratas do grupo controle e de ratas submetidas a dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15º gestação ao 7º dia de lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N=8 animais por grupo. A ANOVA de duas vias, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerada significante, p<0,05. Avaliação do play fighting A figura 11 ilustra os resultados da frequência de ataque da prole de machos e fêmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas significantes entre os grupos [F(3/23)=1,804, p=0,1789)]. 25 Ataque 25 20 Frequência 15 10 5 0 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle Grupos Figura 11. Frequência do comportamento de ataque da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas à dose de 50mg/kg glifosato, durante 15º gestação ao 7º dia de lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0.05. A figura 12 ilustra os resultados da frequência do comportamento de esquiva da prole de machos e fêmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas significantes entre os grupos [F(3/23)=1,478, p=0,2507)]. Esquiva 15 Frequência 10 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle 5 0 Grupos Figura 12. Frequência do comportamento de esquiva da prole de ratas prenhes do grupo controle 26 e de ratas submetidas à dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15º gestação ao 7º dia de lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005. A figura 13 ilustra os resultados da frequência de imobilidade da prole de machos e fêmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas significantes entre os grupos [F(3/23)=2,418, p=0,0963)]. Imobilidade 20 15 10 5 0 Frequência Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle Grupos Figura 13. Frequência do comportamento de imobilidade da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas à dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15º gestação ao 7º dia de lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005. A figura 14 ilustra os resultados da frequência de rotação parcial da prole de machos e fêmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via indicou diferenças estatísticas significantes entre as fêmeas experimentais e controle [F(3/23)=6,167, p=0,0038)]. 27 Rotação Parcial 2.0 ** Frequência 1.5 1.0 0.5 0.0 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle ** Grupos Figura 14. Frequência do comportamento de rotação parcial da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas à dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15º gestação ao 7º dia de lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005 A figura 15 ilustra os resultados da frequência de contra-ataque da prole de machos e fêmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via indicou diferenças estatísticas significantes entre as fêmeas experimentais e controle [F(3/23) = 3,566, p=0,0325)]. 28 Contra-Ataque 8 6 4 2 0 Frequência Machos Experimentais 50mg/kg Machos Controle Fêmeas Experimentais 50mg/kg Fêmeas Controle Grupos Figura 15. Frequência do comportamento de contra-ataque da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas à dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15º gestação ao 7º dia de lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005 O quadro 2 mostra a frequência de rotações completas ocorridas durante o teste de play fighting dos grupos controle e dos grupos experimentais, ambos com filhotes machos e fêmeas, submetidos à dose de 50 mg/kg de glifosato durante o 15º dia de gestação ao 7º dia de lactação. Apenas uma das duplas, em um dos grupos (machos experimentais 50 mg/kg), realizou a rotação completa. Quadro 2. Frequência de rotações completas ocorridas nos grupos controle (machos e fêmeas) e nos grupos experimentais 50mg/kg (machos e fêmeas). Duplas 1 2 3 4 5 6 Macho Controle 0 0 0 0 0 0 Machos Experimentais 0 4 0 0 0 0 Fêmeas Controle 0 0 0 0 0 0 Fêmeas Experimentais 0 0 0 0 0 0 29 Avaliação da interação social A figura 16 ilustra os resultados envolvendo o tempo da prole de machos e fêmeas de ratas experimentais e controles que ficaram no compartimento onde só havia uma gaiola vazia. O teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas entre os grupos [F(3/23)=0,8075, p=0,5045)]. Tempo (s) no compartimento com a gaiola vazia 250 200 Tempo (s) 150 100 50 0 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle Grupos Figura 16. Tempo (em seg.) em que ratos, na idade adulta, machos e fêmeas controles e experimentais que foram submetidos à dose de 50mg/kg de glifosato passaram no compartimento onde havia a gaiola vazia. São apresentadas as médias e os respectivos errospadrão; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05. A figura 17 ilustra os resultados envolvendo o tempo da prole de machos e fêmeas de ratas experimentais e controles que ficaram no compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. O Teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas entre os grupos [F(3/23)=0,2823, p=0,8375)]. 30 Tempo (s) no compartimento com a gaiola com o animal estranho. 400 300 Tempo (s) 200 100 0 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle Grupos Figura 17. Tempo em que ratos, na idade adulta, machos e fêmeas (em seg.) controles e experimentais que foram submetidos à dose de 50mg/kg de glifosato passaram no compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05 A figura 18 ilustra os resultados envolvendo o número de vezes em que a prole de machos e fêmeas de ratas experimentais e controles passaram pela porta do compartimento onde só havia uma gaiola vazia. O teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas entre os grupos [F(3/23) = 0,2202, p=0,8812)]. Número de vezes em que o animal passou pela porta onde havia a gaiola vazia. 5 Número de vezes 4 3 2 1 0 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle Grupos Figura 18. Número de vezes em que ratos, na idade adulta, machos e fêmeas (em seg.) controles e experimentais que foram submetidos à dose de 50mg/kg de glifosato passaram pela porta do compartimento onde havia a gaiola vazia. São apresentadas as médias e os respectivos errospadrão; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05 31 A figura 19 ilustra os resultados envolvendo o número de vezes em que a prole de machos e fêmeas de ratas experimentais e controles passaram pela porta do compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. O teste ANOVA de uma via indicou diferença estatística entre os grupos experimentais machos e fêmeas [F(3/23)=4,545, p=0,0138)]. Número de vezes em que o animal passa pela porta com o animal estranho. 6 * Número de vezes 4 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle 2 0 Grupos Figura 19. Número de vezes em que ratos, na idade adulta, machos e fêmeas (em seg.) controles e experimentais que foram submetidos à dose de 50mg/kg de glifosato passaram pela porta do compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante,*p<0,05. A figura 20 ilustra os resultados envolvendo o número de vezes em que a prole de machos e fêmeas de ratas experimentais e controles realizaram o comportamento de nose poke com o animal estranho que estava dentro da gaiola em um dos compartimentos da caixa de acrílico. O teste ANOVA de uma via não indicou diferenças estatísticas entre os grupos [F(3/23)=1,151, p=0,3528)]. 32 Nose poke 6 Número de vezes 4 Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fêmeas exp. 50mg/kg Fêmeas controle 2 0 Grupos Figura 20. Número de vezes em que ratos, na idade adulta, machos e fêmeas controles e experimentais que foram submetidos à dose de 50mg/kg de glifosato realizaram o comportamento de nose poke com o animal estranho que estava dentro da gaiola. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05 33 5. DISCUSSÃO A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos que ocorrem nos organismos em desenvolvimento, expostos à diferentes agentes químicos antes da concepção, durante o desenvolvimento pré-natal e pós-natal até a puberdade. A toxicologia do desenvolvimento engloba a teratologia e a toxicologia da reprodução (BARROS e SOLANGE, 1996). Antigamente a teratologia estava relacionada apenas com alterações de ordem morfológica, atualmente, é o estudo do desenvolvimento anormal do feto, incluindo malformações estruturais, retardo no crescimento, dano no desenvolvimento e comportamento e até mesmo morte (HANSEN e YANKOVITZ, 2002). Estas alterações podem ser causadas pela ação direta de um agente tóxico sobre o feto ou através da ação no organismo materno (BERNARDI et al., 1999, EATON; GILBERT, 2012). O efeito tóxico de uma substância pode ocorrer durante todo o desenvolvimento embriofetal de um mamífero, no entanto, as consequências podem variar conforme o período de exposição. O desenvolvimento embriofetal de mamíferos pode ser dividido em quatro períodos: implantação, organogênese ou organogenético, desenvolvimento fetal e período neonatal. A toxicidade a agentes tóxicos no período inicial do desenvolvimento (implantação) pode variar conforme o número de células atingidas pelo agente tóxico, ou seja, quanto maior o número de células atingidas, maior será a chance de ocorrer uma embrioletalidade. O período de organogênese abrange desde a proliferação e migração celular até a formação de órgãos rudimentares; nesta fase ocorre uma maior suscetibilidade à ação do agente tóxico, podendo acarretar em malformações estruturais. Após a organogênese, segue-se o período de desenvolvimento fetal e neonatal, exposições que se iniciam durante estes períodos podem apresentar anormalidades celulares e teciduais, podendo interferir em funções normais de importantes sistemas, tais como o sistema nervoso central, sistema imune ou sistema endócrino, além de causar retardo geral do desenvolvimento (OGA, 2008). Um outro tipo de estudo sobre a toxicidade apresenta relação com a toxicologia reprodutiva, onde são analisados os efeitos de um agente ambiental 34 físico ou químico sobre o embrião ou feto, sendo que tais efeitos são dependentes de diversos fatores, como a via e o período de exposição e da gestação, dose, susceptibilidade genética materna ou embrio-fetal e a presença ou natureza de exposições simultâneas (BRENT, 2001). Nos dias de hoje, sabese que o feto pode ser facilmente afetado por compostos tóxicos presente no sangue materno, já que estes atravessam a placenta e chegam a corrente sanguínea do feto (MYLLYNEN; PASANEN; PELKNONEN, 2005). O glifosato é considerado um agente tóxico por ser capaz de contaminar animais e seres humanos. É um herbicida bastante solúvel em água e considerado um dos maiores poluidores de rios e águas de superfície. Sendo assim, a exposição à ele durante a gestação poderia interferir com o desenvolvimento da prole de ratas expostas ao mesmo. No entanto, os presentes resultados em relação ao peso da prole de ratas que foram expostas a dose de 50mg/kg de glifosato na fase perinatal não demonstraram diferenças significativas de peso, evidenciando assim que não houve sinais de toxicidade no período embriofetal, sendo que, os filhotes também foram avaliados quanto a sua morfologia ao nascimento e não apresentaram diferenças morfológicas em relação aos filhotes controles. O play fighting, de acordo com Pellis et al. (1997), possui diferenças de acordo com o sexo do filhote. E isto apresentaria relação com os hormônios esteróides que estão presentes no período perinatal. E devido ao fato do glifosato atuar como um desregulador endócrino, é possível que ele gere mudanças neste comportamento. Os resultados não mostraram diferenças significantes entre os grupos experimentais e controle em relação ao parâmetro ataque, imobilidade, contraataque, rotação completa e esquiva. Mas, o parâmetro de rotação parcial mostrou-se significante com diferença entre os machos do grupo experimental de 50mg/kg e as fêmeas do mesmo grupo. Resultado que corrobora com a ideia de que os hormônios esteroides influenciam no dimorfismo de comportamento de machos e fêmeas. Evidenciando assim, que o herbicida não causou prejuízos no comportamento infantil da prole. 35 A interação social em indivíduos adultos é dependente da ação de feromônios voláteis e não voláteis (FERGUNSON; YOUNG; INSEL, 2002). E o reconhecimento através do cheiro caraterístico gera uma identidade grupal para os roedores (CARVALHO ALMEIDA, 1988). A memória social e o aprendizado apresentam-se relacionados ao reconhecimento social, sendo que, de acordo com Choleris, et al. (2004) existem neurotransmissores envolvidos na memória, como a vasopressina e a ocitocina. E estes podem sofrer influência de desreguladores endócrinos, afetando o comportamento social. Os resultados presentes sobre o comportamento social, no entanto, não mostraram diferenças significantes entre os grupos que foram expostos ao glifosato e o grupo controle. Somente o parâmetro número de vezes em que o animal passa pela porta onde há o desconhecido mostrou-se significante para o grupo experimental de fêmeas. Neste caso, as fêmeas foram com mais frequência ao compartimento com o animal estranho, embora não tenha realizado tanto o comportamento de nose poke quanto o macho, apresentando, assim, uma interação social inferior. Tais resultados demonstram que a fêmea apresenta um comportamento exploratório maior do que o macho, investigando mais um novo ambiente onda há um animal desconhecido, o que é explicado devido ao dimorfismo sexual. A baixa interação social, é influenciada pelo parâmetro nose poke, ou seja, o contato direto entre os dois animais, relacionado com o sistema olfatório. Esta interação menor, pode ser devido á fase do ciclo estral em que a fêmea se encontra, já que a memória social possui relação com a ocitocina, regulada pelo estrogênio e assim, em diferentes fases do ciclo, esta interação pode mudar, sendo mais evidente ou não. Estes resultados, em conjunto, não mostraram diferenças significantes entre os animais do grupo experimental e controle, tanto em relação ao comportamento de brincar de filhotes, quanto ao comportamento social dos adultos. 36 6. CONCLUSÃO A exposição perinatal à dose de 50mg/kg de glifosato-Roundup®: Não induziu diferenças na avaliação do peso dos filhotes. Não induziu sinais de toxicidade evidente nos filhotes. Não alterou os comportamentos de brincar dos filhotes. Não alterou o comportamento e a interação social da prole de idade adulta. 37 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARROS, S. B. M.; SOLANGE, C. D. Avaliação da toxicidade. In: SEIZE, O. Fundamentos de Toxicologia. São Paulo: Atheneu editora São Paulo LTDA, p. 59-70, 1996. BEKOFF, M.; BYERS, J. A. Animal Play: evolutionary, comparative and ecological perspectives. Cambridge University Press, 1998. BERNARDI, M. M. Exposição aos medicamentos durante o período perinatal. In: SPINOSA, H. H.; GÓRNIAK, S. L.; BERNARDI M. M. Farmacologia aplicada à medicina veterinária. 2ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 566-574, 1999. BIANCO, B. et al. O papel dos desreguladores endócrinos na fisiopatologia da endometriose: revisão da literatura. Arquivos Brasileiros da Ciência da Saúde, Santo André, v.35, n.2, p.103-10, Mai/Ago 2010. BORGES FILHO, Epaminondas Luiz. O desenvolvimento do plantio direto no Brasil: a conjunção de interesses entre agricultores, indústrias e o Estado. 2011. 156f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Econômico, Espaço e Meio Ambiente) – Faculdade de Economia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. BRAIBANTE, M. E. L.; ZAPPE, J. A. A química dos agrotóxicos. Química Nova na Escola, vol. 34, n. 1, p. 10-15, 2012. BRASIL. Lei 7.802, de 11 de julho de 1989. Disponível em: 7 em: de <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/leis/l7802.htm>. dezembro de 2012. Acesso BRENT, R. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years? Congenital Anomalies, v. 41, p. 3-21, 2001. 38 CARVALHO ALMEIDA, Ana Maria. Etologia e Comportamento Social. IV Encontro Nacional de Psicologia Social – ABRAPSO/UFES. 1988. CARTER C. S.; KEVERNE E. B. The neurobiology of social affiliation and pair bonding. In: PFAFF, D. W.; ARNOLD, A. P.; ETGEN, A. M., FAHRBACH, S. E.; RUBIN, R. T. (eds.). Hormones, Brain, and Behavior. NY: Academic Press, p.299-337, 2002 CARTHY, J. D.; HOWSE, P. E. Comportamento Animal. In: Temas da Biologia. 2 ed. São Paulo: EPU: Ed. Universidade de São Paulo, vol. 14, 79 p., 1980. CASTRO, Andréa Souza. Avaliação Pontual da Degradação e Transporte do Herbicida Glifosato no Solo da Bacia do Arroio Donato-Pejuçara (RS). Janeiro de 2005. 102f. Dissertação (Mestrado em Recursos Hídricos e Saneamento Ambiental) – Instituto de Pesquisas Hidráulicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. CHOLERIS, E.; KAVALIERS, M.; PFAFF. W. Functional genomics of social recognition. Journal of neuroendocrinology, v. 16, p. 383-389, 2004. CONCEITOS Básicos de Toxicologia. Disponível em: http://www.saude.pr.gov.br/arquivos/File/zoonoses_intoxicacoes/Conceitos_Ba sicos_de_Toxicologia.pdf. Acesso em: 7 de dez. de 2012. COUTINHO, C. F. B.; MAZO, L. H. Complexos metálicos com o herbicida glifosato: Revisão. Química Nova, vol. 28, n. 6, p. 1038-1045, 2005. CRAWLEY, J. N. Mouse Behavioral Assays Relevant to the Symptoms of Autism. Brain Pathol, v. 17, p.448–459, 2007. DALLEGRAVE, Eliane. Toxicidade Reprodutiva do Herbicida GlifosatoRoundup em Ratos Wistar. Fevereiro de 2003. 200f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) – Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 39 EATON, D. L.; GILBERT, S. G. Princípios de Toxicologia. In. KLASSEN, C. D.; WATKINS, J. B. Fundamentos em Toxicologia de Casarett e Doull (Org.). 2ed. Porto Alegre: AMGH, p. 5-20, 2012. FERGUNSON, J. N.; YOUNG, L. J.; INSEL, T. R. The Neuroendocrine Basis of Social Recognition. Frontiers in Neuroendocrinology, v. 23, p. 200-224, 2002. GUYTON, A. C.; HALL, J. E. Endocrinologia e Reprodução. Tratado de Fisiologia Médica. 10 ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, cap 74, p. 905916, 2002. HANSEN, W. F.; YANKOVITZ, J. Pharmacologic therapy for medical discords during pregnancy. Clinical Obstetrics and Ginecology, v.45, n.1, p. 136-152, 2002 HOMBERG, J. R. et al. Acute and constitutive increases in central serotonin levels reduce social play behaviour in peri-adolescent rats. Psychopharmacology, v. 195, p. 175-182, 2007. HOLE, G. Temporal feature of social play in the laboratory rat. Ethology, v. 78, p. 1-20, 1988. HOLE, G. The effects of social deprivation on levels of social play in the laboratory rat (Rattus norvegicus). Behavioral Processes, v. 25, p. 41-53, 1991. JUNIOR, O. P. A. et al. Glifosato: Propriedades, Toxicidade, Uso e Legislação. Química Nova, vol. 25, n. 4, p. 589-593, 2002 MARCONDES, F. K.; BIANCHI, F. J.; TANNO, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: Some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology, v.62, n.4, p.609-614, 2002. MARTIN, P.; CARO, T. M. On the functions of play and its role in behavioral developmental. Advances in the Study of Behavior, v.15, p. 59-103, 1985. MEANEY, M. J.; STEWART, J. A descriptive study of social development in the rat (Rattus norvegicus). Animal Behaviour, v. 29, p. 34-45, 1981. 40 MEANEY, M. J.; STEWART, J.; BEATTY, W. W. Sex differences in social play: the socialization of sex roles. Advances in the Study of Behavior, v. 15, p. 156, 1985. MYLLYNEN, P.; PASANEN, M.; PELKNONEN, O. Human placenta: a human organ for developmental toxicology research and biomonitoring. Placenta, v. 26, p. 361-371, 2005. NORMAN, A. W.; LITWACK, G. Hormones. 2ed. Califórnia: Academic Press. 1997. 558p. NORTOX. Disponível em: < http://www.nortox.com.br/imagens/produtos/glifosato_bula.pdf>. Acesso em: 13 dez. 2012. NOVAES, G. F. et al. Social behavior impairment in offspring exposed to maternal seizures in útero. Journal of Neural Transmission, n.119, p. 639-644, 2012. OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUTO, J.A.O. Fundamentos de toxicologia. 3. ed. São Paulo: Atheneu, 2008. OLIVEIRA, D. P. et al. Exposição ambiental a desreguladores endócrinos: alterações na homeostase dos hormônios esteroidais e tireoideanos. Revista Brasileira de Toxicologia, v. 21, n.1, p.1-8, 2008. OPAS/OMS - Organização Pan-Americana da Saúde/Organização Mundial da Saúde. Manual de vigilância da saúde de populações expostas a agrotóxicos. Representação do Brasil. Brasília, 1996. PANKSEPP, J.; BEATTY, W. W. Social deprivation and play in rats. Behavioral and Neural Biology, v. 30, p. 197-206, 1980. PELLIS, S. M.; PELLIS, V. C. The play fighting of rats in comparative perspective: A schema for neurobehavioral analyses. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, v. 23, p. 87 – 101, 1998. 41 PELLIS et al. Multiple Differences in the Play Fighting of Male and Female Rats. Implications for the Causes and Functions of Play. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, v. 21, p. 105-120, 1997. PLETINIKOV, M.V. et al. Developmental brain injury associated with abnormal play behavior in neonatally Borna disease virus-infected Lewis rats: a model of autism. Behavioural Brain Research, v.100, p.43–50. POPIK, P.; & VAN REE, J. M. Neurohypophyseal peptides and social recognition in rats. In: URBAN, I. J. A.; BURBACH, J. P. H.; WIED, D. De. (eds.). Progress in Brain Research. Elsevier Science, 1998, v.119, p. 415-436. RICHARD, S. et al. Differential effects of glyphosate and Roundup on human placental cells. Environmental Health Perspectives, v. 113, n. 6, p. 716-720, 2005. ROMANO, R. M. et al. A Exposição ao Glifosato-Roundup Causa Atraso no Início da Puberdade em Ratos Machos. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. São Paulo, v.45, n.6, p.481-487. 2008. SANTAMARTA, José. A ameaça dos disruptores endócrinos. Agroecololgia e Desenvolvimento Rural Sustentável, Porto Alegre, v.2, n.3, 2001. SLATER, P. J. B. El comportamiento animal. Madrid: Cambridge, 2000. 240P. THOR, H. D.; HOLLOWAY, W. R. Jr. Play-solicitation behavior in juvenile male and female rats. Animal Learning & Behavior, v. 11, p. 173-178, 1983. VIEIRA, M. L.; SARTORIO, R. Análise motivacional, causal e funcional da brincadeira em duas espécies de roedores. Estudos de Psicologia, vol. 7, n. 1, p. 189-196, 2002. WALSH, L. P.; McCORMICK, C.; MARTIN, C.; et al. Roundup inhibits steroidogenesis by disrupting steroidogenic acute regulatory (StAR) protein expression. Environmental Health Perspectives, v. 108, n. 8, p. 769-776, 2000. 42 WILLIAMS, G. M.; KROES, R.; MUNRO, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v.31, n.2, p.117-165, 2000. YANG, M. et al. Social Peers Rescue Autism-Relevant Sociability Deficits in Adolescent Mice. International Society for Autism Research, n. 4, p. 17-27, 2011. YOSHIZUMI, D. H.; LIMA, S. M. R. R. Esteróides Ovarianos considerações sobre vias de sinalização e suas funções. Disponível em: < http://www.sobrage.org.br/a03.html>. Acesso em: 12 dez 2012.