UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSFundada en 1551 FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA DE POST- GRADO “PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS POR ACTINOMYCETOS EN CULTIVO SUMERGIDO UTILIZANDO PECTINA Y CÁSCARA DE NARANJA” TESIS Para optar el Grado académico de: MAGÍSTER EN BIOTECNOLOGÍA AUTOR Alexis Germán Arroyo Orbegoso LIMA – PERÚ 2002 DEDICATORIA A mis padres: Alipio y Anselma, por su apoyo y comprensión en los momentos más difíciles AGRADECIMIENTOS Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado, por la asesoría y orientación impartida durante el desarrollo de la presente tesis. Dr. Gerardo Gamarra Ballena, por su enseñanza y colaboración prestada. Blgo. Luis Vargas Apaza, por su constante aliento, orientación y colaboración. Dr. Gerardo Gamarra Ballena, Dra. Amparo Zavaleta Pesantes, Mg. Angel Narváez Villavicencio, Mg. Mirtha Roque Alcarraz y Mg. Juan Carlos Woolcott Hurtado, por las sugerencias y correcciones finales realizadas para el logro de la presente tesis. ÍNDICE RESUMEN SUMMARY I. INTRODUCCIÓN II. MARCO TEÓRICO III. MATERIALES Y MÉTODOS IV. RESULTADOS V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES VII. BIBLIOGRAFÍA ANEXOS Alexís Germán RESUMEN El objetivo de esta investigación fue seleccionar las condiciones que permitan la producción de enzimas pectinasas. sulfato de amonio 5 g /L y sulfato ferroso 0. Arroyo Orbegoso.013 g / L. fue realizada la optimización del medio de cultivo experimental. obteniéndose la máxima producción de enzimas. con las siguientes concentraciones: cáscara de naranja 16. para un buen crecimiento del microorganismo. utilizándose matraces Erlenmeyer con 150 mL de medio experimental pH 7. cloruro de calcio. se empleó el diseño experimental Plackett-Burman. sulfato de magnesio y carbonato de sodio. Los cálculos y gráficos estadísticos fueron ejecutados con el software Statistical 2. Palabra clave: biotecnología. obteniéndose 0. pectina. / mL de actividad enzimática. sulfato de amonio.65 U.I. agitación y aireación. temperatura. sulfato de amonio y sulfato ferroso en tres niveles. En la tercera fase. con dos niveles de variación. En la segunda.00 a 37 ºC y 300 rpm por 5 días. se realizó el análisis de regresión múltiple. a partir de cáscaras de naranja. en el que hubo evaluación de las concentraciones de cáscara de naranja. Elaboración y diseño en formato PDF. mediante la evaluación de ocho nutrientes. Con los resultados obtenidos. se determinaron las condiciones de pH . sulfato ferroso. enzimas.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Los nutrientes fueron: cáscara de naranja. úrea. pectinasas. En la primera fase. siguiendo el diseño de Box-Benhken. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .7 g / L. empleando Actinomyces naeslundii. en tres días de biotransformación. cloruro de sodio.1. oranges skin. pectin.65 UI / mL of enzymatic activity in three days of biotransformation. to 37 ºC. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Alexís Germán SUMMARY The objective of this research was to choice the conditions that they permit to optimize the pectinasas enzymes production using orange skins and Actinomyces naeslundii. ammonium sulfate 5 g / L and ferrous sulfate 0. urea. ammonium sulfate. magnesium sulfate y sodium carbonate. agitation to 300 rpm for 5 days. The eight nutrients was: oranges skin. enzymes. agitation and aeration for a good growth microorganism.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. ferrous sulfate.1 software. Key word: biotechnology. on first phase was used qualitative techniques for to determinate the conditions of pH. On the second phase was used the PlackettBurman design through the investigation of eight nutrients with two variation levels. Elaboración y diseño en formato PDF. Third phase of optimization was developed through Box. Arroyo Orbegoso. Optimum Parameters were: oranges skin 16. It was realized a multiple regression analyses with the three variables found previously . it was obtained 0. pectinases. calcium chloride. sodium chloride.7 g / L. cultivation temperature. ammonium sulfate and ferrous sulfate concentration were evaluated on three level.Benhken design. It was used Erlenmeyer flask with 150 mL of experimental medium pH 7.013 g / L. calculus and graphics were developed with Statistical 2. principalmente en la obtención y clarificación de jugos. vinos y cervezas (Fogarty y Ward.Evaluar los niveles de producción de pectinasas con los parámetros establecidos. Orbegoso. utilizando un medio natural a base de cáscara de naranja. Siendo el Perú un país rico en productos agrícolas conviene desarrollar un bioproceso orientado al aprovechamiento integral de recursos provenientes de la producción agrícola y agroindustrial. por lo que. Uno de estos residuos por aprovechar es la cáscara de naranja que. aireación y agitación para la producción de enzimas pectinasas en un medio sintético de laboratorio. en esta investigación trabajamos con una bacteria que en pruebas preliminares produjo enzimas pectinolíticas. resulta atractivo para la producción industrial de enzimas pectinasas. por su volumen. se desarrollo un bioproceso a nivel de laboratorio. 1974. para la producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii planteándonos los siguientes objetivos: . cultivo Arroyo INTRODUCCIÓN Las enzimas pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la pectina. temperatura. en el presente trabajo de investigación. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . por los residuos provenientes de estas actividades. concentración de nutrientes. Éstas presentan una extensa aplicación en la industria alimentaria. Neubeck. Alexís Germán I. además de evitar la contaminación ambiental. . 1975) Las enzimas pectinasas extracelulares que hidrolizan la pectina pueden ser producidas por diferentes microorganismos como hongos y bacterias. Elaboración y diseño en formato PDF.Evaluar los parámetros pH.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. 1980). la pared celular está constituida por una serie de ácidos murámicos y diaminopiméricos. además las encontramos participando en la degradación de desechos orgánicos en los suelos como el compostaje. Muchos actinomycetos pueden crecer en los medios comunes usados en los laboratorios tales como agar nutricio. Los actinomycetos son un grupo de bacterias filamentosas .Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. cultivo Arroyo MARCO TEÓRICO. 2. GRAM (+) . por actinomycetos en cáscara de naranja. por su habilidad para producir metabolitos secundarios. agar sangre y también en agar infusión cerebro corazón. Su información genética posee una inestabilidad muy Elaboración y diseño en formato PDF. para dar la adecuada aireación y homogenización del medio. En cuanto al citoplasma. se ha clasificado como microorganismo procariote debido a que no posee un núcleo y que su cromatina se encuentra libre en el citoplasma. se puede colocar baffles en la parte interior del recipiente. agar tripticasa soya. LOS ACTINOMYCETOS: Los actinomycetos han despertado un gran interés para biotecnólogos. genetistas y ecologistas. Alexís Germán II. pero necesitan ser cultivadas bajo condiciones especiales. las células que se van a formar son denominadas conidias. el microorganismo crecerá en forma de pellet (Cross. dejando el resto del caldo intacto. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . De necesitar mayor mezclado. La agitación puede estar entre 200 – 250 rpm. El crecimiento en un tubo con caldo sin movimiento se da en la superficie. Conforme avanza el tiempo de cultivo. Los cultivos líquidos requieren considerable agitación y aireación. La composición de la membrana ayudó a excluir a los actinomycetos de la denominación hongo.1. por encontrar esteroles en la membrana. característica que ayuda a reconocer a las bacterias. careciendo de pectidoglucanos. Vistos al microscopio tiene la forma de un hongo pequeño de tamaño bacteriano. Los actinomycetos crecerán en caldos. pero poco hicieron para aclarar su naturaleza química. En los actinomycetos podemos ver actualmente el gran potencial que tienen en el campo agrícola. Las pectinas son útiles por su capacidad para formar geles o jaleas con compuestos polihidroxilados. azúcar y ácido en condiciones determinadas. 1961). en la salud y en la biorremediación (Franco.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso.2. 2. Las extensas investigaciones realizadas en los cien años siguientes esclarecieron las propiedades de las sustancias pécticas. biomédico. Los actinomycetos generan metabolitos secundarios al final de la fase logarítmica. Elaboración y diseño en formato PDF. seguidos por los hongos. El vocablo “jalea” se usará para designar al muy conocido producto semisólido formado por pectina. cultivo Arroyo alta. fue aislada por Braconnot en 1824. La sustancia que se había supuesto era la causa de que los jugos de fruta se convirtieran en jalea. Alexís Germán por actinomycetos en cáscara de naranja. como los azúcares o con cantidades diminutas de iones polivalentes. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . En la naturaleza son los mayores productores de antibióticos. En el presente estudio. Entre 1920 y 1940 quedó establecida la producción de pectinas en escala comercial en cierto número de naciones y aquéllas llegaron a formar parte importante en el comercio internacional (Kirk. produciendo una serie de enzimas como las celulasas y amilasas. Se hallan en los tejidos de las plantas. quien la denominó pectina. Tienen la capacidad de degradar pesticidas y derivados de petróleo. 2001). PECTINAS Las pectinas o sustancias pécticas son polisacáridos que se componen principalmente de ácidos poligalacturónicos coloides (poliurónidos derivados del ácido galacturónico CHO(CHOH) 4COOH. Se han encontrado actinomycetos termófilos que interviene en el proceso de compostaje. Los actinomycetos son considerados como los médicos del suelo. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja Elaboración y diseño en formato PDF. Pantoténico riboflavina arginina Cistina lisina metionina triptofano 90.06 Elaboración y diseño en formato PDF.96 22.40 13. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DEL por actinomycetos en cáscara de naranja.3.. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .00 14.06 770.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. CUADRO 1. Alexís Germán 2.00 62.20 0.11 0.62 0.16 0. SUSTRAT O (CÁSCARA cultivo Arroyo DE NARANJA).00 22. 1986).00 0.10 0.28 0.00 6.11 0. Y Solomon N.90 2.70 3.00 6. Componentes principales (%) Minerales (%) Vitaminas (mg/Kg) Aminoácidos (%) materia seca proteína carbohidratos Grasas fibra cenizas calcio magnesio Fósforo Potasio Azufre colina Niacina ac.20 0. COMPOSICIÓN FÍSICO -QUÍMICA DE LA CÁSCARADE NARANJA (Demain A. que influye favorablemente en la degradabilidad y accesibilidad de los componentes poliméricos (polisacáridos y proteínas) y estructurales del sustrato (Milstein y Flowers. etc) (Agosin.) y otros nutrientes (úrea. A LA cultivo Arroyo PRODUCCIÓN DE PECTINASAS. En la Fermentación en Sustrato Sólido (FSS). 1988). debido a que contiene entre 1 a 10% de agua. maíz. El pretratamiento de estos sustratos ( térmico principalmente) tiene un doble propósito. bagazo de manzana. empleados en combinación y/o.4. aumento de la porosidad. igualmente como la producción de otras enzimas hidrolíticas. En otra investigación.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. Elaboración y diseño en formato PDF. bagazo de cítricos. fosfatos. pectinesterasas y celulasas. tales como poligalacturonasas. complementados con fuentes de carbono y energía fácilmente metabolizables (almidón. etc.(Laukevics. el cual contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento microbiano. calcio. Los sustratos más empleados en FSS son productos agrícolas (soya. trigo. 1996). 1986).). la concentración del sustrato es mayor que en la Fermentación en Cultivo Sumergido (FCS). consistiendo en un producto de la agricultura no refinado. arroz. o subproductos agro industriales (salvado de trigo. pero en una FSS con concentración de glucosa de 5 g/L la síntesis de pectinasas no es afectada. cáscaras de diversos vegetales. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Alexís Germán 2. Estos sustratos son colocados en agua. esterilización del sustrato y cambios en las propiedades fisicoquímicas del sustrato (gelatinización del almidón. En la FCS el medio es completamente simple.). Éstos. generalmente. etc. (Solís-Pereira & col. demostraron que en una concentración de 5 g/L de glucosa en una FCS pectinasas por Aspergillus niger la producción de fue reprimida. residuos de remolacha. melazas.. aunque pueden requerir de algún pretratamiento. etc. maltodextrinas. INVESTIGACIONES REFERENTES por actinomycetos en cáscara de naranja. 1995). bagazo de caña. etc). hallando óptimos de 4. Elaboración y diseño en formato PDF.7 U. El ensayo dio lugar a una reducción del 20% de actividad pectinasa (Saval y Huitron. 1996) trabajaron sobre el efecto de las reacciones al variar valores de pH y Temperatura de las preparaciones valores enzimáticas. Los bajos niveles de actividad fueron obtenidos cuando las cáscaras se secaron a una temperatura final de 120 º C. fue realizada determinándose pectin esterasa y poligalacturonasa. 1983). cuando es usado para la producción de pectinasas (Maldonado.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. lo cual indica claramente la importancia de este tratamiento con las cáscaras. Por otro lado.Fattah y Ismail. en tanto que el nivel de pectin esterasa fue particularmente alto con cáscara de limón no lavada. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . 1986). La máxima actividad poligalacturonasa fue de 4.(Aguilar y Huitron. respectivamente. 1995).5 (El Sayed. cultivo Arroyo Una producción de pectinasa usando cáscara de limón con diferentes pretratamientos.5 . En otra investigación (Abdel . 1994). El pH óptimo de la enzima poligalacturonasa fue probada usando buffer acetato para pH 2. Alexís Germán por actinomycetos en cáscara de naranja. La producción de pectinasa extracelular es inducida por sustancias pécticas o por desechos agroindustriales tales como pulpa de limón o naranja. 1986). usando cáscara de limón lavada y no lavada los resultados fueron similares para la poligalacturonasa. Los resultados menos favorables fueron obtenidos usando cáscara de limón seca.0 y una temperatura de 45 ºC.I.5 obteniéndose una actividad pectinolítica máxima a un pH de 3. los cuales tienen apreciables cantidades de pectina .4. Las bacterias anaeróbicas productoras de pectinasas presentan un buen crecimiento a pH 7. se ha probado sulfato de amonio para suplir la fuente de nitrógeno.5 y 50 º C./mL hallada en un caldo de fermentación (Shivakuman. debido al menor costo que el fosfato de amonio. 76 U (unidades de actividad enzimática) para pulpa de café húmedo (Cabello y col. BIORREACTORES.. Moreno y col. Alexís Germán por actinomycetos en cáscara de naranja.5. sabiendo además que la producción de enzimas pectinasas es inducible y no constitutivo (Trejo y col.. desde la década de los 40’s.I. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .1982). también presenta problemas de disipación de calor limitado por la transferencia de masa intrapartícula (Trejo y col. cultivo Arroyo Pectina y glucosa fueron usadas como comparación de fuente de carbono. debido a la gruesa barrera de sólido..4 U. 1982)./(L*h). considerando la naturaleza inducible de las enzimas pectinolíticas (Kilara. Penicillium charlessi y Tubercularia vulgaris). 39 U. utilizando pulpa de café como sustrato. La presencia de pectina en la composición del medio de cultivo es un factor importante.I. se encontró 0.1991). (Sincere.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. 1989). La aplicación de energía a los sistemas de fermentación hace que los Elaboración y diseño en formato PDF. 1977) Con respecto a las desventajas que pueden haber en una FSS tenemos que es un proceso más lento que una FCS. levaduras y hongos en un cultivo sumergido es una práctica universal en la industria de fermentaciones.(1995) reportan un estudio de producción de pectinasa a partir de fermentación en sustrato sólido utilizando cáscara de yuca y limón con Aspergillus niger ATCC 10864 obteniéndose una productividad volumétrica de 434./(L*h) ( Abdel-Fattah y col. utilizando pellets de pulpa de cítricos se obtuvieron actividades pectinolíticas más altas que las producidas por Aspergillus níger.. El cultivo de bacterias. los resultados obtenidos con glucosa fueron pobres. seleccionaron tres cepas productoras de enzimas pécticas (Talaromyces flavus. En otro estudio de producción de pectinasas bacterianas. 2. ya que influye sobre la diversidad y cantidad de enzimas pécticas.. mayor que otros autores. 1991). 2. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . que son de importancia en el diseño de biorreactores: La primera tiene que ver con la esterilidad. existen tres consideraciones. Un tercer punto de aspectos mecánicos. Esto ha permitido el desarrollo de procesos de alta productividad que han hecho del cultivo sumergido la técnica de más uso en la industria de las fermentaciones. Un segundo aspecto de importancia es la remoción de calor. el control de la temperatura en un biorreactor requiere de la remoción fundamental de cantidades importancia son importantes los de calor.6. PECTINEX es una preparación purificada. 1996). juega un rol importante en un diseño exitoso. el acabado de la superficie del tanque. producida por una cepa de Aspergillus níger. cultivo Arroyo procesos de transporte convectivos sean órdenes de magnitud más rápidos que los procesos difusionales que controlan el transporte en el cultivo sólido. Llevar a cabo un proceso en ausencia de contaminación es un requisito fundamental. Alexís Germán por actinomycetos en cáscara de naranja. poligalacturonasa. Elaboración y diseño en formato PDF. con el fin de que el prensado.. El diseño de tomas de muestras y sellos mecánicos.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. la clarificación y la filtración puedan realizarse de una manera segura y económica. la selección de reductores de velocidad y el diseño de la flecha de agitación (Miranda y col. además de la homogenización y la transferencia de oxígeno. así como de la conexión de válvulas y aditamentos. Aunque la agitación mecánica sigue siendo la forma más usada de aplicar energía. La moderna tecnología de los zumos de frutas exige una degradación rápida e intensa de la pectina. siendo capaz de romper sustancias pécticas vegetales. pectinesterasa y hemicelulasas. En vista de que las temperaturas de fermentación son moderadas (25 a 40 ºC) y que el cultivo de células es un proceso exotérmico. El producto contiene principalmente pectin-transeliminasa. ENZIMAS PECTINASAS COMERCIALES. Independientemente del tipo de cultivo. 1990). Es impactante.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. PECTINEX y ULTRAZYM permiten asegurar buenos resultados en todo el mundo. aroma. La estabilidad segura de los zumos completamente claros. se muestra la situación del mercado internacional. 2. La liberación de componentes fundamentales como color. En el cuadro 2. por descomposición específica de la pulpa. con incremento subsiguiente de la producción. La filtración óptima. con menor gasto de material filtrante. Por lo tanto. (Andersen. aumentando con ello el rendimiento global del zumo. SITUACIÓN DEL MERCADO INTERNACIONAL DE LAS ENZIMAS. La floculación rápida y la sedimentación compacta de las sustancias enturbiadoras. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Por su amplio espectro de acción. con un mínimo de clarificantes.. de sus concentrados y de sus diluidos. La reducción de los tiempos de prensado. de acuerdo con los datos publicados por (Eveleigh y col.Durante el tratamiento enzimático de los zumos: El desdoblamiento rápido y completo de la pectina. Alexís Germán por actinomycetos en cáscara de naranja. . 1991). VENTAJAS: La utilización de PECTINEX y de ULTRAZYM garantizan: -Durante la acción de la enzima sobre la pulpa: La mejora en la extracción del zumo. etc..7. cultivo Arroyo PECTINEX y ULTRAZYM son productos que han sido obtenidos como resultado de una investigación y un desarrollo de varios años. por un lado. satisfacen de manera ideal las diversas exigencias que se imponen a su sistema óptimo de enzima en cada una de las etapas individuales de producción. el hecho de que más de 2000 enzimas registradas sólo 60 sean Elaboración y diseño en formato PDF. bajo las más diversas condiciones tecnológicas. 50 23.51 100.83 25 75 325 350 525 1363 1. cultivo Arroyo producidas comercialmente y de éstas sólo cinco cubran más del 80% del mercado (García y col.95 Pectinasa Amilasa fungal 25 25 1.85 25.70 38. Cuadro 2.. 1994). por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .1993) Enzima Ton / año % del total Proteasa fungal 13 0.00 Cuajo microbiano Glucosa isomerasa Amilasa bacteriana Amiloglucosidasa Proteasa bacteriana TOTAL Elaboración y diseño en formato PDF. es un aliciente para la creación de nuevas empresas nacionales o mixtas que produzcan enzimas a nivel nacional o subregional (Illanes.Producción de enzimas pectinasas sumergido utilizando pectina y Orbegoso. PRODUCCIÓN MUNDIAL DE ENZIMAS (García y col.. 1993). Alexís Germán por actinomycetos en cáscara de naranja. Es innegable que la expansión del mercado de enzimas observado en los últimos años en los países de latinoamericana.83 1.83 5. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .2 MEDIOS DE CULTIVO: a). Arroyo Orbegoso. del departamento de Lima.1 MATERIAL BIOLÓGICO: En el presente trabajo. . a partir de una muestra de suelos naranjales de la localidad de Huaral.Cultivo en líquido: Constituido por Caldo Trypticasa Soya y Caldo Trypticasa Soya suplementado con 1% de pectina cítrica. se utilizó el microorganismo Actinomyces naeslundii. 3. suplementado con 1% de pectina cítrica. el cual fue aislado en el Instituto de Microbiología y Biotecnología "Simón Pérez Alva" de la UNMSM. distrito de Huando. MATERIALES Y MÉTODOS 3.Medio de cultivo experimental: Constituido por sales minerales y cáscara de naranja como única fuente de carbono.Medios de cultivo complejos: . e identificado en el Instituto Nacional de Salud (INS)(ANEXO A). Alexís Germán III. variando sus concentraciones de acuerdo al siguiente cuadro: Elaboración y diseño en formato PDF.1.Cultivo en sólido: Constituido por Agar Trypticasa Soya y Agar Trypticasa Soya.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.1. 3.1 MATERIALES. b). 800 16.083 5. 1000. Arroyo Orbegoso. Alexís Germán COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL NUTRIENTES X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN MÍNIMA (g/L) MÁXIMA (g/L) Cáscara. Parafilm Algodón Elaboración y diseño en formato PDF. 5. MATERIALES: Mechero Asa de Kolle Termómetro Cronómetro Erlenmeyers de 250 mL Beakers de 150.200 0. 25 mL Probetas de 100.000 0.000 1.000 0.1.080 0.700 5. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .000 4.000 3.000 0. de naranja (NH4 )2 SO4 ÚREA FeSO4 .020 1. 500. Placas petri Embudos de vidrio Kitasato Tips de 50. 2.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. 500. 10. 1000 mL Baguetas Tubos de ensayo de 15 * 150 mm.000 5. 250.3.000 1. 250.013 0.700 0. 5000 µL.7H2 O Na2 CO3 2. 1000 mL Pipetas de 1.7H2 O CaCl2 NaCl MgSO4 . REACTIVOS: Medio Agar Trypticasa Soya (TSA) Medio Caldo Trypticasa Soya (TSB) Úrea Sulfato de magnesio Cloruro de calcio Solución amortiguadora (buffer) de fosfato 0. Hidróxido de sodio Alcohol etílico de 96 º Agar-agar Solución amortiguadora (buffer) de acetato 0. pH 4.05 M.1. pH 7 Ácido sulfúrico q.05 M.5.2 µM Bomba de aire de 500 mL / min (URANUS) 3. Arroyo Orbegoso. 1959) Estándar de Ácido D-galacturónico para análisis (SIGMA)1 mg /mL Sulfato de amonio Tartrato de sodio y potasio Estándar de Albúmina sérica de bovino 10 mg / mL Pectina (sigma) Pectina cítrica de grado alimentario Cáscaras de naranja Sulfato ferroso Cloruro de sodio Rojo de rutenio Elaboración y diseño en formato PDF. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .8 Solución de pectina al 1% Reactivo de Ácido 3.4.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.dinitrosalicilico (DNS) (Miller.p. Alexís Germán Pinzas Gradillas Filtro gelman 0. Alexís Germán 3.2.m.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. de la siguiente manera: . por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Horno a 180 º C Centrífuga Agitador a 200 r.p. ACONDICIONAMIENTO DEL MICROORGANISMO (Cabello y col. MÉTODOS 3. y luego se incubó durante 5 días a 37 º C. Elaboración y diseño en formato PDF. EQUIPOS Autoclave Biorreactor de 1 litro Espectrofotómetro de rango visible SPECTRONIC 20 Estufa con temperatura controlada a 37 º C MEMMERT S 30 Baño maría con temperatura controlada a 37 ºC INSTRUMENTAL. Arroyo Orbegoso.1982). El microorganismo que utilizamos en esta investigación fue sembrado periódicamente. 1000.Se sembró una colonia de Actinomyces naeslundii en un tubo con Caldo Trypticasa Soya.1. Cocinilla Refrigeradora Balanza analítica Balanza de platillos Bomba de vacío Vortex Equipo de destilación Micro pipetas de 50. suplementado con 1% pectina cítrica.. tanto en un medio sólido como en el líquido.2. 5000 µL 3.5.1. 1999). La aireación-agitación se evaluó a las 72 horas de incubación. AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO.1999)..Inoculación del microorganismo en caldos de TSB -Incubación de los tubos los tubos a temperaturas de 28ºC.2. EVALUACIÓN TEMPERATURA Y PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS pH. 7 y 8. En el presente caso. se siguió el siguiente procedimiento: . el microorganismo fue Inoculado en caldos de TSB. Alexís Germán . a 600 nm de los tubos con caldo control de TSB. 3. se repitieron los pasos anteriores por 60 días. amortiguados a tres pH (5. se midió la masa celular por espectrofotometría a 600 nm. En primer lugar. y. se incubó en estufa a 37 ºC por 72 horas.Posteriormente... y se realizó la incubación durante 3 días a 37 º C. finalmente.A continuación.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. suplementado con 1% pectina cítrica. a) DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO ( Becker y col. b) DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA (Becker y col. PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS. a 37 ºC. se realizó una siembra del medio líquido en Agar Trypticasa Soya. c) DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN (Becker y col. Arroyo Orbegoso. por espectrofotometría a 600 nm. a continuación.1999). en dos condiciones experimentales: -Tubos con sello de parafina estéril y sin agitación (SIN aireación-agitación) -Tubos sin sello de parafina estéril y con agitación (CON aireación-agitación) Elaboración y diseño en formato PDF. . comparando el aumento de la masa microbiana por espectrofotometría. 37ºC y 45 ºC durante 72 horas -Medición de la masa celular.2. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .5). que se transfirieron a matraces erlenmeyer cuyos contenidos fueron de 150 mL. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . suplementado con 1 % de pectina cítrica. Enseguida. a continuación. la cáscara fue secada a 80 º C por 24 horas en estufa.2. Posteriormente.f. d) DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL : El medio de cultivo estuvo representado por nutrientes ubicados dentro de un rango mínimo- máximo: Elaboración y diseño en formato PDF.c.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. la cáscara de naranja fue triturada en un molino manual de tornillo sin fin y tamizada a un tamaño de partícula menor a 0. Las condiciones de crecimiento del microorganismo fueron de 37 ºC durante 24 horas. De aquí./mL. haciendo diluciones de éste en solución fisiológica estéril. hasta obtener una suspensión de células de 3 x 10 9 u. la cual tuvo el siguiente tratamiento: La cáscara de naranja fue recolectada de comerciantes de jugo de naranja cercanos a la UNMSM. se extrajo el aceite de la cáscara de naranja utilizando un equipo de arrastre al vapor. c) PREPARACIÓN DEL INÓCULO: El inóculo se preparó a partir de un cultivo de 24 horas. Alexís Germán 3. Arroyo Orbegoso. se tomaron alícuotas de 45 mL.3.5 mm de diámetro b) MANTENIMIENTO DEL MICROORGANISMO: El microorganismo Actinomyces naeslundii se mantuvo por resiembras periódicas en el medio Agar Trypticasa Soya (TSA). CONDICIONES DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN: a) ACONDICIONAMIENTO DEL SUSTRATO Se utilizó cáscara de naranja como sustrato para la biotransformación. 700 0.000 5.080 0.000 1.013 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .000 1.000 0. fue evaluada por la liberación de azúcares reductores de la pectina (1% p/v pectina sigma).200 0.000 0. a 5000 rpm por 20 minutos de las muestras constituidas por 5mL de cultivo. Alexís Germán CUADRO 3.700 5..7H2 O CaCl2 NaCl MgSO4 .083 5.8 (Miller y col.000 Estos componentes fueron evaluados en una plantilla estadística de PlacKettBurman. durante 7 días.020 1. de donde se obtuvo los nutrientes más significativos para la producción de enzimas pectinasas. 1959) teniendo en cuenta que una unidad enzimática se definió como la Elaboración y diseño en formato PDF.000 0.4. OBTENCIÓN DE PECTINASAS: La obtención del extracto enzimático crudo fue realizada por centrifugación. tomadas cada 8 horas.000 4. Arroyo Orbegoso. Se realizó una curva estándar de ácido D-galacturónico al 1% preparado en solución amortiguadora de acetato 0.2. la cual fue medida colorimétricamente. MÉTODOS DE ANÁLISIS: a) DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA: La Actividad enzimática del extracto obtenido luego de la biotransformación.7H2 O Na2 CO3 2. con el reactivo ácido 3.1M y pH 4. COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO EXPERIMENTAL NUTRIENTES X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN MÍNIMA (g/L) MÁXIMA (g/L) Cáscara de naranja (NH4 )2 SO4 ÚREA FeSO4 .5 - dinitrosalicílico (DNS). 3. e).Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.800 16. Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán cantidad de enzima que liberó 1µM de ácido D-galacturónico por minuto a 50 ºC (ANEXO M ). b) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA: Fue utilizada la técnica de recuento en placa de células viables, para lo cual se tomaron alícuotas del cultivo cada 8 horas (1 mL);luego, se realizó diluciones seriadas, para colocar 0.1 mL de células diluidas en la superficie de una placa TSA, extendiéndose éstas, con una asa de Drigalski, e incubadas, finalmente, a 37 ºC (ANEXO C). 3.2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: a) ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS. En una primera etapa de análisis se utilizó el diseño experimental de Plackett-Burman para identificar los nutrientes de mayor influencia en la producción de pectinasas, esto permitió evaluar 8 variables en 12 experimentos con 2 réplicas, teniendo en cuenta una concentración alta (+1) y una baja (-1) de cada uno de los nutrientes. La evaluación de los mismos, se realizó en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 150 mL de medio experimental. Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán CUADRO 4. PLANTILLA DE PLACKETT BURMAN ( Ayala y Pardo,1995 ) VARIABLES N X1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 X2 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 X3 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 X4 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 X5 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 -1 X6 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 -1 X7 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 X8 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 Donde: X1= Cáscara de naranja. X5= CaCl2 X2= (NH4)2SO4 X6= NaCl X3= (NH2)2CO X7= MgSO4 X4= FeSO4*7H2O X8= Na2CO3 b) OPTIMIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES PARA LA MÁXIMA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS. Se utilizó el Diseño de Box – Benhken, el cual sirvió para determinar las concentraciones óptimas de cada variable independiente (X 1= Cáscara de naranja; X2= (NH4)2 SO4 y X4= FeSO4. 7H2O ), para la máxima producción de pectinasas, diseño que fue complementado con la técnica de análisis de respuesta superficial a las variables independientes anteriores, para luego ajustarlas al modelo polinomial cuadrático siguiente: Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso, Alexís Germán Z=b0+b1*X1+b2*X2+b3*X4+b4*X1*X2+b5*X1*X4+b6*X2*X4+b7*X12+b8*X22+b9*X42 Donde: Z = Variable dependiente (Producción de enzima) X1= Cáscara de naranja. X2= (NH4)2SO4. X4= FeSO4*7H2O. b0 = Constante por determinar b1, b2, b3 = Coeficientes lineales por determinar b4, b5, b6, b7, b8, b9 = Coeficientes cuadráticos por determinar CUADRO 5. PLANTILLA DE BOX BENHKEN (Robles y Col. 1995) VARIABLES N X1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 X2 1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0 -1 0 0 X4 1 -1 1 0 0 -1 1 1 0 0 0 1 1 -1 0 0 1 -1 0 -1 -1 0 1 -1 0 -1 1 0 -1 -1 0 0 Para la identificación de un valor óptimo, fue necesario estimar la curvatura de las variables ensayadas, determinándose los coeficientes del modelo polinomial, usando la técnica de regresión múltiple, cuyos valores fueron asignados a las ecuaciones XY polinomiales, para generar respuestas predictivas (representadas en los gráficos de respuesta en superficie y de líneas de contorno). Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM en el cual fueron evaluados el crecimiento microbiano y la actividad enzimática. Arroyo Orbegoso.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Con las concentraciones óptimas obtenidas del experimento anterior. se realizó un último experimento. utilizando para ello un inóculo en fase logarítmica con la finalidad de aprovechar la fuente de carbono en el mantenimiento del microorganismo. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Alexís Germán c) BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR. Elaboración y diseño en formato PDF. Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.0 7.8 0.7 0. RESULTADOS 4. TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO.5 pH Elaboración y diseño en formato PDF. PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.2 0.3 0.1. EFECTO DEL pH SOBRE EL CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Densidad óptica a 600 nm 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO FIGURA 1. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS pH.1. Arroyo Orbegoso.6 0.1.1 0 5.4 0.5 0.0 8. Alexis Germán IV. 4. luego de 72 horas de incubación (Figura 3). Alexis Germán FIGURA 2.5 9 10) pH = 5. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Elaboración y diseño en formato PDF.0 4.0 5 6) (7 8 pH = 8.1. Arroyo Orbegoso. DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA La evaluación del crecimiento del microorganismo vs.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. determinó que la temperatura óptima fue de 37 ºC. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH Tubo # (1 2 3 ) (4 pH = 7.2. temperatura en caldo TSB . 1. Elaboración y diseño en formato PDF.65) se obtuvo en un medio control con aireación-agitación a 300 rpm.O. Arroyo Orbegoso.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Estos resultados. 0. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO Densidad óptica a 600 nm DEL MICROORGANISMO 0. para el proceso de biotransformación sobre medio natural.5 vvm.4 0.3 0. (Figura 4). Alexis Germán FIGURA 3. DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN En experimentos previos se determinó que la mayor concentración de biomasa ( D. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . presentaron la necesidad de fijar valores de agitación 300 rpm y aireación 0.3.7 0.2 0.1 0 28 37 45 Temperatura ( ºC ) 4.6 0.5 0. es decir.2 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.7 0. se observa que la máxima producción de pectinasas es alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano.1 0 SIN CON AIREACION-AGITACION 4. Alexis Germán FIGURA 4. En la Figura 5. Elaboración y diseño en formato PDF.2. EFECTO DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN EN EL CRECIMIENTO Densidad óptica a 600 nm DEL MICROORGANISMO 0.6 0.4 0. Arroyo Orbegoso. a las 64 horas.3 0.5 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. 00 48 56 0. ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS.70 Log (ufc/mL) 8.PECTINA 1% Tiempo (horas) Log N° DE (ufc/ml).50 0.60 8.50 8 16 24 0.3.00 0. PECTINASA UI/mL PRODUCCIÓN DE PECTINASAS EN MEDIO TS. para un análisis posterior de optimización ( ANEXO K ).00 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .80 9.I/ml ) 4. seleccionándose éstos. Alexis Germán FIGURA 5.1.10 32 40 5. Arroyo Orbegoso.00 0. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN 4.50 0.50 96 10 4 11 2 12 0 80 88 0.90 9.30 6.40 7. (NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O.00 64 72 5. ACTIVIDAD PECTINASA ( U.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Elaboración y diseño en formato PDF.3.20 0 6.00 0. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y 10.50 0. El análisis del diseño de Plackett Burman demostró que los nutrientes que más influyeron sobre la producción de pectinasas fueron: Cáscara de naranja .00 ACT.50 7. CUADRO 6.013 2.7 g/ L ).3. L.I.700 5. maximizó la respuesta entre las 60 y 80 horas.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. FeSO4*7H2O (0.7H2O = (NH2)2CO = CaCl2 = NaCl = MgSO4 = Na2CO3 CONCENTRACIÓN (g / L) 16. tiempo en el que se logró una producción de 0.051 3.3.000 0.1 y L.I. llevada a cabo con los resultados obtenidos del diseño de Box Benhken. 4. CONCENTRACIONES ÓPTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR VARIABLES VALORES X1 = Cáscara de naranja ÓPTIMOS x2 X4 X3 X5 X6 X7 X8 VALORES MEDIOS = (NH4)2 SO4 = FeSO4. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Arroyo Orbegoso.850 0.600 2.400 Elaboración y diseño en formato PDF. obtuvimos los siguientes resultados: Cáscara de naranja ( 16. BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR La cinética microbiana.3.65 U.000 0.71 U./mL (ANEXOS L.2. (NH4)2SO4 (5 g/ L ). Mediante la optimización de los 3 nutrientes más influyentes.013 g/ L ) y una producción máxima predictiva de pectinasas de 0./mL de la enzima.2).OPTIMIZACIÓN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA ETAPA ANTERIOR. Alexis Germán 4. utilizando el diseño de Box Benhken. En la misma figura. durante el proceso de biotransformación.2).5 vvm. podemos notar que éste obtuvo un máximo valor entre las 60 y 80 horas de transcurrido el proceso de biotransformación./mL (ANEXO L.c / mL Tiempo de biotransformación : 120 horas Volumen de inóculo : 100 mL Temperatura : 37 ºC Aireación : 0./mL a las 72 horas.65 U. Alexis Germán Volumen del medio experimental : 1000 mL Concentración celular del inóculo : 3 x 10 u.0 9 En el resultado del crecimiento de la población microbiana que se muestra en la Figura 6. se muestra la producción de pectinasas.I. registrándose una alta producción de 0. Agitación : 300 rpm.f. Elaboración y diseño en formato PDF. pH : 7. valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de Superficie Respuesta 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .71 U. Arroyo Orbegoso.I. 50 0.50 8.40 0.50 6.00 9.50 9.70 0. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE PECTINASAS POR Actinomyces naeslundii EN UN BIORREACTOR DE 1 0. pectinasa (UI/mL) 10.50 5.00 8.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.60 0.00 5.00 11 2 96 80 64 48 32 0. Arroyo Orbegoso.00 6.00 16 0 Log (ufc/mL) LITRO Tiempo (horas) Log N° DE ufc/mL.50 7. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .00 7.20 0.30 0.I/mL ) Elaboración y diseño en formato PDF. Alexis Germán FIGURA 6.10 Act. ACTIVIDAD PECTINASA ( U. 0 y 8.en medio líquido (Figura 5). La producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii . concordando con lo expuesto por Cross (1980).0 y temperatura de 37ºC (Figuras 1. permitió seleccionar los nutrientes más influyentes en el proceso de biotransformación. para un buen crecimiento de Actinomyces naeslundii. mediante el diseño experimental de Plackett Burman. evidenció que la enzima alcanza su mayor rendimiento al final de la etapa logarítmica del crecimiento microbiano. los cuales fueron posteriormente ajustados con el diseño de Elaboración y diseño en formato PDF.5 y a las pH y temperatura óptimos obtenidos.0 y una temperatura de 37 º C.2. concuerdan con lo reportado por Bergey(1974). (1986) en el sentido de que las pectinasas son enzimas inducidas por la presencia de sustancias pécticas El análisis estadístico. Los valores de pH 5.5 vvm para la aireación y de 300 rpm para la agitación fueron fijados en el presente trabajo (Figura 4). En el experimento se determinó que el microorganismo necesitó aireación y agitación. lo cual ratifica lo expuesto por Franco (2001) y también concuerda con lo obtenido por Aguilar y Huitron. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . dichos trabajos se realizaron mayormente a nivel de erlenmeyers. donde menciona un pH 7.0. para un mayor crecimiento.3) que a los temperaturas de 28 y 45 ºC.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Los valores de 0. procedimientos que dificultan la evaluación de las variables antes mencionadas. por lo que en adelante se trabajó con una solución amortiguadora de fosfato a pH 7. DISCUSIÓN El crecimiento de Actinomyces naeslundii en caldo TSB suplementado con 1% de pectina evidenció a las 48 horas un mayor desarrollo a pH 7. No se reportan resultados comparativos en la literatura citada ya que. Arroyo Orbegoso. Alexís Germán V. en un medio sumergido. lo cual significa que la ecuación de coeficientes se acerca al evento experimental. se encontró que en el primer medio hay mayor actividad enzimática.65 U. La utilización de estos diseños estadísticos han sido desarrollados también por otros autores como: Robles H.3. el valor de 0. estimularía la producción de pectinasas.4.I. para utilizar la pectina en estado libre que.65U./mL respectivamente. y L. 0.(2001)./mL de actividad enzimática es menor que lo reportado por otros investigadores como Cabello y col. debido a la mejor disponibilidad de Actinomyces naeslundii . sales minerales y agua.1.80 U. L.I.2. Arroyo Orbegoso.77 U.(1996).1. siendo la más representativa la Figura L. En el trabajo de investigación se obtuvo una correlación estadística de 0. además de una mejor correlación.I. (1982). suplementado con 1% de pectina y el medio experimental desarrollado.7.5. L..013 g/ L. 16..1.1.1.84.6.. FeSO4*7H2O./mL de actividad producidas por un Bacillus.. Asimismo.I. constituido por pulpa de café. Las Figuras L.7 y L. donde se puede apreciar que la elevación de la concentración de X1 (cáscara de naranja) y la disminución de X4 (FeSO4*7H2O). Spp. para la producción de pectinasas. Miranda y col.1. Mientras que las Figuras L.8 muestran un equilibrio inestable que perjudica el análisis de óptimización y nos aleja de la solución. L. obteniendo finalmente valores óptimos para cáscara de naranja.7 g/ L.(2001).1. (NH4)2SO4 . L./mL y 0.(1995).1. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .5 g/ L. Alexís Germán Box Benhken.1. Elaboración y diseño en formato PDF.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. L. atrapada en partículas de cáscaras de naranja.1.1. quienes obtuvieron 3.9 muestran tendencias hacia la maximización de la producción de enzimas. Al comparar las actividades enzimáticas máximas producidas en el medio TSB. cuyos valores fueron 0.Trujillo y col. y Vasquez y col. 2. (NH4) 2SO4 5 g/L y FeSO4*7H2O 0. Arroyo Orbegoso.65 U. compuesto por cáscara de naranja 16.0.5 vvm de aireación. Se obtuvo una actividad enzimática de 0. 300 rpm y 0. 37 ºC. Las condiciones de crecimiento y producción de pectinasas por Actinomyces naeslundii son: pH 7./mL en cultivo sumergido en medio óptimizado. CONCLUSIONES 1.5 g/L. Elaboración y diseño en formato PDF.I. Alexís Germán VI.013 g/L.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Utilization of orange peels for the production of multienzyme complexes by some fungal strains. Rev. RUIZ..A. Dordrecht.. Enzyme and Microbial Technology. E. 6 A. (1986). Microbiol.. PERÚ..Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Washington D. A. (1999). D.38-41. BIBLIOGRAFÍA 1 ABDEL-FATTAH. A.. MAUREIRA.O.663 –665. 8 BECKER. 4 AGUILAR. 201-204. Chem.. (1991) Enzimas para la producción de zumos de fruta. M. A. Información técnica de Novo Nordisk Ferment Ltd. E. S. 35.. V. Acribia.. Universidad Nacional Agraria la Molina.. I . (1996).115 . Technol.7 645-650 3 AGOSIN. J.C. (1995). Elaboración y diseño en formato PDF. BIFFANI. R. A. MABROUK. 173-179. (1996). M.6.A. & PEREZ. A & B S. 24. J. & PARDO. ESPAÑA. G. 5 ANDERSEN. & HUITRON. 7 AYALA . (1982). SUIZA. & ZACHGO.. Production of polygalacturonase and pectin methyl esterase by Fungi. J. USA. (1974) Manual of Systematic Bacteriology. G.. (2001).. C. & ISMAIL.134. Latamer. P. & ISMAIL. F.. 10 CABELLO-VELAZCO. Process. Kluwer Editions... Alexís Germán VII. Curso Aplicaciones de la biotecnología enzimática en procesos agroindustriales. In "Recent advances in solid state cultivation". Optimización por diseños experimentales. A. Producción de pectinasas bacterianas utilizando pulpa de café como substrato. Biotecnología curso práctico de laboratorio.. 2 ABDEL-FATTAH. Application of fed-batch cultures in the production of extra cellular pectinase by Aspergillus sp. (1977). CALDWELL.. S. Arroyo Orbegoso.A. Biochem. & ORIHUELA.C. 9 BERGEY. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . 11 CAMPOS. (1970) Official Methods of Analysis of Association of Official Analitical Chemists. 541-545. Microbiol.. 9. Alemania. 47. (1994). Sci. A. 29.solid cultures. M.. (1980). Bioresource Technology.. Bioeng. V. (1994). Isolation and characterization of polygalacturonase and invertase from yeast Endomycopsis fibuligera 3812. E. Elaboración y diseño en formato PDF. H. Detection of Polygalacturonase. 605-609 14 DE LA CRUZ. II Congreso Peruano de Biotecnología y Bioingeniería. (1981).. 13:59-119. Arroyo Orbegoso.. Actinomycetos morfología. 321-333. 20 GAINVORS. PERÚ. J. R. (2001). Biotechnol. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM ... 19 FRANCO. II Congreso Peruano de Biotecnología y Bioingeniería.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. J. & FREZIER. Determination of the specific growth rate of molds on semi. Bioconversion of date waste.some guidelines. 25-28. MOHARIB. Biotecnología alimentaria.131 16 DONAGHY. S. & JWANNY. (1974). (2001). I..P. USA. O. 21 GARCIA. Pectin-lyase and Pectin-esterase Activities in a Saccharomyces cerevisiae Strain. 255-262. (1993). A. MÉXICO. 13 CROSS.110-112. A. 18 FOGARTY. (1986). USA. & LOPEZ-MURGUIA. & SOLOMON. N.. H. A. potencial biotecnológico y agroindustrial. UR-FS-LMG.M. 23.. 17 EL-SAYED. FRANCIA. American Society for Microbiology. American Society for Microbiology. Alexís Germán 12 CARRIZALES. & MC KAY. S. 15 DEMAIN. PERÚ. Pectin extraction from citrus peel by polygalacturonase produced on whey.. QUINTERO. RODRIGUEZ. M. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Optimización de la producción de metilgalato de Caesalpinea spinosa por fermentación en estado sólido con Aspergillus níger MIT-HI. Technol. Growth and examination of Actinomycetes. & WARD. & MIRANDA. H. (1994). W. Progress in Industrial Microbiol.130. & SARDINA. Limusa Noriega editores. Internat. Pectinases and pectin polysaccharides. T. T. 56.. BURNS. Production of pectinases by Aspergillus sp. & DANLEY.(1994). (1991). M. 501-504.. T. APSITE. Academic. 30 C KAY. A. A. A.Food Sci. Biotechnol. & CHIRIFE. 185-188. 29 MALDONADO. O. A. USA. & WICKER. J. 2. Review. Handbook of food isotherms: water sorption parameters for food and food components. J. J. 26 KIRK. 481-483..Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.II.. Elaboración y diseño en formato PDF. 27 KUNDU. 25 KILARA. Press. New York. J. (1961). (1983). (1988). 32 MILSTEIN. Alexís Germán 22 HART. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Orange finisher pulp as substrate for polygalacturonase production by Rhizopus oryzae. L. H. Enciclopedia de Tecnología Química. 200-201. B.(1982). 61. 1465-1474. using differently pretreated lemon peel as the carbon source. (1982). 23 IGLESIAS. Arroyo Orbegoso. Biotecnología de las enzimas. & VIESTUR. A.. A. Role of water in the hydrolysis of cellulose in a solid state. A. MÉXICO. 31 ILLER.. Enzymes and their uses in processed apple industry. J. Bioeng.Ed. CHILE. Solid substrate fermentation of what straw to fungal protein. A. Primera edición. (1959). Analytical Chemistry 31. Editorial Universitaria de Valparaíso. E.T. H. M. (1984). H. Process. Biotechnol. 17.. GHOSH. Biochem. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . 28 LAUKEVICS. 353-358. (1986). Bioeng 26. G.(1986). S. Biotechnol.. & GHOSH. A plate assay method for the detection of fungal polygalacturonasa secretion. 381-386. 8... Y. 426–428.. 4 35-41. PARISH.Technol... FEMS Letters 56.NAVARRO. L.. 24 ILLANES. Heat and microbial treatments for nutritional upgrading of wheat straw. 28. HispanoAmericana..VERED.Fermen.SHARMA & FLOWERS. New York. K. Universidad Nacional de Trujillo. H. Tesis. H. 467. Universidad Peruana Cayetano Herédia. 24. 41 SANJAY. P. & VAN DEMARK. D. M. Diseño de biorreactores. P. P. (1983). & HORNA. H. 38 RAIMBAULT. H. (1995)..Tesis. Diseño y Análisis de Experimentos. In: Reed.) Enzymes in Food Processing. 6. Arroyo Orbegoso. WOOLCOTT. 42 SEELEY. G. Production of extra cellular pectinase enzymes by a mutant of Penicillium occitanis. Anaerobic degradation of pectin by mixed consortia and optimization of fermentation parameters for higher pectinase activity. 308-311.C. D. Elaboración y diseño en formato PDF. (1995). ROBLES. (1995). E. PERÚ. 20. Universidad Nacional Agraria la Molina.. J. PERÚ. 199-209. Optimización de la producción de bioinsecticida por Bacillus Thuringiensis . Lett. 34. 35 MORENO. Curso Teórico-Práctico.. ESPAÑA. 36 NEUBECK. Dev. J. Universidad Nacional de Ingeniería.. Grupo Editorial Iberoamericana. Alexís Germán 33 MIRANDA.. Biotechnol. (Ed. 37 QUISPE.(1994). Biotechnol. (1990). C. 40 SAVAL. Ind. Microbiol. Appl. Microbiol. & TIRABY. Appl. & ALAZARD.509.. (1973). DURAND. Fruits. 39 ROBLES. & MARCEL. Eur. (1996). S. Microbiol pectinases from henequen pulp. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . 9. D. Manual de Laboratorio de Química Orgánica II. & NAND.. Microbiol.. Culture method to study fungal growth in solid fermentation. 547-551...( 1975).Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.. G.. Editorial Blume. Academic Press. MÉXICO. fruits products and wines. Producción de pectinasa a partir de fermentación en sustrato sólido utilizando cáscara de yuca y limón con Aspergillus níger ATCC 10864. 43 SHIVAKUMAN. (1992). J.. 34 MONTGOMERY. Microb. Manual de Laboratorio para Microbiología. Appl.E. PERÚ. H. PERÚ. & HUITRON... 59-63. (1980). 117-119. 11. & SAID. Pectin enzymes production in solidstate fermentation using citrus pulp pellets by Talaromyces flavus. S. 257-260. World Journal of Microbiology and Biotechnology 12. Tubercularia and Penicillium charlessi. II Congreso Peruano de Biotecnología y Bioingeniería. Production of pectinases by Aspergillus Níger in solid-state fermentation at high initial glucose concentrations. 4. E. (1996). LOPEZ. II Congreso Peruano de Biotecnología y Bioingeniería. C.. 49 . ORIOL. V. PERÚ.. 343-344. G. S. & GUTIÉRREZ. P.FAVELA.M. M.. VINIEGRA.. MgSO4. Producción de pectinasas de Aspergillus níger por fermentación sólida sobre soporte . (2001). M. R.(2001). & RAIBANT.& ROBLES.. S. H. PERÚ. & HORNA. Neotrop. 47 TRUJILLO. (1994). R.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. 48 VASQUEZ.. 46 TREJO. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . E. ROUSSOS. A. Influencia de las concentraciones del almidón de papa. CHARLESSI. Micol. Alexís Germán 44 SIESSERE. Optimización en la producción de ensilado de residuos de sardina (sardinops sagax sagax) utilizando cepas de levaduras. Arroyo Orbegoso. Elaboración y diseño en formato PDF. Biotechnol. CaCO3 & KH2PO4 en medio fermentativo a base de “sanguaza” sobre la producción de bioinsecticida por Bacillus thuringiensis. MENDOZA..62. (1991). E. Apli. 45 SOLIS. Proskaeur Ureasa Hidrólisis de gelatina Hidrólisis de Pectina Negativo Positiva Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . se identificó que nuestro microorganismo fue Actinomyces naeslundii Elaboración y diseño en formato PDF. resultando una coloración GRAM POSITIVO CUADRO 7. IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE Actinomyces naeslundii Morfología de la colonia: circular.NO2 Voges. convexa y de color blanco Estudio microscópico: La observación microscópica se realizó a un cultivo joven de 24 horas.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso. Alexís Germán ANEXOS A. Con las pruebas anteriores y otras adicionales.663 –665. I pp . PRUEBAS BIOQUÍMICAS CARACTERÍSTICAS RESULTADOS Formación de ácidos Arabinosa Fructosa Negativo Positivo Galactosa Positivo Glucosa Manitol Ribosa Xilosa Almidón soluble Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Catalasa Motilidad Indol NO3 . entera. Finalmente.( Mc Kay. ACTIVIDAD HIDROLÍTICA DEL MICROORGANISMO SOBRE LA PECTINA Elaboración y diseño en formato PDF. Alexís Germán B EVALUACIÓN CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD PECTINASA DE Actynomices naeslundii. Luego.. lo cual evidenció la degradación de la pectina. enseguida. 1988) . se adicionó el reactivo rojo de rutenio al 1 % sobre el área donde estuvo la colonia. la placa fue colocada a 50 º C por 48 horas. Arroyo Orbegoso.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.Se sembró por puntura en una placa petri con agar control TSA suplementado con 1% de pectina cítrica. incubándose. se retiró la colonia crecida por lavados sucesivos con agua destilada estéril. a 37 º C por 5 días. tornándose ésta de un color púrpura. A continuación. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . 0.015M: CH3COOH 0. . . Arroyo Orbegoso.. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 8. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Alexís Germán C. RECUENTO DE CÉLULAS VIABLES (Becker y col.Una vez que la superficie de la placa está seca.7839 g/L Agua destilada 1000 mL E. 0. 0.1999) .497 g/L Na2HPO4 1.Tomar una muestra de cultivo.015M: NaH2PO4 0. la gota se extiende sobre la superficie con un asa de Drigalski (a modo de palo de hockey).087 g/L Agua destilada 1000 mL Elaboración y diseño en formato PDF.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. se coloca ésta en la estufa de incubación a 37 ºC D.1 mL de células diluidas sobre la placa de agar TSA. . y hacer diluciones 10X (Cada dilución 10X se prepara añadiendo 1 mL de células a 9 mL de diluyente estéril).Colocar 0. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO DE SODIO pH 7.1 mL de células diluidas sobre la superficie de una placa de agar TSA.5.3264 g/L CH3COONa 0. SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE ACETATO DE SODIO pH 5.Después de colocar la alícuota de 0.618 g/L Agua destilada 1000 mL F.015M: NaH2PO4 0.04 g/L Na2HPO4 2. Alexís Germán G.62 0.34 0.78 0.65 Elaboración y diseño en formato PDF.30 0.25 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . sin aireación-agitación con aireación-agitación 1 0. EVALUACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN N Densidad óptica a 600 nm.60 0. EVALUACIÓN DE LA TEMPERATURA N Densidad óptica a 600 nm 28 º C 1 2 3 4 5 37 ºC 0.75 0.60 0.18 0.1.16 G.41 0.55 0.27 PROMEDIO 45 ºC 0.3.2.38 0.19 0.30 0.15 0.19 8.34 G.58 3 0.20 0. Arroyo Orbegoso.15 0.38 0.66 0.28 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.72 PROMEDIO 0.68 0. EVALUACIÓN DEL pH N Densidad óptica a 600 nm 5 1 2 3 PROMEDIO 7 0.73 0.71 0.38 0.22 0.31 0.23 0.13 0.44 0.38 0.5 0.64 2 0. I/mL ) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 104 112 120 6.50 0.60 0.1994) Cenizas (AOAC.74 0.45 9.43 9.48 9.72 0.48 6.46 9.00 4.08 5.61 0.00 0.77 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .00 0.93 7.50 5. TIEMPO Log N° DE ACTIVIDAD (Horas) ufc / mL PECTINASA ( U. Arroyo Orbegoso.40 Elaboración y diseño en formato PDF.22 0. % 92.00 4.05 0. 1961) Proteína (AOAC.48 6.49 9. Alexís Germán H. 1961) Pectina (Kirk.00 CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN UN MEDIO TSB SUPLEMENTADO CON 1% PECTINA II.48 9.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.00 2. 1961) Aceites y grasas (UNI.00 8. 1961) I.80 0.15 6.81 6.10 0. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO DE LA CÁSCARA DE NARANJA ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO materia seca (AOAC.12 0.49 6.45 6.21 0.59 0.68 0. 51 8.90 8.00 0.15 0.52 0.09 0.09 8.23 0.0*10 8 3.07 5.27 0.26 0.40 0.1*10 8 22.09 0.25 0.76 9.64 0.1*10 8 6.8*10 8 10.3*10 8 5.98 7.f.0*10 8 12.3*10 7 96.00 0.84 8.21 6.I/mL ) TOTAL (mg/Ml) 8.2*10 120 3.26 0.40 0.00 0. Arroyo Orbegoso.0*10 9 3.12 0.34 9.54 0.48 8.15 0.58 0. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO EN UN MEDIO CÁSCARA DE NARANJA TIEMPO NÚMERO DE (Horas) CÉLULAS ( u.54 9.11 0.38 0.5*10 9 3.11 0.48 9.49 8.19 0. Alexís Germán J.01 8.71 9.5*10 8 5 ACTIVIDAD Log N° DE ENZIMÁTICA PROTEÍNA CEL/mL PECTINASA ( U.49 0.65 Elaboración y diseño en formato PDF.00 0.24 0.62 0.0*10 5.1*10 5 14. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .16 0.11 0.0*10 6 16.26 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.2*10 8 3.c / mL ) 8 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 104 112 3.9*10 8 8.46 0.00 0. Arroyo Orbegoso. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Alexís Germán Elaboración y diseño en formato PDF. Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Alexís Germán Elaboración y diseño en formato PDF. Alexís Germán Elaboración y diseño en formato PDF.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo Orbegoso. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Alexís Germán Elaboración y diseño en formato PDF. Arroyo Orbegoso. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Alexís Germán Elaboración y diseño en formato PDF. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . Arroyo Orbegoso. 1.STA 10v*10c) Z=0.451 0.01064*x-0.493 0.0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.0179*y^2+0.08 g / L Function Plot (NEW.0179*y^2+0.08 g / L 3D Contour Plot (NEW. NARANJA g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.00221*x*y 5.0 2.1432*y-0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.5 3.0 4.408 0.01064*x-0.472 0.429 0.1432*y-0.387 0.7199-0.451 0. Alexís Germán L. FIGURAS REFERENTES A LAS ECUACIONES XY POLINOMIALES PARA EL CÁLCULO DE LAS RESPUESTAS EN SUPERFICIE Y LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS FIGURA L. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .493 0.408 0. Arroyo Orbegoso.472 0.535 X1 = CASC.0 3.1 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.430 0.366 0.5 X2 = ( NH4 ) 2SO4 g / Lt 4.00221*x*y 0.0005*x^2+0.STA 10v*10c) Z=0.0 1.535 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.514 0.345 0.5 1.1.514 0.7199-0.5 2.345 0.366 0.387 0.0005*x^2+0. NARANJA g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.08854*y-0.464 0.0465 g / L Function Plot (NEW.4929+0.496 0.496 0.367 0.2 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.529 0.00221*x*y 0.0008*x-0.431 0.529 0.0465 g / L 3D Contour Plot (NEW.464 0.1.399 0.0885*y-0.5 2.431 0.STA 10v*10c) Z=0.561 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.0 4.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.002210*x*y 5.334 0.0 1.5 ( NH4 )2 SO4 g / Lt 4.0179*y^2+0.561 CASC. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .0005*x^2+0.0179*y^2+0.0 3.0005*x^2+0.399 0.0 2.4929+0.334 0.0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.269 0.0008*x-0.5 1. Arroyo Orbegoso.269 0.5 3.367 0.302 0. Alexís Germán FIGURA L.302 0.STA 10v*10c) Z=0. 7199-0.321 0.1432*y-0.274 0.3 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.0 4.417 0.608 0.0 3.704 CASC.013 g / L 3D Contour Plot (NEW.0 2.656 0.561 0.0179*y^2+0.0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0. Arroyo Orbegoso.0005*x^2+0.465 0.704 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X4 = FeSO4 * 7H2 O = 0.5 1.5 ( NH4 )2 SO4 g / Lt 4.STA 10v*10c) Z=0.00221*x*y 5.01064*x-0.465 0.513 0.1.274 0.0005*x^2+0.608 0.5 2.321 0.5 3.0106*x-0.00221*x*y 0. NARANJA g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.369 0.013 g / L Function Plot (NEW. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .513 0.STA 10v*10c) Z=0.1432*y-0.369 0.7199-0.561 0.656 0.0 1. Alexís Germán FIGURA L.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.0179*y^2+0.417 0. 3D Contour Plot (NEW. NARANJA = 16.5 2.5 4.058 0.362 0.278 0.278 0. Arroyo Orbegoso.895*y^2-1. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .068 Fe SO4 * 7 H2O g / Lt 0.063 0.STA 10v*10c) Z=0.6309*x*y 0.488 0.078 0.320 0.153 0.033 0.1.5 5.0 1.195 0.530 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC.488 0.237 0.1914*y+0.2184+0.073 0.4 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC.530 ( NH4 )2 SO4 g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF. Alexís Germán FIGURA L.028 0.0 0.048 0.895*y^2-1. NARANJA = 16.7 g / L Function Plot (NEW.0 2.404 0.237 0.0242*x+4.0 4.153 0.1914*y+0.053 0.6309*x*y 0.7 g / L.023 0.0242*x+4.013 1.043 0.5 3.195 0.446 0.404 0.362 0.0179*x^2-24.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.018 0.2184+0.446 0.0 3.320 0.0179*x^2-24.038 0.STA 10v*10c) Z=0. 6939*y+0.549 0.018 0.5 2.549 0.0 0.340 0.01797*x+6.033 0.445 0.0 2.35 g / L Function Plot (NEW.5 3.6309*x*y 0.5 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC. Arroyo Orbegoso.063 0.STA 10v*10c) Z=0. NARANJA = 9.410 0.514 0.514 0.073 0.0 4.410 0.445 0.0 3.895*y^2-1.1979+0.5 4.5 5.306 0.375 0.038 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.01797*x+6.6939*y+0.375 0.0179*x^2-24.068 Fe SO4 * 7 H2O g / Lt 0.023 0. Alexís Germán FIGURA L.583 0.1979+0.583 0.618 ( NH4 )2 SO4 g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.895*y^2-1.0179*x^2-24.340 0.058 0.078 0.043 0.028 0.6309*x*y 0.0 1.479 0. NARANJA = 9.048 0.618 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC.STA 10v*10c) Z=0.35 g / L 3D Contour Plot (NEW.306 0.1.479 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .053 0.013 1. NARANJA = 2 g / L 3D Contour Plot (NEW.0 1.013 1.068 Fe SO4 * 7H2O g / Lt 0.033 0.493 0.560 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC.053 0.0179*x^2-24.493 0.293 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .1.048 0.360 0.063 0.018 0.0 4.895*y^2-1.028 0.560 ( NH4 )2 SO4 g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.6 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X1 = CASC.5 2.895*y^2-1.19944*y+0.5 3.1994*y+0.460 0.259 0.073 0.360 0.393 0.12008-0. NARANJA = 2 g / L Function Plot (NEW.426 0.058 0.00828*x+9.426 0.259 0.527 0.STA 10v*10c) Z=0.00828*x+9.6309*x*y 0.078 0.12008-0.043 0.0 0. Arroyo Orbegoso.0179*x^2-24.527 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.023 0.6309*x*y 0.STA 10v*10c) Z=0.0 2.326 0.293 0.038 0.5 5.393 0.460 0.326 0.5 4. Alexís Germán FIGURA L.0 3. 633 0.673 0.STA 10v*10c) Z=0.394 0. NARANJA g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.553 0. Arroyo Orbegoso.013 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.553 0.473+0.673 0.3405*x*y 0.038 0.473 0.354 0.7229*y-0.7 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4 )2 SO4 = 5 g / L Function Plot (NEW.058 0.0005*x^2-24.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.633 0.078 0.712 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4 )2 SO4 = 5 g / L 3D Contour Plot (NEW.473+0.712 CASC.593 0.0005*x^2-24.STA 10v*10c) Z=0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .02765*x+1.053 0.895*y^2-0.073 0.018 0.023 0.895*y^2-0.048 0.354 0.028 0.3405*x*y 0.043 0.473 0.1.7229*y-0.033 0.513 0.434 0.394 0.593 0. Alexís Germán FIGURA L.068 Fe SO4 * 7H2O g / Lt 0.434 0.513 0.063 0.02765*x+1. 018 0.078 0.STA 10v*10c) Z=0. NARANJA g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .294 0.313 0.8 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4 )2 SO4 = 3 g / L Function Plot (NEW.06701+0.STA 10v*10c) Z=0.370 0.033 0.038 0.256 0.34048*x*y 0.407 0.275 0.0005*x^2-24.34048*x*y 0.895*y^2-0.256 0. Arroyo Orbegoso.388 0.426 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4 )2 SO4 = 3 g / L 3D Contour Plot (NEW.9847*y-0.294 0.895*y^2-0.332 0.313 0.1.048 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.058 0.023 0.351 0.043 0.370 0.013 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.02323*x+4.02323*x+4.073 0.053 0.332 0.063 0.388 0.275 0.407 0.351 0.9847*y-0. Alexís Germán FIGURA L.06701+0.0005*x^2-24.028 0.426 CASC.068 Fe SO4 * 7H2O g / Lt 0. 0005*x^2-24.053 0.STA 10v*10c) Z=0.393 0.028 0.01881*x+8.293 0.2465*y-0.34048*x*y 0.0942+0.293 0.068 Fe SO4 * 7H2O g / Lt 0.360 0.326 0.048 0.360 0.527 0.527 0.460 0.393 0.1.426 0.460 0. Alexís Germán FIGURA L.033 0.01881*x+8.34048*x*y 0.895*y^2-0.043 0.326 0.560 above LÍNEAS DE CONTORNO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4 )2 SO4 = 1 g / L 3D Contour Plot (NEW. Arroyo Orbegoso.895*y^2-0.493 0.073 0. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .493 0.023 0. NARANJA g / Lt Elaboración y diseño en formato PDF.013 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0.018 0.Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.259 0.259 0.STA 10v*10c) Z=0.058 0.038 0.0005*x^2-24.560 CASC.9 RESPUESTA EN SUPERFICIE DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS CUANDO X2 = (NH4 )2 SO4 = 1 g / L Function Plot (NEW.426 0.063 0.078 0.2465*y-0.0942+0. Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Alexís Germán Elaboración y diseño en formato PDF. Arroyo Orbegoso. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM . 2 1 0.3 0.2 0 0.9 1 Acido D-galacturónico (mg/mL) Elaboración y diseño en formato PDF. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja.2 0. Alexís Germán M.7 0..4 0.5 mL buffer acetato 1.4 1.0 mL Llevar a ebullición 10 min preincubación 50 ºC x 15 min sustrato (pectina al 1%) 0.0 mL Absorvancia (540 nm) CURVA STANDARD DE ACIDO DGALACTURÓNICO 2 1. 1959).5 mL 50 ºC x 30 min 3.5 0.0 mL -----50 ºC x 15 min 0.0 ML centrifugar a 4000 rpm x 10 minutos decantar y llevar a 100 ºC x 5 minutos leer la absorvancia a 540 nm MUESTRA 0.8 0.8 0. Procedimiento: BLANCO volúmen de medio 0.6 1.5 mL Incubar 50 ºC x 30 min DNS 3. DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DEL ÁCIDO D- GALACTURÓNICO (MÉTODO DE MILLER & COL.6 0.5 mL 1.8 1. Arroyo Orbegoso.6 0.4 0. Alexís Germán Actividad Enzimática ( UI / mL ) = ( M – B ) * 103 ? moles PM * (Tiempo de reacción de 30 min) Donde: M. por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM .galacturónico en mg / mL PM = peso molecular del ácido D – galacturónico ( 212.2 ) N. B = concentración de ácido D .Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. BIORREACTOR UTILIZADO PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS Elaboración y diseño en formato PDF. Arroyo Orbegoso.