Separación e Identificación de Aminoácidos de Jugos de Frutos

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ANTECEDENTES La cromatografía (chromo= color y graphie=escritura, escribir en colores) fue inventada el 1903 por el botánico ruso Mikhail Tswett. Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de cromatografía de capa fina. Egon Stahl (1956) dió el nombre de cromatografía de capa fina, estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a esta técnica simple, económica y eficiente. FUNDAMENTO La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es una técnica analítica rápida y sencilla que permite: ‐ Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificación. ‐ Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia. ‐ Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado. El fundamento de la separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R) tenga un carácter más apolar, tendrán tendencia a desplazarse con la fase móvil, mientras que los aminoácidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la fase estacionaria. Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más apolares que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma, usa la cromatografía bidimensional. Basada en el principio anterior, con la diferencia en la técnica, la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90° y se realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema Práctica No. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Página 1 ácidos carboxílicos). haluros de alquilo.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS de solventes determinado. y se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente. calculándose el correspondiente valor de Rf. aldehídos y cetonas). la segunda cromatografía debería incrementar en grado sustancial la separación de la mezcla de componentes. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de descomposición. La alúmina anhidra es el más activo de los dos. El gel de sílice. es decir. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interacción dipolo‐dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan. se determina la posición de los componentes con un reactivo de revelado (ninhidrina). se utiliza para separar sustancias más polares (alcoholes. por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos. ambas de carácter polar. aminas. éteres. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida. por el contrario. Tras la eliminación del disolvente. Rf = Frente o distancia del soluto Frente o distancia del disolvente OBJETIVO Práctica No. Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel de sílice (SiO2) y la alúmina (Al2O3). es el que retiene con más fuerza a los compuestos. Página 2 . El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente. con el de la unidimensional. Lisina. Figura 1: Cromatograma 1 Unidimensional. Identificar los aminoácidos separados por comparación de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminoácidos. de izquierda a derecha. Histidina. Tirosina. Fase móvil: cloroformo-metanol-amoniaco. Metionina. Práctica No. Página 3 . Glicina. Comparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Aminoácidos: Arginina. Glutamina. Prolina. De acuerdo a la relación de migración para las sustancias aquí utilizadas se obtuvieron los siguientes valores de Rf para cada una de ellas.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS    Separar los aminoácidos presentes en el jugo del jitomate por cromatografía bidimensional en capa fina. Triptofano. Fenilalanina. RESULTADOS: En cada placa cromatografía se observan manchas de diferentes tamaños correspondientes a cada uno de los aminoácidos y a diferentes distancias. Lisina. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Triptófano. II Fase Móvil Práctica No. Página 4 I Fase . Metionina. Fase móvil: Butanol-ácido acético-agua. Fase móvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fenilalanina.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Figura 2: Cromatograma 2 Unidimensional. Tirosina. Glicina. de izquierda a derecha. Fase móvil II: butanol-ácido acético-agua. II Fase Móvil I Fase Figura 3: Cromatograma 3 Bidimensional de aminoácidos tipo. Prolina. Histidina. Glutamina. Aminoácidos: Arginina. 9 0.9 0.1898 Tirosina (Tyr) 5. Fase móvil II: butanol-ácido acético-agua.7 7.8 0.6153 1.4 7.4050 Histidina (His) 4.8 0.8 0.3846 3. Fase Cromatograma 1 Móvil Aminoácido 2ª Fase Móvil Cromatograma 2 Frent e del solut o Frente del disolvente Rf Frente del soluto Frente del disolvent e Rf Arginina (Arg) 1.7 7. Página 5 . Tabla 1.8 0.8 7.9 0.8 0.4177 Glicina (Gly) 3.3 7.9 0.1 7.6075 Fenilalanina (Phe) 6.8 7.9 0.1518 Glutamina (Glu) 2.9 0.5769 3.8205 4.3 7.8 7.2 7.5 7.9 0.6538 4.9 0.3076 1.5 7.9 0.6 7.8 0.8 0.8 7.5 7.8717 5.8 7.9 0.6708 Práctica No.5512 2. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases móviles.8 0.1923 1.8 0.3291 Prolina (Pro) 4. 1ª.3417 Triptófano (Thr) 4.2 7. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina.3 7.1772 Lisina (Lys) 2. Fase móvil I: cloroformo-metanolamoniaco.5949 Metionina (Met) 6.4 7.8 0.4871 2.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Figura 4: Cromatograma 4 Bidimensional del jugo de jitomate.4 7. 8 7.1518 1.1772 1.1666 Histidina His 1.2 7.5 7.9 0.8 7.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Tabla 2.3 7.7 7.6 7.3 7.9 0.7 7. Aminoácido 1ª.0 7.8 0. 3.9 0.2051 Glicina Gly 2.6 7.8 0.9 0.4177 3.3417 2.3 7.4 7.8 0. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina.9 0.3291 2.0 7.2 7.3205 Triptófano Thr. Página 6 .6923 Tabla 3.5949 4.6153 Fenilalanina Phe.8 0.9 0.8 0.5 7.9 0. Fase Cromatograma 4 Frent e del solut Frente del disolvente Móvil Rf 2ª Fase Cromatograma 4 Frente del Frente del disolvent Móvil Rf Práctica No.6708 5.6025 Metionina Met 4.9 0.9 0. 4. 5. Aminoácido 1ª.8 0.2564 Prolina Pro 2.1 7.8 0.1898 1.4 7. Fase Cromatograma 3 Móvil 2ª Fase Cromatograma 3 Móvil Frent e del solut o Frente del disolvente Rf Frente del soluto Frente del disolvent e Rf Lisina Lys 1.6075 4.8 0.8 0.9 0.4050 2.8 7. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.8 0.7 7.1282 Arginina Arg 1.3589 Gutamina Glu 3.3974 Tirosina Tyr. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles. 5 7.1518 0.3417 2.8 7.7 7.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS o Lisina Lys Arginina Arg Histidina His Glicina Gly Triptófano Thr Glutamina Glu Torosina Tyr.1666 0.8 0.6708 problema (IV) Aminoácido correspondiente Lisina Lys Arginina Arg Glicina Gly Triptófano Thr Glutamina Glu Fenilalanina Phe DISCUSIÓN: La cromatografía en capa fina como método cualitativo y cuantitativo.3974 0.6708 Tabla 4.1 3.8 7.6 2.3974 2.4810 4.1282 0.8 0.2 2.1 4.9 0.9 7.3924 0.1518 0. Lisina.7 7.2564 0. Fenilalanina Phe soluto e 1.2784 0.9 7.1282 0.3589 0. Rf creciente en la 1ª fase móvil 0.3589 1.8 0.9 0.2 2.8 7.0 2.9 0.3164 0. Cromatograma bidimensionales desarrollado en las 2 fases móviles.8 7.6025 0.9 7. Práctica No.5 2.9 7.9 0.3670 3.1265 0.6923 Rf en la 2ª Fase móvil 0.0 1.3670 0.6923 5. en este caso se tuvieron 10 Aminoácidos tipo (Arginina.2564 0.2784 0. siempre requiere contar con un estándar de referencia.9 7. Glutamina. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina.8 7.8 0.1666 0.8 7.0 1.2050 0. Glicina.3 1. Página 7 .8 7.3 7. Metionina Met.3924 0.1265 0.9 7.6153 3.8 7. Incluso algunos factores que pudieron haber afectado al Rf son: el grado de pureza del adsorbente. Tirosina.(que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) por lo que genera una mancha de color amarillo obscuro la cual se observo plenamente en la placa II y III. La mayoría de los aminoácidos pudo identificarse en cada una de las placas desarrolladas gracias al revelado que se hizo con una solución de ninhidrina.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Prolina. permitiendo el reconocimiento de los mismos por la coloración denominada púrpura de Ruhemann. Metionina. puesto que la fase móvil recorrió en un tiempo muy corto al esperado cada uno de los cromatogramas. puesto que así es posible caracterizar a un compuesto más específicamente registrando sus Rf en varios disolventes. Página 8 . lo que quiere decir que tendrá 2 separaciones de acuerdo a las propiedades de cada fase. Glutamina y Práctica No. ya que de 10 aminoácidos tipo se identificaron 6 en el jugo de jitomate a partir de la comparación de la tabla 2 y 3. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Arginina. II: butanol-ácido acético-agua (3:1:1)). Triptófano. la prolina no tiene dicho grupo libre. ninguno de ellos presentó el mismo. pues se aglutinaron en un sólo espacio. pero ello constituye una ventaja. Comparando la cromatografía unidimensional y bidimensional se destaca que la segunda fue más eficiente debido a que. Sin embargo.. con los datos experimentales obtenidos. De los que no fue posible hacerlo se debe a las características tan similares que tienen los aminoácidos unos con otros. Histidina. no es la misma por su naturaleza química. Al realizar los cálculos de Rf para determinar en específico cada uno de los aminoácidos encontrados en nuestra solución problema. Triptófano. la concentración del ambiente de la cámara y la temperatura. ya que esta reacciona debido a la presencia del grupo α–NH2. se logro la identificación de: Lisina. sino –NH. Glicina. Nuestros valores pueden considerarse satisfactorios. ya que la tendencia de estos para asociarse con mayor fuerza a una u otra fase móvil (I: Cloroformo-metanol-amoniaco 17% (2:2:1). la muestra se encuentran expuesta a 2 fases móviles. dando como resultado el incremento en el grado de separación de cada uno de los aminoácidos presentes en nuestra solución problema. CONCLUSIÓN: Se logró separar cada uno de los aminoácidos presentes en el jugo del jitomate por cromatografía bidimensional y debido a que cada uno de ellos presentes en la muestra tiene un Rf característico. Fenilalanina) para comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del estándar al ser revelada con agentes químicos. 0. Observando la tabla. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. Nutriente Leucina Lisina **Metionina **Prolina Serina **Tirosina Treonina Triptófano Valina Cantidad 28 mg. 7 mg.93 mg. 24 mg. PREGUNTAS EXTRAS: 1. 22 mg. 26 mg. 12 mg.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Fenilalanina. 0 mg. 11 mg. se verifica que las concentraciones de los aminoácidos no encontrados en el jitomate son muy bajas **por lo cual no se logró su identificación en la cromatografía unidimensional en la práctica. 15 mg.. 27 mg.. Nutriente Ácido aspártico Ácido glutámico Alanina Arginina Cistina Fenilalanina Glicina Hidroxiprolina **Histidina Isoleucina Cantidad 113 mg. 21 mg. 17 mg. ** Aminoácidos no identificados en la solución problema. 314 mg. Página 9 . 17 mg. 6 mg. Compare con sus resultados y concluya.Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema. 21 g. 2. Práctica No. 21 mg.Escriba la reacción completa y con nombres. de la ninhidrina con un aminoácido. -Contaminación de los reactivos. siempre y cuando realicemos la eliminación de la primera fase móvil con aire caliente para no causar problemas a la segunda. 4. . Página 10 .INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 3.. -Marcar las placas con pluma o plumón. -El haber raspado la sílica de las placas cromatograficas. -La temperatura de las cámaras.¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Si es posible cambiar el orden. BIBLIOGRAFÍA: Práctica No.Colocar mal los cromatogramas en la cámara.. -No usar guantes de látex para la preparación de las placas cromatograficas. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina. -No dispersar bien la ninhidrina en la placa resultando que no se revelen algunas separaciones. ya que la separación de los aminoácidos de jugo se da en cuanto a las polaridades de cada uno.Indique las posibles fuentes de error en esta técnica. fquim..htm http://depa.mx/amyd/archivero/M.fquim. Douglas A.Cromatogrficos_6700.uah. 2008.pdf http://www. 1 Separación e Identificación de Aminoácidos de jugos de frutos por Cromatografía Bidimensional en capa fina.unam. James Haller. F.. México. Página 11 .quimicaorganica.es/reac_der_aa_ninhydrin. Sexta Edición.html http://biomodel. Crouch.unam.mx/proteinas/estructura/EPamm2.es/tecnicas/crom/inicio.INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Skoog.htm http://www. Cengage Learning.cromlab.org/foro/1-introduccion-a-la-quimicaorganica Práctica No. pág 851 http://depa. “Principios de Análisis Instrumental”.