Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Métodos de Análisis Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida. Profesora: Guillermina Rosas Sandoval Alumno: Miranda Onofre José Manuel Grupo: 4IV1 Fecha de entrega: 25 de abril de 2016 Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas. en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia. para la mejor separación de cada una de las muestras. el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Objetivos.N’metilén-bis-acrilamida). la acrilamida y la bis-acrilamida (N.   Efectuar la separación de proteínas de varias muestras mediante la técnica de la electroforesis en gel de poliacrilamida.5 4. Por ejemplo si dos moléculas tienen masa y formas iguales. El radical persulfato activa al TEMED. (f) No de Clara Suero bandas Yogurt en: 5.3 5. Tabla 1.5 5. cm. La poliacrilamida se forma por polimerización de dos compuestos. cm. Característica \ %T Longitud del gel antes de teñir. que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.3 4. elasticidad.1 5 1 6 8 4 9 7 10 9 11 12 8 . Características de los electroferogramas a diferentes %T. Datos e informe experimental.2 5. la de mayor carga neta se desplazara más rápido hacia un electrodo.2 5.5 10 12. formándose así una red de porosidad bastante uniforme. Fundamento. (l) Longitud del gel después de teñir.3 5. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bis-acrilamida.2 4. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a velocidad determinada por su relación cargamasa.3 5. porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. (l’) Distancia recorrida por el colorante. cm. Determinar cuál es el tamaño óptimo de poro de gel. La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico.3 3.5 4.9 5.5 7.Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida. 6 1 1.4643 1.5 2.1435 0.03 2.2 1.6 0.2 1.7818 1.605 0.3 2 2.6941 1.3 2 2.5891 1.544 1.3504 0.5 3.7 0.1854 0.3789 1.2393 0.6532 1.3028 Log(M*1 00) 1.5 2.3708 0.6 1.6 1.6 1.5 Muest ra Valores de m de proteína seleccionada (cm) Clara Suero Yogurt Clara Suero Yogurt Clara Suero Yogurt Clara Suero Yogurt 1. %T 5.Tabla 2.759 1.7 0.5 2.3 2.4945 0.6 Valor prome dio de m (cm) 1.2618 1.6 1 1.1568 1.5 2.7 0.2 1.45 0.6 1.5 7.1 2.2 1.6 0. Movilidad electroforética relativa promedio.2 1.2 1.6 1.5 3.6 1.2913 0.46 3.7475 0.5829 .3 2.6 0.6 1 1.4 3.5746 0.2 1.7 0.6 0.6 1 1.873 1.5 10 12.6 Movilidad electrofor ética relativa M 0.2 1. 05x + 2. Los valores de la ordenada al origen no corresponden al valor de la carga. Como se puede observar en la gráfica y con las ecuaciones obtenidas teóricamente las proteínas en la clara de huevo (ovoalbúmina) son de mayor tamaño.Grafica 1. En nuestro caso sabemos que todas las proteínas utilizadas tienen carga negativa debido a que como se trabajó en un pH básico.06x + 1. En cuanto a sus cargas eléctricas relativas de las moléculas las podemos comparar a partir de las ordenadas al origen de las rectas en la Gráfica de Ferguson.05 R² = 0. Esto se puede deducir porque en el gráfico de Ferguson la pendiente de la recta formada indica el tamaño molecular relativo de la proteína de estudio. hay una gran cantidad de iones oxidrilo presentes o que hacen que los grupos amino de los aminoácidos sean neutralizados dejándonos solo con la carga de los grupos carboxilo la cual es . las cuales se tomaron como las más abundantes en cada muestra.09 R² = 1 f(x) = .0.87 R² = 0.0. Grafica de Ferguson f(x) = . seguidas por las del suero (albumina) y al final la de menor tamaño se encuentra en el yogurt (caseína).0. sólo nos haces referencia de qué moléculas tienen más carga.04x + 2.1).95 f(x) = .98 Clara Linear (Clara) Suero Linear (Suero) Yogurt Linear (Yogurt) Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus cargas eléctricas relativas al pH del regulador de trabajo (8.7-9. negativa además de que en la electroforesis de puede observar que estas corren hacia el ánodo. Diga cuál %T recomienda para la separación de las proteínas de cada muestra. Las concentraciones óptimas de persulfato amónico y TEMED dependen de la concentración de acrilamida. formándose así una red de porosidad bastante uniforme. se puede observar que en un valor de 12. por lo tanto esta es la concentración recomendada para las 3 muestras.5 se tiene un mayor número de bandas lo cual nos habla de una mayor resolución. Escriba la reacción completa para la copolimerización de la acrilamida y la bisacrilamida por radicales libres.5 en el caso del yogurt. Por lo que observando la ordenada al origen de cada recta el yogurt tiene una mayor carga negativa que la clara de huevo y el suero sanguíneo humano. ¿por qué? Como él %T determina el tamaño del poro del gel. que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. ¿Qué función tiene el TEMED y el persulfato de amonio? El radical persulfato activa al TEMED. por el contrario. . esto se debió a un mal conteo de las bandas por lo que también para esta muestra se recomienda una concentración de 12.5%. el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Una concentración demasiado baja puede traducirse en que parte del monómero no polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida. un exceso de catalizador origina un número elevado de cadenas de acrilamida anormalmente cortas. Aunque en la tabla 1 se muestra un número mayor de bandas con una concentración de 10% que con 12. La movilidad. Acrilami da Bisacrilamida . Investigar los monómeros utilizados. etc.Se puede aplicar en la preparación y purificación de moléculas y fragmentos de DNA y RNA Electroforesis analítica. 1.. se define como la velocidad que toma la partícula por unidad de campo. Velocidad de migración..   Electroforesis preparativa. el movimiento de una molécula tiene una determinada velocidad conocida como velocidad de migración. Defina electroferograma. Un electroferograma es un gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis. monitorear un proceso de purificación.Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una de la electroforesis analítica. Su signo es igual al de la carga de la partícula. estimar Peso molecular. Dicha velocidad de migración es un valor característico de la molécula y del campo eléctrico. (u).La movilidad electroforética es un caso particular de la velocidad de migración de un ion. conocer la composición de un preparado proteico heterogéneo.En electroforesis.. Movilidad electroforética. cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Se pueden realizar electroferogramas con resultados derivados de:     Pruebas genealógicas de ADN Pruebas de paternidad Secuenciación de ADN Huella genética Preguntas extra. Defina velocidad de migración y movilidad electroforética..Permite realizar algunos tipos de diagnósticos. Como se pudo observar en los datos obtenidos. esto debido a que en la corrida de nuestras muestras al tener un poro más pequeño se obtiene una mayor resolución en los resultados observando un mayor número de bandas. esto es posible de obtener con una mayor concentración de los monómeros en el gel ya que si la concentración es baja abra mayor difusividad de nuestra muestra. generando la malla. Discusión. Regulando la concentración de ambos tipos de monómero y su proporción se consiguen distintas porosidades. ¿Por qué se generan burbujas en la electrolisis? Porque en los cátodos se producen reacciones químicas de oxidación-reducción con desprendimiento de gases. matriz o red tridimensional del gel. Aunque hay que tener en cuenta que la corrida no solo depende del tamaño del poro de gel. ¿Qué es electrolisis? Se dice de la producción de una ruptura de un enlace químico haciendo pasar una corriente eléctrica por ciertos líquidos conductores (electrolitos). Esto nos indica que la que menos de desplazo fue la muestra de clara de huevo y la que más corrió fue la muestra de yogurt. 2. ya que también se deben tener en cuenta las cargas de las proteínas a utilizar así como su tamaño y su peso. en el suero humano la albumina y en el yogurt la caseína. Estas reacciones se producen en los electrodos por la llegada y salida de electrones. Una vez hecho esto se consideró que los resultados obtenidos eran respecto a ellas dándonos como resultado que la más grande de las tres es la ovoalbúmina y la que tiene mayor carga es la caseína. Para poder interpretar el grafico de Ferguson se procedió a investigar cuales eran las proteínas en mayor concentración en cada muestra encontrándose que para la muestra de clara de huevo es la ovoalbúmina. . la concentración del gel preparado nos ayudó a crear diferentes tamaños de porosidades para la electroforesis lo cual produjo que en unas placas corrieran más las proteínas que en otras. 3.La acrilamida forma polímeros lineales pero la bis-acrilamida introduce uniones cruzadas entre las cadenas de poliacrilamida. ucv.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos. Ed. 2001. la buena separación de proteínas depende la concentración de los monómeros en el gel que se prepara ya que de esto dependerá que se puedan distinguir entre las diferentes moléculas que se encuentran en ella. paginas consultadas 87. pag. Rubinnson. 722-730 . “Biologia celular y molecular”.Conclusión. Para el caso de este experimento se puede concluir que la concentración adecuada para las muestras es de 12. Editorial Prentice Hall. México D.ve:8080/generador/sites/lab-bioqgen/archivos/Lomonte%20-%20Cap13%20PAGE. Bibliografía. Medica Panamericana.F. Rubinson.php? url=LzNfUFJBQ1RJQ09TL0VsZWN0cm9mb3Jlc2lzLnBkZg%3D %3D&cidReset=true&cidReq=FISDOS http://biomodel.uah.5 %T ya que fue en la que mejor resolución se tuvo. Kenneth A & J. 5a edición. En este tipo de electroforesis.htm Harvey Lodish.ciens..es/slide/2539074/ http://www.pdf http://alimentosproteinas.org/claroline/backends/download. España.dyndns.        http://www.aulavirtualexactas.88.com/huevo http://slideplayer. Madrid.F. 2005. Análisis Instrumental.