Rugai & Araújo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL __ Identificação de Bacilos Gram Negativos

04/12/13Rugai & Araújo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL :: Identificação de Bacilos Gram Negativos Identificação de Bacilos Gram Negativos Meio de Rugai & Araújo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL Atualmente conhecido como IAL (Meio Instituto Adolfo Lutz) foi inicialmente proposto por Rugai & Araújo, em 1986, com a intenção de eliminar as falhas existentes nos meios similares, até então usados. Em 1972, Pessoa & Silva, desenvolveram um meio que possibilitou a pesquisa da motilidade e da descarboxilação da lisina, concomitantemente com as reações obtidas no meio clássico de Rugai & Araújo. Este meio é utilizado para identificar as principais espécies de Enterobactérias, Víbrios e Aeromonas , permitindo em um só tubo a leitura, das seguintes reações: motilidade da bactéria indicado pela turvação da lisina na base, lisina descarboxilase, fermentação da glicose em profundidade e da sacarose na superfície do meio, produção de gás sulfídrico (H2 S), gás em glicose, utilização do aminoácido L-triptofano (desaminação), hidrólise da uréia e no tampão do tubo, um desenvolvimento de coloração avermelhada que indica a formação de indol. O meio IAL é constituído por duas fases, superior e inferior, separadas por uma camada intermediária, chamada vascar, de cerca de 2 mm. 1 - Fase Intermediária (Vascar) Fórmula: Vaselina líquida Cera de carnaúba 90 mL 10 g Preparo: Pesar a cera e adicionar a vaselina em um copo de Becker e aquecer com agitação constante até completa fusão da cera e o aparecimento de uma mistura líquida homogênea. Tomando cuidado para não ocorrer o superaquecimento (repetir este procedimento de aquecimento toda vez que for usar o vascar). O vascar é armazenado em um recipiente de boca larga, rotulado em geladeira. Distribuir cerca de 0,2 mL de vascar em tubos 12 mm x 120 mm antes de colocar a fase inferior do meio. 2 - Fase Inferior Fase semi-sólida permite observar a descarboxilação da lisina e a mobilidade da bactéria. Após preparo, o meio apresenta coloração lilás. Fórmula: Extrato de levedura Dextrose Nitrato de potássio L-Lisina Ágar ágar Solução alcoólica de púrpura de bromocresol à 0,2% Água destilada pH final = 6,4 1,2 g 0,2 g 0,2 g 2g 1,6 g 4 mL 400 mL Preparo: Pesar todos os reagentes individualmente e adicionar a um balão com a água sem o ágar. Homogeneizar e verificar o pH 6,4. Juntar o ágar-ágar, e aquecer levemente sob constante agitação até a completa dissolução do ágar. Distribuir 2 mL nos tubos de vidro 12 mm x 120 mm, já contendo o vascar. www.microclinica.ufsc.br/index.php/metodo/rugai_araujo/ 1/3 Solução alcoólica de púrpura de bromocresol a 0.s. 3 .Solução alcoólica de azul de bromotimol a 1. permite observar a utilização da glicose em profundidade com ou sem produção de gás.p.5% Fórmula: Azul de bromotimol Álcool etílico (q.5 g 100mL Preparo: Pesar o azul de bromotimol e adicionar em um copo de Becker com um pouco do álcool para dissolver.ufsc. Armazenar em geladeira.br/index. deixar solidificar em posição vertical a temperatura ambiente. hidrólise da uréia e a produção de indol na rolha de algodão hidrófilo.8 g 0. Após 30 minutos acrescentar a púrpura e o álcool.microclinica. só assim ele estará pronto para receber a fase superior assepticamente.5% 4g 0. colocá-los na posição vertical.Fase Superior Meio sólido. no ápice do meio.04/12/13 Rugai & Araújo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL :: Identificação de Bacilos Gram Negativos Fechar cada tubo com rolhas de algodão hidrófilo (branco).s. Após a completa dissolução.4 g 100mL Preparo: Armazenar em frasco âmbar a temperatura ambiente.8 g 2g 0. Após autoclavação.) para 100mL.Solução de substratos Fórmula: Citrato de ferro amoniacal Tiossulfato de sódio Sacarose Glicose ou Dextrose Uréia Água destilada 2g 2g 80 g 10 g 40 g 85 mL Preparo: Adicionar em um copo de Becker todos os reagentes previamente pesados e a água. embalar. 7 . esterilizar por filtração e distribuir assepticamente em frasco âmbar com tampa de rosca já estéril.p. para dissolver. Utilizar somente após 48 horas.php/metodo/rugai_araujo/ 2/3 . utilização da sacarose e desaminação de l-triptofano (LTD). produção de H 2S. Após a completa dissolução. homogeneizar até a completa dissolução.) 1.2% Fórmula: Hidróxido de sódio 1N Púrpura de bromocresol Álcool etílico Água destilada 1mL 0.2g 63mL 49mL Preparo: Adicionar 1mL da solução de hidróxido de sódio 1N à água e esperar 30 minutos para estabilizar. 4 . Fórmula: Triptona Extrato de carne Cloreto de sódio Fosfato dissódico L – triptofano Solução alcoólica de azul de bromotimol 1. completar com o restante do álcool (q. 5 . Após preparo o meio apresenta coloração verde. 6 .Hidróxido de sódio (NaOH) 1N Fórmula: Hidróxido de sódio Água destilada 0.4 g 0. em seguida levar ao banho-maria 65º C. rotular e autoclavar a 120° C por 15 minutos. Armazenar em frasco âmbar à temperatura ambiente.8 mL www. O vascar forma um anel sobre a fase inferior. 04/12/13 Ágar ágar Água destilada pH final = 6. Após completa solidificação.Reativo de Ehrlich para indol (para teste na rolha de algodão) Fórmula: Paradimetilaminobenzaldeído Ácido orto-fosfórico na formula líquida xaroposo Álcool etílico absoluto Água destilada (qsp) 1g 14 mL 50 mL 100 mL Preparo: Em frasco âmbar com tampa esmerilhada.4 g 400 mL Preparo: Pesar todos os reagentes um a um e ir adicionando em um balão com a água sem o ágar. Homogeneizar e acertar o pH para 6. Após autoclavação.: índice :. Se Pega uma colônia a ser pesquisada. . adicionar assepticamente 1. Juntar o ágar. Incubar em estufa bacteriológica a 37° C por 18 a 24 horas. para que o meio não desidrate. Colocar os tubos inclinados em ângulo de 45° a temperatura ambiente até solidificar.4 Rugai & Araújo modificado por Pessoa & Silva ou meio IAL :: Identificação de Bacilos Gram Negativos 4. identificar e levar a autoclave 120° C por 15 minutos.Leitura do meio de IAL Interpretação Fase Superior Ápice: azul: sacarose negativa LTD negativo Amarelo: sacarose positiva LTD negativo verde garrafa: sacarose negativa LTD positivo castanho: sacarose positiva LTD positivo Base: amarelo: glicose positiva Base: amarelo: glicose positiva Azul: uréia positiva Preto: H2 S positivo amarelo com bolhas : glicose e gás positivos Fase Inferior: violeta : lisina descarboxilase positiva Amarelo : lisina descarboxilase negativa com turvação : motilidade positiva (móvel) sem turvação : motilidade negativa se observa nitidamente o crescimento Teste de indol na rolha: Após a incubação pingar assepticamente.br/index. Tampar com algodão hidrófobo.4. Homogeneizar e distribuir assepticamente 2 mL deste meio em tubos de vidro 12 mm x 120 mm. rotular cada tubo e armazenar na geladeira em recipiente fechado.microclinica. © 2005-2012 . Ao voltar à superfície semear em estria na superfície inclinada do meio. embalar. cuidando para não mexer a agulha.Helena C ristina Ferreira Franz — conteúdo sob licença creative commons www. e inocula-se em picada (punção) até quase chegar ao final do tubo.75 mL da solução de substrato. Indol positivo: algodão fica rosa ou vermelho Indol negativo: algodão permanece sem cor ou com coloração amarelo. 2 à 3 gotas do reativo de Ehrlich para indol na rolha do algodão hidrófilo. 8 . dissolver o aldeído no álcool. para cada 100 mL de meio. contendo a fase inferior e o vascar já estéril e solidificado. 9 . Inoculação O Meio de IAL deve ser inoculado com fio bacteriológico flambado e resfriado. aquecer levemente sob constante agitação até a completa dissolução do ágar.ufsc.php/metodo/rugai_araujo/ 3/3 . resfriar à 65° C. evitando o superaquecimento.