Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Normas do Laboratório de Microbiologia 1. Os alunos somente poderão assistir ou participar dos experimentos práticos protegidos com avental apropriado (uso obrigatório); 2. Os alunos que apresentem soluções de continuidade (ferimentos ou cortes) na pele devem informar ao professor antes do início da prática para que o mesmo avalie se o aluno pode participar diretamente da prática; 3. Os objetos pessoais, exceto aqueles utilizados em experimento da prática (caderno, caneta, lápis, etc...), devem ser colocados nos armários; 4. Os alunos devem, de preferência, ocupar um lugar específico na bancada e mantê-lo fixo por todo o semestre; 5. Os estudantes devem evitar conversas paralelas e circulação entre as bancadas para diminuir os riscos de contaminação; 6. Antes de iniciar os trabalhos, os alunos devem sempre realizar a desinfecção da bancada utilizando algodão embebido em soluções de álcool a 70% ou de hipoclorito de sódio a 1000 ppm, ou outro agente, por um período adequado; Apesar de não trabalharmos com amostras clínicas ou microrganismos virulentos, convém considerar que todo material biológico é infeccioso; 7. Todo experimento deve ser efetuado com o máximo de cuidado e atenção; 8. Não é permitido fumar, beber ou comer no laboratório; 9. Manter a bancada arrumada e colocar papéis no lixo; 10.É recomendado não assistir aulas de chinelos, sandálias ou bermudas; 11.Ao receber o material para a prática verificar se está devidamente íntegro, tubos tampados adequadamente, se não há vazamentos; 12. Ao utilizar alças e agulhas de platina as mesmas devem ser esterilizadas por flambagem antes e após cada operação efetuada com culturas microbianas; 13.Colocar os instrumentos e materiais utilizados inclusive vidraria, em recipientes apropriados, ao final do experimento; 14.Caso ocorra algum acidente comunicar imediatamente ao Professor Responsável que tomará as providências cabíveis; Ao final dos experimentos envolvendo microscopia, as objetivas devem ser limpas, o condensador deve ser deixado na posição original e o equipamento devidamente protegido e desligado; 15.Os alunos devem trazer canetas tipo Pilot para identificar devidamente os materiais utilizados na prática, facilitando o reconhecimento posterior; 16.Não é permitido pipetar com a boca, em vez disso usar pêras ou pipetadores apropriados; 17.Não recapear agulhas; 18.Ao final da aula prática envolvendo culturas microbianas, lavar as mãos com sabão líquido e enxugar com papel toalha ou álcool-gel; 19.Após o término do experimento o aluno deverá deixar a bancada limpa e organizada; 20.Após o término da aula, o aluno deverá retirar o jaleco e acondicioná-lo apropriadamente, pois não será permitido que o aluno circule pelas dependências do Instituto com o avental utilizado na aula prática; 1 Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Após os trabalhos de laboratório, o recolhimento do material e o descarte das culturas são feitos por técnicos do laboratório. Cabe ao aluno, entretanto, deixar a bancada organizada e limpa. Uso do Bico de Bunsen A chama tem três zonas: duas internas, mais frias, formadas por um gás que não entrou em plena combustão; a última é a zona oxidante da chama, sendo a que mais se emprega em microbiologia. Esta região azul da chama, na parte superior, é que deve ser utilizada para esterilizar alças e agulhas de platina. As alças devem ser colocadas num ângulo de 45o na chama até ficarem incandescentes. Esperar esfriar e utilizar. Todo o material de microbiologia deve ser manipulado atrás do fogo, na área estéril, de forma a proteger o operador de possíveis aerossóis gerados e proteger a amostra biológica de contaminação. Procedimento: 1. Abrir a válvula de controle do gás; 2. Acender o fósforo; 3. Abrir lentamente a válvula do distribuidor; 4. Ajustar a chama; 5. Desligar na ordem inversa: feche a válvula do distribuidor e em seguida a válvula de controle de gás. 2 Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 01 – Coloração de Gram 1. Princípio Baseado na impregnação pelo cristal violeta (corante primário) na parede celular de algumas espécies bacterianas após este corante formar um complexo insolúvel com uma solução de iodo (lugol – mordente). Estas bactérias, devido à natureza de sua parede celular, retém o cristal violeta, mesmo após tratamento com descorante orgânico (álcool-acetona) e são chamadas de Gram-positivas. As bactérias que perdem a coloração primária são ditas Gram-negativas, sendo posteriormente coradas pelo corante secundário (fucsina), tomando a coloração rósea. 2. Amostra 2.1. Tipo de amostra Qualquer amostra clínica onde se deseja pesquisar a presença de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, anteriormente ao cultivo ou não ou, ainda, de colônias isoladas em meios de cultivo primários. 3. Metodologia - Posicionar a lâmina sobre o suporte. - Cobrir a lâmina com violeta de Genciana por 1 minuto. - Lavar com água corrente e adicionar o lugol, deixando-o agir por 1 minuto. - Com a torneira ligeiramente aberta, retirar todo o lugol e proceder a descoloração com álcool-acetona (tempo crítico – aproximadamente 5 segundos), até que a coloração violeta não se desprenda mais da lâmina. Enxaguar imediatamente. - Adicionar a Fucsina de Gram por 30 segundos. Enxaguar e secar a lâmina. Observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). 4. Interpretação Bactérias Gram-positivas = se coram em azul Bactérias Gram-negativas = se coram em vermelho 5. Interferentes O cristal violeta pode precipitar, formando estruturas semelhantes a cocos Gram-positivos. Entretanto os precipitados são geralmente maiores que as bactérias. Nesse caso, o corante deve ser filtrado antes do uso. O descoramento em excesso ou a falta do mesmo podem fornecer resultados errôneos, assim como o ajuste inadequado do conjunto ótico do microscópio. 3 em imersão. Streptococcus sp. e avaliar as seguintes bactérias quanto a morfologia (cocos. cocobacilos.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 02 . 4.Observação de características morfológicas e tintoriais na Coloração de Gram Observar ao microscópio. Morfologia Arranjo Gram 3. Staphylococcus sp. Bactéria 1. Enterococcus sp. 2. Bacillus sp. agrupados. Streptococcus pneumoniae 5. arranjo (isolados. Escherichia coli 6. 4 . em tétrades) e coloração de Gram (Gram-positivos ou Gram-negativos). Acinetobacter sp. em cachos de uva. bacilos. 8. vibrio). Neisseria sp. em cadeias. 7. aos pares. pela técnica de isolamento. Salmonella sp. Proteus mirabilis. Incubar as placas a 35 ± 1 oC por 24 horas. Após o período de incubação observar e anotar as características das colônias nos diferentes meios de cultura. Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella sp) e deverá inocular em diferentes meios de cultura. Anotar também as características observadas nos microrganismos dos outros colegas Meio de cultura Bactéria testada Pigmentaç ão (Cor da colônia) Característica diferencial do meio Observações Sangue Mac Conkey XLD Hektoen Observações: 5 ..Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aulas 03 – Semeadura em Meios de cultura seletivos e diferenciais Cada dupla receberá um microrganismos (Escherichia coli. especialmente estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. imediatamente após a coleta. • Rolar o swab no início de um quadrante da placa de ágar sangue (AS) e. Amostra 2. Metodologia 3. fazer a semeadura do material no meio pela técnica de isolamento. Tipo de amostra Secreção de orofaringe. 2. posteriormente. fazer um esfregaço em lâmina. 6 .3. • Cuidar para não tocar com o swab na parede da cavidade bucal e não carregar saliva. com o abaixador de língua. Estabilidade da amostra Amostra em placa: encaminhada em até 2 horas em temperatura ambiente Amostra em meio de transporte: 24 horas em temperatura ambiente 2. faringe.2. • Caso não esteja disponível a placa de AS. Semeadura e isolamento Com auxílio de uma alça de platina. verificando a presença de leucócitos. amigdalite). mas também para evitar complicações posteriores. • Expor o máximo as amígdalas. 3. • Esfregar o swab. amígdalas e/ou pontos purulentos dessas regiões.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 04 – Coleta de secreção de orofaringe 1. nas amígdalas e na faringe posterior. 3. A urgência não é justificada apenas pela doença básica (faringite. glomerulonefrite e endocardite reumática. corar pelo método de Gram e observar ao microscópio com objetiva de 100x. Material para coleta .01 tubo de Stuart (meio de transporte) Procedimento: • Sentar o paciente e inclinar levemente a cabeça de modo a obter boa iluminação na cavidade oral.01 abaixador de língua .1 Bacterioscopia Após fixar o esfregaço.2. 2.02 lâminas para microscopia . Coletar também qualquer outro ponto de pus.01 placa de Agar sangue ou . introduzir o swab em um meio de transporte de Stuart. células e bactérias. potencialmente graves. de maneira rotatória.1. como febre reumática. uma vez que se faz necessária a terapia imediata. caso contrário haverá contaminação da amostra. Incubar em jarra com 5% de tensão de CO2 por 24-48 horas. Princípio Isolar bactérias patogênicas de secreção de orofaringe.01 swab estéril . Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Proceder a identificação baseada na morfologia das colônias e hemólise em Agar sangue. selecionar uma colônia da placa. fazer um esfregaço e corar pelo Gram. Isto pode gerar dificuldades na interpretação clínica do resultado. 7 . presentes na saliva e na cavidade oral (ex. Interferentes Qualquer antibiótico administrado previamente a coleta poderá fornecer resultados falso negativos. 4. este tipo de contaminante não deve ser valorizado em culturas de orofaringe. Observar ao microscópio. Atividade de quinta-feira: Após o período de incubação. A falta de uma técnica adequada de coleta poderá levar a uma contaminação da amostra por bactérias da microbiota normal. Entretanto.: Estreptococos do grupo Viridans e estafilococo coagulase-negativo). 13. Ligar a autoclave na temperatura Aguardar a saída contínua de vapor da Fechar a válvula de vapor. Abrir a autoclave. 18. 5. 9. máxima. mangueira. recipiente de autoclavacao 3. Uso da Autoclave 1. desejado 4. 16. microondas 6. 2. 12. de pressão chegar a zero. sem colocar o rosto em Retirar o material cuidadosamente. cima. Quando a pressão chegar temperatura média e marcar o tempo de 15. 1 atm (120oC). Colocar o material a ser autoclavado no Fechar a autoclave. 8 . 14.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 05 – Preparo de meios de cultura 1. respeitando a carga máxima. 17. Verificar se o nível da água cobre a resistência (a água deve tocar o fundo do cesto). cesto. Aguardar a autoclave atingir a pressão de a 1 atm. 7. baixar o termostato para a esterilização. 11. Abrir a válvula de vapor. Calcular a quantidade de meio necessária Pesar o meio de cultura e colocar no Medir o volume de água destilada Adicionar a água ao recipiente Dissolver com ou bastão de vidro e/ou no Autoclavar por 15 minutos a 120 0C a 1 Esperar esfriar (ficar morno) e verter nas placas. Desligar a autoclave e esperar o indicador Abrir a válvula de vapor. atm. 10. 8. : ácido. Identificar o microrganismo. gás +. Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Meio SIM Usar agulha Inocular em picada Usar a agulha . Incubar as provas de identificação a 35 ± 1 oC por 24 horas.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 06 – Identificação de Enterobactérias e Bacilos Gram-negativos não fermentadores Quarta-feira 1. Interpretar e anotar os resultados das provas bioquímicas. ácido.: inerte AA + . Usar a alça. Resu lt Motilidade Indol H2S Uréia Lisina Fenilalanin a Citrato Cresciment o a 42oC 9 . 3. Inocular em picada e na superfície do agar inclinado. Usar a alça. ácido. Usar a alça e soltar 1 a 2 colônias no caldo. H2S – AA + + : ácido. 2. Incubar no banho-maria a 42oC. gás +. Inocular em picada e fazer estrias na superfície inclinada. ácido. fazendo estrias. Inocular 1 a 2 colônias e cobrir o tubo com 3 gotas óleo mineral. Usar a alça. Cor verde escuro: positivo Cor do meio inalterada: negativo Azul: positivo Verde ou ausência de crescimento: negativo Turvação do caldo: positivo Ausência de crescimento: negativo Colocar uma colônia sobre a tira de oxidase Usar a agulha. Quinta-feira 1. Inocular a superfície do meio inclinado. Inocular a superfície do meio inclinado. Meio Citocromooxidase TSI Semeadura em provas bioquímicas Interpretação Como inocular Pigmento roxo: positivo Pigmento incolor: negativo KK .. 2. 3. H2S + KA + . Inocular a bactéria nos meios de identificação bioquímica e fazer a prova da citocromo-oxidase. fazendo estrias. gás +. Coloração rosa Pink: positivo Produção de pigmento negro no meio SIM Rosa: positivo Cor inalterada: negativo Fica amarelo e retorna a púrpura: positiva Amarelo: negativa Adicionar 5 gotas de cloreto férrico 10% na superfície. Colocar os resultados em tabelas de identificação bioquímica. Cada dupla receberá uma bactéria em Agar inclinado e deverá proceder a identificação do microrganismo. H2S – Visualizada no meio SIM Turvação ou crescimento difuso na picada: positivo Ausência de turvação ou crescimento difuso: negativo Adicionar 3 gotas do reativo de indol no tubo de SIM e aguarda 2 min.: ácido. Esquema Geral de Identificação 10 .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 DNAse Halo claro: positivo Sem halo: negativo Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Usar a alça. Adicionar HCL 1 N para proceder a leitura. fazendo uma estria. Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 1 . Módulo V) 11 . (ANVISA. Nível de complexidade 1.Consulta para identificação das principais Enterobactérias de importância clínica (%). Módulo V) 12 . Nível de complexidade 2.Consulta para identificação das principais Enterobactérias de importância clínica (%).Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 2 . (ANVISA. Motilidade positiva.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Esquemas de identificação de bacilos gram-negativos não fermentadores da glicose Tabela 1 . Oxidase-negativa.Bacilos Gram-negativos. TSI inerte 13 . Motilidade positiva. TSI inerte 14 . Oxidase positiva.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Tabela 2 – Bacilos Gram-negativos. 2. 15 . Observar as hemólises e características das colônias em agar sangue de carneiro 5%. 4. Catalase-positivos Inocular a colônia suspeita no plasma e incubar a 35 oC por 4 horas. Princípio Identificar os cocos Gram-positivos até o gênero: Staphylococcus. aureus. realizar uma bacterioscopia e depois a prova da catalase. Prova da catalase Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos. transferir uma colônia para a lâmina e emulsioná-la no peróxido c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO 3. pingar uma gota de peróxido de hidrogênio 20 volumes b) Com auxílio de uma alça. a) Em uma lâmina limpa. a formação de um coágulo indica um resultado positivo e identifica S. Após o período de incubação. Streptococcus e Enterococcus.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 07 – Identificação de cocos Gram-positivos 1. Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Esquema de identificação de cocos Gram-positivos de importância médica Identificação de Staphylococcus soagulase negativos (SCN) CAT Stap 16 . Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Identificação de Enterococcus 17 . 18 . Materiais inadequados . pela técnica de esteira. Tipo de amostra Urina colhida por micção (jato intermediário). possibilitando assim.Amostra em frasco não estéril . • Após a homogeneização da amostra. 2.Jato primário de urina (a não ser por solicitação médica) .Amostra colhida de bolsa coletora de pacientes sondados 5.1. a obtenção de colônias isoladas para contagem. 4. Semeadura e isolamento • Para a cultura quantitativa de urina utilizar a alça calibrada de 1 µl (1:1000) ou 10 µl (1:100). Estabilização e armazenamento A urina que não for transportada ao laboratório em até uma hora ou semeada dentro de duas horas após a coleta deve ser refrigerada até o momento da semeadura.2.Urina colhida com coletor e contaminada com fezes (bebês) . seguida de um estriamento perpendicular a esta estria inicial. Preparo da amostra Não é exigido 3. 24 horas.1. Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais que propiciam o desenvolvimento de patógenos de interesse em infecções urinárias e sua quantificação pela semeadura com alça calibrada. diferenciando infecção de colonização. no máximo. Metodologia 5. podendo permanecer nestas condições por. proceder a semeadura com alça apropriada em ágar CLED e ágar Mac Conkey. punção suprapúbica. Esta semeadura constará inicialmente de uma estria central na superfície do Agar. O objetivo é isolar e quantificar bactérias patogênicas do trato urinário. 2. Amostra 2. cateterização ou sonda uretral.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Aula 08 – Urocultura Roteiro de aulas práticas 1. • Analisar as características das colônias e proceder a identificação (Bacilos Gram-negativos ou Cocos Gram-positivos).000 UFC/ml Cultura negativa Contagem de colônias: zero UFC/ml 7. Interferentes O uso de antibióticos e diuréticos pode diminuir sensivelmente a contagem de colônias. Contagem de colônias • Caso seja utilizada a alça de 1 µl. Interpretação De acordo com o número de microrganismos isolados e sua quantidade. Incubar as placas a 35o C por 18-24 horas. 19 . Amostras não refrigeradas poderão apresentar um subcrescimento de bactérias contaminantes. “positivando” a cultura. 6.1. o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa. Modelo de resultado Desenvolvimento de Escherichia coli Contagem de colônias: Superior a 100.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 • Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 5. proceder a interpretação de acordo com a necessidade. multiplicado por 1000.2. O crescimento de uma ou duas espécies em contagem superior a 100.000 UFC/ml dever ser sempre valorizado (identificação + antibiograma). Amostras colhidas inadequadamente poderão apresentar contaminação bacteriana por microbiota normal da uretra e/ou vaginal.000 UFC/ml devem ser analisadas criteriosamente em cada caso. Desenvolvimento de três ou mais espécies em contagens inferiores a 100. • Caso seja utilizada a alça de 10 µl. multiplicado por 100. o número de UFC será dado pela contagem das colônias do mesmo aspecto na placa. 6. a refrigeração pode inviabilizar algumas cepas de Shigella. Hektoen e no caldo GN. 3. Homogeneizar por 2 minutos. conforme descrito a seguir. em meio de transporte. Princípio O crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais propicia o enriquecimento e o desenvolvimento de patógenos de interesse nas gastroenterites. A partir disto é possível a sorotipagem de bactérias enteropatogênicas (Salmonella. 3. caso necessário. Repicar do caldo GN para uma placa com XLD e incubá-la por 18 – 24 horas a 35oC. deixar secar e corar pelo método de Gram. Preparar uma suspensão em salina conforme dito acima. Metodologia 3.EPEC) presentes na amostra. Amostra Fezes recentes em frasco de boca larga estéril ou em meio de transporte ou swab retal em meio de transporte. coli invasora EIEC e E.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 09 – Coprocultura 1. 3. moldadas.4Semeadura e isolamento Proceder a semeadura direta por esgotamento no meio MacConkey.: diarréicas. Observar ao microscópio (10x) a presença de aglutinação. 2.3Bacterioscopia de Gram Realizar apenas quando solicitado pelo médico ou para a pesquisa de Campylobacter (presença de leucócitos e bacilos Gram-negativos curvos). 20 . E. ex. etc) das fezes (p. Identificar as colônias de interesse por meio de provas bioquímicas.2Exame microscópico direto A partir de um frasco sem meio de transporte realizar uma suspensão em salina sobre uma lâmina e observar a presença de leucócitos em objetiva de 40x. 1 gota do anti-soro e misturar com uma gota da suspensão bacteriana. Procedimento: Adicionar 2 – 3 colônias suspeitas a 1 mL de salina e homogeneizar bem. 3. Shigella. coli enteropatogênica . deve ser feito sob refrigeração por mais 24 horas. Entretanto. Sorologia: Após a leitura das provas de triagem. O armazenamento após a semeadura direta e enriquecimento da amostra. realizar a sorologia indicada. Colocar em uma placa escavada. Incubar as placas por 18-24 horas e o caldo GN por 4 horas (máximo 6 horas).1Exame macroscópico Anotar sempre o aspecto mucosanguinolentas. pode permanecer até 24 horas em temperatura ambiente. Estabilidade e armazenamento da amostra: A amostra. Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Anti-soros utilizados: Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 2) Salmonella polivalente somático e flagelar. Exemplos: “Não houve desenvolvimento de Salmonella. Caso a aglutinação se repita. Algumas cepas de EPEC podem apresentar aglutinação inespecífica com todos os antisoros (cepas autoaglutináveis). 21 . boydii. pois este prejudica a coloração e causa interferência no método. Nestes casos. “Desenvolvimento de Salmonella”. re-isolar as cepas e repetir a sorologia. 3) Shigella: S. S. dysenteriae. Interferentes A bacterioscopia não pode ser realizada com amostra em meio de transporte. Modelo de resultado Será relatada a presença ou ausência dos enteropatógenos aqui pesquisados. B e C 5) EIEC: polivalentes A e B 4. flexneri. conforme faixa etária (a EPEC só deve ser pesquisada em crianças até 2 anos de idade). 4) EPEC (crianças até 02 anos): polivalentes A. S. S. coli enteropatogênica clássica”. sonnei. 5. o resultado é inconclusivo. Shigella e E. A semeadura em grandes quantidades de amostra pode causar a viragem do pH dos meios e não permitir a obtenção de colônias isoladas. 2. • Puncionar a veia do paciente e coletar o volume de sangue recomendado (5 a 10 mL para adultos e 2 a 4 mL para crianças). Princípio O Objetivo da hemocultura é a realização do isolamento. Tipo de amostra 22 . incubar as amostras e observar uma a uma a cada 24 horas para pesquisa de hemoculturas positivas. identificação e antibiograma de bactérias que possam estar envolvidas em um processo infeccioso da corrente sanguínea. Mac Conkey. • No caso da detecção de hemocultura positiva (por turvação. Hemoculturas positivas: • Homogeneizar bem a amostra e. maior será a probabilidade do isolamento do agente etiológico causador da infecção. Incubar as placas a 37oC por 24 horas. • Caso haja crescimento.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 10 – Hemocultura 1. utilizando algodão embebido em álcool 70%. com auxílio de uma seringa de insulina. Deixar o álcool agir por 1 minuto. Quanto maior o número de amostras coletadas. coletar 0. Transferir uma gota para preparar lâminas para corar pelo Gram. Aula 10 . vácuo e CO2. Procedimentos: • Fazer rigorosa assepsia da pele do paciente. • Enquanto isso. observando-as a cada 24 horas. Amostra Tipo de amostra: Sangue venoso ou arterial. • No setor. Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias. O número de amostras varia conforme solicitação médica. grumos ou hemólise). permitindo assim o desenvolvimento da grande maioria dos microrganismos envolvidos em bacteremias. Após o término da incubação. Enviar o frasco para o setor.Cultura de ponta de cateter 1. Isto é possível através da incubação das amostras em caldos de enriquecimento na proporção de 1:10. para que haja diluição das prováveis substâncias inibitórias presentes no sangue. 2. friccionar um algodão embebido em álcool 70% na tampa de borracha do frasco de hemocultura. Tranferi-lo imediatamente para o frasco de hemocultura. Hemocultura negativas: Devem ser incubadas por 7 dias a 37oC. identificar a bactéria com provas bioquímicas e realizar o antibiograma específico para o patógeno isolado. Identificar o frasco. utilizando o Agar sangue. liberar o resultado da hemocultura como Negativo. O frasco de hemocultura contém ainda um anticoagulante (SPS).1 mL da amostra e transferir uma gota para Agar sangue. proceder da seguinte maneira. retirar a ponta de cateter do frasco e rolar o mesmo por toda a extensão da placa (4 a 5 vezes) • Incubar a 35oC por 24 horas. Exemplo: Microrganismo isolado: Staphylococcus aureus Contagem de colônias: 89 UFC/segmento Ou Não houve desenvolvimento de microrganismos. caso positivo.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Ponta de cateter. 4. Procedimento • Deixar a placa com Agar sangue a temperatura ambiente. 5. Interpretação Por estar em contato direto com a corrente sanguínea a colonização da ponta do cateter oferece risco eminente de disseminação destas bactérias para o sangue. • Com auxílio de uma pinça estéril (flambada e resfriada). Cateteres colonizados por 15 UFC ou mais constituem uma importante fonte de infecção. contar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de cada espécie (geralmente cresce um único tipo). • Confeccionar uma lâmina para Gram e proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada. • Observar se houve crescimento e. Modelo de resultado Deve-se relatar a bactéria isolada e o número de UFC encontrado. 23 . Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 3. incluir no laudo a seguinte observação: “Amostra não representativa do trato respiratório inferior. Princípio Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos. Sugerimos repetir exame. Incubar a 35oC por 24 horas. 2. aspirado traqueal. Dentre estes. Amostra Escarro Coleta: Expectorar a amostra de maneira que esta seja representativa do trato respiratório inferior Enviar o frasco para o laboratório dentro de 1 hora 3. 5. Metodologia BACTERIOSCOPIA • Observar a presença de leucócitos. leva a resultados mais conclusivos. observando rigorosamente as instruções de coleta”. células epiteliais e bactérias (fazer o Gram mesmo que o médico não tenha solicitado) • Observar em aumento de 10x. pesquisar principalmente microrganismos cuja patogenicidade é bem estabelecida neste tipo de material. os mais freqüentes são: Staphylococcus aureus: ++++ Pseudomonas aeruginosa: +++ Streptococcus pneumoniae: ++ Klebsiella pneumoniae: ++ Haemophilus influenzae: ++ 24 . Se for observada uma quantidade superior a 10 células epiteliais e/ou quantidade inferior a 25 leucócitos por campo (observar 10 campos). diferenciais e enriquecidos. o escarro não é o material mais representativo do quadro infeccioso do trato respiratório inferior. A análise microbiológica de outros materiais como lavado brônquico. SEMEADURA E ISOLAMENTO Semear em ágar chocolate. Agar sangue e Mac Conkey pela técnica de isolamento.1 Interpretação A cultura de escarro é de valor questionável. Para contornar o problema de contaminação com bactérias não patogênicas. Observar o crescimento e fazer uma bacterioscopia (Gram) das colônias de prováveis patógenos e proceder a identificação. Material inadequado Amostra contendo muita saliva 4. O Agar chocolate deve ser incubado em tensão de CO2. Resultados 5. que propiciem o desenvolvimento da maioria dos patógenos de interesse clínico nesse tipo de material. Por outro lado.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 11 – Cultura de escarro 1. Isto é devido ao fato deste material ser invariavelmente contaminado por bactérias da microbiota normal do trato respiratório superior. Atividade prática: Observe as lâminas de escarro coradas pelo Gram e.1 Tipo de amostra Aspirado traqueal 2. utilizando meios de cultura apropriados (Agar sangue. em UTIs). Agar chocolate e Mac Conkey) e um fluidificante. resultado não divulgado). adicionar 100 µl mais 900 µl de solução fisiológica estéril e homogeneizar bem (Diluiçã 1/10) Diluição final 1/20 • Inocular 1 µl e semear pela técnica de esteira.2 Coleta Coleta: procedimento médico 2. Observe cerca de 10 campos em aumento de 10x e faça uma média.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Moraxella catarrhalis: ++ Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas As bactérias acima descritas devem ser pesquisadas primeiramente na cultura do escarro de rotina. Contagem de Contagem de células leucócitos epiteliais Lâmina Lâmina Lâmina Lâmina Lâmina 1 2 3 4 5 Avaliação Bactérias Aula 11 – Cultura quantitativa de aspirado traqueal 1. classifique essas amostras em adequadas ou inadequadas. SEMEADURA • Homogeneizar bem a amostra • Misturar 1 mL da amostra com 1 ml de N-acetilcisteína 1% (fluidificante) (Diluição ½) • Da mistura anterior (Diluição ½). Amostra 2. de acordo com os critérios acima descritos. 2.3 Preparo da amostra BACTERIOSCOPIA Preparar duas lâminas diretamente do material e corar pelo Gram para avaliar a qualidade da amostra (controle de qualidade interno.000) 25 . exceto quando houver solicitação médica em pacientes gravemente debilitados (ex. Princípio Desenvolvimento e quantificação de bactérias Gram negativas e Gram positivas. (Diluição final: 1/20. Exemplo: “Desenvolvimento de Klebsiella pneumoniae Contagem de colônias: 1. contar todas as colônias e multiplicar por 20. (Exemplo: contagem de 50 colônias x 20. Proceder a identificação conforme o tipo de bactéria isolada.2 Modelo de resultado No laudo deve constar a bactéria identificada e o número de colônias contadas. Para calcular o número total de colônias por mililitro de amostra. nestes casos a contagem de colônias é geralmente baixa.000. “Não houve desenvolvimento de bactérias Contagem de colônias: zero UFC/ml”. 4.000 UFC/ml) O resultado será expresso conforme abaixo. Resultados 3.000 UFC/ml) Valor significativo para aspirado traqueal: 106 UFC/ml (1. 3. Fluxograma de processamento do aspirado traqueal 26 .000 UFC/ml”. Interferentes A presença de contaminantes do trato respiratório superior pode fornecer resultados falso-positivos. Entretanto.000 = 1.000. 5.1 Interpretação A quantificação de bactérias neste tipo de amostra é importante para estabelecer uma melhor correlação com uma infecção e descartar a probabilidade de uma contaminação pela microbiota normal.000.000. 3.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 • • • Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Incubar a 35oC por 24 horas Observar o crescimento e caso positivo anotar a quantidade de colônias de cada tipo e confeccionar uma lâmina das colônias de interesse para iniciar a identificação. Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 27 . citológicos e bioquímicos do líquor. Geralmente a concentração de microrganismos no líquor é baixa. daí a importância da concentração da amostra antes do processamento. Coleta da amostra: equipe médica especializada 3. Procedimento Avaliar em conjunto com a cultura os parâmetros físico-químicos. • Transferir a amostra para um tubo estéril. • Identificar por provas bioquímicas. • Após período de incubação. Quando houver pedido de citologia e bioquímica.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 12 . Dependendo do microrganismo presente. Exemplo de resultado: Cultura de líquor: “Desenvolvimento de Neisseria meningitidis”. Resultado O isolamento de qualquer bactéria é forte indício de meningite. O volume mínimo recomendável para o isolamento de bactérias é 1 mL. qualquer achado no exame bacterioscópico ou cultura deve ser considerado e criteriosamente reportado.000 rpm por 15 minutos. Princípio A meningite aguda é a principal manifestação de infecção do SNC e representa uma emergência médica. entretanto observar a correlação dos achados na cultura com características físicoquímicas. Liberar no laudo o gênero e espécie do microrganismo isolado. Por se tratar de um material estéril em condições habituais. • Centrifugar a 4. Amostra A amostra deve ser coletada em um tubo estéril e encaminhada ao laboratório a temperatura ambiente o mais rápido possível. 2. • Incubar as placas a 35 oC com 5% de CO2 por 24-48 horas.Cultura de Líquor 1. observar se há crescimento bacteriano. inocular em Agar chocolate e Agar sangue (pela técnica de isolamento) e prepara lâminas para corar pelo Gram. bioquímicas e citológicas do líquor é essencial. prazos superiores a 1 hora podem ser prejudiciais ao exame. o material deve ser primeiramente encaminhado a bacteriologia e depois aos demais setores. 4. • A partir do sedimento. 28 . porém volumes menores podem ser aceitos. pelo menos. 4.10. são colocados discos de papel. onde é semeada uma quantidade padrão de microrganismos em teste. • Incubar a placa invertida. A medida do halo de inibição e a comparação deste com uma tabela normatizada é que vai fornecer a susceptibilidade do microrganismo. • Ajustar a turvação da suspensão bacteriana para o equivalente do tubo 0. Entretanto. e o crescimento do organismo em teste fica inibido a uma certa distância do disco. de maneira que os discos fiquem a uma distância de. Princípio Observar a resistência ou sensibilidade que uma determinada cepa bacteriana apresenta frente a antimicrobianos. Ou. por 18-24 horas e proceder a leitura dos halos com auxílio de uma régua e tabela de interpretação. • Aplicar os discos na placa. Modelo de resultado Urocultura: Escherichia coli Contagem de colônias: superior a 100. Para a quantidade de colônias de 3 x 10 8 UFC/ml. com auxílo de uma pinça. Importante: Cultura pura 3. através de zonas de inibição de crescimento in vitro. é comum ocorrer discrepâncias entre as sensibilidades in vitro e in vivo. Na superfície de um meio de cultura. tocar umas cinco colônias bem isoladas da bactéria em teste e inoculá-las em solução fisiológica.Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 13 – Antibiograma 1. Procedimento • Com uma alça bacteriológica. 15 mm de distância (centro a centro). 2. impregnados com concentrações conhecidas de antibióticos. retirar o excesso nas paredes do tubo e semear na placa de Mueller-Hinton pela técnica de “8 direções”. Cabe ao clínico perceber as situações e tomar as devidas providências. • Embeber um swab no caldo inoculado. (Se der > 0.000 UFC/ml Antibiograma: 29 . a absorbância deve estar entre 0. Amostra Colônias previamente isoladas do microrganismo a ser testado.08 e 0. se der < 0.08 = acrescentar mais colônias).5 de Mc Farland com boa luminosidade contra um fundo branco com listras negras. pode-se utilizar o ajuste visual. comparando-se com uma escala de 0. a 625 nm.10 = diluir adicionando mais salina.5 da escala de Mac Farland. 5. O ajuste é feito em espectrofotômetro. A seleção dos discos a serem utilizadas depende da bactéria testada (consultar manual do CLSI). É então formada uma concentração em gradiente pela difusão do antibiótico no Agar. Interpretação A determinação do perfil de susceptibilidade de uma bactéria pode fornecer um auxílio muito importante para o clínico. utilizando um tubo de solução fisiológica não inoculada para “zerar” o aparelho. Norfloxacina Resistência a: Não houve resistência aos sais testados. Sensibilidade a: Amicacina. Gentamicina Sensibilidade reduzida a: Ciprofloxacina. Imipenem. 30 .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Cefrtiaxona. Nitrofurantína. Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Bactéria testada: _____________________________________________________ Antibiótico Classificaçã o CLSI Medida do halo (mm) Classificação (S. I ou R) 31 . Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 32 . Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas 33 . óculos e luvas. até a emissão de vapores. secreção muconasal.1 Tipo de amostra: Escarro. outras bactérias podem apresentar álcool-ácido resistência parcial ou total (Ex. Carmen Paz. 3. Amostra 2.Além das micobactérias. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color. 2000. linfa. até que toda a fucsina seja eliminada.Descorar com álcool-ácido. .Preparar o esfregaço do material e fixar com calor. são chamadas de álcool-ácido resistentes. as micobactérias resistem ao descoramento por solventes orgânicos fortes (como o álcool-ácido) e. LCR. fezes. Princípio A parede celular das micobactérias.Cobrir com azul de metileno (coloração de fundo) por 2 minutos. Interpretação A observação de bacilos álcool-ácidos resistentes (coradas em rosa) é altamente sugestiva de micobactérias.Secar e observar ao microscópio com objetiva de 100x (imersão). ..Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 5 minutos. 34 . aspirado traqueal. Buenos Aires: Panamericana. . leprae os mais frequentes. uma vez coradas.Riscos na lâmina podem ser confundidos com BAAR se o observador não tiver muita experiência. Interferentes . urina. Nocardia. São Paulo: Sarvier. 4. devido ao seu alto conteúdo lipídico. OPLUSTIL. secreção traqueal. Elmer W. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. lavado brônquico. Entretanto. por isso. 254 p. 2. Esta coloração é realizada para detectar a presença e evidenciar as características morfológicas e tintoriais dos Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR).Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 14 – Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR) 1. . 1999. Outras micobactérias também são álcool-ácido-resistentes. 1432 p. aquecendo-a por duas vezes durante este período. Não deixar ferver. Metodologia . . lavado bronco-alveolar. As amostras de vias aéreas superiores deve ser manipuladas com máscaras. 5. Rhodococcus) Referências: KONEMAN. apresenta resistência a coloração. sendo o Mycobacterium tuberculosis e o M. líquidos estéreis em geral. 1. selecionar os sítios de coleta .Disciplina de Microbiologia Clínica VIII Nível / 2010 Profa Daiane Bopp Fuentefria Roteiro de aulas práticas Aula 15 – Coleta de linfa do lóbulo da orelha e/ou dobra do cotovelo. Técnica de Coleta de Material para Baciloscopia: • • • • • • • • receber o paciente e explicar sobre o exame. Espalhar circularmente e cuidadosamente até obter os esfregaços homogêneos com 1 cm de diâmetro. usar lâminas de vidro novas e limpas . demarcar as lâminas do lado que serão feitos os esfregaços. fazer assepsia. 35 . Corar as lâminas com Zhiel-Neelsen (BAAR) e observar ao microscópio para pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes. sem sangrar. usar uma lanceta para cada paciente. identificá-las com o nome do paciente e o local da coleta. colocar o material coletado na lâmina previamente demarcada. fazer boa isquemia com a pinça de Kelly e a incisão.