Resumen Final Instrumental

Análisis InstrumentalCompilado Teórico Análisis Instrumental - Compilado teórico Abril 2011 - Versión 1.0 - por Biam! Agosto 2011 – Versión 1.1 – por Biam! Cursada 2do cuatrimestre 2010 Docentes Módulo Analítico: Tudino, Mabel Beatríz Módulo Orgánico: Burton, Gerardo – Erra Balsells, Rosa Módulo Biológico: Corton, Eduardo – Nesse, Alcira Beatríz 1 Análisis Instrumental Compilado Teórico Abril 2011 – Versión inicial. Agosto 2011 – Corrección de errores ortográficos – Citometría de flujo (agregado). 2 Análisis Instrumental 1. Compilado Teórico MÓDULO ANALÍTICO ................................................................................................................................................... 7 1.1. Introducción................................................................................................................................................................. 7 1.1.1. Parámetros de calidad de un método analítico .................................................................................................................................................. 7 1.1.2. Instrumentos para el análisis........................................................................................................................................................................... 7 1.1.2.1. Dominio de los datos................................................................................................................................................................. 7 1.1.2.2. Ruido instrumental ..................................................................................................................................................................... 8 1.1.2.3. Fuentes de ruido instrumental.................................................................................................................................................. 8 1.2. Introducción a la espectroscopía óptica ...................................................................................................................... 9 1.2.1. Propiedades ondulatorias de la radiación electromagnética ................................................................................................................................ 9 1.2.2. Emisión de radiación ...................................................................................................................................................................................... 9 1.2.3. Absorción de radiación.................................................................................................................................................................................. 10 1.2.4. Absorción atómica ........................................................................................................................................................................................ 10 1.2.5. Absorción molecular...................................................................................................................................................................................... 11 1.2.6. Aspectos cuantitativos de las medidas espectrométricas ................................................................................................................................... 11 1.2.7. Instrumentación para espectroscopía óptica..................................................................................................................................................... 12 1.2.7.1. Fuentes de radiación ................................................................................................................................................................ 12 1.2.7.2. Selectores de longitud de onda............................................................................................................................................... 13 1.2.7.3. Recipientes para la muestra..................................................................................................................................................... 15 1.2.7.4. Detectores de radiación ........................................................................................................................................................... 15 1.2.7.5. Procesador de seña y dispositivos de lectura ....................................................................................................................... 17 1.2.8. Diagramas de niveles de energía..................................................................................................................................................................... 17 1.2.9. Ancho de las líneas atómicas......................................................................................................................................................................... 18 1.2.10. Efecto de la temperatura en los espectros atómicos .......................................................................................................................................... 18 1.2.11. Introducción de la muestra............................................................................................................................................................................. 19 1.2.11.1. Introducción de la muestra en disolución ............................................................................................................................ 19 1.2.11.2. Introducción de la muestra en sólidos .................................................................................................................................. 20 1.3. Absorción y fluorescencia atómica.............................................................................................................................. 21 1.3.1. Técnicas de atomización ................................................................................................................................................................................ 21 1.3.1.1. Atomización con llama ............................................................................................................................................................ 21 1.3.1.2. Atomización electrotérmica .................................................................................................................................................... 22 1.3.2. Fuentes de radiación...................................................................................................................................................................................... 23 1.3.2.1. Lámparas de cátodo hueco ..................................................................................................................................................... 23 1.3.2.2. Lámparas de descarga sin electrodo ...................................................................................................................................... 23 1.3.3. Modulación de la fuente ................................................................................................................................................................................ 24 1.3.4. Espectrofotómetros......................................................................................................................................................................................... 24 1.3.4.1. Instrumentos de haz sencillo .................................................................................................................................................. 24 1.3.4.2. Instrumentos de doble haz ..................................................................................................................................................... 24 1.3.5. Interferencias en espectroscopía de absorción atómica....................................................................................................................................... 24 1.3.5.1. Interferencias espectrales ........................................................................................................................................................ 25 1.3.5.2. Interferencias químicas ............................................................................................................................................................ 26 1.3.5.3. Aplicaciones de la espectrometría de absorción atómica................................................................................................... 26 1.3.5.4. Limites de detección ................................................................................................................................................................ 26 1.3.6. Técnicas analíticas en absorción atómica ........................................................................................................................................................ 26 1.3.6.1. Preparación de la muestra ....................................................................................................................................................... 26 1.3.6.2. Curvas de calibración ............................................................................................................................................................... 27 1.3.7. Espectroscopía de fluorescencia atómica.......................................................................................................................................................... 27 1.4. Emisión atómica .........................................................................................................................................................27 1.4.1. Espectroscopía de emisión con fuente de plasma.............................................................................................................................................. 28 1.4.1.1. Fuente de plasma de acoplamiento inductivo...................................................................................................................... 28 1.4.1.2. Fuente de plasma de de corriente continua.......................................................................................................................... 29 1.4.2. Espectrómetros con fuente de plasma.............................................................................................................................................................. 29 1.4.2.1. Espectrómetros secuenciales .................................................................................................................................................. 29 1.4.2.2. Espectrómetros multicanal ..................................................................................................................................................... 30 1.4.3. Aplicaciones de las fuentes de plasma ............................................................................................................................................................ 30 1.4.3.1. Preparación de la muestra ....................................................................................................................................................... 31 1.4.3.2. Elementos susceptibles de determinación............................................................................................................................ 31 1.4.3.3. Selección de la línea analítica .................................................................................................................................................. 31 1.4.3.4. Curvas de calibrado .................................................................................................................................................................. 31 1.4.3.5. Interferencias............................................................................................................................................................................. 31 1.4.4. Espectrometría de emisión con fuentes de arco y chispa ................................................................................................................................... 32 1.5. Luminiscencia molecular ............................................................................................................................................32 1.5.1. Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia.................................................................................................................................................... 32 1.5.1.1. Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia...................................................................................... 32 1.5.1.2. Diagramas de niveles de energía para las moléculas fotoluminiscentes .......................................................................... 33 1.5.1.3. Velocidades de absorción y emisión...................................................................................................................................... 34 1.5.1.4. Procesos de desactivación ....................................................................................................................................................... 34 1.5.1.5. Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia ........................................................................................... 35 1.5.1.6. Espectros de excitación y emisión ......................................................................................................................................... 37 1.5.2. Instrumentos para la medida de la fluorescencia y fosforescencia...................................................................................................................... 37 3 ......................................................................................................5...........................................1.............2............................................................................................ 53 1....................................1.............................................................. 65 1.........................4.. 40 1.9........................................... 49 1.... 44 1........................................................................................................................................ Corrientes polarográficas......................................................................................................................................................................................................................9...............8.. Eluyentes típicos ...........9...............................................2................................................3..............................................................................2........................................................................ 43 1.............................9...........................................................................................................7....................................9................................. 54 1..........9.......................................... Resumen de parámetros y ecuaciones .... Velocidad de migración de los solutos ..............................8................. Aplicaciones de la cromatografía líquida de alta eficiencia .............................................. Cromatografía de elución en columna.................................. 59 1.................................................................... Ventajas del electrodo de gotas de Hg .....1........3..............................................................................................6................................. 59 1....................5.....................1.............................6......... 58 1................................................. 45 1...................................... Columnas abiertas .................................................4.. Corriente de difusión en los electrodos de gotas ..................................................................... Diseño de instrumentos ......... Instrumentación en voltamperometría................................ Eficacia de la columna en la cromatografía de líquidos.......9.................................................................................................................. 56 1..............................................................................................9.......................... 65 1...................................................................................7.......................................................................... Efecto del tamaño de las partículas en la eficacia de la columna ......................6................................. Perfiles de concentración para electrodos planos en disoluciones no agitadas................................................................. 64 1..6........................................................................................................................................................................1.....8..9................................................................................................ Cromatografía gaseosa .............................................................................. Columnas rellenas............................................................................................... 51 1........3.... Variables que afectan la eficacia de una columna.............................................................................................................................................................................. Cromatografía líquida de alta eficacia ............................................................................................. Voltamperometría...................9............................8..........2.............................................................. Voltamperometría hidrodinámica..........3.................2.......... Efectos de las velocidades de migración y del ensanchamiento de banda sobre la resolución ................................5..............................6......4......................2....................... Fase estacionaria ......... 47 1..5.............................. Separación isocrática y con gradiente ..1.......5............................................................................... 43 1...............2...................................................... Cromatografía de intercambio iónico ........................................................................................................................................................... 44 1......1....... Componentes de los fluorímetros y los espectrofluorímetros......... 58 1.................................... Polarografía de barrido lineal.....................................................................7................................................... 56 1.............................................. 59 1........... Cromatogramas.........4............ 49 1.................... 59 1.......... Sistema de inyección de muestra.............. 44 1................ Dilución del analito ........ Configuración de la columna y del horno para la columna ..................................................7....................................... 37 1...........6............2...................................................................................................................8................................ Sistema de bombeo ..................... Polarografía .........................3.........7...................9......................................................................8..................6.........4...................................................4........................... Voltamperogramas .....1........................ 39 1..... 62 1................ 46 1.....7........... 49 1............ Materiales de soporte sólidos.............. Influencia del caudal de la fase móvil..............1................4............. Sistema de inyección de muestra.................2.....1..............6.... 64 1............................1........................... Ondas de oxígeno...................5.39 1.....................................................3.......... Introducción a las separaciones cromatográficas ............................................................7...........5.9............. Cromatografía de adsorción ........................... 62 1.............8....2.......................................................2....................5...... Rellenos de intercambio iónico ....... Aplicaciones... 51 1................................... 63 1......................................................................... 65 1...................... Columnas y fases estacionarias para cromatografía de gases.......7. Instrumentación para cromatografía de líquidos .........2..........................................6...........................2................8..........................9......9.4...................................... Corrientes residuales . Ensanchamiento de banda ................................................................................................8....................... 41 1................................................... Columnas para cromatografía de líquidos ............. 61 1.......................................8.......2...........3............................................... Cromatografía de reparto......................7................ 58 1..................................................................................... Polarografía diferencial de impulsos.....2.........................................................................................................5...........................6.............................................................................6...9.................................. 66 1.......5.1.......2............ 51 1.................1...........................................................1............. 45 1................... Eficacia de la columna ...................................53 1................................................................1......3............7...........................1.............8. 61 1..........7..................................................................................................3. Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografía de líquidos ...................................................9......... 59 1............................. 52 1.......................... Efecto del tamaño de las partículas del relleno ...................... 61 1............................................... Perfiles de concentración para microelectrodos en disoluciones agitadas ....2.................................................4..............................1............. 52 1......................7......................6............................... Aplicaciones de la cromatografía de reparto............................ 41 1...9....................... 54 1.....................................................6.........4.....................2...................................................................................................................................................................................................... Instrumentos para la cromatografía gas-líquido...........................9...5................................. Métodos para describir la eficacia de la columna ........................4....................................... 54 1................................................................................................2........................................................2..............................................................................6....................... 62 1................................ Optimización del eluyente.8..........................4...............8...............................8..... Métodos polarográficos y voltamperométricos de impulso .................................. 54 1.........3............................... 64 1...... Detectores........6..........................................................................3......................8...................................................8......................Análisis Instrumental Compilado Teórico 1........................................8............6.............4...... Sistemas de detección ....................................................................6........5........6.....................8...............................................................................4..................7..........................3.....................7..............2..7............................................... 60 1......................................................... 58 1...................................................................... 37 1................... Cromatografía iónica con columnas supresoras............4..............4......................................3.......................................................................................4.48 1......................................................................60 1...........................7.................................................................................................2....................................................................................... 40 1..4............................................................................................................6........................................................................... Relación entre la altura de plato y las variables de la columna......1....... 55 1. 44 1. Microelecrtrodos...................2........ 41 1..............1............ 56 1.................................... Clasificación de los métodos cromatográficos en columna ..... El problema general de la elución .......... 64 1............ 55 1.......................................................................................................8.............. 66 4 ... 46 1................ Definición de altura de plato ............... 48 1.................................8.......2......................................................3........... 41 1..............6.... Señal de excitación en voltamperometría ................................. La forma de los picos cromatográficos........................................1.3....................................1.......9.....................................4........................................6............................................................................... 65 1.............2.........2.. 49 1....... Aplicaciones orgánicas y bioquímicas de la cromatografía iónica ....................2................................................. Desventajas del electrodo de gotas de Hg....4................ Voltamperogramas para mezclas de reactantes .....3............1.....6.. Gas portador ..................................2..... Resolución de la columna................8......................................2.......................................................................9........................................................... 43 1....................8......2.........................................................3...............4.........................................5..... .........................................1..................... Utilidad de PFGE............2.............................4.........10...................... El sistema rotante ..............1.....................................1.. Bibliografía usada ................ Tipos de microscopios ................ 79 2........................1......................... Tiempo de relajación spin-spin (T2) ..................................................1.......................................................................................................................2.................................... 87 2.................................................................... Desacoplamiento spin-spin ....................................................................................................................................1. El origen del acoplamiento escalar .. 78 2.........2....................................... Efectos paramagnéticos.................................................... Otros efectos ................................................1......3... 97 3....................................................................86 2............................... Efecto Overhauser nuclear..1................1.1..2......................................................................1................................................1...................................................................... 85 2............. 102 3....................................................10......2............................................ 81 2........2................................................... Procesos de relajación............10..................................................................4................................................................................................1............................................... Efectos de grupos vecinos ...................................................................................................................................................................................................1..............1.........................................10.........................2........................................................................................ 103 3.2..........1............. Equivalencia magnética..........2......... 94 3................... 74 2...................... 104 3...............................1......................5.................................................................... Introducción .......................... Secuenciación genética .................................9.............................................................1.................................................99 3.................. 79 2..................5.................. 66 1.................... 85 2......................... 86 2................................... Resonancia magnética nuclear ...9.... Parámetros ópticos ....................................... 83 2. Electroforesis en geles de agarosa.....1.......................... 70 2.2...................................................... 78 2............................................7... 77 2..........8........................................3......................... Introducción ......................................................................... 74 2...........................................................1........2..................................................2....................................... Efectos del equilibrio conformacional...........................................................2...............................................3..........................................................................................2.......................1. Bibliografía usada ............................3.................................. Factores que afectan la electroforesis... La escala del desplazamiento químico.............. Magnetización macroscópica................................................... 85 2..6....................................................................................2.......... 82 2..........2......... Desplazamiento químico ..................1.............................................................................. Relajación spin-red ......................... Principio de funcionamiento............................ El modelo vectorial........... 103 3.....................................................................................................................................................6...................................2......2... Microscopios ópticos .............................. Estructura y síntesis de la matriz del gel ... Electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)..... MÓDULO BIOLÓGICO ........................................................7....1........................... 101 3....... Efecto de la relajación en los espectros ..................68 2........... Sistemas fuertemente acoplados .......... Núcleos equivalente........... Métodos de redisolución .......1...............1...................... Efectos diamagnéticos ....................................................................1..................................................................................1.. 77 2..................... Relajación spin-spin..................94 3................................2........................................................................................................2.....................1.............................................. 70 2...... 86 2................................2............................................................ 92 2....................................................................................1.................. Componentes de un espectrómetro de masa ............................................2............................................................................................. Características de los sistemas en PAGE .......................1..............4........3....................................................................4.........................10....................................... 90 2...........2.............10............... 83 2.................................................................................................................2..............5.......................... 100 3......1................................................................... Otros procesos de relajación .........1........ Componente de un microscopio........1.... Tiempo de relajación spin-red (T1) ...................................................................................... 78 2............................... 75 2......6.................................1......2.................................... 95 3................................................................................................ 94 3............11.................................................................4........................................................... Equipo para PFGE ................................................................................. 103 3................... 99 3..........................................12..........2..........2.... Electroforesis.................................................................................................................................1....................... Determinación del tamaño molecular con SDS-PAGE .........2...........................................................................................................................................................1.....10...........93 3...........9.................................................................................................. 81 2.................2................. Momento angular y magnetismo nuclear .................................................................................. Porosidad del gel...................1..........2.........1.............................................................................9............................................................................................................Análisis Instrumental Compilado Teórico 1........................................3.. Electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE).................................................................. 70 2....................................................................................2................1.......................................2. 71 2... 66 1............................................................................................... 68 2..................1...................... Microscopios electrónicos............................... 84 2... Microscopía...............................................2............................ 98 3..................................3.....67 MÓDULO ORGÁNICO .............................................................................................. Espectroscopía RMN......2.......................................... 69 2.....................................3................................................................................................ 71 2................ Polarografía de onda cuadrada ...... Analizadores ............................................................................................................................................................2........................................................2...........................................................2....................9.................................................2....................... 68 2........1........ 72 2.....................................................................................................1....................................................................................................................................................................................................2.....................2................................ Apantallamiento nuclear............................................................................................................................................................................................................................................. Aplicaciones... Espectrometría de masa............. 2............................................... 71 2................................................2.................... 104 5 .................4..........7.................. 68 2..........1............................3...............2.......1...............2.............................................1.............................. 79 2................................................................1......................................................... Escala de tiempos de la RMN...................5....... Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) ...................................................1.............................................1.....................................4.............................................................................................................................................................5............. Ventajas y desventajas de los geles de poliacrilamida ..................1.. El origen de los desplazamientos químicos................ 80 2.................................................................................................................2......................... Cámaras de volatilización e ionización.................................10...... 101 3.......... 94 3.............3..................................6............................................................................................ 102 3........................... 97 3...................................................................... Diagramas de energía ......................................................................................4......................4. 104 3.............................................1...........................1..........2.............2........4........................................................................................2..........6......................................... Interacción Spin-Spin.....1..........2... 100 3................................................................................................................................1........................................2...................................................................................................................................................................................1...........2........................................................... .................................................5............................2....................1...................................................4.................................................................................................... 115 Características de la interacción antígeno anticuerpo.............................8..................................................................................................................................................... Electroforesis Rocket................................................. Biosensores piezoeléctricos........................... Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ...............5................................ Tipos de biosensores .....3........... 117 3................. Citometría de flujo..... 118 3......3.........................................4......................................3........................................................2....................................................................................... 105 3.......................2...................................................... 106 3............ Tipos de electroforesis capilar ........7................................4.................................. 106 3.......................................................................................................3..........................2............6........................... Métodos de inmovilización del material biológico.............................. 112 3....... 115 Ensayos basados en el uso de anticuerpos............... 113 3.................4....................3.........................................................6......................2.......................... Prestaciones de los Citómetros de Flujo..1...... 107 3.2.....2.............................................................................4........... Ventajas y aplicaciones de IEF.............................. Ventajas y desventajas de la electroforesis capilar.............7................. 107 3....................... Biosensores termométricos...............................................................................................6................................1................. 105 3............................................................................................. 3.............................................................. 122 6 ........................5......................................................................................................... 121 3.................................... 114 Terminología........5...................................................................................................... 116 Inmunosensores ......................................................................................................4.................... ..........................................................................1.............3......................................... 112 3..................................6..................4.......... 118 3................................................... 108 3.....................................4...............................................6.......... Biosensores ópticos.......................................................................................................7.................................................................5.........................................................2............................................................. 117 3...................................2...........................................5......... Separación de ADN con electroforesis capilar........5.....................................6....................................................4...................4.....................................................2............................................... 114 3.............................. 110 Controles positivos y negativos ..........................7......................................... 3.. 117 3..........................................................2..........................................................................................5.................. .......................................................................................................... Estándares y controles.................................................... Medios soporte para IEF ....................................................................5...............2.....5............................................... Aplicaciones de PFGE ............... 111 PCR en tiempo real ............................... Inmunodifusión ............... Bibliografía usada ....................5........................ Transductores térmicos .... Incremento de la relación señal/ruido ............................................................5....7............1................................................7.............................................5............................ Propiedades deseables de un biosensor ........................ 114 3.......... 3.... Principio ................ 3.....2..........4................................................................ Poder resolutivo de IEF .............................................4..................................................... 3.......................................... 113 3........................... Biosensores......................6...............5..................................................3.................................................... Marcadores fluorescentes................. 107 3.....1...........................................................................................................................................Esquema general de la PCR...............................2...............................................................5.......................2..........................................2.....................2......................................... 112 3................... 3...........6................................. 107 3..............2......6......3........................................4.......................................................................................2.......................................................................2.............................................................................................................................................................................. 111 Biosensores y técnicas bioanalíticas ......6...................................................................... 110 Limitaciones y requerimientos............................ 3......5......................................................................... 117 3.................................................................... Gradiente de pH .......................................................................................................................... Determinación de pI ...............................................................3................................... 120 3..................................... 115 Anticuerpos: producción y marcado.....................................4................4.............................................................................2.......... Fluorocromos en el análisis de ADN......................2..............5......1.....2.......3....................................... 105 3........................1.....................................5...............................................................................................4....................6........................................... Condiciones de la electroforesis capilar..5.........................................................................................................................3.......................................................................................... 109 Ciclo de amplificación .......................................................... 115 Uniones no covalentes en la interacción antígeno-anticuerpo.....4..... Inmunoelectroforesis............................................. 3......... 114 3.............................Análisis Instrumental Compilado Teórico 3................................................. 112 3............................................................................................................. Detectores..............4............................................... Flujo electroendosmótico (o electroosmótico)......................... 112 3........7...............1........................... Isoelectroenfoque (IEF) .....................2................................................6................................. 3...... 109 Características deseable de PCR...... Aplicaciones.................................................................................................... 105 3............. 120 3...................6......................................................................... 119 3..................................... 106 3... 3........................................................................ Inmunoelectroforesis bidimensional ................................ 118 3..5.................6.................................... 106 3..3....................... 3......................... Componentes básicos de un citómetro de flujo .6....... 3.....................5........................................................ 3..2......................................... Factores que afectan la resolución de PFGE........ 119 3..................... 113 3.......................................2..................................................................... Parámetros medibles en citometría de flujo ........................... 104 3..............6.................................... Biosensores enzimáticos........................6.......................................5...... 104 3...................................................... Ventajas de los biosensores................................. 105 3.......... Fluorocromos ...................................................................................3......... Electroforesis capilar .....................3...............................................................................................................3.......7...........5.......5....................................................................4...... 108 3.................................................................6.............................4................... 108 Reactivos para PCR ..6........................................3............ 107 3.........4.............5...............................7.......................................................................................2...................................................................................... 105 3..................................................................................................2.....6................................... Inmunoensayos ..... Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. de detectores sensibles y de dispositivos de lectura permite el uso de instrumentos electrónicos que recogen información en do- 7 . Los diferentes modos de codificar la información en forma eléctrica se denominan dominios de los datos. Instrumentos para el análisis Un instrumento para el análisis químico transforma la información relacionada con las propiedades físicas o químicas del analito en información que pueda ser manipulada e interpretada por un ser humano.: medir un volumen de una solución con una bureta -entra una muestra y sale un número.). Parámetros de calidad de un método analítico 1.2.1.poner una muestra en una balanza mecánica. Módulo Analítico 1. o se transforma de un sistema de información a otro como una señal eléctrica.2.1: Diagrama de bloque que muestra el proceso completo de una medida instrumental. etc.1. un instrumento analítico puede considerarse como un dispositivo de comunicación entre el sistema objeto de estudio y el científico. 1. Por tanto.1.1. Para estudiar cómo funcionan los instrumentos es importante entender la manera en la que se codifica la información. La aparición de procesadores de señales electrónicas.1. 1. Fig. Dominios no eléctricos y eléctricos El proceso de medida comienza y termina en dominios no eléctricos (Ej. Dominio de los datos En el proceso de medida colaboran una amplia variedad de dispositivos que transforman la información de una forma a otra.1. Introducción 1. El ruido de cada componente puede ser distinto y provenir de distintas fuentes. celdas electroquímicas. El resultado numérico final debe ser proporcional a la propiedad física o química inherente al analito. condensadores. Ruido de parpadeo Se caracteriza por tener un valor inversamente proporcional a la frecuencia de la señal que se observa. 8 .3. Las señales digitales pueden transmitirse con un mayor grado de integridad que las analógicas y son compatibles con las computadoras y por lo tanto pueden procesarse con el uso de un software adecuado. Sólo desaparece en el cero absoluto.Análisis Instrumental Módulo Analítico minios no eléctricos. Señales (dominios) analógicos y digitales La señal de salida de la mayoría de los transductores usados en los instrumentos analíticos es una seña analógica.2. Para aprovechar las ventajas de la electrónica digital es necesario transformar la señal analógica en digital. una lleva la información acerca del analito y la otra (ruido) está compuesta por información ajena y no deseada porque degrada la exactitud y la precisión de un análisis a la vez que aumenta el límite inferior de la cantidad de analito que se puede detectar. la señal analógica se convierte en digital mediante la adquisición y el registro a intervalos regulares de tiempo de la salida analógica. Fuentes de ruido instrumental El ruido se asocia a cada componente de un instrumento: la fuente. 1. Ruido de disparo Se origina siempre que exista una corriente que produzca el movimiento de partículas cargadas a través de una unión.1. En los instrumentos modernos.2. etc. el transductor de entrada. Estos sucesos cuantizados se producen al azar y la velocidad de los mismos está sujeta a fluctuaciones estadísticas. Ruido instrumental Cada medida analítica consta de dos componentes.2. que a su vez crean variaciones de voltaje que aparecen como ruido en la lectura. Ruido térmico Se debe a la agitación térmica de los electrones u otros portadores de carga en las resistencias. se lo denomina también ruido 1/f.1. Por lo que el ruido observado es una mezcla compleja. 1. Este movimiento aleatorio origina periódicamente heterogeneidades de carga. Las corrientes implican la transferencia de electrones individuales a través de la unión. Fig. Gran parte de estos ruidos se producen debido a que cada conductor de un instrumento es una antena potencial capaz de captar radiación electromagnética y convertirla en una señal eléctrica.2: Representación gráfica de la respuesta de un detector en función del tiempo para la misma señal (a) en forma analógica y (b) en forma digital. Ruido ambiental Es una mezcla de los ruidos provenientes del entorno. 1. Es significativo para frecuencias menores que 100Hz. El ruido es la desviación aleatoria ajena y no deseada que degrada la exactitud y aumenta el límite de detección. todos los elementos que tratan la señal y el transductor de salida. la procesan en dominios eléctricos y la representan en dominios no eléctricos nuevamente (entra una muestra con una propiedad dada del analito y sale un resultado numérico final). 3: Esquemas representativos de los principios de emisión. 1. 1. La fuente del espectro de bandas consiste en pequeñas moléculas o radicales. Los tres tipos de espectros se ponen de manifiesto en la figura: de líneas. La figura 1. Finalmente. como la transmisión.2.1. con oscilaciones sinusoidales en ángulo recto de uno respecto a otro y respecto a la dirección de propagación. que generalmente toma la forma de una representación grafica de la potencia relativa de la radiación emitida en función de la longitud de onda o de la frecuencia. solo se considerara la componente eléctrica de la radiación. la reflexión.4 muestra un espectro de emisión típico. Emisión de radiación La radiación electromagnética se origina cuando las partículas excitadas (átomos. 1. ya que el campo eléctrico es el responsable de la mayoría de los fenómenos que interesan. Propiedades ondulatorias de la radiación electromagnética La radiación electromagnética se representa como un campo eléctrico y otro magnético que están en fase. Fig. absorción y fluorescencia. 9 .Análisis Instrumental 1. El espectro de líneas esta formado por una serie de picos agudos y bien definidos originados por la excitación de átomos individuales.2.2. iones o moléculas) se relajan a niveles de menor energía cediendo su exceso de energía en forma de fotones. la parte continua del espectro es consecuencia del aumento del ruido de fondo que se evidencia por encima de 350 nm aproximadamente.4: Espectro de emisión de una salmuera obtenida con una llama de oxígeno hidrógeno. La radiación emitida por una fuente excitada se caracteriza adecuadamente por medio de un espectro de emisión. Módulo Analítico Introducción a la espectroscopía óptica Los métodos espectroscópicos ópticos se fundan en: x Absorción x Fluorescencia x Fosforescencia x Dispersión x Emisión x Quimioluminiscencia Q hν EMISIÓN hν Q ABSORCIÓN hν FLUORESCENCIA Fig. El espectro de bandas consiste en varios grupos de líneas tan estrechamente espaciadas que no se llegan a resolver completamente. de bandas y continuo. Los espectros de líneas y de bandas están superpuestos al espectro continuo. Se dice que la radiación está polarizada en el plano cuando todas las oscilaciones tanto del campo eléctrico como del magnético están en un solo plano. la refracción y la absorción. 1. En la mayor parte del resto del texto.2. 2. La radiación térmica de esta clase. o estado fundamental. 1. y el espectro consiste en una serie de líneas agudas con anchuras de 10-4 Å aproximadamente. iones o moléculas que componen la muestra. La absorción provoca que estas partículas pasen de su estado normal a temperatura ambiente. Fig. La relativa simplicidad de dichos espectros se debe al pequeño número de posibles estados de energía de las partículas absorbentes. el estudio de las frecuencias de la radiación absorbida proporciona un medio para caracterizar los componentes de una muestra. la energía de los fotones excitadores debe coincidir exactamente con la diferencia de energía entre el estado fundamental y uno de los estados excitados de las especies absorbentes.2. a uno o más estados excitados de energía superior. La radiación del cuerpo negro se produce por innumerables oscilaciones atómicas y moleculares excitadas en el sólido condensado por la energía térmica. Las partículas individuales en estado gaseoso se comportan como cuerpos independientes.Análisis Instrumental Módulo Analítico Espectros de líneas Los espectros de líneas en las regiones ultravioleta y visible se producen cuando las especies radiantes son partículas atómicas individuales que están muy separadas entre si. de modo que para que se produzca la absorción de la radiación. Espectros de bandas Los espectros de bandas se encuentran con frecuencia en fuentes espectrales que presentan radicales o pequeñas moléculas en estado gaseoso. moléculas o iones solo tienen un número limitado de niveles de energía discretos. Espectros continuos La verdadera radiación contínua se produce cuando los sólidos se calientan hasta la incandescencia. Absorción de radiación Cuando la radiación atraviesa una capa de un sólido. denominada radiación del cuerpo negro. un líquido o un gas. La excitación sólo puede producirse mediante un proceso electrónico en el que uno o 10 . en estado gaseoso. 1. 1. Las bandas surgen a partir de numerosos niveles vibracionales cuantizados que se superponen al nivel de energía electrónico del estado fundamental de una molécula. los átomos. un proceso en el que la energía electromagnética se transfiere a los átomos.5: Diagrama de niveles de energía para (a) un átomo de sodio que muestra la fuente de un espectro de líneas y (b) una molécula simple que muestra la fuente de un espectro de bandas.3. es característica de la temperatura de la superficie emisora más que del material del que está compuesta la superficie. De acuerdo con la teoría cuantica.4. Como estas diferencias de energía son características para cada especie. ciertas frecuencias pueden eliminarse selectivamente por absorción. Absorción atómica El paso de radiación policromática ultravioleta o visible a través de un medio constituido por partículas monoatórnicas produce la absorción de sólo unas pocas frecuencias bien definidas. 5. el número de posibles niveles de energía para una molécula es normalmente de unos órdenes de magnitud mayor que para una partícula atómica. a su vez. que consisten en una serie de líneas agudas y bien definidas. para cada estado de energía electrónica de una molécula.6: Atenuación de un haz de radiación por una disolución absorbente. Finalmente. especialmente en estado condensado. En general. El segundo término de la derecha se refiere a la energía total asociada al elevado número de vibraciones interatómicas presente en las especies moleculares. son posibles numerosos estados rotacionales. 1. fluorescencia o luminiscencia La potencia de radiación emitida por un analito es proporcional a la concentración del analito. una molécula tiene muchos mas niveles cuantizados de energía vibracional que niveles electrónicos. Estas relaciones vienen dadas por: A = abc Fig. generalmente existen varios estados vibracionales posibles y. Instrumentos La potencia se determina con un detector de radiación que convierte la energía radiante en una señal eléctrica. así pues.Análisis Instrumental Módulo Analítico más de los electrones del átomo se promocionan a un nivel de energía superior. A diferencia de los espectros de absorción atómicos. 1. En consecuencia. La radiación ultravioleta y visible tiene la energía suficiente para producir transiciones únicamente de los electrones más externos o electrones enlazantes. E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional Donde la Eelectrónica representa la energía electrónica de la molécula que proviene de los estados energéticos de sus distintos electrones enlazantes. asociada a las bandas de una molécula. Esto es.2. la absorbancia es directamente proporcional al camino óptico b a través del medio y la concentración c de la especie absorbente. ya que el número de estados de energía de las moléculas es generalmente enorme si se compara con el de los átomos aislados. los espectros moleculares de las regiones ultravioleta y visible se caracterizan normalmente por bandas de absorción que a menudo abarcan un intervalo considerable de longitudes de onda. son considerablemente más complejos que los espectros atómicos.2. Ley de Beer Para una radiación monocromática. Aspectos cuantitativos de las medidas espectrométricas Potencia radiante Energía de un haz de radiación que alcanza un área dada por segundo. La energía E. para cada uno de estos estados vibracionales. esta formada por tres componentes. 11 . la Erotacional es la energía debida a los distintos movimientos rotacionales dentro de una molécula.6. Absorción molecular Los espectros de absorción de las moléculas poliatómicas. Métodos basados en la emisión. 1. Métodos basados en la absorción Se requiere medir la potencia inicial y final. 7. (b) de fluorescencia. Fuente contínua Emiten radiación que varía de forma gradual con la longitud de onda. 1. 12 . la intensidad de los dos haces se mide simultanea o casi simultáneamente.2.2. fosforescencia y dispersión. x Un detector de radiación que convierta energía radiante en señal (en general eléctrica). para proporcionar la estabilidad requerida se necesita a menudo una fuente de potencia regulada. Fig. Instrumentación para espectroscopía óptica Los instrumentos espectroscópicos incluyen cinco componentes: x Una fuente de energía radiante. La potencia radiante de una fuente varia exponencialmente con la tensión de su fuente de alimentación. su potencia de salida debe ser estable durante periodos de tiempo razonables. Por otra parte.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.7: Componentes de diversos tipos de instrumentos para espectroscopía óptica: (a) de absorción. Fuente de línea Emiten un número limitado de líneas o bandas cada una abarca un intervalo limitado de longitudes de onda. x Un recipiente transparente para contener la muestra. el problema de la estabilidad de la fuente se soluciona con diseños de doble haz en los que la relación de la señal de la muestra respecto a la de la fuente en ausencia de muestra sirve como parámetro analítico. Fuentes de radiación Una fuente debe generar un haz de radiación con potencia suficiente para que se detecte y se mida con facilidad para poderla utilizar en estudios espectroscópicos. x Un sistema de procesamiento de datos. 1. Además. (c) de emisión o quimioluminiscencia. de manera que el efecto de las fluctuaciones de la señal de salida de la fuente se anula en gran parte. Por ello. x Un dispositivo que aísle una región restringida del espectro.1. En dichos diseños.7. en su lugar.8: Señal de salido de un selector de longitud de onda típico. es un requisito para obtener una relación lineal entre la señal óptica y la concentración. estrecho y continuo de longitudes de onda denominado banda. El resultado es que se refuerza esta determinada longitud de onda. a su estrecha anchura de banda y a la naturaleza coherente de su señal de salida. con frecuencia. Filtros de interferencia: los filtros de interferencia se fundamentan en las interferencias ópticas para producir bandas estrechas de radiación. lo que se obtiene es una banda. se necesita una radiación constituida por un grupo limitado. El espesor de la capa dieléctrica se controla cuidadosamente y determina la longitud de onda de la radiación transmitida. 1. una fracción atraviesa la primera capa metálica. que no están en fase. Fig. los filtros y los monocromadores. No existe ningún selector de longitud de onda que se aproxime al caso ideal. Si la parte reflejada de esta segunda interacción es de la longitud de onda adecuada. siendo la resolución mejor cuanto más estrecha es la anchura de banda. Fig. 1. Cuando un haz perpendicular de radiación colimada incide en esta disposición.Análisis Instrumental Módulo Analítico Láseres Los láseres son fuentes muy útiles en la instrumentación analítica debido a su elevada intensidad. 1. la señal de salida de un selector de longitud de onda correspondería a una radiación de una única longitud de onda o frecuencia. Obsérvese que el dibujo no está hecho a escala y que las tres bandas centrales en realidad son mucho más estrechas. Idealmente. Un filtro de interferencia consta de un dieléctrico transparente (con frecuencia fluoruro de calcio o de magnesio) que ocupa el espacio entre dos películas metálicas semitransparentes. puede proporcionar selectividad tanto a los métodos de absorción como a los de emisión y. mientras que la mayoría de las otras longitudes de onda. Esta disposición se coloca entre dos placas de vidrio u otro material transparente.7. 13 . Selectores de longitud de onda Para la mayoría de análisis espectroscópicos. sufren una interferencia destructiva.2.2. se refleja parcialmente desde la cara interna de la primera capa en fase con la luz incidente de la misma longitud de onda. La anchura de banda efectiva.9: (a) Esquema de la sección transversal de un filtro de interferencia. Una anchura de banda estrecha aumenta la sensibilidad de las medidas de absorbancia. mientras que el resto se refleja. es una medida inversa de la calidad del dispositivo. La parte que ha pasado sufre una partición similar cuando incide en la segunda película metálica. (b) Esquema que muestra las condiciones para una interferencia constructiva. Existen dos clases de selectores de longitud de onda. Análisis Instrumental Módulo Analítico Filtros de absorción Los filtros de absorción se han utilizado mucho para la selección de bandas en la región visible. Estos filtros funcionan absorbiendo ciertas zonas del espectro. El tipo más habitual es un vidrio coloreado o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio. El primero tiene la ventaja de una mayor estabilidad térmica. Los filtros de absorción tienen anchuras de banda efectivas que oscilan entre 30 y 250 nm. Los filtros que proporcionan las anchuras de banda más estrechas también absorben una fracción significativa de la radiación deseada y pueden tener una transmitancia del 10% o menos en sus picos de banda. Los filtros de corte tienen transmitancia de casi el 100% en una zona del espectro visible, pero luego disminuyen rápidamente hasta un valor de transmitancia igual a cero en el resto. Una banda espectral estrecha puede aislarse acoplando un filtro de corte con un segundo filtro. Monocromadores Los monocromadores se diseñan para realizar barridos espectrales. Los monocromadores para las radiaciones ultravioleta, visible e infrarroja son similares en cuanto a construcción mecánica, ya que todos ellos utilizan rendijas, lentes, espejos, ventanas y redes o prismas. Monocromadores de red Las radiaciones ultravioleta, visible e infrarroja pueden dispersarse dirigiendo un haz policromático a través de una red de transmisión o hacia la superficie de una red de reflexión; esta última es con mucho la más usual. Las redes réplica, que se usan en la mayoría de los monocromadores, se fabrican a partir de una red patrón. Esta última consiste en una superficie dura, pulida y ópticamente plana sobre la que se han grabado, con una herramienta de diamante afilada adecuadamente, un gran número de surcos paralelos y muy próximos entre sí. La red escalerilla es una red tipo escalerilla, a la que se la han hecho estrías o surcos de forma que tiene caras relativamente anchas, en las que se produce la reflexión, y caras estrechas no utilizadas. Esta geometría proporciona una difracción muy eficaz de la radiación. Cada una de las caras anchas se puede considerar como una fuente puntual de radiación; así pues, se puede producir una interferencia entre los haces reflejados. La radiación entra en el monocromador por una abertura estrecha rectangular o rendija, se colima y, seguidamente, incide sobre la superficie del elemento dispersante con un ángulo dado. En un monocromador de red, la dispersión angular de las longitudes de onda tiene su origen en la difracción que se produce en la superficie reflectante; la dispersión lineal significa que la posición de una banda a lo largo del plano focal para una red varía linealmente con su longitud de onda. Monocromador de prisma Los prismas se pueden utilizar para dispersar radiación ultravioleta, visible e infrarroja. Sin embargo, el material usado para su fabricación difiere según la región de longitudes de onda. La refracción en las dos caras da lugar a una dispersión angular de la radiación. Las longitudes de onda más cortas se dispersan en mayor grado que las largas. Monocromadores de escalera Los monocromadores de escalera contienen dos elementos dispersantes dispuestos en serie. El primero de estos elementos es un tipo especial de red denominada red de escalera. El segundo, que le sigue, es generalmente un prisma de baja dispersión o, a veces, una red. Los monocromadores de escalera proporcionan una mayor dispersión y mayor resolución que una red de escalerilla del mismo tamaño Las rendijas de un monocromador juegan un importante papel para determinar sus características de funcionamiento y calidad. La anchura de banda se define como el espacio de ajuste del monocromador necesario para mover la imagen de la rendija de entrada a través de la rendija de salida; la anchura de banda efectiva, que es la mitad de la anchura de banda cuando las dos anchuras de las rendijas son iguales, se aprecia que es el intervalo de longitudes de onda que salen del monocromador para un ajuste dado de longitud de onda. La anchura de banda efectiva se puede relacionar con la dispersión recíproca lineal. 14 Análisis Instrumental Módulo Analítico La anchura de banda efectiva de un monocromador depende de la dispersión de la red o del prisma así como de la anchura de las rendijas de entrada y de salida. La mayoría de los monocromadores están equipados con rendijas variables, de manera que la anchura de banda efectiva se puede cambiar. Cuando se necesita resolver bandas estrechas de absorción o de emisión es deseable utilizar anchuras de rendija mínimas. Por otra parte, el estrechamiento de las rendijas viene acompañado de una disminución notable de la potencia radiante disponible, dificultándose la consecución de medidas exactas de dicha potencia. Por tanto, se pueden utilizar anchuras de rendija mayores para los análisis cuantitativos más que para los cualitativos, en los que el detalle espectral es importante. Fig. 1.10: Efecto de la anchura de banda sobre los detalles del espectro del vapor de benceno: (a) 0.5 nm; (b) 1.0 nm; (c) 2.0 nm. 1.2.7.3. Recipientes para la muestra Las celdas o cubetas que contienen las muestras se deben fabricar de un material que sea transparente a la radiación de la región espectral de interés. Para trabajar en la región ultravioleta (por debajo de 350 nm) se necesita cuarzo o sílice fundida; ambas sustancias son transparentes en la región visible, así como en la región infrarroja hasta aproximadamente 3 μm. Los vidrios silicatados se pueden emplear en la región comprendida entre 350 y 2000 nm. Los recipientes de plástico también se utilizan en la región visible. La sustancia más habitualmente empleada para las ventanas de las cubetas en la región infrarroja es el cloruro de sodio cristalino. 1.2.7.4. Detectores de radiación Propiedades del detector ideal: x Elevada sensibilidad. x Elevada relación señal/ruido. x Respuesta constante en un intervalo considerable de longitudes de onda. x Debe tener un tiempo de respuesta rápido. x Señal de salida igual a cero en ausencia de iluminación. x La señal eléctrica producida por el transductor debería ser directamente proporcional a la potencia radiante. Existen dos tipos generales de detectores de radiación: uno responde a los fotones y el otro al calor. Todos los detectores de fotones (también denominados detectores fotoeléctricos o cuánticos) tienen una superficie activa, que es capaz de absorber radiación. En algunos tipos, la energía absorbida causa la emisión de electrones y el desarrollo de una fotocorriente. En otros, la radiación promociona electrones a las bandas de conducción; en este caso, la detección se basa en el aumento de la conductividad resultante (fotoconducción). La diferencia entre detectores de fotones y de calor es importante, ya que el ruido de disparo, a menudo, limita el comportamiento de los primeros, mientras que el ruido térmico suele limitar el de los últimos. Detectores de fotones: Células fotovoltaicas 15 Análisis Instrumental Módulo Analítico La energía radiante genera una corriente en la interfase entre una capa semiconductora y un metal. Es sencillo, robusto, tiene bajo costo y no requiere fuente eléctrica externa. Tiene como desventajas que la respuesta varía con la longitud de onda, experimenta fatiga a niveles de iluminación altos y no responde bien a niveles de iluminación bajos. Fototubos La radiación causa la emisión de electrones de una superficie sólida fotosensible. Tubos fotomultiplicadores Contienen una superficie fotoemisora, así como varias superficies adicionales que emiten una cascada de electrones cuando son alcanzadas por los electrones procedentes del área fotosensible. Es altamente sensible (pueden detectar un solo fotón) y el tiempo de respuesta extremadamente rápido. La desventaja es que presenta corriente oscura debido a electrones emitidos térmicamente, y debe enfriar por debajo de -30 ºC. Detectores de fotoconductividad La absorción de la radiación por un semiconductor produce electrones y huecos, dando lugar así a un aumento de la conductividad. Son los detectores más sensibles para el cercano IR. Fotodiodos de silicio Los fotones aumentan la conductancia a través de una unión pn polarizada inversamente. Son más sensibles que el fototubo de vacío pero menos que el fotomultiplicador. Detectores de transferencia de carga Se recogen y miden las cargas desarrolladas en un cristal de silicio como resultado de la absorción de fotones. Los detectores de calor son empleados en la región infrarroja. Esta región posee muy poca energía por lo que la fotoemisión no es observada y de los detectores fotoeléctricos solo aquellos en los que ocurre fotoconducción pueden ser empleados. Los detectores térmicos responden al promedio del poder radiante aplicado. En estos detectores la radiación incide sobre un pequeño cuerpo negro que la absorbe y produce un aumento en su temperatura, el cambio de T es por lo tanto la señal medida. El problema con estos detectores es que son muy sensibles al ruido térmico. Termopares Consiste en un par de uniones que se forman soldando los extremos de dos piezas de un metal a otro metal distinto. Entre las dos uniones se genera un potencial que varía con la diferencia de temperatura de las uniones. Bolometros Es un tipo de termómetro de resistencia construido con láminas de metales, como platino o níquel, o a partir de un semiconductor; estos últimos dispositivos frecuentemente se denominan termistores. Estos materiales muestran un cambio de resistencia relativamente grande en función de la temperatura. El elemento sensible es pequeño y está ennegrecido para absorber el calor radiante. Piroelectricos Se construyen a partir de una lámina cristalina de materiales piroeléctricos, que son aislantes (materiales dieléctricos) con unas propiedades térmicas y eléctricas muy especiales. Cuando se aplica un campo eléctrico a través de cualquier material dieléctrico, se produce una polarización eléctrica cuya magnitud es función de la constante dieléctrica del material. Para la mayoría de los dieléctricos, esta polarización inducida disminuye rápidamente hasta cero cuando se elimina el campo externo. Por el contrario, las sustancias piroeléctricas mantienen una fuerte polarización dependiente de la temperatura después de eliminar el campo. Así, colocando el cristal piroeléctrico entre dos electrodos (uno 16 11: Diagramas de niveles de energía para (a) sodio atómico y (b) ion magnesio. Las energías de varios orbitales atómicos se indican en el diagrama mediante líneas horizontales. y producir así un ion sodio. Fig.5. 1. 1. si los dos movimientos se dan en direcciones opuestas. pero no en longitudes de onda reales. tanto el movimiento de giro (o espín) como el movimiento orbital crean campos magnéticos. pero sus magnitudes son generalmente tan pequeñas que resultan indetectables. 1. integrar o convertir a logaritmo. Además. que se muestra en la Figura 8-1a. Obsérvese que la escala de energía es lineal en unidades de electrón-voltio (eV). registradores y tubos de rayos catódicos. medidores digitales. Con los orbitales d y f se dan diferencias similares. el procesador de señal puede utilizarse para llevar a cabo operaciones matemáticas en la señal como diferenciar. en la Figura 8-1a sólo se indica un único nivel para los orbitales d. Procesador de seña y dispositivos de lectura El procesador de señal es generalmente un dispositivo electrónico que amplifica la señal eléctrica del detector. Los dos campos interaccionan en el sentido de atraerse.Análisis Instrumental Módulo Analítico de ellos es transparente a la radiación infrarroja) se obtiene un condensador dependiente de la temperatura. por ello. cambiar la fase de la señal y filtrarla para eliminar los componentes no deseados. es un diagrama característico. Algunos de ellos son el medidor d'Arsonval.8. se origina una fuerza de repulsión.2 eV. asignando el valor cero al orbital 3s. 17 . Debido a la rotación de la carga que transporta el electrón. Obsérvese el parecido con el modelo de líneas. Obsérvese que los orbitales p se desdoblan en dos niveles que difieren ligeramente en energía. escalas de potenciómetros. la energía del electrón cuyo espín se opone a su movimiento orbital es ligeramente menor que la de aquél en el que sus movimientos son iguales. Además. El diagrama del sodio.2. El desdoblamiento de los orbitales p.7. Como consecuencia. la energía necesaria para arrancar el único electrón 3s. Existen distintos tipos de dispositivos de lectura en los instrumentos modernos. La escala se extiende hasta unos 5.2. cuando los movimientos son paralelos. Diagramas de niveles de energía El diagrama de niveles de energía de los electrones externos de un elemento proporciona un método adecuado para la descripción de los procesos en los que se basan los diversos métodos de espectroscopia atómica. puede cambiar la señal de corriente continua a corriente alterna (o a la inversa). Esta diferencia se explica asumiendo que un electrón gira alrededor de su propio eje y que la dirección de este movimiento puede ser la misma o la opuesta al movimiento orbital. d y f de alta energía en dos estados es característico de todas Las especies que contienen un único electrón externo. un aumento de la temperatura favorece la eficacia del proceso de atomización y por lo tanto el número de átomos en el vapor. por tanto. sólo lo afecta a sistemas de arco o chispa. Por ejemplo. Las líneas de absorción y de emisión atómica presentan una distribución de longitudes de onda simétrica respecto de la lambda del máximo. Ensanchamiento natural (principio de incertidumbre) Las líneas tienen anchuras finitas porque los tiempos de vida de los estados involucrados son finitos. Como la mayor población de átomos se encuentra en el estado fundamental las técnicas de absorción y fluorescencia atómica deberían ser más sensibles que la técnica de emisión atómica. se origina una dispersión de las longitudes de onda emitidas o absorbidas. hay incertidumbre en los tiempos de transición y un ensanchamiento por el principio de incertidumbre.10. En las llamas el efecto Doppler origina anchos dos órdenes de magnitud mayores que el ancho natural de línea. De esta forma llega al detector una distribución de longitudes de onda simétrica. Estas colisiones provocan pequeños cambios en los niveles de energía del estado fundamental y. Sin embargo. Efecto de la temperatura en los espectros atómicos Una pequeña variación en la temperatura genera una gran variación en el número de átomos en el estado excitado y por lo tanto en la intensidad de las líneas de emisión.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. Los átomos que se mueven perpendicularmente al detector no experimentan ningún desplazamiento. Ensanchamiento por presión o colisiones (Lorentz) Por colisiones con especies emisoras o absorbentes con otros átomos e iones en el propio medio calor calorífico. 1. En las medidas de absorción y fluorescencia se emplea la gran mayoría de átomos no excitados y la variación de la temperatura no varía significativamente el número de átomos en el estado fundamental. Variaciones en la temperatura afectan el grado de ionización del analito y por lo tanto la concentración del analito no ionizado. Ancho de las líneas atómicas En espectroscopia atómica la anchura de las líneas atómicas es de considerable importancia.2. despreciable en sistemas convencionales. Se define como ancho de línea o ancho línea efectiva el Δλ medido a mitad de altura. Los átomos presentan una distribución de velocidades de Maxwell-Boltzmann. dado que así se reduce la posibilidad de interferencias debidas al solapamiento de espectros. Por lo tanto las técnicas basadas en la emisión requieren un control riguroso de la temperatura de atomización. La energía asociada a este lambda máximo se corresponde con la diferencia de energía entre los dos estados cuantizados responsables de la absorción o de la emisión. las líneas estrechas son muy convenientes tanto para el trabajo en emisión como en absorción.2. Se usa para corrección de fondo. Ensanchamiento por efecto Doppler (o de temperatura) La longitud de onda de la radiación emitida o absorbida por un átomo que se mueve disminuye si el movimiento es hacia el detector y aumenta si el átomo se aleja del mismo. Un aumento de la temperatura aumenta el efecto Doppler y por lo tanto aumenta el ensanchamiento de línea.9. el máximo desplazamiento Doppler lo presentan aquellos átomos que se mueven a las velocidades más altas y en línea con el detector. Ensanchamiento por efecto Stark Causado por campos eléctricos intensos. Todos estos efectos hacen necesario controlar la temperatura para las medidas cuantitativas de absorción y fluorescencia. Ensanchamiento por efecto Zeeman Causado por campos magnéticos intensos. en la 18 . Sin embargo. Ensanchamiento por efecto Holtsmark Ensanchamiento de resonancia por colisiones con átomos de la misma especie. antimonio. los métodos de fluorescencia atómica son los más sensibles de los tres.11. como un filamento de tántalo o una barra de carbono.2. Los análisis cuantitativos se realizan a partir de las alturas o áreas de los picos obtenidos. 1.es arrastrado a la cámara de atomización por un gas inerte. Introducción de la muestra en disolución Las disoluciones se introducen generalmente en el atomizador por métodos que incluyen la nebulización. En contraste con los anteriores nebulizadores.1.Análisis Instrumental Módulo Analítico absorción atómica se miden la diferencia A = log P0 .2. transporta la muestra vaporizada al atomizador. Es decir. el sistema electrotérmico produce una señal discreta en vez de una señal continua.11. arsina. como el argón. Dicho procedimiento mejora los límites de detección de estos elementos de 10 a 100 veces. Vaporizadores electrotérmicos Un vaporizador electrotérmico (ETV) es un evaporador situado en una cámara cerrada a través de la cual un gas inerte. selenio.+ 3H+ + 4H3AsO3 l 3H3BO3 + 4AsH3 m + 3H2O El hidruro volátil -en este caso. Una pequeña muestra líquida o sólida se sitúa sobre un conductor. Este proceso se denomina aspiración. 19 . El tipo más común de nebulizador es el nebulizador neumático de tubo concéntrico en el que la muestra líquida es aspirada a través de un capilar por una corriente de gas a elevada presión que fluye alrededor del extremo del capilar (efecto Venturi). En principio. El flujo de gas conduce a la muestra a la zona en la que tiene lugar la atomización.log P que si P0 y P son parecidas generan grandes errores relativos. Una corriente eléctrica entonces evapora la muestra rápida y completamente mezclándose con el argón. bismuto y plomo en un atomizador en forma de gas. Dichos nebulizadores producen aerosoles más densos y más homogéneos que los nebulizadores neumáticos. una reacción característica se puede representar por la expresión: 3BH4. donde se descompone el hidruro originándose los átomos del analito. Introducción de la muestra El objetivo del sistema de introducción de muestra en la espectrometría atómica es transferir una parte reproducible y representativa de la muestra a uno de los atomizadores citados con una elevada eficacia y sin efectos interferentes adversos. las muestras generalmente se disuelven en un medio acuoso y se introducen en el atomizador por medio de un nebulizador que transforma el líquido en una fina niebla o aerosol. que son conducidas al atomizador. 1. en los que la muestra se bombea sobre la superficie de un cristal piezoeléctrico que vibra a una frecuencia de 20 Khz a varios MHz. La cámara generalmente es un tubo de sílice calentado a varios cientos de grados centígrados en un horno o en una llama. Nebulizadores neumáticos En un análisis por espectrometría atómica. El gas a elevada velocidad rompe el líquido en finas gotitas de distinto tamaño. estaño. Técnicas de generación de hidruros Las técnicas de generación de hidruros proporcionan un método para introducir muestras que contienen arsénico. Nebulizadores ultrasónicos Varios fabricantes de instrumentos también ofrecen nebulizadores ultrasónicos. Generalmente se pueden generar rápidamente hidruros volátiles adicionando una disolución acuosa acidificada de la muestra a un volumen pequeño de una disolución acuosa al 1 por 100 de borohidruro de sodio en un frasco de vidrio. la señal de la muestra atomizada aumenta hasta un máximo y después disminuye hasta cero a medida que la muestra sale del atomizador. en la que la muestra se convierte en una niebla de pequeñas gotitas finamente divididas (aerosol) por medio de un chorro de gas comprimido. La facilidad con la que se alcanza este objetivo depende en gran medida del estado físico y químico del analito y de la matriz de la muestra. 11. sin embargo. Técnica de la descarga luminiscente El dispositivo de descarga luminiscente (GD) es una fuente versátil que permite introducir y atomizar la muestra simultáneamente. acondicionamiento de la muestra. Con frecuencia en los atomizadores de arco o chispa eléctricos.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.000 V. Introducción de la muestra en sólidos La introducción de sólidos en forma de polvo. Inserción directa de la muestra En la técnica de inserción directa. metalo-partículas en atomizadores de plasma o llama tiene la considerable ventaja de evitar la etapa. la muestra se sitúa físicamente dentro del atomizador. convirtiendo la muestra en una nube de materia vaporizada y en forma de partículas que es arrastrada al atomizador. precisión y exactitud. pueden reducirse a polvo y situarse sobre o dentro de una sonda que se inserta directamente dentro del atomizador. Ablación por arco y chispa Las descargas eléctricas de varios tipos se utilizan con frecuencia para introducir muestras sólidas en los atomizadores. Vaporizadores electrotérmicos Los vaporizadores electrotérmicos. El potencial aplicado causa la descomposición del argón en iones positivos y electrones. un haz de láser focalizado de la energía necesaria se dirige a la superficie de la muestra sólida. Este proceso de introducción de la muestra se denomina ablación. En el caso de muestras sólidas. Se produce la expulsión de átomos neutros de la muestra por un proceso denominado chisporroteo. El calentamiento se produce por calentamiento conductivo de la muestra mantenida sobre o dentro de una barra o navecilla de grafito o tántalo. que ya se han descrito brevemente en un apartado anterior. además de las muestras en disolución. la descarga luminiscente tiene lugar en una atmósfera de argón a baja presión (1 a 10 torr) entre un par de electrodos que están a un potencial de 250 a 1. donde se produce la ablación. de descomposición y disolución de la muestra. las muestras metálicas se introducen como uno de los electrodos o ambos electrodos utilizados para producir el arco o la chispa. Dichos procedimientos. Un gas inerte transporta la muestra vaporizada al interior del atomizador. 20 . El campo eléctrico acelera los iones argón hacia la superficie del cátodo que contiene la muestra.2. La interacción de la descarga con la superficie de la muestra sólida crea una nube formada por la muestra en forma de partículas y vaporizada.2. Brevemente. De forma similar a la ablación por arco y chispa. presentan frecuentemente dificultades importantes en la calibración. Ablación por láser La ablación por láser es un método relativamente nuevo y versátil para introducir las muestras sólidas en los atomizadores. con frecuencia tediosa y larga. también se utilizan para varios tipos de muestras sólidas. que es transportada al atomizador por medio de un gas inerte. 1.12.12: Procesos que tienen lugar durante la atomización.1. atómicos e iónicos. Luego la disociación de la mayoría de estas moléculas produce un gas atómico.12. Indudablemente se producen también otras moléculas y átomos en la llama como resultado de las interacciones del gas combustible con el gas oxidante y con las distintas especies de la muestra. y se transporta a una llama donde se produce la atomización. Produciéndose tantos procesos complejos. produciéndose así espectros de emisión moleculares. El aspecto y el tamaño relativo de estas regiones varían considerablemente con la relación combustible-oxidante. mezclado con el gas combustible. así como con el tipo de combustible y de oxidante. una fracción de las moléculas. El primero es la desolvatación. Módulo Analítico Absorción y fluorescencia atómica 1. La zona de combustión primaria en una llama de hidrocarburos se reconoce por su coloración azul 21 . átomos e iones también se excita por el calor de la llama. una serie compleja de procesos encadenados tiene lugar en la llama.3.Análisis Instrumental 1. Técnicas de atomización 1. no es sorprendente que la atomización sea la etapa más crítica en la espectroscopia de llama y la que limita la precisión de dichos métodos.3.3. 1. las regiones más importantes son la zona de combustión primaria. La mayoría de los átomos así formados se ionizan originando cationes y electrones. Atomización con llama En un atomizador de llama.1. la región interconal y la zona de combustión secundaria. la disolución de la muestra es nebulizada mediante un flujo de gas oxidante. en el que se evapora el disolvente hasta producir un aerosol molecular sólido finamente dividido. Como se indica en la Figura 1. En cuanto a la estructura de la llama. Como se muestra en la Figura 1. Fig. se calcinan a una temperatura algo más alta en un tubo de grafito o cubeta de grafito calentado eléctricamente. de sensibilidad. que es relativamente estrecha en llamas de hidrocarburo estequiométricas. La plataforma también es de grafito y se encuentra debajo del orificio de entrada de la muestra. no se han aplicado para la obtención directa de espectros de emisión. la atomización con llama resulta ser superior a todos los demás métodos que se han desarrollado hasta ahora para la introducción de muestras líquidas tanto para la espectrometría de absorción atómica como de fluorescencia atómica. la atomización de la muestra se produce en un período de tiempo de unos pocos milisegundos a segundos. por ello. puede alcanzar varios centímetros de altura con fuentes ricas en combustible de acetileno/oxígeno o acetileno/óxido nitroso. 1. por ello. el oxidante y el combustible se queman pues en un mechero provisto de una ranura. CH y otros radicales.000ºC. en segundo lugar. formado por el flujo del gas oxidante. en esta zona no se alcanza el equilibrio térmico y. En estas condiciones. 22 . se mezcla con el combustible y pasa a través de una serie de deflectores que eliminan las gotitas de disolución que no sean muy finas. por lo general. la atomización tiene lugar en un medio en el que no se produce un cambio tan rápido de temperatura.). la atomización se retrasa. Fig. La región interconal. Los atomizadores de llama se emplean en espectroscopia de emisión. Los mecheros de flujo laminar proporcionan una llama relativamente estable y larga. una gran porción de la muestra se pierde por el drenaje. se mide la absorción o la fluorescencia de las partículas atomizadas en la zona situada inmediatamente por encima de la superficie calentada. Pueden citarse dos razones para la menor eficacia de la introducción de la muestra en la llama: en primer lugar.13: Regiones de una llama (izq. 1. que produce una llama que generalmente mide entre 5 y 10 cm de longitud. luego. cuando la temperatura del tubo se eleva rápidamente. Por tanto.1. La plataforma de L'vov se utiliza con frecuencia en los hornos de grafito. lo que eleva la temperatura a unos 2. el tiempo de residencia de los átomos individuales en el camino óptico en la llama es breve. unos pocos microlitros de muestra se evaporan primero a baja temperatura y. El aerosol. pero. El aerosol. perfiles de temperatura en una llama gas natural/aire (der. En términos de reproducibilidad. En general. donde se drena hacia un contenedor de desechos. absorción y fluorescencia atómica. otros métodos de atomización son claramente mejores.). De este modo se obtienen picos más reproducibles. la corriente se incrementa rápidamente a varios cientos de amperios.000 o 3. Como consecuencia de la acción de estos deflectores. Atomización electrotérmica Proporcionan generalmente una mayor sensibilidad debido a que toda la muestra se atomiza en un período muy corto y el tiempo promedio de permanencia de los átomos en el camino óptico es de un segundo o más. En la zona de combustión secundaria. Los atomizadores electrotérmicos se utilizan para las medidas de absorción atómica y de fluorescencia atómica. los productos formados en la región interior se convierten en óxidos moleculares estables que se dispersan por los alrededores. la mayor parte de la muestra se recoge en el fondo de la cámara de mezcla.2.3. en términos de eficacia en la introducción de la muestra y. ya que la muestra no está el tiempo suficiente en contacto directo con la pared del horno. La muestra se evapora y se calcina sobre esta plataforma de la manera usual. Sin embargo. La zona es frecuentemente rica en átomos libres y es la parte de la llama más ampliamente utilizada en espectroscopia.Análisis Instrumental Módulo Analítico que proviene de los espectros de bandas de C2. esta zona rara vez se utiliza en la espectroscopia de llama. Tras la calcinación. En los atomizadores electrotérmicos. Sin embargo. Estas propiedades tienden a aumentar la sensibilidad y la reproducibilidad. 2. entonces las sensibilidades son muy bajas. a unos pocos torr y una pequeña cantidad del metal (o su sal) cuyo espectro se desea obtener. posibilidad de obtenerlo en un estado de máxima pureza y mínima contaminación del horno. o bien. Por todo ello. para su activación se utiliza un campo intenso de radiofrecuencia o radiación de microondas.3. se utilizan también modificadores de matriz.2. Es decir. de este modo. Tienen capacidad para estabilizar al analito. los cationes gaseosos adquieren la suficiente energía cinética como para arrancar algunos de los átomos metálicos de la superficie del cátodo y producir una nube atómica. la T de la fuente se mantiene por debajo de la T de la llama. 1. las corrientes mayores provocan un aumento del número de átomos no excitados en la nube. los métodos de horno son lentos -requiriendo habitualmente varios minutos por elemento-.2. son capaces de absorber la radiación emitida por los átomos excitados. por consiguiente. a su vez. El cátodo está construido con el metal cuyo espectro se desea obtener. Además. El problema creado por el ancho reducido de las líneas de absorción atómicas se resuelve utilizando fuentes de líneas con anchos de banda aún más estrechos que los picos de absorción. este diseño aumenta también la probabilidad de que la redeposición sea en el cátodo más que sobre las paredes de vidrio. las corrientes elevadas originan intensidades de radiación mayores. los átomos metálicos se vuelven a depositar difundiendo de nuevo hacia la superficie del cátodo o hacia las paredes de vidrio del tubo.2. siendo por lo general menor de dos órdenes de magnitud. De esta forma.3. por lo general. producen intensidades radiantes que son uno o dos órdenes de magnitud superiores a las lámparas de cátodo hueco. Fuentes de radiación La dependencia lineal entre la absorbancia del analito y su concentración (ley de Beer) sufre desviaciones cuando el ancho de banda de la fuente es mayor que el ancho de banda de absorción. La misma no debe modificar la vida útil del horno y no debe introducir excesiva absorción de fondo. La lámpara no contiene electrodos. Además. pero. Además las pendientes de las curvas son pequeñas porque solo una fracción de la radiación proveniente del monocromador es absorbida por la muestra. La precisión relativa de los métodos sin llama se encuentra generalmente en el intervalo del 5 al 10 por 100 en comparación con el 1 por 100 o menos que se puede esperar en la atomización con llama o plasma. al volver al estado fundamental emiten su radiación característica.3. Este tipo de lámpara consiste en un ánodo de wolframio y un cátodo cilíndrico cerrados herméticamente en un tubo de vidrio lleno con neón o argón a una presión de 1 a 5 torr. Los átomos no excitados. La eficacia de la lámpara de cátodo hueco depende de su geometría y del potencial aplicado. amplio espectro de aplicación. Las condiciones de trabajo de la fuente se eligen de manera que el ensanchamiento Doppler sea menor que el ensanchamiento que el pico de absorción tiene en la llama. Una lámpara típica está constituida por un tubo de cuarzo herméticamente cerrado que contiene un gas inerte. Otra desventaja es que el intervalo analítico es pequeño. sirve de soporte para una capa de dicho metal. la atomización electrotérmica se aplica normalmente sólo cuando la atomización con llama o plasma proporcionan límites de detección inadecuados. Una parte de los átomos metálicos desprendidos se encuentran en estado excitado y. lo que da lugar a una corriente de aproximadamente 5 a 15 mA al tiempo que los iones y electrones migran hacia los electrodos. Esta autoabsorción reduce la intensidad. se produce la ioni- 23 . Para el análisis de absorción de un elemento se utiliza la radiación de emisión del mismo elemento. La configuración cilíndrica del cátodo tiende a concentrar la radiación en una región limitada del tubo metálico. Dado que las líneas de absorción atómicas son muy estrechas aún si se utilizaran fuentes de radiación continua con un buen monocromador se obtendrían curvas de calibrado no lineales. sobre todo en el centro de la banda de emisión. Esta ventaja se neutraliza en parte por un aumento del ensanchamiento por efecto Doppler de las líneas de emisión de la lámpara.Análisis Instrumental Módulo Analítico Los atomizadores electrotérmicos ofrecen la ventaja de su elevada sensibilidad para pequeños volúmenes de muestra. Cuando se utiliza el horno de grafito.1. Al final. a este proceso se le denomina chisporroteo. Cuando se aplica un potencial del orden de 300 V entre los electrodos se produce la ionización del gas inerte. Lámparas de descarga sin electrodo Las lámparas de descarga sin electrodos (EDL) son fuentes de espectros atómicos de líneas muy utilizadas y. en su lugar. Los potenciales elevados y. Lámparas de cátodo hueco La fuente más común para las medidas de absorción atómica es la lámpara de cátodo hueco. 1. El inconveniente de esta técnica es la necesidad de una lámpara distinta para cada elemento (o a veces grupos de elementos). como el argón. Si el potencial es lo suficientemente grande. 1. el detector recibe dos tipos de señal. o cortador. debido a la excitación y emisión de los átomos del analito. 1. Interferencias en espectroscopía de absorción atómica En los métodos de absorción atómica se presentan dos tipos de interferencias. En el apartado siguiente se explican los métodos para corregir estas pérdidas.3. Los dos haces se juntan mediante un espejo semiplateado y llegan a un monocromador de red Czemey-Tumer. y pasan al sistema de tratamiento de datos. La salida de éste se utiliza para alimentar un amplificador de cierre sincronizado con el movimiento del cortador. el haz de referencia no pasa a través de la llama. Instrumentos de doble haz El haz que proviene de la fuente de cátodo hueco se divide mediante un cortador reflectante. De este modo. la corriente oscura se anula con un obturador enfrente del detector. La mayoría de los instrumentos de absorción atómica utilizan tubos fotomultiplicadores como detectores. el instrumento debe ser capaz de proporcionar una anchura de banda lo suficientemente estrecha para que pueda aislar. 24 . por consiguiente. un tubo fotomultiplicador actúa como detector. Las interferencias espectrales se producen cuando la absorción o emisión de una especie interferente se solapa o aparece muy próxima a la absorción o emisión del analito. la radiación emitida correspondiente a la longitud de onda seleccionada por el monocromador está inevitablemente presente en la llama.1. no existe una corrección de la pérdida de potencia radiante debida a la absorción o dispersión de la radiación por la propia llama. Sin embargo. originándose iones que son acelerados por la componente de radiofrecuencia del campo hasta que adquieren la suficiente energía para excitar a los átomos del metal cuyo espectro se desea. y. se obtiene la transmitancia reemplazando el blanco por la muestra.Análisis Instrumental Módulo Analítico zación del argón. 1. entre la fuente y la llama. un cortador o una fuente de alimentación de impulsos. una alternante de la fuente y otra continua que proviene de la llama. el alimentador de la fuente puede diseñarse para funcionar con corriente alterna o de manera intermitente. consiste en varias fuentes de cátodo hueco.4.3. Espectrofotómetros En general. Las interferencias químicas se producen como consecuencia de diversos procesos químicos que ocurren durante la atomización y que alteran las características de absorción del analito.4. un disco metálico circular.3.4. una mitad pasa a través de la llama y la otra mitad fuera de ella. La rotación del disco a velocidad constante conocida proporciona un haz intermitente cortado a la frecuencia deseada.2. Estas señales se convierten en las correspondientes respuestas eléctricas. Una forma sencilla y muy efectiva de modular la emisión de la fuente es interponer en el haz. A continuación se hace el ajuste del 100% transmitancia con un blanco que se aspira en la llama o que se quema en un atomizador sin llama. Como alternativa. Se amplifica entonces la relación entre las señales de la referencia y de la muestra.3. se necesitan sistemas electrónicos que puedan discriminar entre la señal modulada de la fuente y la señal continua de la llama. Así. un atomizador y un espectrofotómetro sencillo de red de difracción con un fotomultiplicador como detector. Tal como se ha subrayado anteriormente. Finalmente. al que de forma alterna se le han eliminado cuadrantes para permitir el paso de luz. Modulación de la fuente En un instrumento de absorción atómica típico es necesario eliminar las interferencias producidas por la emisión de radiación en la llama. 1. 1. que puede ser un medidor digital o un registrador de señal. de modo que su resolución por el monocromador resulta imposible. 1. es necesario modular la salida de la fuente para que su intensidad oscile a una frecuencia constante. la línea elegida de las otras líneas que pueden interferir o disminuir la sensibilidad del análisis. para que la fuente se encienda y se apague a una frecuencia constante deseada. Instrumentos de haz sencillo Un instrumento característico de haz sencillo.5. A fin de eliminar los efectos de la emisión en la llama.3. Hay que resaltar que en los instrumentos de absorción atómica de doble haz. para la medida. La mayor parte de la radiación que se emite se elimina mediante el monocromador.3. Si se reúnen estas condiciones. que se denomina a veces el método Smith-Hieftje de corrección del fondo. Por tanto. la potencia del haz transmitido. se basa en la autoinversión o autoabsorción. los picos σ sólo absorben la radiación polarizada a 90 grados respecto al campo.5. se produce un error positivo en la absorbancia y. De esta forma se consigue una corrección del fondo. se produce un desdoblamiento de los niveles de energía electrónicos de los átomos. Corrección de fondo basado en el efecto Zeeman Cuando un vapor atómico se expone a un intenso campo magnético. por el contrario. El modelo más sencillo. Existen métodos de corrección para estas interferencias: Método de corrección de las dos líneas El procedimiento de corrección de las dos líneas utiliza una línea que proviene de la fuente de radiación como referencia. siendo la suma de las absorbancias de estas líneas exactamente igual a la de la línea de la cual proceden. común para todos los espectros atómicos. los cuales son capaces 25 . P. existen diversos modelos de desdoblamiento. que se observa con transiciones singulete. Tal como se ha mencionado anteriormente.3. Cuando la procedencia de la interferencia es la mezcla de combustible y oxidante. W o partículas carbonosas). La presencia de radiación contínua y de bandas representa una fuente potencial de interferencias que debe controlarse por medio de una elección adecuada de la longitud de onda.1. por consiguiente. Interferencias espectrales Se producen cuando la absorción o emisión de una especie se solapa con la absorción o emisión del analito. Pero si la absorción o dispersión se debe a la matriz de la muestra se pueden corregir modificando los parámetros analíticos como la temperatura y la relación combustible/oxidante. se denomina efecto Zeeman. Método de corrección con una fuente continua En esta técnica. conduce a una línea central o línea π y a dos líneas satélite σ igualmente espaciadas. El pico π absorbe solamente la radiación que está polarizada en un plano paralelo al campo magnético externo. pero no debe ser absorbida por éste. Pero se pueden producir debido a la superposición con bandas de absorción o a la dispersión por partículas (óxidos de Ti. no resulta afectada.01 nm. Cuando la absorción o dispersión se debe a la matriz de la muestra. La aplicación del efecto Zeeman en los instrumentos de absorción atómica se basa en la distinta respuesta a la radiación polarizada de los dos tipos de picos de absorción. comportamiento de la radiación que emiten las lámparas de cátodo hueco cuando se les aplican corrientes elevadas. lo que conduce a la formación de diversas líneas de absorción para cada transición electrónica. Esta disminución en la potencia se utiliza para corregir la absorbancia de la línea del analito.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. por la corrección de la señal de fondo o por el cambio de las condiciones de atomización. se reduce por la presencia de los componentes de la matriz. se supone que cualquier disminución en la potencia de la línea de referencia respecto a lo observado durante la calibración se debe a la absorción o dispersión por los componentes de la matriz de la muestra. Estas líneas están separadas unas de otras en unos 0. En este caso. Dado que las líneas de la fuente son muy estrechas es rara la interferencia debido a la superposición de líneas. En función del tipo de transición electrónica implicado en el proceso de absorción. La absorbancia de la radiación de deuterio se resta entonces de la del haz del analito. Zr. por ello. Esta línea debería estar lo más próxima posible a la línea del analito. Corrección de fondo basado en una fuente con autoinversión Este método. la atenuación de la potencia de la radiación continua durante el paso a través de la muestra atomizada indica solamente la absorción de banda ancha o la dispersión producida por los componentes de la matriz de la muestra. entonces se puede realizar la corrección midiendo la absorbancia de un blanco. se utiliza una lámpara de deuterio como fuente de radiación continua en toda la región ultravioleta. Ambos disminuyen la potencia del haz transmitido y dan lugar a errores positivos. entonces el problema es más complicado. La configuración del cortador se modifica para que la radiación de la fuente continua y la de la lámpara de cátodo hueco pasen alternadamente a través del atomizador de tubo de grafito. Pr. mientras que la potencia del haz incidente. las corrientes elevadas producen una gran concentración de átomos no excitados. en la concentración. Este fenómeno. La anchura de rendija se ajusta con un ancho suficiente para que la fracción de radiación de la fuente continua que se absorbe por los átomos de la muestra sea despreciable. D. La presencia de equilibrios entre iones y átomos en las llamas tiene algunas consecuencias importantes en la espectroscopia de llama. tales como suelos. La recuperación de la fuente. Un efecto adicional de las corrientes elevadas es el gran ensanchamiento que originan en las bandas de emisión de las especies excitadas. La absorbancia total se obtiene cuando se opera a bajas corrientes. Los agentes protectores impiden las interferencias formando con el analito especies estables volátiles.5. los límites de detección en espectroscopia de absorción atómica de atomización con llama se encuentran en el intervalo de 1 a 20 ng/mL o 0. Por esta razón. está afectada de forma compleja por la temperatura. 1.002 a 0. Sin embargo. tejidos animales. la 8-hidroxiquinolina y el APDC (la sal de amonio del ácido 1-pirrolidinacarboditioico) En las mezclas de combustión que contienen aire como oxidante. Los efectos de los desplazamientos de los equilibrios de ionización con frecuencia se pueden eliminar con la adición de un supresor de ionización. Por ejemplo.3. la intensidad de las líneas de absorción o emisión atómicas de los metales alcalinos.001 a 0. Desafortunadamente. plantas. y hay una concentración notable de electrones libres.. por lo general en agua. Aplicaciones de la espectrometría de absorción atómica La espectrometría de absorción atómica constituye un medio sensible para la determinación cuantitativa de más de 60 elementos metálicos o metaloides. El ciclo de medida puede llevarse a cabo repetidamente para obtener relaciones señal/ruido satisfactorias. en las llamas de temperaturas más elevadas en las que el oxidante es el oxígeno o el óxido nitroso.3.5. Las temperaturas elevadas provocan un aumento de la población de átomos excitados.5. la ionización es más importante.6. cuando la corriente disminuye. rubidio y cesio. con atomización electrotérmica los valores correspondientes son 0. Existen tres reactivos que por lo general se utilizan con este fin. Por tanto. El efecto neto produce una banda con un mínimo en su centro. lo que origina resultados menores que los esperados. Preparación de la muestra Una desventaja de los métodos espectroscópicos de llama es el requisito de que la muestra se ha de introducir en la fuente de excitación disuelta.01 ng/mL o 2 x 10-6 a 1 x 10-5 ppm. el cual proporciona una concentración relativamente alta de electrones en la llama. y sólo es posible su determinación con espectrofotómetros que operan en vacío.3. la ionización de los átomos y moléculas es pequeña y. 1. se programa la lámpara para funcionar alternadamente con bajas y altas corrientes.1. y la absorbancia debida al fondo resulta de las medidas en la segunda parte del ciclo. También se pueden emplear agentes liberadores. puede despreciarse. en las llamas más caloríficas se puede observar una disminución de la absorción o emisión.020 P. A fin de obtener absorbancias corregidas. contrarrestando este efecto. Las líneas de resonancia de los elementos no metálicos se localizan en general por debajo de los 200 nm. En muchas ocasiones pueden eliminarse o atenuarse las interferencias debidas a la formación de especies poco volátiles aumentando la temperatura. cuando la radiación en el pico de absorción está en un mínimo. suelen utilizarse temperaturas de excitación más bajas para el análisis de los metales alcalinos.4. por lo general. El sistema de tratamiento de datos resta entonces la absorbancia del fondo de la total para obtener un valor corregido. en particular del potasio. son el EDTA. También se han encontrado ejemplos de interferencias de cationes. de acuerdo con la ecuación de Boltzmann.3.2.6. Interferencias químicas El tipo más común de interferencia es probablemente el producido por aniones que forman compuestos de baja volatilidad con el analito y reducen así su velocidad de atomización. se produce en milisegundos. muchos materiales de interés. que corresponde exactamente a la longitud de onda del pico de absorción. 1. Técnicas analíticas en absorción atómica 1. En el comercio se encuentran instrumentos equipados para este tipo de corrección. hay una disminución de la concentración de átomos como resultado de la ionización. no son directamen- 26 . En algunos casos se hallan límites de detección muy alejados de estos intervalos. en determinadas circunstancias. 1. Limites de detección Para muchos elementos. que son cationes que reaccionan preferentemente con el interferente e impiden su interacción con el analito. como consecuencia se suprime la ionización del analito.Análisis Instrumental Módulo Analítico de absorber la radiación emitida por las especies excitadas. Sin embargo.3. derivados del petróleo y minerales.3. se obtienen buenos espectros de emisión para la mayoría de los elementos en unas mismas condiciones de excitación. lámpara de descarga sin electrodo y láseres. arco o chispa con frecuencia son muy complejos. Esta cantidad de líneas. bromo. se pueden registrar simultáneamente espectros para docenas de elementos. las fuentes de llama son menos satisfactorias.Análisis Instrumental Módulo Analítico te solubles en los disolventes habituales. no ha tenido una gran aplicabilidad debido a la gran eficacia de los métodos de absorción y emisión atómica que se desarrollaron previamente. Sin embargo. nítrico o perclórico (digestión húmeda). las fuentes de plasma permiten la determinación de no metales como cloro. La espectrometría de emisión de plasma. Una de las ventajas de la atomización electrotérmica es que algunos materiales pueden atomizarse directamente evitando de esta manera la etapa de la disolución. digestión a elevada temperatura. compuestos que son muy resistentes a la descomposición térmica. yodo y azufre. y es arriesgado realizar un análisis por absorción atómica sin determinar experimentalmente si existe o no una relación lineal. circonio y niobio). 1. Fuente: lámparas de cátodo hueco. la región de la llama que permite obtener intensidades óptimas de la línea analítica es distinta de un elemento a otro. descarga luminiscente o un plasma de acoplamiento inductivo. o incluso miles. Finalmente.3. fósforo. Espectroscopía de fluorescencia atómica La técnica es adecuada y útil para la determinación de un número razonable de elementos. porque las condiciones óptimas de excitación varían mucho de un elemento a otro. los métodos con fuentes de plasma tienen generalmente unos intervalos lineales de concentración que abarcan varias decenas de órdenes de magnitud. Además no ha demostrado ninguna ventaja significativa sobre los métodos de absorción y emisión ya establecidos.2. que es una consecuencia directa de sus temperaturas más elevadas. En segundo lugar. la absorción atómica debería cumplir la ley de Beer. siendo la absorbancia directamente proporcional a la concentración. de líneas.6. en consecuencia. carbonato sódico. de hecho se encuentran con frecuencia desviaciones de la linealidad. combustión en una bomba de oxígeno o en otro recipiente para evitar pérdidas del analito. Desde este punto de vista. es que permiten la determinación de bajas concentraciones de elementos que tienden a formar compuestos refractarios (es decir. Los espectros de emisión obtenidos utilizando fuentes de plasma. Curvas de calibración En teoría. Alguno de los métodos más habituales para la descomposición y disolución de las muestras en los métodos de absorción atómica son: tratamiento con ácidos minerales en caliente.3. peróxido sódico o pirosulfato potásico. Entre sus ventajas está la menor interferencia entre elementos. tales como óxidos de boro. que es muy 27 .7. por último. a diferencia de los métodos de absorción descritos en el capítulo anterior que sólo abarcan dos o tres órdenes. fusión a elevada temperatura con reactivos como óxido bórico. se necesitan altas temperaturas para la excitación de algunos elementos y bajas para otros. Además. Emisión atómica Generalmente. Otra ventaja de las fuentes de plasma. durante el proceso. uranio. La rápida relajación de las especies excitadas va acompañada de la producción de espectros de líneas ultravioleta y visible que son útiles para el análisis cualitativo y cuantitativo de los elementos. excitan una parte de estas especies a estados electrónicos superiores. se debería preparar periódicamente una curva de calibrado que cubra el intervalo de concentraciones correspondiente a la muestra. sino que también. los atomizadores citados anteriormente no sólo transforman los componentes de las muestras en átomos o iones elementales sencillos. y con frecuencia requieren un tratamiento previo laborioso para obtener una disolución del analito adecuada para la atomización. horno termoeléctrico. en la atomización y en la medida de la absorbancia existen un gran número de variables incontrolables que justifican la medida de una disolución patrón cada vez que se realiza un análisis 1. oxidación con reactivos líquidos como ácidos sulfúrico. están constituidos por cientos. 1. Además. Sin embargo. Esta propiedad tiene especial importancia en el análisis multielemental de muestras muy pequeñas. wolframio. más energéticas. Por consiguiente. arco y chispa ofrece varias ventajas con respecto a los métodos de absorción de llama y electrotérmico.4. Receptáculo de muestra: llama. un plasma es una mezcla gaseosa conductora de la electricidad que contiene una concentración significativa de cationes y electrones (la concentración de ambos es tal que la carga neta se aproxima a cero). A continuación el vapor se conduce hasta la antorcha de plasma mediante un flujo de argón. Sin embargo. el calentamiento óhmico es consecuencia de la resistencia que presentan los iones y electrones a este movimiento. Los iones resultantes y sus electrones asociados interaccionan entonces con el campo magnético oscilante producido por la bobina de inducción. Los efectos de interferencia por ionización son pequeños o inexistentes debido a que la concentración de los electrones que provienen de la ionización del Ar es mucho mayor que los que provienen del analito.1. En el plasma de argón empleado frecuentemente en los análisis de emisión.000 K. Atomización e ionización de los analitos Las observaciones se hacen a 15-20 mm por encima de la bobina de inducción. a la vez que mantiene el amplio intervalo lineal de trabajo.4. la ausencia de interferencias y la aptitud para el análisis multielemental del ICP. Una vez que se han formado los iones de argón en un plasma. los iones de argón y los electrones son las principales especies conductoras.4. Por lo que la atomización es más completa y hay menos problemas de interferencias químicas. (2) plasma de corriente continua (DCP). La sección transversal es relativamente uniforme y como 28 . En esta zona la radiación de fondo está libre de líneas de Ar y es adecuada para el análisis. Espectroscopía de emisión con fuente de plasma Por definición.Análisis del elemento de interés por encima del núcleo (10-30mm) con plasma ópticamente transparente. Existen tres tipos de plasma de alta temperatura: (1) plasma de acoplamiento inductivo (ICP). la muestra se vaporiza en un horno similar a los descritos para la atomización electrotérmica. Esta interacción hace que los iones y los electrones dentro de la bobina se muevan en trayectorias circulares. La ionización del argón que fluye se inicia por medio de una chispa que proviene de una bobina Tesla. En el momento en el que los átomos alcanzaron la zona de observación estuvieron 2 ms a temperatura entre 4000 y 8000 K. Fuente de plasma de acoplamiento inductivo La antorcha consiste en tres tubos concéntricos de cuarzo a través de los cuales fluyen corrientes de argón. aumenta la probabilidad de interferencias espectrales en el análisis cuantitativo 1.Análisis Instrumental Módulo Analítico ventajosa cuando se busca información cualitativa. aunque los cationes de la muestra también estén presentes en menor cantidad. en general. Los dispositivos más utilizados para la inyección de la muestra son los nebulizadores. La atomización se produce en un medio “inerte” lo que aumenta el tiempo de vida del analito al evitar la formación de óxidos. 1. Con frecuencia. la mayor fuente de ruido en un método de ICP radica en la etapa de introducción de la muestra. El núcleo tiene una emisión continua (como la llama de combustión) sobre la que se superpone el espectro del propio argón (puede ser recombinación de e. En este caso. blanco brillante e intenso coronado por una cola en forma de llama. el horno se utiliza únicamente para la introducción de la muestra y no para la atomización de la muestra. La señal observada consiste en un pico fugaz semejante a los picos obtenidos en absorción atómica electrotérmica. La vaporización electrotérmica acoplada a una antorcha de plasma ofrece las ventajas de los hornos electrotérmicos de poder analizar micromuestras y de poseer bajos límites de detección.1. La observación analítica es. Estos tiempos y temperaturas son dos o tres veces mayores que los alcanzados por los métodos de llama. son capaces de absorber la suficiente energía de una fuente externa como para mantener la temperatura a un nivel tal que la posterior ionización sustente el plasma indefinidamente.1. Rodeando la parte superior de este tubo se encuentra una bobina de inducción.con otros iones o el propio argón). que está alimentada por un generador de radiofrecuencia. para las aplicaciones de plasma. Introducción de la muestra Las muestras se introducen dentro de la antorcha mediante un flujo a través del tubo central de cuarzo. y (3) plasma inducido por microondas (MIP). Otro método para la introducción de muestras líquidas y sólidas en un plasma es la vaporización electrotérmica. refrigerada por agua. Aspecto del plasma y espectros Núcleo no transparente. la temperatura puede llegar a ser de 10. a 15-20mm de la bobina de inducción. Se ioniza el Ar y se desarrolla una corriente (~14 A). 1. Por lo tanto se obtienen curvas de calibración lineales de varios órdenes de magnitud. Por otra parte. se utilizan poco los instrumentos de transformada de Fourier. La temperatura en el núcleo del arco es de 10000 K y en la zona de observación de 5000 K. los instrumentos multicanal se diseñan para medir simultánea o casi simultáneamente la intensidad de las líneas de emisión de un gran número de elementos (a veces tantos como 50 o 60). excita y examina. la red es fija y es la rendija y el tubo fotomultiplicador los que se mueven a lo largo del plano o curva focal. Fuente de plasma de corriente continua Consiste en tres electrodos: dos ánodos de grafito y un cátodo de W. Por ello.Análisis Instrumental Módulo Analítico consecuencia no se producen efectos de autoabsorción y autoinversión.2. resultan caros en términos de consumo de muestra y de tiempo. con un detector fotomultiplicador. multicanal simultáneos y de transformada de Fourier. El Ar fluye desde los bloques anódicos hacia el catódico. Espectrómetros con fuente de plasma Propiedades deseables de un espectrómetro de emisión: Los instrumentos para espectroscopia de emisión son principalmente de tres tipos: secuenciales. el barrido se realiza girando la red por medio de un motor paso a paso controlado digitalmente. En este caso. No obstante.2.4.2. uno para la región ultravioleta y el otro para el visible. Espectrómetros secuenciales La mayoría de los instrumentos secuenciales incorporan un monocromador de red. En algunos instrumentos de este tipo. estos instrumentos. Actualmente. aunque son más sencillos. La sensibilidad es menor o igual que la del plasma de acoplamiento inductivo y la reproducibilidad es comparable. Los instrumentos secuenciales generalmente se programan para ir de la línea de un elemento a la de otro. de manera que las distintas longitudes de onda se van enfocando secuencialmente y con mucha precisión en la rendija de salida. a una determinada longitud de onda. en algunos diseños. Cuando se han de determinar varios elementos.4. La muestra se aspira dentro del área entre los dos ánodos donde se atomiza. 29 . Consume menos Ar y la fuente auxiliar es más sencilla y barata. 1.1. 1. el tiempo de excitación será bastante mayor con los instrumentos secuenciales que con los otros dos tipos. esperando el tiempo suficiente (pocos segundos) hasta obtener una relación señal/ruido satisfactoria.600 surcos por milímetro. Generalmente la red es holográfica con 2. Por otra parte los electrodos de grafito se han de sustituir cada pocas horas con lo que requiere mayor mantenimiento.1. También se comercializan instrumentos que tienen dos juegos de rendijas y tubos fotomultiplicadores.400 o 3. el haz de salida se cambia de una rendija a la otra moviendo un espejo plano.4. Análisis Instrumental Módulo Analítico Espectrómetros de barrido giratorio Con espectros complejos compuestos por cientos de líneas, realizar el barrido de una región significativa de longitudes de onda conlleva una cantidad de tiempo excesivo, lo que resulta poco práctico. Para solventar parcialmente este problema, se han desarrollado los espectrómetros de barrido giratorio, en los que la red, o el detector y la rendija, se mueven mediante un motor de dos velocidades. En este caso, el instrumento se mueve rápidamente o gira hacia una longitud de onda próxima a una línea. La velocidad del movimiento se ralentiza rápidamente, de manera que el instrumento barre a través de la línea en una serie de pequeñas etapas (de 0,01 a 0,001 nm). Es esencial el control de dicho instrumento por ordenador. Con el barrido giratorio, se minimiza el tiempo gastado en las regiones de longitud de onda sin datos útiles, sin embargo, se emplea en las líneas analíticas el tiempo suficiente para obtener relaciones señal-ruido satisfactoria. Espectrómetros de red de escalera de barrido Puede funcionar como un instrumento de barrido o como un espectrómetro multicanal simultáneo. El barrido se lleva a cabo por movimiento de un tubo fotomultiplicador en las dos direcciones x e y para barrer una placa de rendijas localizada en el plano focal del monocromador. La placa contiene 300 rendijas fotograbadas. El tiempo necesario para cambiar de una rendija a otra es generalmente de 1 s. El instrumento puede funcionar en la modalidad de barrido giratorio. También puede convertirse en un policromador multicanal colocando varios tubos fotomultiplicadores pequeños detrás de las rendijas adecuadas en la placa de rendijas. 1.4.2.2. Espectrómetros multicanal Los instrumentos multicanal simultáneos pertenecen a dos tipos generales: policromadores y sistemas de elementos en serie. El primero utiliza para la detección una serie de tubos fotomultiplicadores, mientras que el segundo emplea como detectores dispositivos bidimensionales de inyección de carga o dispositivos de acoplamiento de carga. Policromadores La superficie de la red cóncava, las rendijas de entrada y de salida se localizan alrededor de un círculo de Rowland cuya curvatura corresponde a la curva focal de la red cóncava. La radiación que proviene de las rendijas de salida se refleja mediante espejos hacia los tubos fotomultiplicadores. Las rendijas vienen fijadas por el fabricante para transmitir las líneas de los elementos fijadas por el usuario. Sin embargo se puede cambiar la distribución de las líneas para incorporar nuevos elementos o eliminar otros. La rendija de entrada se puede mover tangencialmente en el círculo con un motor de paso, permitiendo el barrido a través de los picos y proporciona información para las correcciones de fondo. Instrumentos de inyección de carga Disponen de espectrómetros de red de escalera y de detectores bidimensionales de transferencia de carga. Emplea un prisma de CaF2 que clasifica la radiación que llegará a una red de escalera donde se forman los distintos órdenes espectrales. El detector es un dispositivo de inyección de carga. Un espejo focaliza las imágenes de la rendija sobre la superficie del detector. Para eliminar la corriente oscura en los elementos del detector, la unidad se introduce en nitrógeno líquido que mantiene la temperatura a 135 K. 39 elementos de detección (ventana de lectura) para controlar cada línea espectral. Habitualmente la línea espectral se focaliza sobre los 9 elementos centrales de la ventana, mientras que los otros 15 proporcionan información sobre la intensidad del fondo. Para producir S/N buenas en el caso de líneas de emisión débiles se pueden utilizar tiempos de integración de 100 s o más. Se calibra con respecto a la línea de Hg (de una lámpara de 253,65 nm). 1.4.3. Aplicaciones de las fuentes de plasma Las fuentes de plasma son ricas en líneas de emisión características, lo que hace que sean útiles para el análisis elemental tanto cualitativo como cuantitativo. Resulta incuestionable que las fuentes de plasma de acoplamiento inductivo y de corriente continua proporcionan datos analíticos cuantitativos mucho mejores que otras fuentes de emisión. La calidad de estos resultados radica en su gran estabilidad, bajo ruido, poca 30 Análisis Instrumental Módulo Analítico radiación de fondo y la ausencia de interferencias cuando se trabaja en unas condiciones experimentales apropiadas. Con respecto a los límites de detección, el funcionamiento de la fuente de plasma de acoplamiento inductivo es algo mejor que el de la fuente de plasma de corriente continua. Sin embargo, esta última cuesta menos comprarla y mantenerla, y para muchas aplicaciones analíticas resulta totalmente satisfactoria. 1.4.3.1. Preparación de la muestra La espectroscopia de emisión de plasma de acoplamiento inductivo se utiliza principalmente para el análisis cualitativo y cuantitativo de muestras que están disueltas o en suspensión en disolventes acuosos u orgánicos. Los métodos para la preparación de dichas disoluciones son similares a los descritos de absorción atómica de llama. Algunos de los métodos habituales son: tratamiento con ácidos minerales en caliente; oxidación con reactivos líquidos (digestión húmeda); combustión en bomba de oxígeno; digestión a elevada temperatura; fusión a elevada temperatura, usando óxido bórico, carbonato sódico, mineralización por microondas. Sin embargo, con los de emisión de plasma, existe la posibilidad de analizar directamente muestras sólidas. Para ello se utilizan procedimientos de vaporización electrotérmica, ablación por láser o por chispa y descarga luminiscente. 1.4.3.2. Elementos susceptibles de determinación En principio, se pueden determinar todos los elementos metálicos por espectrometría de emisión de plasma. Para la determinación de boro, fósforo, nitrógeno, azufre y carbono se necesita un espectrómetro de vacío, porque las líneas de emisión de estos elementos se encuentran por debajo de 180nm, zona en la que absorben los componentes atmosféricos. Su utilidad para el análisis de metales alcalinos se encuentra limitada por dos razones: (1) las condiciones de trabajo que pueden adaptarse para la determinación de la mayoría de los otros elementos no son adecuadas para los metales alcalinos, y (2) las líneas más intensas del Li, K, Rb y Cs se sitúan en longitudes de onda del infrarrojo cercano, lo que conduce a problemas de detección con muchos espectrómetros de plasma que están diseñados principalmente para la radiación ultravioleta. Debido a esta clase de problemas, la espectroscopia de emisión de plasma generalmente se limita a la determinación de aproximadamente 60 elementos. 1.4.3.3. Selección de la línea analítica La mayoría de los elementos tienen varias líneas significativas que se pueden utilizar para su identificación y cuantificación. Generalmente se puede encontrar una línea adecuada para la determinación de cualquier elemento. La selección dependerá de los elementos que se hallen en la muestra y de la posibilidad de solapamiento de líneas. 1.4.3.4. Curvas de calibrado Las curvas de calibrado en espectrometría de emisión de plasma consisten la mayoría de las veces en una representación gráfica de la intensidad de corriente o de la tensión de salida del detector en función de la concentración del analito. Con frecuencia, las curvas de calibrado son lineales. Sin embargo, se encuentran desviaciones de la linealidad cuando se cubren intervalos grandes de concentración. La principal causa de la no linealidad es la autoabsorción, en la que la señal de salida disminuye como consecuencia de la absorción por parte de átomos no excitados del medio. La autoabsorción sólo comienza a ser evidente a elevadas concentraciones del analito y origina que la curva de calibrado se curve hacia el eje de abscisas. La no linealidad surge también de correcciones del fondo erróneas y de respuestas no lineales de los sistemas de detección. Frecuentemente se utiliza un patrón interno en la espectrometría de emisión. Los límites de detección obtenidos en emisión de plasma de acoplamiento inductivo son comparables o mejores que otros métodos espectrales atómicos. 1.4.3.5. Interferencias En las fuentes de plasma, las interferencias químicas y de matriz son significativamente menores que con otros atomizadores, tal como se ha subrayado anteriormente. Sin embargo, a concentraciones bajas de analito, la emisión de fondo debida a la recombinación de iones de argón con electrones es lo suficientemente intensa como para requerir correcciones cuidadosas. Con los instrumentos monocanal, esta corrección se consigue de forma adecuada a partir de las medidas realizadas a ambos lados del pico. Muchos instrumentos multicanal están equipados con elementos ópticos que permiten correcciones similares. Dado que los espec- 31 Análisis Instrumental Módulo Analítico tros de ICP para muchos elementos son muy ricos en líneas, se producen interferencias espectrales debido a solapamiento de líneas. 1.4.4. Espectrometría de emisión con fuentes de arco y chispa Las espectrometrías con fuentes de arco y chispa están basadas en la obtención mediante la excitación del espectro de emisión de los elementos por medio de arcos eléctricos o chispas eléctricas. En las fuentes de arco y chispa, la excitación de la muestra se produce en el pequeño espacio existente entre dos electrodos. El paso de electricidad entre los electrodos a través de este pequeño espacio proporciona la energía necesaria para atomizar la muestra y producir átomos o iones en estados electrónicos excitados. Los espectros de emisión permiten la determinación de elementos metálicos en varios tipos de muestras sólidas: metales, aleaciones, suelos, minerales y rocas. Las fuentes de arco y chispa todavía encuentran un uso considerable en análisis cualitativo, pero han sido desplazados por los métodos de plasma en análisis cuantitativo. 1.5. Luminiscencia molecular La fluorescencia y fosforescencia molecular y la quimioluminiscencia se conocen en conjunto como luminiscencia molecular. En todos estos procesos, las moléculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo. La fluorescencia y fosforescencia utilizan como fuente de excitación la absorción de fotones por lo que se las suele denominar fotoluminiscencia. La quimioluminiscencia se basa en el espectro de emisión de una especie excitada que se forma en el curso de una reacción química (analito + oxidante en general) que da lugar a un producto de oxidación del reactivo o del analito. En algunos casos es el analito el que, sin participar de la reacción, ejerce un efecto catalítico o de inhibición de la reacción. 1.5.1. Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia La fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y sólidos. Como ejemplo los electrones 3s de los átomos de sodio en estado vapor pueden ser excitados al 3p absorbiendo luz de 589, 6 y 589,0 nm y pasados 10-8 a 10-5 segundos volver al estado fundamental emitiendo luz de la misma λ en todas las direcciones. También puede ocurrir con especies moleculares. La fluorescencia en donde la emisión se produce sin cambio de frecuencia respecto de la absorción se llama fluorescencia de resonancia. Lo más frecuente es encontrar bandas de fluorescencia o fosforescencia molecular centradas en λ más largas (o energías menores), este desplazamiento se conoce como Stokes. 1.5.1.1. Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia Spin del electrón El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haber dos electrones con los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricción requiere que no haya más de dos electrones en un orbital, y además, los dos deben tener los estados de espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines están apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayoría de las moléculas no presentan un campo magnético neto y se dice, por tanto, que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos permanentes. Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un momento magnético y, consecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un campo magnético; por ello, se dice que los radicales libres son paramagnéticos. Estados excitados singulete/triplete Cuando uno de los electrones de la molécula es excitado a un nivel de energía superior, se genera un estado singulete o triplete; será singulete si el Spin del electrón promovido continúa apareado con el del estado fundamental y será triplete si está desapareado. El estado singulete excitado es más ener- 32 La probabilidad de excitar de singulete a triplete excitado es baja y los picos de absorción son muy poco intensos. 1. 33 . 1. Las dos líneas de la izquierda representan estados electrónicos singulete uno (S1) y singulete dos (S2) y la de la derecha la energía del primer estado electrónico triplete (T1). Las propiedades de una molécula son diferentes en el estado triplete excitado respecto del singulete (diamagnética y paramagnética por ejemplo). De allí.1. La energía de T1 es menor. normalmente singulete representada por So (a temperatura ambiente es la energía de aproximadamente todas las moléculas en una solución). el tiempo de vida medio de un triplete excitado va de 10-4 a varios segundos y el de un singulete excitado de 10-8 a 10-5.Análisis Instrumental Módulo Analítico gético que el triplete excitado. supone un cambio en el estado electrónico y es menos probable que un singulete/singulete. • Líneas gruesas superiores son los niveles de energía de los estados vibracionales fundamentales de los tres estados electrónicos excitados.5. Diagramas de niveles de energía para las moléculas fotoluminiscentes Fig.15: Diagrama de energía parcial para un sistema fotoluminiscente. Importante: una transición singulete/triplete o al revés. • Línea gruesa horizontal inferior representa la energía del estado fundamental.2. 1.14: Estados de spin. Es posible poblar un estado singulete excitado a triplete excitado y se obtiene fosforescencia Fig. Procesos de desactivación La molécula excitada puede volver al estado fundamental por diversos procesos: Las líneas rectas corresponden a desactivación por emisión de un fotón de radiación (fluorescencia o fosforescencia) y las flechas onduladas corresponden a desactivación no radiativa. Para sistemas débilmente absorbentes. 1. mucho menor que el tiempo de vida del estado excitado electrónicamente.5. es de baja probabilidad y suele llamársela transición prohibida). Sin embargo. Desplazamiento Stokes (a > λ). La conversión interna a través de niveles vibracionales solapados es normalmente más probable que la pérdida de energía por fluorescencia.1. Conversión interna Describe los procesos intermoleculares por los cuales la molécula pasa a un estado electrónico de más baja energía sin emisión de radiación. Por tanto. La transición se produce desde el nivel vibracional más bajo del estado excitado electrónico (S1 a So). Esta relajación es muy rápida (aproximadamente 10-12 segundos o menos).5. Los otros caminos de desactivación tienen explicación menos elaborada pero requieren consideración. 34 .1. el proceso requiere del orden de 10-15 a 1014 s. La excitación directa (disociación) o relajación por conversión interna (predisociación) que conducen a un estado vibracional lo suficientemente grande para provocar la ruptura de un enlace compiten con los procesos de fluorescencia. tiene lugar a una velocidad significativamente más lenta. • La excitación desde So a T1 no se muestra por poco importante (implica cambio de multiplicidad. la emisión fosforescente requiere tiempos comprendidos entre 10-4 y 10 s o superiores. los tiempos de vida pueden ser tan largos como de 10-6 a 10-5 s. la excitación puede dar como resultado la conversión de la molécula a cualquiera de los diversos estados vibracionales. la velocidad promedio de una transición triplete a singulete es menor que la correspondiente transición singulete a singulete. la fluorescencia desaparece o es menos intensa. en disolución. Las velocidades del proceso de emisión fluorescente se pueden calcular cuantitativamente. donde la probabilidad del proceso de transición es más pequeña. Si el sistema puede decaer del sistema electrónico excitado al fundamental por conversión interna entonces rara vez emite fluorescencia (compuestos alifáticos).Análisis Instrumental Módulo Analítico • Las líneas finas son los estados electrónicos vibracionales (varias). el exceso de energía vibracional se pierde rápidamente por colisiones (entre moléculas excitadas o con el solvente). Por otro lado. Como se ha señalado.4. Relajación vibracional La molécula excitada puede posicionarse en cualquiera de los niveles vibracionales pero. la emisión fluorescente. Como resultado hay una transferencia de energía y un pequeño aumento de la temperatura del solvente. Por ello. Velocidades de absorción y emisión La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme. El tiempo de vida del estado excitado se relaciona inversamente con la absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso de excitación. • La excitación de la molécula en So puede producirse por la absorción de dos bandas de radiación. para absortividades molares comprendidas entre 103 y 105. los tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7 s. 1. aparecen varios picos que se corresponden con que el electrón puede volver a cualquiera de los estados vibracionales del fundamental hasta llegar al estado más bajo vibracional del electrónico fundamental.3. Para ver fotoluminiscencia se requieren sistemas con características estructurales y ambientales que hagan que los procesos de relajación no radiativos se hagan lentos de modo que la emisión radiante pueda competir desde el punto de vista cinético. se observa fluorescencia. El camino más propicio para volver al fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado. una alrededor de λ1 (Sol S1) y la otra alrededor de λ2 (So l S2). Cuando la desactivación por fluorescencia es más rápida que la desactivación no radiante. Es eficaz cuando dos niveles electrónicos están lo suficientemente próximos para que se solapen los niveles de energía vibracional. De no ser así. Análisis Instrumental Módulo Analítico Conversión externa o atenuación colisional Es el proceso mediante el cual la desactivación ocurre de un estado electrónico excitado a través de la transferencia de energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros solutos. La fluorescencia se observa (experimentalmente) en compuestos cuya transición de más baja energía es π → π*.5. Tipos de transiciones en fluorescencia Se produce con radiación de longitud de onda mayor que 250 nm. valores menores puede producir desactivación por otras vías (predisociación). Una transición triplete → singulete es mucho menos probable que una transición singulete → singulete. furano).5. Eficacia cuántica y tipo de transición La fluorescencia está más asociada con transiciones π → π*. la intensidad fluorescente aumenta con el número de anillos y con su grado de condensación.1. Las conversiones internas y externas compiten con tanto éxito con la fosforescencia que normalmente se observa a bajas temperaturas. en medios altamente viscosos o por moléculas adsorbidas en superficies. -OCH3) aumentan intensidad fluorescente. Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia Rendimiento cuántico El rendimiento cuántico. de fluorescencia o de fosforescencia es simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto al número total de moléculas excitadas. Heterociclos con nitrógeno. La mayoría de los aromáticos no sustituidos son fluorescentes en solución. a 200 nm la energía es 140 kcal/mol y se pueden romper enlaces. Efectos de estructura Los hidrocarburos saturados no presentan luminiscencia (σ). ya que tales transiciones presentan tiempos de vida medios más cortos y porque es menos probable que tengan lugar los procesos de desactivación que compiten con la fluorescencia. inhibe en general la fluorescencia. Sustituyentes donores de electrones (-NH2. para ellas la eficiencia cuántica es mayor. externa o por fosforescencia. aumenta la predisociación debido al enlace de fácil ruptura. Fosforescencia Después del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado. la desactivación posterior puede tener lugar por conversión interna. También termodinámicamente se observa que la constante de velocidad para el cruce entre sistemas es menor para los estados excitados π → π*. Las estructuras condensadas con benceno presentan fluorescencia. tiempos de vida más corto. Ver explicación a través de valor de la absortividad molar (100 a 1000 veces superior en π → π* con tiempos de vida más cortos). Los heterociclos sencillos no presentan fluorescencia (piridina. la transición de más baja energías es nlπ* que impide la fluorescencia pero. 1. -OH. por lo que el tiempo de vida medio del estado excitado respecto a la emisión es mucho mayor. Se favorece con la presencia de átomos pesados (I. Br) y con la presencia de especies paramagnéticas (oxígeno) en solución. Cruce entre sistemas Es un proceso en el cual se invierte el espín de un electrón excitado (cambia la multiplicidad de la molécula). Entonces aquellas condiciones que reduzcan el número de colisiones (baja T y elevada viscosidad) aumentan la fluorescencia. Átomos pesados internos (sustituyentes haluros) aumenta el cruce a estados tripletes y favorecen la fosforescencia. En el caso de NO2 y I. La tran- 35 . Entonces no hay fluorescencia para transiciones σ* → σ y si para transiciones de menor energía π* → π o π* → n. la adición de anillos bencénicos aumenta la absortividad molar del pico de absorción. o la eficacia cuántica. La probabilidad aumenta si se solapan los niveles vibracionales. La adición de un ácido carboxílico o de un grupo carbonilo. Autoabsorción: tiene lugar cuando la longitud de onda de emisión se solapa con un pico de absorción. Estos efectos pueden ocasionar un máximo en IF vs. Esto se debe a que la falta de rigidez de una molécula puede provocar un aumento en la velocidad de conversión interna y un consecuente aumento de desactivación no radiativa. Efecto del oxígeno disuelto La presencia de oxígeno reduce la intensidad de fluorescencia debido a (i) oxidación de las especies fluorescentes inducida fotoquimicamente o (ii) la presencia de especies paramagnéticas como el oxígeno favorece el cruce de sistemas y la conversión a estados tripletes. 1. C. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisión son diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. 36 .Análisis Instrumental Módulo Analítico sición n → π* tiene menor energía que la transición π → π* y el rendimiento de fluorescencia es menor para primer caso. la fluorescencia disminuye porque la radiación emitida atraviesa la solución y es reabsorbida por otras moléculas fluorescentes. Ciertos agentes quelantes orgánicos aumentan su fluorescencia al complejarse con iones metálicos porque la estructura es más rígida. 3. Auto-atenuación: es el resultado del aumento de colisiones entre moléculas excitadas que aumenta la transferencia de energía por vía no radiante. Efecto de la temperatura y del disolvente El rendimiento cuántico de la fluorescencia disminuye al aumentar la temperatura ya que aumenta la frecuencia de colisiones y por lo tanto la probabilidad por conversión externa. Efecto de la concentración Desviaciones negativas: 1. los términos de órdenes superiores de la expansión no son despreciables y entonces hay desviaciones negativas.16: Curva de calibración para el sulfato de quinina. 2. Rigidez estructural La fluorescencia se favorece en moléculas con estructuras rígidas. La parte no rígida de la molécula puede sufrir vibraciones de baja frecuencia respecto de otras partes y esos movimientos explican ciertas pérdidas de energía. Una disminución de la viscosidad del disolvente también aumenta la probabilidad de conversión externa y conduce a una disminución del rendimiento cuántico de fluorescencia. Fig. Efecto del PH La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende del pH. Cuando C es elevada. 1. Componentes de los fluorímetros y los espectrofluorímetros Fuentes La magnitud de la señal es proporcional a la potencia de la fuente por lo que se usan fuentes más intensas. .5. 1. Generalmente.5. Espectros de excitación y emisión El espectro de excitación se obtiene midiendo la intensidad luminiscente a una longitud de onda fija variando la longitud de onda de excitación y es prácticamente igual a un espectro de absorción. detectores de diodos en serie y transferencia de carga (para detección rápida). cuatro caras espejadas o dos consecutivas. La Figura 1.Lámpara de arco de Xe: fuente de radiación continua desde 250 a 800 nm. monocromadores de red (uno ó dos). robustos y fáciles de usar. de un fluorímetro o un 1. Se utilizan FM.Lámpara de arco de Hg: emite líneas a 254.Láseres: ideales cuando las concentraciones son muy bajas y cuando se requiere radiación monocromática para minimizar los efectos de las interferencias fluorescentes. rectangulares o cilíndricas.18 muestra un esquema de un fluorímetro de filtros característico que consta de una lámpara de mercurio para la excitación de la fluorescencia y un par de tubos fotomultiplicadores como detectores.2. Fig. 1. Instrumentos para la medida de la fluorescencia y fosforescencia 1. Diseño de instrumentos Fluorímetros Los fluorímetros de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de llevar a cabo análisis cuantitativos por fluorescencia. 578. El haz que sale de la fuente se divide cerca de ella en un haz de refeFig. para seleccionar las longitudes de onda de la radiación de excitación y de emisión se utilizan filtros de interferencia y de absorción. 313. Filtros y monocromadores Filtros de interferencia.1. los fluorímetros son compactos. . 302. Los espectros de fluorescencia y fosforescencia.17: Componentes espectrofluorímetro.2. 37 . .5. 1. Detectores Las señales son de baja intensidad por lo que se requiere elevada ganancia de amplificador. 546.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.6.18: Un fluorímetro típico. Como ya se ha señalado. Cubetas Vidrio o cuarzo.2.2. 691 y 773 nm que se pueden aislar con filtros adecuados.5. después de ser dispersada en el segundo monocromador. 2) Normalmente las medidas de fosforescencia se realizan a la temperatura de nitrógeno líquido (77 K) para prevenir la degradación de salida por desactivación colisional. Todas estas características instrumentales varían con la longitud de onda y difieren de un instrumento a otro.19 suministra perfectamente espectros satisfactorios para el análisis cuantitativo. del detector y de los monocromadores. que es el verdadero espectro de fluorescencia. El haz de referencia se atenúa mediante el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente la misma que la intensidad de fluorescencia. La radiación que procede del primer monocromador se divide en dos. los espectros de emisión obtenidos no son necesariamente comparables con los de otros instrumentos. ya que la señal de salida depende no sólo de la intensidad de fluorescencia sino también de las características de la lámpara.19 se muestra el diseño óptico de uno de ellos. El haz de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y provoca la emisión de fluorescencia. Un instrumento como el que se muestra en la Figura 1. Fosforímetros Los instrumentos utilizados para estudios de fosforescencia tienen dos componentes adicionales: 1) Dispositivo que alterna excitar (irradiando la muestra) y medir la intensidad de fosforescencia (después de un retraso de tiempo adecuado). que utiliza dos monocromadores de red. En la Figura 1. una parte se dirige hacia el fotomultiplicador de referencia y la otra hacia la muestra. 38 . Espectrofluorímetros Algunos fabricantes de instrumentos ofertan espectrofluorímetros capaces de obtener los espectros de excitación y los de emisión. Las señales de salidas eléctricas de los dos detectores se dirigen hacia un divisor analógico. La radiación emitida pasa a través de un segundo filtro que posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador. Por lo que se requiere un recipiente Dewar con ventanas de cuarzo. La radiación fluorescente resultante. Sin embargo. Ambos haces pasan a través del filtro primario y a continuación el haz de referencia se refleja hacia el tubo fotomultiplicador de referencia. se detecta en un segundo fotomultiplicador. Se han desarrollado varios métodos para obtener el espectro corregido. para obtener la relación entre las intensidades de la muestra y de referencia. muchos de los instrumentos comerciales modernos y más sofisticados están preparados para obtener directamente los espectros corregidos Fig. Esto es necesario para separar la emisión fosforescente de larga vida de la fluorescente. 1. El analito existe en forma de un soluto en un disolvente sólido.Análisis Instrumental Módulo Analítico rencia y en un haz de muestra. libre de efectos instrumentales.19: Un espectrofluorímetro. que sirve como parámetro analítico. En la cromatografía en plano. 1. un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por presión. la fase estacionaria se fija sobre una placa plana y la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad. Por el contrario. Determinación fluorimétrica de iones inorgánicos y determinación fluorimétrica de especies orgánicas: más de 200 sustancias incluyendo compuestos orgánicos. Ya que la sensibilidad de un método espectrométrico de emisión se puede aumentar aumentando P0 mientras que en espectrofotometría de absorción un aumento en P0 también aumenta P y no afecta A. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. esteroides y vitaminas. Las medidas de fotoluminiscencia proporcionan un importante método para la detección y determinación de los componentes que eluyen de columnas cromatográficas. 1.6. 39 . los componentes de la muestra se separan en bandas que pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente. La muestra se desplaza con una fase móvil (gas. se mueven con rapidez. enzimas. agentes medicinales. Las dos fases se elijen de tal modo que los componentes se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria.5.3. productos naturales. Introducción a las separaciones cromatográficas Cromatografía es un método de separación que permite separar componentes de mezclas complejas.Análisis Instrumental Módulo Analítico Fig.20: Esquema de un dispositivo para alternativamente excitar y observar la fosforescencia. Como consecuencia de la distinta movilidad. Aplicaciones Los métodos espectrométricos de emisión tienen sensibilidades dos o tres órdenes de magnitud superiores a los métodos de absorción. 1. líquido. En la cromatografía en columna. fluido supercrítico) que se hace pasar sobre una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una columna o superficie sólida. En el mejor de los casos.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.21). Clasificación de los métodos cromatográficos en columna 1.6. Esta fracción de tiempo es pequeña para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria. La introducción de fase móvil adicional (el eluyente) hace que la fase móvil que contiene una parte de la muestra avance por la columna. Al mismo tiempo. o zonas. Y es grande cuando es más probable la retención en la fase móvil (componente A). la velocidad media a la que una zona de soluto migra en la columna depende de la fracción de tiempo que reside en esta fase. Cromatografía de elución en columna La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición continuada de nueva fase móvil. Fig.6. (b) Señal de salida del detecto en las distintas fases de la elución mostradas en (a).21) después de lo cual los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases. donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase móvil y las porciones frescas de fase estacionaria a las que accede (tiempo ti).21: (a) Diagrama que muestra la separación de A y B por cromatografía de elución en columna.1. El aislamiento de las especies separadas se lleva a cabo haciendo pasar suficiente cantidad de fase móvil a través de la columna hasta que las bandas individuales salen de ella. una única porción de la muestra se introduce en la parte superior de la columna (tiempo to en la Figura 1. pudiendo así detectarse o recogerse. 40 . Como se indica en la figura.2. 1. tiene lugar una distribución entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la muestra. debido a que el movimiento de los solutos sólo puede ocurrir en la fase móvil. Las sucesivas adiciones de la fase móvil hacen avanzar las moléculas de soluto por la columna en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y móvil. que se localizan a lo largo de la columna (véase el tiempo t2 en la Figura 1. Sin embargo. las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la mezcla en bandas. 6. Cuando no es así.2. La cromatografía en la que es aplicable esta ecuación se denomina cromatografía lineal y. de las velocidades relativas con las que eluyen las dos especies.6.2. Cromatogramas Si un detector que responde a la concentración del soluto se coloca al final de la columna. Así.3. se puede escribir: La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribución. en tal caso. más sensibles que los que serían necesarios si el proceso de separación no fuera imprescindible. En general se pueden buscar condiciones en que la separación supere al ensanchamiento y resolver. tiempo) identifica un componente en el eje tiempo y lo cuantifica según el área subtendida debajo del pico. 1.6. Los picos se ensanchan a medida que avanzan (es inevitable). las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra.1) Donde CS es la concentración molar del soluto en la fase estacionaria y CM es la concentración molar en la fase móvil. Tiempo de retención El tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector se denomina tiempo de retención y se le da el símbolo tR. los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y móvil. Por tanto. es útil tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo.2. Velocidad de migración de los solutos La eficacia de una columna cromatográfica para separar dos solutos depende. la razón de distribución o coeficiente de distribución. K es constante en un amplio intervalo de concentraciones de soluto. a saber. K En general. Dilución del analito La Figura 1. dilución del analito. La eficacia de una columna cromatográfica depende de las velocidades relativas con las que se eluyen las especies a separar. se obtienen una serie de picos como se muestra en la parte inferior de la Figura 1. Las discusiones teóricas se limitarán exclusivamente a la cromatografía lineal.21.21 ilustra una importante característica común al proceso de separación. en parte. y que acompaña casi siempre a las separaciones. y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de fase móvil añadido). este tipo de espe- 41 .6. Constante de distribución.1.3. Efectos de las velocidades de migración y del ensanchamiento de banda sobre la resolución El cromatograma (señal vs. para el soluto A. A menudo la muestra o la fase móvil contiene una especie que no se retiene. Así. con frecuencia. lo que significa que se produce una importante dilución de los analitos mientras ellos están siendo separados. de este modo. y se define como: (1.2. 1. Estas velocidades están relacionadas con las constantes de equilibrio de distribución de las especies entre las fases móvil y estacionaria. los picos son gaussianas simétricas características y los tiempos de retención son independientes de la cantidad del analito inyectado. Este gráfico denominado cromatograma. 1. el tamaño de la banda original que contiene los analitos en la figura es notablemente más pequeño que cualquiera de las dos zonas que llegan al detector. Idealmente. Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios en función de las cuales las especies se distribuyen entre las fases estacionaria y móvil. los detectores empleados para los analitos separados deben ser. CS' es directamente proporcional a CM'. Relación entre el tiempo de retención y el coeficiente de distribución Para relacionar el tiempo de retención de un soluto con su coeficiente de distribución. es el tiempo necesario para que. por término medio. en algunas ocasiones se denomina tiempo muerto. La velocidad lineal promedio de migración del soluto es: (1. el factor de retención KA’ se define como: (1. Sustituyendo la Ecuación (1. Análogamente. la elución tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los tiempos de retención. su velocidad de migración se expresa como una fracción de la velocidad de la fase móvil: Sin embargo.5) Cuando el factor de retención para una especie es mucho menor que la unidad. Por tanto. una molécula de la fase móvil pase a través de la columna. esta fracción coincide con el número promedio de moles de un soluto en la fase móvil. necesario para que la especie no retenida alcance el detector.Análisis Instrumental Módulo Analítico cies pueden añadirse para facilitar la identificación de los picos. dividido por el número de moles de soluto en la columna: El número total de moles de un soluto en la fase móvil es igual a la concentración molar CM del soluto en esta fase multiplicado por el volumen de la fase VM.1) en esta ecuación se obtiene una expresión para la velocidad de migración del soluto en función de su coeficiente de distribución y de los volúmenes de las fases estacionaria y móvil: (1. La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del movimiento de las moléculas de la fase móvil. Cuando el factor 42 . el tiempo muerto. Para una especie A. en cualquier instante. la velocidad lineal promedio u del movimiento de las moléculas de la fase móvil es: (1.4) La velocidad de migración del soluto: el factor de retención El factor de retención o factor de capacidad es un parámetro importante que con frecuencia se utiliza para describir las velocidades de migración de los solutos en las columnas. El tiempo tM. De manera semejante. el número de moles del soluto en la fase estacionaria viene dado por el producto de la concentración CS del soluto en la fase estacionaria y su volumen VS.3) Donde tM.2) Donde L es la longitud de la columna que está rellena. 6.1. El tiempo que pasa en cada una es muy irregular y depende que gane accidentalmente suficiente energía térmica del medio para que se produzca la transferencia. La forma de los picos cromatográficos La teoría cinética de la cromatografía explica las formas de los picos y los efectos de distintas variables sobre el ancho de los mismos. no son infrecuentes las alturas de plato que oscilan de unas pocas décimas a una milésima de centímetro o menos. respectivamente. Sin embargo. El movimiento del analito a través de la columna se trataba entonces como una transferencia por etapas de la fase móvil equilibrada de un plato al siguiente. k’B y k’A son los factores de retención de B y de A. Métodos para describir la eficacia de la columna Dos términos afines se utilizan ampliamente como medidas cuantitativas de la eficacia de una columna cromatográfica: (1) la altura de plato H y (2) el número de platos N. y en el tipo de fases móvil y estacionaria utilizadas. Los dos están relacionados por la ecuación: N= L/H (1.4. 1. No obstante. La eficacia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de platos.Análisis Instrumental Módulo Analítico de retención es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor. Según esta definición α siempre es mayor que la unidad. Idealmente. Dado que la molécula se eluye solamente cuando reside en la fase móvil.4.6. y KA es el coeficiente de distribución para la menos retenida. denominadas “platos teóricos”. Esta nomenclatura es tal vez algo desafortunada pues tiende a perpetuar el mito de que una columna contiene 43 . Las bandas cromatográficas ideales tienen forma gaussiana y se puede atribuir a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las numerosas moléculas de soluto en la banda cromatográfica. Velocidades de migración relativas: el factor de selectividad El factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como: (1. las separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de retención para las especies de una mezcla oscilan entre 2 y 10. los tiempos de elución son excesivamente largos. Las eficacias en términos de número de platos pueden variar desde pocos cientos a varios cientos de miles. Se han encontrado enormes diferencias en las eficacias debido a diferencias en el tipo de columna. La teoría del plato explica con éxito la forma gaussiana de los picos cromatográficos y su velocidad de desplazamiento a través de la columna. o que eluye con más rapidez. los términos originales para la eficacia se han incorporado a la teoría de velocidades. 1. El origen de los términos «altura de plato» y «número de platos teóricos» proviene de un estudio teórico pionero de Martin y Synge en el que trataron una columna cromatográfica como si fuera similar a una columna de destilación que estuviera constituida por numerosas capas estrechas. Una molécula de soluto experimenta miles de transferencias entre la fase estacionaria y la fase móvil durante la migración. El ancho de la banda está relacionado directamente con el tiempo de residencia en la columna e inversamente con la velocidad con la que fluye la fase móvil. su migración a través de la columna es muy irregular.6) Donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente retenida B.4. debido a que se dispone de más tiempo para que la dispersión tenga lugar. El ancho de la banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna. al final se abandonó en favor de la teoría de la velocidad. la especie A.2. debido a que la primera fallaba al intentar justificar el ensanchamiento de pico de una manera mecanicista.7) Donde L es la longitud (normalmente en centímetros) del relleno de la columna. otras se retrasan debido a que han sido retenidas mayor tiempo que el promedio en la fase estacionaria. Eficacia de la columna 1. discretas pero contiguas. Se suponía que en cada plato se establecía el equilibrio de la especie entre las fases móvil y estacionaria. Ciertas moléculas se desplazan con rapidez.6. La consecuencia de estos procesos individuales aleatorios es una dispersión simétrica de las velocidades alrededor del valor medio. y cuanto menor es la altura de plato. 5. En general se asume que las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana. Los mínimos para la cromatografía de líquidos generalmente se dan con caudales bastante menores que para la cromatografía de gases. predice exactamente el perfil de la gráfica de H frente a u. por ello resulta conveniente definir la eficacia de una columna en los términos de varianza por unidad de longitud de la columna.22: Efecto del caudal de la fase móvil sobre la altura de plato (a) en cromatografía de líquidos y (b) en cromatografía de gases. De hecho. que corresponde a la base del triángulo. de los ingenieros químicos holandeses y que condujeron a la ecuación de van Deemter. (1. que algunos autores creen más fiable. Fig. H pasa por un valor mínimo (o un máximo en eficacia) a bajos caudales. para calcular H. los estudios de eficacia generalmente se han realizado determinando H en función de la velocidad de la fase móvil u. la cual puede escribirse de la siguiente forma: 44 . Influencia del caudal de la fase móvil La magnitud de los efectos cinéticos sobre la eficacia de la columna depende claramente del tiempo de contacto entre la fase móvil y la fase estacionaria. La teoría cinética.6.8) N se puede calcular a partir de dos medidas de tiempo. Definición de altura de plato La anchura de una curva gaussiana está directamente relacionada con la varianza σ2 o la desviación estándar σ de una medida.Análisis Instrumental Módulo Analítico platos donde se dan las condiciones de equilibrio. y a menudo son tan bajos que en las condiciones de trabajo habituales no llegan a observarse.6.5.2. 1. la altura de plato H viene dada por: (1. esta gráfica se denomina frecuentemente representación gráfica de la ecuación de van Deemter. tR y W.22.6. Ensanchamiento de banda 1.5.3. Por esta razón.4. en su tratamiento del ensanchamiento de banda cromatográfico. El número de platos viene entonces dado por: (1. De esta forma. el estado de equilibrio nunca se puede alcanzar con la fase móvil moviéndose constantemente. En ambos gráficos de la Figura 1.1. se basa en determinar W1/2. se ha de conocer también la longitud del relleno de la columna L. en los años cincuenta.9) Otro método para evaluar N. Relación entre la altura de plato y las variables de la columna La aproximación matemática al comportamiento de las columnas cromatográficas empezó con los estudios. 1. el cual a su vez depende del caudal de la fase móvil.6. 1. la anchura del pico a la mitad de su altura máxima. 1.10) Tanto N como H se utilizan para evaluar la eficacia de la columna. 1. y A. la difusión longitudinal y la transferencia de masa entre las fases. en centímetros por segundo. Cuanto mayor es el flujo. La resolución de una columna se define como: 45 . Término del camino múltiple (A) El ensanchamiento de banda surge en parte debido a la multitud de caminos por los cuales las moléculas pueden caminar a través de la columna rellena. menos sucede la difusión del centro de la banda a los costados y menor es el ensanchamiento.6.23: Altura de plato en función de la velocidad lineal.11) Donde H es la altura de plato.6. Se requiere un tiempo para que el analito difunda desde una fase hacia la interfase para que se produzca la transferencia y esto ensancha el pico. menos tiempo hay para que se produzca la transferencia y menor es el ancho del pico. para partículas de diversos tamaños. en centímetros. es decir en el mismo sentido y en el sentido opuesto del flujo de la fase móvil. Efecto del tamaño de las partículas en la eficacia de la columna El diámetro de las partículas que constituyen el relleno afecta la eficacia de la columna: Fig. 1. B y C son los coeficientes. El ensanchamiento por transferencia de masa se debe a la difusión que tiende a ocurrir perpendicularmente a la dirección de flujo y por lo tanto cuanto mayor es la velocidad de flujo. Término de transferencia de masa (C u) Las columnas cromatográficas siempre trabajan en condiciones alejadas del equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria. Resolución de la columna La resolución R. y u es la velocidad lineal de la fase móvil. 1. La longitud de estos caminos puede diferir significativamente y por lo tanto el pico se ensancha. de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos.6. Término de la difusión longitudinal (B/u) Los solutos difunden desde la zona central donde es mayor la concentración hacia las regiones más diluidas situadas por delante y por detrás de la banda. que se relacionan respectivamente con los fenómenos de los caminos múltiples de flujo.Análisis Instrumental Módulo Analítico (1.7. Sin embargo.6. Este recurso normalmente es costoso en términos de tiempo necesario para completar la separación. Se dispone de varias opciones.8. Con fases móviles líquidas. a no ser que el aumento de N se lleve a cabo mediante una reducción de H en vez de por alargamiento de la columna.12) 1. las condiciones se han ajustado de tal forma que los factores de retención de los componentes 1 y 2 (k’1 y k’2) están en el intervalo óptimo de 2 a 5. (2) cambiar la temperatura de la columna. k' puede mejorarse a menudo aumentando la temperatura. Con fases móviles gaseosas. 1. las opciones incluyen: (1) cambiar la composición de la fase móvil. reduciendo la viscosidad del disolvente se pueden conseguir menores alturas de plato. La disminución en el tamaño de partícula del relleno conduce a importantes mejoras de H. 1.6. Variación del factor de selectividad Cuando α se aproxima a la unidad. En el cromatograma (a). El problema general de la elución La Figura 1. el cambio en la composición del disolvente muchas veces permite la manipulación de k' de tal manera que se obtienen mejores separaciones. los factores de retención correspondientes a los otros componentes están muy alejados del intervalo 46 Fig.8. la forma más fácil de mejorar la resolución es optimizando k'. incluyendo los cambios en el pH. optimizar k' y aumentar N no suele ser suficiente para conseguir una separación satisfactoria de dos solutos en un tiempo razonable. se ha de buscar un procedimiento para aumentar α. Por lo general. donde B/u normalmente es despreciable.Análisis Instrumental Módulo Analítico (1. Variables que afectan la eficacia de una columna Variación de N Una forma obvia de mejorar la resolución es aumentar el número de platos teóricos de la columna. (3) cambiar la naturaleza de la fase estacionaria. al aumentar así los coeficientes de difusión en la fase móvil. Variación del factor de retención Muchas veces una separación se puede mejorar significativamente manipulando el factor de retención K’B. Mientras k' se mantiene en el intervalo óptimo de 1 a 10. (4) utilizar efectos químicos especiales. determinada ésta por sus expectativas y comodidad. en orden decreciente de conveniencia. Con fases móviles líquidas. Los incrementos de K’B generalmente aumentan la resolución (pero a expensas del tiempo de elución). Variación de H Se ha demostrado que puede conseguirse una importante mejora de la resolución sin repercutir en el tiempo si se puede reducir la altura de plato. En estas circunstancias.24 muestra unos cromatogramas hipotéticos para una mezcla de seis componentes formada por tres pares de sustancias que difieren ampliamente en sus coeficientes de distribución y por tanto en sus factores de retención.24: El problema general de la elución . A menudo. El fenómeno ilustrado en la Figura 1.9. la separación de los otros dos pares de componentes no es enteramente satisfactoria. como en el cromatograma (c). 1.24. las condiciones al principio podrían ser las que corresponden al cromatograma (a). en estas circunstancias el tiempo de elución resulta ser ideal. En cromatografía de gases. con este procedimiento se obtienen. Esos cambios se pueden realizar por etapas o de forma continua. Sin embargo. esos picos están tan ensanchados que puede ser difícil identificarlos inequívocamente. la elución se podría completar en las condiciones que permiten obtener el cromatograma (b). Una solución frecuente para este problema es cambiar las condiciones que determinan los valores de k' mientras tiene lugar la separación. Como se muestra en el cromatograma (b).24 se da con la suficiente frecuencia como para darle un nombre el problema general de la elución. en un tiempo mínimo. De nuevo.Análisis Instrumental Módulo Analítico óptimo. De este modo. Tras la aparición de los picos de esos componentes.6. En cromatografía de líquidos. se obtiene el cromatograma (c). De este modo. el incremento de la temperatura (programación de la temperatura) permite conseguir las condiciones óptimas para las separaciones. inmediatamente después de la elución de los componentes 1 y 2. en las que los valores de k' son óptimos para los componentes 3 y 4. Resumen de parámetros y ecuaciones 47 . además. para la mezcla que se muestra en la Figura 1. Sin embargo. los picos de los componentes 5 y 6 aparecen tras un tiempo desmesurado. las condiciones se podrían cambiar a las que resultaban óptimas para la separación de los componentes 3 y 4. el cambio de las condiciones para optimizar la separación de los componentes 5 y 6 hace que los picos de los cuatro primeros componentes se agrupen de tal modo que su resolución no sea satisfactoria. En una tercera serie de condiciones. picos satisfactorios para todos los componentes de una mezcla. las variaciones de k' se obtienen por variaciones en la composición de la fase móvil durante la elución (elución con gradiente o programación del disolvente). Módulo Analítico Cromatografía gaseosa En la cromatografía gas-sólido se produce la retención de los analitos en una fase estacionaria sólida como consecuencia de la adsorción física. La cromatografía gas-sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción). La cromatografía gas-líquido se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. Instrumentos para la cromatografía gas-líquido Fig.7.1. 48 . 1. de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. 1.7.Análisis Instrumental 1.25: Representación esquemática de un cromatógrafo de gases. Buena estabilidad y reproducibilidad. las sensibilidades de los detectores que se van a describir difieren en un factor de 107. sin embargo.1. La reproducibilidad es baja y se agregan estándares internos para corregir.2. que deben ser químicamente inertes. 1. con lo que se aumenta la temperatura de la columna bien de forma continua o bien por etapas. 4. 49 . o más. Sistemas de detección El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes características: 1. Por ejemplo. esto para columna empaquetada.7. a menudo es conveniente emplear una programación de temperatura. Hasta el punto de que el detector debería estar a prueba de la impericia de operadores inexpertos.).7. 6. la resolución óptima se asocia con una temperatura mínima. La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha de regularse a las décimas de grado. El método más común es el que usa una micro jeringa para líquidos (μL) o bien para gases (gastight) a través de un diafragma o Septum de goma con una cámara de vaporización instantánea en la cabeza de la columna (la temperatura es aproximadamente 50 ºC por encima del punto de ebullición del componente menos volátil). 1. Las columnas capilares resisten volúmenes mucho menores y se emplea un sistema divisor que hace pasar por la columna sólo una pequeña fracción de la muestra (0. Se inyecta la muestra con la jeringa en el puerto de inyección a través del Septum que es autosellable y el puerto se caliente lo suficiente para que la muestre vaporice de modo casi instantáneo. En la práctica. Además. 1. por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de temperatura controlada. 5.1. al mismo tiempo que tiene lugar la separación. 2. manómetros y medidores de caudal. y por tanto del tiempo que se necesita para completar el análisis. sílice fundida o teflón. En general. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud. se obtienen tiempos de elución razonables (2 a 30 min. Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados en ciertos casos. Con el suministro del gas se encuentran asociados los reguladores de presión. el nitrógeno y el hidrógeno. en contrapartida la reducción de temperatura produce un aumento en el tiempo de elución. Se puede usar inyección automática a través de válvulas rotatorias tipo Rheodyne. A fin de poder colocarse en el interior de un horno termostatizado.7.1. En general. Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 hasta 50 m de longitud.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. Alta fiabilidad y manejo sencillo. se encuentran el helio.4. el sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. los menos sensibles no resultan convenientes para algunas aplicaciones. las sensibilidades de los detectores actuales se encuentran en el intervalo de 10-15 a 10-8 g de soluto/s. Configuración de la columna y del horno para la columna En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas. Intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 ºC. Están construidas con acero inoxidable. normalmente se configuran como helicoides con diámetros de l0 a 30 cm. Gas portador Entre los gases portadores.1. Como se indicará posteriormente. Aquello que constituye una adecuada sensibilidad no puede evaluarse de forma cuantitativa. Sistema de inyección de muestra La inyección lenta de muestras grandes provoca ensanchamiento de bandas y resolución pobre.7. la elección de los gases está con frecuencia determinada por el tipo de detector que se utiliza. Para muestras cuyos componentes presentan un amplio intervalo de temperaturas de ebullición. Adecuada sensibilidad. las rellenas. 3. Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal.3.1. vidrio.01 uL o menor). con una temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición promedio de la muestra. y las abiertas o capilares. lo que permite recoger los solutos tras la detección. tal es el caso de los pesticidas y de los bifenilos policlorados. o también. en consecuencia. No destructivo de la muestra. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino. es más un detector sensible a la masa. un termistor semiconductor. producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a través de la llama. Además. y se mide la intensidad de emisión resultante. a una potencia eléctrica constante. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas. normalmente níquel-63. tales como carbonilo. oro o wolframio. a diferencia del detector de hilo. El sensor de un catarómetro consiste en un elemento calentado eléctricamente cuya temperatura. 8. halógeno y amina. Las conductividades térmicas del helio y del hidrógeno son aproximadamente de seis a diez veces mayores que las de la mayoría de los compuestos orgánicos. Este tipo de detector opera casi del mismo modo que un contador proporcional para la medida de rayos X el efluente de la columna pasa sobre un emisor β. y por lo general. por ello. Este detector ha demostrado ser especialmente útil en la detección de contaminantes como los mercaptanos. Grupos funcionales. Cuando se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama. su amplio intervalo dinámico lineal (~105) . El detector de ionización de llama responde al número de átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo. a veces. el termistor tiene un coeficiente de temperatura negativo. de modo que. que un sistema sensible a la concentración. El detector de quimioluminiscencia del azufre también se ha adaptado para la cromatografía de fluidos supercríticos. Las conductividades de los otros gases portadores son más parecidas a las de los constituyentes orgánicos y por esta razón con un detector de conductividad térmica debe usarse hidrógeno o helio como gas portador con la finalidad de obtener una buena sensibilidad. catarómetro. debido a su selectividad para detectar compuestos que contienen halógenos.Análisis Instrumental Módulo Analítico 7. La intensidad de fluorescencia resultante es proporcional a la concentración de azufre. Detectores de captura de electrones (ECD) El detector de captura de electrones ha llegado a ser uno de los detectores más ampliamente utilizados para el análisis de muestras medioambientales. Respuesta semejante para todos los solutos o. por el contrario. Este dispositivo se denomina. Un electrón del emisor provoca la ionización del gas portador (con frecuencia. nitrógeno) y la producción de una ráfaga de elec- 50 . tiene lugar una disminución relativamente grande de la conductividad térmica del efluente de la columna y. La mayoría de los compuestos orgánicos. cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de hidrógeno/aire. su respuesta universal tanto a especies orgánicas como a inorgánicas. una respuesta selectiva y altamente predecible para uno o más tipos de solutos. originan en la llama pocos iones o prácticamente ninguno. la corriente que resulta se dirige para su medida hacia un amplificador operacional de alta impedancia. Detectores de conductividad térmica (TCD) Se basa en los cambios en la conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de las moléculas de analito. incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia orgánica. Los gases así obtenidos se mezclan con el ozono. Una limitación del catarómetro es su sensibilidad relativamente baja (~10-8 g de soluto/mL de gas portador) Detectores de quimioluminiscencia del azufre (SCD) Se basa en la reacción entre ciertos compuestos azufrados y el ozono. alcohol. uno de los más aplicables en cromatografía de gases. el detector experimenta un marcado aumento en la temperatura. Detectores de ionización de llama El detector de ionización de llama (FID) es el detector más extensamente utilizado. Las ventajas del detector de conductividad térmica son su sencillez. el detector es insensible a gases no combustibles. y su carácter no destructivo. depende de la conductividad térmica del gas circundante. En el detector de quimioluminiscencia del azufre el eluyente se mezcla con hidrógeno y aire y se produce la combustión como en el detector de ionización de llama. En un quemador el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y con aire para luego encenderse eléctricamente. La utilización de estas columnas es más problemática y sus requerimientos son mayores con respecto a los sistemas de detección y de inyección. Otros tipos de detectores El detector fotométrico de llama (FPD) se ha utilizado extensamente para el análisis de contaminantes del aire y del agua como los pesticidas y los hidrocarburos. 1.2. no es sensible a grupos funcionales como aminas. el programa de tratamiento de datos suministrado con el detector permite medir la concentración de 15 elementos. Este tipo de columnas contiene varias veces la fase estacionaria que tiene una columna de pared recubierta y.7. Presumiblemente. Sin embargo. denominados columna abierta de pared recubierta (WCOT) y columna abierta recubierta con soporte (SCOT). con una longitud característica de 2 a 3 m y un diámetro interno de 2 a 4 mm. o de teflón. Hasta el momento. la corriente disminuye significativamente en presencia de moléculas orgánicas que tienden a capturar electrones. tienen una mayor capacidad de carga. Los detectores de captura de electrones son altamente sensibles y tienen la ventaja de no alterar la muestra de manera significativa (a diferencia del detector de llama). La respuesta no es lineal. Las columnas abiertas de pared recubierta son simplemente capilares con la pared interna recubierta de una fina capa de fase estacionaria. También se venden columnas de alta resolución. la superficie interna del capilar está revestida de una capa delgada (~30 μm) de un material soporte. Detectores de emisión atómica (AED) El efluente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas. Estos espectros son recogidos en un espectrómetro que utiliza una serie de diodos configurados en un plano móvil. que provoca la ionización de las moléculas. Estos tubos 51 .2. la cual es amplificada y registrada. a no ser que el potencial a través del detector se aplique en forma de impulsos. Las nuevas columnas WCOT son columnas abiertas de sílice fundida. quinonas. por tanto. y así obtener sus espectros de emisión atómica característicos. en cambio. Una aplicación importante del detector de captura de electrones es la detección y determinación de insecticidas clorados. Generalmente. son de dos tipos básicos. El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva. peróxidos. De este proceso de ionización. el efluente de la columna se irradia con un haz intenso de radiación ultravioleta de energía variable entre 8.3 y 11. pero es sensiblemente mayor que la de una columna rellena. Se trata de un detector selectivo que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fósforo. Al aplicar un potencial a través de una celda que contiene los iones producidos. Columnas abiertas Las columnas abiertas o columnas capilares.7. alcoholes e hidrocarburos. aluminio). se origina una corriente de iones. siendo muy sensible a las moléculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halógenos. cobre. la eficacia de una columna SCOT es menor que la de una columna WCOT.1. que se acopla a un espectrómetro óptico de emisión de diodos en serie. en ausencia de especies orgánicas. que es capaz de detectar la radiación emitida desde 170 a 780 nm.2. En este detector. El azufre de la muestra se convierte simultáneamente en S2= el cual emite una banda centrada en 394 nm. Columnas rellenas Las actuales columnas rellenas se fabrican con tubo de vidrio. En las columnas abiertas con soporte recubierto. y grupos nitro. Las columnas abiertas de sílice más frecuentemente utilizadas tienen diámetros internos de 320 y 260 μm. El plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos de una muestra. metal (acero inoxidable. su intervalo de respuesta lineal se limita normalmente a unos dos órdenes de magnitud. resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Por otra parte. excitarles.7. En el detector de fotoionización. tal como tierra de diatomeas. 1. la cual convierte parte del fósforo a una especie HPO que emite bandas de radiación centradas alrededor de 510 y 526 nm. el eluyente se hace pasar a través de una llama hidrógeno aire a baja temperatura.2. Columnas y fases estacionarias para cromatografía de gases 1. un futuro software permitirá también la detección de otros elementos.Análisis Instrumental Módulo Analítico trones.7 eV (A =149 a 106 nm). Los diodos en serie son capaces de controlar simultáneamente de dos a cuatro elementos en una posición dada. con diámetros de 200 y 150 μm. 05 a 1 μm) de fase estacionaria líquida. de este modo. 52 . por un mecanismo de radicales libres. en el que una pequeña cantidad de líquido inmovilizado es arrastrada fuera de la columna durante el proceso de elución. Al calentarse la película se inicia. El enlace implica la unión. el material de soporte utilizado con más frecuencia se prepara a partir de tierras de diatomeas de procedencia natural. la reacción entre los grupos metilo en las cadenas del polímero. los tubos se configuran en forma helicoidal con un diámetro aproximado de unos 15 cm. la polimerización también se ha iniciado por exposición de las columnas recubiertas a radiación gamma. En la actualidad. Además.4. que se recubre con una delgada capa (0. Estas plantas tomaban sus nutrientes y eliminaban sus residuos por difusión molecular a través de sus poros. finamente dividido y homogéneo. Todavía no se dispone de ninguna sustancia que reúna perfectamente todas esas características. Con objeto de poder introducirlas en un horno termostatizado. las moléculas del polímero se unen mediante enlaces cruzados de carbono a carbono. las columnas que no han sido tratadas pierden lentamente su fase estacionaria debido al «sangrado». 1. En otras ocasiones. El soporte ideal consiste en partículas esféricas. Las películas que resultan de estos tratamientos son menos extraíbles y tienen una estabilidad térmica mucho mayor que las películas no tratadas. (2) estabilidad térmica.2.3. Con el uso. (4) características de disolvente tales que los valores de k' y de α de los solutos a resolver estén dentro de un intervalo conveniente.7. 1. El sangrado se acentúa cuando una columna debe limpiarse con un disolvente para eliminar los contaminantes. pequeñas y uniformes con una buena resistencia mecánica y una superficie específica de al menos 1 m2/g. que se pueda limpiar con un disolvente cuando la película se haya contaminado.7.2. (3) químicamente inerte. el material debería ser inerte a elevadas temperaturas. que están constituidas por esqueletos de miles de especies de plantas unicelulares que habitaban antiguos mares y lagos. el punto de ebullición del líquido debe ser al menos 100 ºC mayor que la temperatura de trabajo máxima de la columna).Análisis Instrumental Módulo Analítico se rellenan densamente con un material de relleno. Fase estacionaria Las propiedades deseables para una fase líquida inmovilizada en una columna cromatográfica gaslíquido comprenden: (1) baja volatilidad (idealmente. o soporte sólido. y poder humectarse homogéneamente con la fase líquida. debido a que la cromatografía de gases también se fundamenta en este tipo de difusión molecular. de tal forma que exista la mayor superficie de contacto posible con la fase móvil. de una capa monomolecular de la fase estacionaria a la superficie de sílice de la columna. Las columnas comerciales están disponibles con fases estacionarias con enlaces entrecruzados y/o enlazadas. El entrecruzamiento se lleva a cabo in situ después de que la columna haya sido recubierta con uno de los polímeros. sus restos resultan muy adecuados como materiales de soporte. Una forma de realizar el entrecruzamiento consiste en incorporar un peróxido al líquido original. El objetivo del enlace y del entrecruzamiento es la preparación de una fase estacionaria de larga duración. Como consecuencia. Materiales de soporte sólidos El soporte sólido en una columna rellena sirve para retener y ubicar la fase estacionaria líquida. La unión química y el entrecruzamiento inhiben el sangrado. mediante una reacción química. x Sensibilidad. esteroides. los hidrocarburos alifáticos de los alcoholes alifáticos. x Cromatografía de adsorción: especies no polares. x Cromatografía de reparto: especies poco polares no iónicas. ácidos nucleicos. especies organometálicas e inorgánicas. x Separación de especies no volátiles. carbohidratos. x Cromatografía de intercambio iónico: especies iónicas de masa molecular más pequeña. por ejemplo. hidrocarburos. isómeros estructurales y grupos de compuestos como. antibióticos. 1.8.26: Aplicaciones del HPLC. 53 .1.Análisis Instrumental 1. x Cromatografía de exclusión por tamaño: solutos con masas moleculares superiores a 10000.8. proteínas. Módulo Analítico Cromatografía líquida de alta eficacia 1. x Determinaciones cuantitativas exactas. Aplicaciones de la cromatografía líquida de alta eficiencia Fig. fármacos. x Gran aplicabilidad: aminoácidos. plaguicidas. 3.1. y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. Con frecuencia. Fig. Separación isocrática y con gradiente Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una elución isocrática. La Figura 1. En este caso se utilizan dos o tres sistemas disolventes con una polaridad significativamente distinta. La elución con gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los primeros picos. 54 . Sin embargo.2.8.2. 1. Efecto del tamaño de las partículas del relleno La eficacia de una columna de HPLC debería mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamaño de partícula. El ensanchamiento proviene de las diferencias en la velocidad de flujo de las capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.8. 1.2. se varía la relación de los disolventes de forma programada. El así llamado ensanchamiento de banda extra-columna.2.27 es una demostración experimental de este efecto. tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna propiamente dicho. la eficacia de la separación se aumenta notablemente por una elución con gradiente. Como consecuencia. En cromatografía de gases la difusión compensa la dispersión extra-columna. en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. la parte central de una banda de soluto se mueve con más rapidez que la periférica. Una vez que comienza la elución. 1.27: Efecto del tamaño de partícula del relleno y del caudal sobre la altura de plato H en cromatografía de líquidos. tiene lugar cuando se transporta el soluto a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección. Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografía de líquidos En cromatografía de líquidos. a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Eficacia de la columna en la cromatografía de líquidos 1. La elución con gradiente produce unos efectos similares a los producidos por la programación de temperatura en cromatografía de gases. y en ella se observa que una reducción del tamaño de partícula de 45 a 6 μm origina una disminución de diez o más veces de la altura de plato.8. la difusión en los líquidos es significativamente menor.8. 5 por 100 relativo y (5) componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o Teflón).000 psi. Las bombas de este tipo son baratas y están exentas de impulsos. Además. el cual a su vez se bombea hidráulicamente por un pistón de vaivén..000 psi). consisten.1. el flujo que resulta está libre de pulsaciones. (2) un flujo libre de pulsaciones. y sus caudales constantes. que se ha de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la línea base del cromatograma. controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. y además 55 . Instrumentación para cromatografía de líquidos Fig. También se puede comunicar la presión al disolvente mediante un diafragma flexible.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. 1. El disolvente está en contacto directo con el pistón. (3) un intervalo de caudales de 0.28: Esquema de un aparato de HPLC.8. equipadas con un émbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. 1. aunque tienen una limitada capacidad y presión de salida.4.1 a 10 mL/min. (4) el control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0. Las bombas de desplazamiento también producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresión. Bombas recíprocas Las bombas recíprocas. que son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente.4. por lo general. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo pulsado. Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada (~250 mL) y una notable incomodidad para el cambio de disolventes. su fácil adaptación a la elución con gradiente. que se abren y cierran alternativamente. Entre las ventajas de las bombas recíprocas se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 μL). Bombas de desplazamiento Las bombas de desplazamiento consisten por lo general en unas grandes cámaras como una jeringa.8. que se utilizan en aproximadamente el 90 por 100 de los sistemas de HPLC comerciales. en una pequeña cámara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor de arrastre. Sistema de bombeo Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen (1) la generación de presiones por encima de 6. Dos válvulas con cierre de bola. la fase móvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en una vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. sus altas presiones de salida (por encima de los 10. Bombas neumáticas En las bombas neumáticas más simples. 3. Ocasionalmente. .Extender acoplando columnas adicionales. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados.Tamaños de partículas de los rellenos: 5 a 10 μm . alúmina.Rellenos de partículas porosas: Micropartículas porosas con 3 a 10 μm de diámetro. polímero.4. con la excepción de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. . 4. Además. el cromatograma consiste en una representación del logaritmo del cociente de las dos señales detectadas en 56 . Se reemplaza cuando se contamina. 1.Standard: 25 cm longitud. Columnas para cromatografía de líquidos Se construyen con un tubo de acero inoxidable (presiones hasta 10000 psi).2.5 cm longitud. . N = 100000 platos/metro (Ventaja: rapidez y mínimo consumo de disolvente). Se recubren muchas veces con películas orgánicas que se unen químicamente o físicamente a la superficie.Análisis Instrumental Módulo Analítico el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresión de la columna.6 mm diámetro.8. .000 psi con una precisión relativa de unas décimas por ciento.8. 1-4. N = 40. 3 o 5 mm partículas. de 10 a 30 cm de longitud.000 a 60. . Las micropartículas son de silica o alúmina o de un polímero. Además. en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. También existen válvulas de inyección de micromuestras. .Los instrumentos modernos tienen control de T desde ambiente a 100-150 ºC Rellenos de la columna .4. Se usa para mejorar la vida de la columna analítica.8. Aunque T constante mejora el cromatograma. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de silica. Detectores de absorbancia Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz. tubo de vidrio con paredes resistentes (presiones hasta 600 psi).La mayoría de las aplicaciones no requieren control de la temperatura y se trabaja a T ambiente. Precolumnas .000 psi. . con bucles con volúmenes de 0.Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Columnas termostatizadas . Sistema de inyección de muestra En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza bucles de muestra. no son utilizables en la elución con gradiente y están limitadas a presiones menores de unos 2.5 a 5 μL. 1.000. Columnas analíticas . Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 7.Alta performance: 3 a 7. Detectores Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades para la cromatografía de gases. un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.Diámetro interno: 4 a 10 mm. Estos dispositivos son normalmente una parte integrada del equipo cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde 5 a 500 μL.4.Rectas. en combinación con un solo fototubo se utiliza un sistema de corte haz.Relleno pelicular: Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 a 40 μm de diámetro.Composición similar a la columna analítica. 1.4. 5 μm partículas.6 mm diámetro. Alternativamente. . En cualquier caso. Análisis Instrumental Módulo Analítico función del tiempo. es notablemente más sensible que el detector de índice de refracción. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación del haz incidente. Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos Detector de luz dispersada tras evaporación En este detector. las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia. El segundo. la voltamperometría. mucho más sofisticado. Detectores de absorbancia en el infrarrojo. lo que origina unas finas partículas de analito. Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores Consisten en un espectrofotómetro de barrido con una red entre sus componentes ópticos. Detectores electroquímicos Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroquímicos. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no volátiles. La radiación dispersada se detecta perpendicularmente al flujo mediante un fotodiodo de silicio. También se utilizan instrumentos de un solo haz. Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta. Además. Estos dispositivos se basan en la amperometría. una vez amplificada y registrada. 334 Y 365 nm empleando otros filtros. 57 . Ofrecen las ventajas de una elevada sensibilidad. El desplazamiento resultante del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida. Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorómetros y espectrofluorímetros. Se pueden elegir varios modos operacionales. Lo más común en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros. 313. es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier. con barrido de longitud de onda que proporcionan tres filtros circulares variables. Las finas gotitas se llevan a través de un tubo por el que pasa la corriente del gas a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil. adecuación y una extensa aplicabilidad. mientras que otros abarcan la radiación ultravioleta y la visible. Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. proporciona el cromatograma. El primero. En algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a 250. el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Se ofrecen dos tipos de detectores de absorbancia en el infrarrojo. la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. sencillez. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz láser. En la mayoría de ellos. la culombimetría y la conductimetría. la cual. Detectores de índice de refracción El disolvente en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la otra mitad. En este caso. Se controlan los factores de selectividad para lograr una buena resolución variando la naturaleza de la fase móvil (manteniendo k´ en un intervalo) o la fase estacionaria.8. se ha de poner especial cuidado en que el valor del pH no sea mayor que. Optimización del eluyente Se controla el tiempo total de elución con la polaridad (modifica los factores de retención). la elución se lleva a cabo con una fase móvil de elevada polaridad como es el caso de una disolución acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como metanol. el componente menos polar es el que eluye primero y en fase inversa el componente más polar es el primero en eluir.5. lo que originaría la degradación o destrucción del relleno. la fase estacionaria y la fase móvil (a diferencia de CG donde la fase móvil es un gas ideal y sólo sirve de portador de componentes). Fase normal: La fase estacionaria es polar (grupos ciano. en ambas la fase estacionaria se soporta sobre partículas de silica o alumina de 3. aunque el método más utilizado es la cromatografía de reparto de fase unida químicamente.5 porque si no puede tener lugar la hidrólisis del siloxano. 1.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.5. 7.2.5. Cromatografía de reparto Es el tipo de cromatografía de líquidos más utilizado. Se puede subdividir en líquido-líquido y cromatografía de fase unida químicamente. De este modo.8. 1. o acetonitrilo). acetonitrilo o tetrahidrofurano. 1. Eluyentes típicos Se requiere un equilibrio entre las fuerzas intermoleculares entre el soluto. En la mayoría de las aplicaciones de la cromatografía en fase inversa. Se elige la polaridad de la fase estacionaria bastante similar a la de los analitos y para la elución se utiliza una fase móvil de polaridad considerablemente distinta.1. Se distinguen dos tipos de cromatografía de reparto: de fase normal y de fase inversa.8. Aplicaciones de la cromatografía de reparto 58 . metanol. En fase normal. 5 o 10 μm.8.5. En polaridades crecientes: hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes < agua. Fase inversa: La fase estacionaria es no polar y la fase móvil polar (agua.3. aproximadamente. amino y diol) y la fase móvil no polar (hexano o isopropileter). responden de una forma predecible a los cambios de concentración. La columna supresora está rellena con una segunda resina de intercambio iónico. La única limitación de los detectores de conductividad resultó ser un serio problema que retrasó su uso generalizado. 1. sin alterar los iones del analito. dichos detectores son sencillos y baratos de fabricación y mantenimiento. El problema de la elevada conductividad del eluyente fue resuelto mediante la introducción de la denominada columna supresora del eluyente inmediatamente después de la columna analítica de intercambio iónico. En consecuencia. Los sitios activos más comunes de intercambiadores catiónicos son los grupos sulfónico –SO3−H+(ácido fuerte) y carboxílico –COO−H+ (ácido débil).3. uno que es demasiado fuerte y el otro demasiado débil. en lugar de la polaridad como guía de la fuerza de los disolventes). Variando la relación de volúmenes se puede obtener un valor adecuado para k´.1. 1. la conductividad de los componentes de la fase móvil tiende a enmascarar la de los analitos. sueros.29: Resinas de intercambio iónico. Micropartículas porosas de silica recubiertas con una delgada película del intercambiador. permitirá cambiar los valores de α y aumentar la resolución. 1.8. fáciles de miniaturizar. cetonas< alcoholes. Aplicaciones orgánicas y bioquímicas de la cromatografía iónica La cromatografía de intercambio iónico se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo fármacos y sus metabolitos. Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino terciario –N(CH3)3+OH−(base fuerte) o grupos amino primarios –NH3+OH−(base débil).7. el cambio de un disolvente fuerte por otro (mientras k´ se mantiene más o menos constante). Sin embargo. Cuando se produce el solapamiento de picos.2. Un inconveniente de las columnas supresoras es la necesidad de regenerarlas periódicamente (normalmente.7.7. aldehídos. Cromatografía iónica con columnas supresoras Los detectores de conductividad eran la elección obvia para este objetivo. sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres. Esta limitación proviene de la elevada concentración de electrólito que se requiere para eluir la mayoría de los iones analito en un tiempo razonable. 1. son universales para las especies cargadas y.8.8. El orden de los tiempos de retención es: Olefinas < hidrocarburos aromáticos < haluros. que convierte eficazmente los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas. como norma general. y por lo común son robustos y de prolongada duración. Fig. y por ello se reduce considerablemente la sensibilidad del detector. aminas < sulfonas< sulfóxidos< amidas < ácidos carboxílicos Se varía la composición de la fase móvil para ajustar k´y α (se utiliza la fuerza del eluyente.8. Rellenos de intercambio iónico Relleno de partícula pelicular en el que la superficie de una partícula grande (30 a 40 μm) esférica y no porosa se recubre con una resina sintética de intercambio iónico. 59 .Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. 1. conservantes de alimentos. cada 8 o 10 h) a fin de convertir los rellenos otra vez en la forma ácida o básica original. Cromatografía de adsorción La cromatografía de adsorción o líquido-sólido utiliza como fase estacionaria a la silica (o en pocas ocasiones a la alumina). Estos detectores pueden tener una elevada sensibilidad. recientemente se dispone de supresores de membrana que operan continuamente.6.7. Cromatografía de intercambio iónico Los procesos de intercambio iónico se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que están en la superficie de un sólido de elevada masa molecular y esencialmente insoluble. azúcares y preparaciones farmacéuticas. Además. Se eligen dos disolventes compatibles. mezclas de vitaminas.8. 30b y 1. Las intensidades de corriente se miden en diferentes momentos durante la vida de estos impulsos. se aplica a una celda electroquímica. Generalmente.Análisis Instrumental 1. Las voltamperometrías son métodos electroanaliticos basados en mediciones de la intensidad de corriente (I) en función del potencial (V) aplicado. Un ciclo completo puede durar 100 segundos o más. o completarse en menos de un segundo. una señal de excitación que es un potencial variable. En las Figuras 1.30c se muestran dos señales de excitación de impulsos. primero aumenta linealmente hasta un máximo y después disminuye linealmente con una pendiente del mismo valor numérico hasta su valor original.1. Esta señal de excitación provoca una respuesta de intensidad de corriente característica en la que se basa el método. o de trabajo. 60 . 1. en condiciones que favorezcan la polarización de un electrodo indicador. en función del potencial aplicado). La intensidad de corriente que se desarrolla en la celda se registra entonces en función del tiempo (y. el potencial varía de forma cíclica entre dos valores. unos pocos micrómetros cuadrados o incluso menos. con el objeto de aumentar la polarización. 1. por tanto. los electrodos de trabajo en voltamperometría son microelectrodos que tienen áreas superficiales como máximo de unos pocos milímetros cuadrados y en algunas aplicaciones. Este proceso se puede repetir numerosas veces.30 se indican los tipos de voltamperometrías que utilizan las diversas señales de excitación. registrándose la intensidad de corriente en función del tiempo. en la que el potencial de corriente continua aplicado a la celda aumenta linealmente (normalmente en el intervalo de 2 a 3 V) en función del tiempo.30d. Fig. Con la onda de forma triangular que se muestra en la Figura 1. Estas técnicas se tratan en los siguientes apartados.9. La señal de excitación clásica en voltamperometría es el barrido lineal que se muestra en la Figura 1. que contiene un microelectrodo.9. En la última columna de la Figura 1.29 a. Módulo Analítico Voltamperometría La voltamperometría abarca un grupo de métodos electroanaliticos en los que la información sobre el analito se deduce de la medida de la intensidad de corriente en función del potencial aplicado. Señal de excitación en voltamperometría En voltamperometría.30: Señales de potencial de excitación utilizadas en voltamperometría. La polarografía es una voltamperometría en la que el microelectrodo de trabajo es un electrodo de gotas de mercurio. un semiconductor como estaño u óxido de indio. El tercer electrodo es un electrodo auxiliar. en un microelectrodo de película de mercurio.2. Obsérvese que pueden tolerarse potenciales negativos relativamente elevados con los electrodos de mercurio debido al elevado sobrepotencial del hidrógeno en este metal. Una ventaja adicional de los electrodos de mercurio es que numerosos iones metálicos se reducen reversiblemente a amalgamas en la superficie de un electrodo de mercurio. Microelecrtrodos Los microelectrodos utilizados en voltamperometría tienen una variedad de configuraciones y formas. Además. Por convenio. o electrodo de trabajo. son pequeños discos planos de un conductor montado a presión en unas varillas de material inerte como Teflón o Kel-F que llevan incorporado un alambre de contacto.1.32 ilustra la apariencia de un voltamperograma de barrido lineal típico para una electrólisis que implica la reducción de una especie del analito A para dar un producto P. es fácil formar una superficie metálica limpia produciendo simplemente una nueva gota. se supone que el microelectrodo está conectado al polo negativo de un generador de barrido lineal por lo que los potenciales aplicados se dan con signo negativo tal como se muestra. Las corrientes límite son. mientras que las corrientes anódicas se dan con un signo negativo.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1. directamente proporcionales a la concentración de reactante. cuyo potencial se varía linealmente con el tiempo. Voltamperogramas La Figura 1. Instrumentación en voltamperometría Fig. El segundo electrodo es un electrodo de referencia (normalmente uno de calomelanos saturado o de plata/cloruro de plata) cuyo potencial permanece constante durante el experimento. La celda consta de tres electrodos sumergidos en una disolución que contiene el analito y también un exceso de un electrólito no reactivo llamado electrólito soporte. Los límites negativos son debidos a la reducción del agua dando hidrógeno.9. 1. A menudo.9. sino también de la composición de la disolución en la que está sumergido. 1. Los microelectrodos de mercurio han sido ampliamente utilizados en voltamperometría por diversas razones. lo que simplifica la química del proceso. El intervalo de potenciales en el que estos electrodos pueden ser utilizados en disoluciones acuosas varía y depende no sólo del material del electrodo. Generalmente. generalmente. las limitaciones de los potenciales positivos están provocadas por las elevadas intensidades de corriente que se desarrollan debido a la oxidación del agua para dar oxígeno molecular. como platino u oro. que sirve simplemente para conducir la electricidad desde la fuente de la señal a través de la disolución al microelectrodo. que normalmente es una espiral de alambre de platino o una piscina de mercurio.2.9. La posibilidad de obtener fácilmente una superficie nueva es importante. Los voltamperogramas de barrido lineal adquieren generalmente la forma de una curva sigmoidea llamada onda voltamperométrica. debido a que se alcanza al ser limitada la velocidad a la cual el reactivo puede llegar a la superficie del electrodo por un proceso de transporte de masa. Por tanto se puede escribir: 61 . La intensidad de corriente constante que aparece después de la pendiente se llama corriente límite i. Sus dimensiones son de tamaño reducido con el objeto de exaltar su tendencia a ser polarizado. El conductor puede ser un metal inerte. Uno de los electrodos es el microelectrodo.2. o un metal recubierto con una película de mercurio. Una de ellas es el intervalo de potenciales negativos relativamente elevado antes descrito. 1. ya que las intensidades de corriente medidas en voltamperometría son bastante sensibles a la limpieza y a que estén libres de irregularidades. En este caso. grafito pirolítico o carbón vítreo.31: Sistema para voltamperometría potenciostática de barrido lineal con tres electrodos.2. las intensidades de corriente catódicas se tratan siempre como positivas. la fracción de corriente total transportada por el analito se aproxima a cero. 1. en una disolución sin agitación. en el que el movimiento del líquido no tiene un modelo regular.2. La voltamperometría de barrido lineal en la cual la disolución o el electrodo se mantienen en movimiento se llama voltamperometría hidrodinámica. este flujo tiene lugar en el seno de la disolución lejos del electrodo. La voltamperometría que emplea un electrodo de gotas se llama polarografía.3. tiene lugar una transición a un flujo laminar. 1. el reactante es transportado a la superficie del electrodo mediante tres mecanismos: migración bajo la influencia de un campo eléctrico.3. Es decir. 1. se pueden identificar tres tipos de flujo. Como resultado.33. Los potenciales de semionda son a veces útiles para la identificación de los componentes de una disolución. (3) A δ cm de la superficie del electrodo. En voltamperometría. es necesario representar los modelos de flujo de líquido en una disolución agitada que contiene un pequeño electrodo plano. la velocidad del flujo laminar se aproxima a cero como resultado de la fricción entre el líquido y el electrodo. Fig. La voltamperometría de barrido lineal cuantitativa se basa en esta relación. las capas de líquido se deslizan unas respecto a otras en una dirección paralela a la superficie del electrodo. El potencial al cual la intensidad de corriente es igual a la mitad de la corriente límite se llama potencial de semionda y se representa por el símbolo E1/2 . dando lugar a una capa delgada de disolución estancada llamada capa de difusión de Nernst. la convección mantiene la concentración de A en su valor inicial y la concentración de P en un nivel de casi desaparición. 62 . Como se muestra en la Figura 1.32: Voltamperograma de barrido lineal de la reducción de una especia hipotética A para dar un producto P. esto es. Perfiles de concentración para electrodos planos en disoluciones no agitadas Durante una electrólisis.3.9. pero normalmente no es idéntico a esta constante. (1) Flujo turbulento. a través de las regiones de flujo laminar y turbulento. No es práctico obtener corrientes límites con electrodos planos en disoluciones no agitadas porque las intensidades de corriente disminuyen continuamente con el tiempo como consecuencia de que las pendientes de los perfiles de concentración se hacen menores. tal como el electrodo de gotas de mercurio. convección como resultado de la agitación o vibración y difusión debido a diferencias de concentración entre la capa de líquido en contacto con la superficie del electrodo y el seno de la disolución.1. todos los esfuerzos tienden a minimizar el efecto de la migración introduciendo un exceso de un electrólito inactivo. Es sólo en la capa estancada de difusión de Nernst donde la concentración de reactante y producto varían en función de la distancia a la superficie del electrodo. Después de corregir el potencial de semionda con el potencial del electrodo de referencia (0. Con el objetivo de obtener rápidamente corrientes límites reproducibles. Cuando la concentración de electrólito soporte excede la del analito en 50 o 100 veces. es necesario (1) que la disolución o el microelectrodo estén en movimiento continuo y reproducible o (2) que se utilice un electrodo de gotas.242 V para un electrodo de calomelanos saturado) queda muy relacionado con el potencial estándar de la semirreacción.9.Análisis Instrumental Módulo Analítico il = k.cA Donde CA es la concentración del analito y k es una constante. la velocidad de migración del analito hacia el electrodo de carga opuesta es prácticamente independiente del potencial aplicado. Perfiles de concentración para microelectrodos en disoluciones agitadas Para entender el efecto de la agitación. En estas condiciones el transporte de masas del analito hacia la superficie del electrodo tiene lugar sólo por difusión. En el flujo laminar. Voltamperometría hidrodinámica 1. Cuando se aplica un potencial a un electrodo plano en ausencia de convección. (2) A medida que la superficie está más cerca.9. un mínimo de 0.9.33: Modelos de flujo en la superficie de un microelectrocapa estática de difusión. la difusión se limita a una capa estrecha de líquido. cA. la concentración de A en el equilibrio en la superficie del electrodo se ha reducido hasta un 80 por 100 de su valor inicial mientras que la concentración de P en el equilibrio ha aumentado en una cantidad equivalente. Los potenciales de semionda de los dos reactantes difieren en unos 0.34. por tanto. al potencial X. prácticamente todos los iones A que entran en la capa superficial se reducen instantáneamente a P.l P de una disolución agitada de A. Finalmente.1 V en la curva A. Por tanto.Análisis Instrumental Módulo Analítico La Figura 1.34 muestra los voltamperogramas de un par de mezclas de dos componentes. si se agita la disolución. Como se muestra en la Figura 1. aparecen intensidades de corriente constantes controladas por difusión. Fig. las concentraciones en equilibrio de las dos especies en la superficie son aproximadamente las mismas e iguales a cA/2. 63 .3 V Fig.2 V en la curva B. Obsérvese que un solo voltamperograma puede permitir la determinación cuantitativa de dos o más especies siempre que haya suficiente diferencia entre los potenciales de semionda sucesivos para permitir la evaluación de las corrientes de difusión individuales. Tal como se muestra en la Figura 1.34a. δ oscila entre 10-2 y 10-3 cm.34: Voltamperogramas de mezclas de dos compuestos. esto es. Voltamperogramas para mezclas de reactantes Normalmente.2 V si la especie más fácilmente reducible experimenta una reducción de dos electrones.34b.3. que está inmediatamente adyacente a la superficie del electrodo y tiene un espesor de δ cm. la concentración de A en la superficie se aproxima a cero. el voltamperograma de una mezcla es simplemente la suma de las ondas de los componentes individuales. que no puede ampliarse hacia la disolución ni con el transcurso del tiempo. los reactantes de una mezcla se comportan independientemente en un microelectrodo. dependiendo de la eficacia de la agitación y de la viscosidad del líquido. igual que en el caso de una disolución sin agitación.33.34: Perfiles de concentración en una interfase electrodo/disolución durante la electrólisis A + ne. 1. mientras que la de P se aproxima a la concentración original de A. la disolución se divide en dos regiones. donde el transporte de masa tiene lugar por convección mecánica producida por el agitador. 1. y en 0. al potencial Z e inferiores.1 a 0. Y y Z. a potenciales mayores en valor absoluto que Z la concentración de P en la capa superficial permanece constante en cPº = cA debido a la difusión de P hacia la región agitada. cPº=cA – cAº. Sin embargo. Una representa el seno de la disolución y se compone de las dos regiones de flujo turbulento y flujo laminar que se muestran en la Figura 1.2 V en la curva B. se necesitan de 0. tiene lugar sólo por difusión. 1. La segunda región es la capa de difusión de Nernst. que es el potencial de semionda. muy poco después de aplicar un potencial. Generalmente. En la Figura 1.3. Al potencial Y. Como consecuencia. En la Fig. Los potenciales de semionda difiere en 0. Normalmente. 1.1 Ven la curva A y en unos 0. el transporte de masa do en una disolución agitada. La Figura 1. a potenciales más negativos que Z.34 muestra dos grupos de perfiles de concentración uno para A y otro para P a los tres potenciales que se indican como X. La concentración de A en esta región es cA mientras que cP es prácticamente cero. Debido a que la convección está ausente. la eliminación del oxígeno es generalmente la primera etapa en los procedimientos voltamperométricos. En primer lugar. se utiliza un electrodo de gotas de mercurio como electrodo de trabajo. Tal como cabría esperar de consideraciones estequiométricas.12M de KCl libre de oxígeno. 1. La curva inferior corresdurante el análisis.4.Análisis Instrumental Módulo Analítico se necesitan si la primera reducción es un proceso de un electrón. la presencia de oxígeno a menudo interfiere en la determinación exacta de otras especies.35: Voltamperograma de la reducción de oxígeno de una disolución 0. Polarografía La polarografía fue el primer tipo de voltamperometría descubierto y utilizado. Corrientes polarográficas La intensidad de corriente en una celda que contiene un electrodo de gotas experimenta fluctuaciones periódicas que corresponden en frecuencia a la velocidad de goteo. Difiere de la voltamperometría hidrodinámica en dos aspectos.4. La segunda corresponde a la posterior reducción del peróxido de hidrógeno. para evitar la reabsorción del ponde a una disolución 0. como se muestra en la Figura 1. donde la variación de la corriente con el tiempo es relativamente pequeña. Cuando una gota se desprende del capilar.9. La corriente promedio es la hipotética corriente constante.9.35. elelectrodo de gotas se unía al terminal negativo de una fuente de corriente continua. Ondas de oxígeno El oxígeno disuelto se reduce fácilmente en un microelectrodo. normalmente nitrógeno. El filtro de paso bajo limita las oscilaciones a una magnitud razonable y la corriente promedio (o. Una consecuencia de la primera diferencia es que las intensidades límites polarográficas están controladas sólo por difusión en vez de por difusión y convección.9. siempre que el tiempo de goteo t sea reproducible. Sin embargo. oxígeno. la cual en el tiempo de gota t produciría la misma cantidad de carga que produce la corriente fluctuante durante el mismo período. 1. las corrientes límite polarográficas son generalmente uno o más órdenes de magnitud menores que las corrientes límite hidrodinámicas.4. La primera resulta de la reducción del oxígeno a peróxido de hidrógeno. la corriente máxima) se determina entonces fácilmente. 1. una disolución acuosa saturada de aire presenta dos ondas inconfundibles atribuibles a este elemento.9. Así. Polarografía de barrido lineal Los primeros métodos polarográficos se basaban en medir la intensidad de corriente en función del potencial aplicado a un electrodo de gotas de mercurio. 1. entonces aumenta rápidamente cuando el área del electrodo crece debido a la mayor superficie hacia la que la difusión puede tener lugar. se hace pasar sobre la superficie una corriente del mismo gas. Las medidas voltamperométricas ofrecen un método adecuado y ampliamente utilizado para la determinación de oxígeno disuelto en disoluciones. 1. la intensidad de corriente cae a cero. se elimina la convección y en segundo lugar. La desaireación de la disolución durante varios minutos con un gas inerte (purga) permite esta eliminación. En la mayor parte de los experimentos.1M de KCl saturada de aire.1. Para determinar esta corriente promedio. y el potencial de esta fuente se aumentaba de manera lineal hasta que la corriente crecía exponencialmente como consecuencia de la reducción del disolvente o del electrólito soporte.3. alternativamente. Por tanto. Fig. es necesario reducir las grandes fluctuaciones en la corriente con un filtro de paso bajo o muestreando la corriente cerca del final de cada gota.2. 64 . las dos ondas tienen la misma altura.4. de manera que cuando se forma cada gota. Estas variables se tienen en cuenta en la ecuación de Ilkovic: Donde (id)máx es la corriente máxima en microamperios. Finalmente.4. A potenciales mayores de +0. tanto m como t se evalúan con facilidad experimentalmente y es por tanto posible comparar las corrientes de difusión de diferentes capilares. la exactitud y sensibilidad del método polarográfico dependen de la magnitud de la corriente residual no faradaica y de la exactitud con la que una corrección de este efecto pueda determinarse.4. de iones de metales pesados del agua destilada y de las impurezas presentes en la sal utilizada como electrólito soporte.4. Corrientes residuales Esta intensidad de corriente tiene dos componentes. A aproximadamente -0. 2.3.4 V. 1. Nueva superficie metálica se genera continuamente (se evita comportamiento irregular debido a adsorción de impurezas) 1. Corriente residual limita la sensibilidad a 10-5 M (aunque se puede mejorar en dos órdenes de magnitud).4 V. el mercurio tiende a ser positivo con respecto a la disolución. El producto m2/3t 1/6 en la ecuación de Ilkovic. llamado constante del capilar. el exceso de electrones de la fuente de corriente continua proporcionan a la superficie de cada gota una carga negativa y este exceso de electrones desaparece con la gota cuando ésta cae. En presencia de especies que formen precipitados o complejos con el Hg(I) el potencial disminuye. Desventajas del electrodo de gotas de Hg 1. Para obtener una expresión para la corriente promedio en vez de la máxima. Debido a que cada nueva gota se carga cuando se forma. A potenciales menos negativos que aproximadamente -0. los electrones son repelidos de la superficie hacia el seno del mercurio produciendo una intensidad de corriente negativa. resulta una pequeña pero continua intensidad de corriente.9. por Ej. El primero corresponde a la reducción de trazas de impurezas que están siempre inevitablemente presentes en la disolución del blanco e incluye la contribución de pequeñas cantidades de oxígeno disuelto. A potenciales más negativos que aproximadamente -0. Esto es.4 V se forma Hg(I).4. esta corriente puede ser tanto negativa como positiva. 2.4. El segundo componente de la corriente residual es la llamada corriente de carga o capacitiva que resulta del flujo de electrones que carga las gotas de mercurio con respecto a la disolución. describe la influencia de las características del electrodo de gotas en la corriente de difusión. Facilidad de oxidación del Hg entonces limita su uso como ánodo.9. La corriente de carga es un tipo de corriente no faradaica (véase Apartado 22 A-3) en el sentido de que la carga es transportada a través de la interfase electrodo/disolución sin que le acompañe un proceso de oxidación/reducción. Entonces se pueden depositar iones Zn y Cd desde soluciones ácidas.6. la constante en la ecuación anterior debe ser 607 en vez de 706.9. Corriente de difusión en los electrodos de gotas En la deducción de una ecuación para las corrientes de difusión polarográficas. la superficie del mercurio no está cargada y la corriente de carga es cero. con Cl− se forma Hg2Cl2(s) a 0 V.9. que está relacionada con el tiempo de gota en segundos t. Elevado sobrepotencial para la reducción de H+ (alto límite negativo). Ventajas del electrodo de gotas de Hg 1. es necesario tener en cuenta la velocidad de crecimiento del electrodo esférico. y c es la concentración del analito en milimoles por litro.5.Análisis Instrumental Módulo Analítico 1.4 V. Obsérvese que tanto la corriente promedio como la máxima se pueden utilizar en polarografía cuantitativa. 1. la velocidad de flujo de mercurio a través del capilar m en mg/s y el coeficiente de difusión del analito D en cmvs. 65 . esto es. Durante esta segunda etapa del análisis. Normalmente se representa la diferencia entre estas corrientes Δi para dar los voltamperogramas. normalmente desde una disolución agitada. Polarografía de onda cuadrada La polarografía de onda cuadrada es un tipo de polarografía de impulsos que ofrece la ventaja de una gran velocidad y una elevada sensibilidad. Estas limitaciones se han superado con creces con métodos de impulsos y con el desarrollo de electrodos. Ambos métodos se han aplicado también con electrodos diferentes del electrodo de gotas de mercurio. primero se deposita el analito sobre un microelectrodo. La voltamperometría de onda cuadrada también ha sido utilizada con electrodos de mercurio de gota colgante y en detectores cromatográficos. en tales casos los procedimientos se llaman voltamperometría diferencial de impulsos y de onda cuadrada. Como resultado de la etapa de preconcentración. no fue sólo la aparición de diversos métodos espectroscópicos más adecuados. la polarografía de barrido lineal dejó de ser una herramienta analítica importante en la mayoría de los laboratorios. sino también los inconvenientes inherentes al método.Análisis Instrumental Módulo Analítico 3. 1. la utilización de instrumentos poco adecuados y.5. La etapa de deposición equivale a una preconcentración electroquímica del analito.9. 1. Se obtiene mayor resolución. Esta diferencia es directamente proporcional a la concentración. Se tratarán las dos técnicas de impulsos más importantes. es posible y también práctico aumentar la precisión del análisis haciendo un promediado de los datos de varios barridos voltamperométricos. y el analito depositado se determina por uno de los procedimientos voltamperométricos que se han descrito en la sección previa. y el potencial del pico corresponde al potencial de semionda polarográfico. en otro tiempo popular. se para la electrólisis y la agitación. sobre todo.6. midiendo la corriente en ese momento se reduce la corriente no residual. el microelectrodo se comporta como un cátodo durante la etapa de deposición y como un ánodo durante la etapa de redisolución en la que el analito se reoxida volviendo a su estado original. En un método de redisolución catódica. mientras que el impulso inverso da una corriente anódica i2. En los métodos de redisolución anódica. El impulso directo produce una corriente catódica i. Después de un tiempo perfectamente medido. los métodos de redisolución presentan los límites de detección más bajos de todos los procedimientos voltamperométricos. 1.9. la polarografía diferencial de impulsos y la polarografia de onda cuadrada.05 V (en barrido lineal 0. el analito depositado en el microelectrodo se redisuelve. La mayor sensibilidad se debe al aumento de la corriente Faradaica y a la Disminución de la corriente no Faradaica. Métodos polarográficos y voltamperométricos de impulso En los años sesenta. Con un electrodo de gotas de mercurio.2. Polarografía diferencial de impulsos La altura del pico es proporcional a la concentración y el potencial es similar al potencial estándar de la semireacción. Mayor sensibilidad: 10-7 a 10-8 M (en barrido lineal 10-5 M).1. durante el impulso inverso. el tamaño de un impulso es suficientemente elevado como para que tenga lugar la oxidación del producto formado en el impulso directo. ya que cuando se forma la gota aumenta la corriente no Faradaica que luego decae a cero cerca de la vida final de la gota.2 V de diferencia). Métodos de redisolución Los métodos de redisolución engloban una variedad de procedimientos electroquímicos que tienen una etapa inicial característica común. Debido a la velocidad de la medida. los deficientes límites de detección. 66 . se observan picos con diferencias de máximo de 0. el microelectrodo se comporta como un ánodo durante la etapa de deposición y como un cátodo durante la redisolución. En todos estos procedimientos. cuando la intensidad de corriente de carga es esencialmente constante.9.5. En una reacción de reducción reversible. Un voltamperograma completo se obtiene en menos de 10 ms.9. La idea detrás de todos los métodos polarográficos de impulsos es medir la intensidad en el momento en el que la diferencia entre la curva faradaica deseada y la corriente de carga que interfiere sea grande. La razón del descenso en el uso de esta técnica. entre ellos la lentitud. la concentración del analito en la superficie del microelectrodo es mucho mayor que en el seno de la disolución.5. 1. el barrido se lleva a cabo durante los últimos milisegundos de la vida de una única gota. De uso incómodo (se atasca) y el Hg es tóxico. lo que da nombre a estos métodos. Módulo Analítico Bibliografía usada - Teóricas de Mabel Tudino (2010) - Teóricas de Federico Williams (2007) - Skoog.Análisis Instrumental 1. Holler.10. Principios de Análisis Instrumental 67 . Nieman (5ta Edición). El momento magnético μ (también vectorial) es directamente proporcional a I. su dirección y magnitud están cuantizadas. En el caso de los núcleos llamamos spin nuclear (I) al momento angular total.1.1.3) . la componente z de I está cuantizada: Iz = m ћ (2. Módulo Orgánico 2. tiene 2I+1 valores en pasos enteros entre +I y -I. 2. El tratamiento para protones y neutrones individuales es igual al caso de los electrones.1. partículas acopladas) Las partículas con número de spin ½ tienen dos valores posibles para su momento angular intrínseco: corresponden a los estados de spin +½ y -½. si bien el momento magnético es bastante menor. Magnetización nuclear El momento magnético de un núcleo está íntimamente relacionado con su momento angular.Análisis Instrumental Módulo Orgánico 2. El momento angular intrínseco está asociado a un momento magnético μ. El momento angular I (vectores se indican en negrita. Para las combinaciones de protones y neutrones en núcleos el tratamiento es más complejo: Dentro del núcleo los nucleones (protones y neutrones) tienden a formar pares. la constante de proporcionalidad se conoce como la relación giromagnética γ: μ = γI 68 (2. adopta una orientación de un pequeño número de orientaciones permitidas de distinta energía. El número de protones y neutrones no apareados determina en mayor medida el número cuántico de spin de un núcleo. Momento angular y magnetismo nuclear Momento angular de spin Los núcleos magnéticos poseen un momento angular intrínseco denominado spin cuya magnitud está cuantizada en unidades de ћ (h/2π): Magnitudes del momento angular de spin: [I(I+1)]1/2 ћ (2. Esto es la espectroscopía de resonancia magnética nuclear.1. El momento magnético puede tener igual dirección y sentido que el campo.1) Las partículas se clasifican según su número cuántico de spin I en: • I = n/2 fermiones (electrones. no confundir con el número cuántico I) de un núcleo de spin I tienen sólo 2I+1 proyecciones sobre un eje elegido en forma arbitraria. En caso de ser el eje z. el número cuántico magnético. Estos dos estados están separados por una energía ΔE que depende de la fuerza de la interacción entre el núcleo y el campo. neutrones tienen I = ½) • I = n bosones (fotones.2) Donde m. protones. Cuantización espacial El momento angular de spin es una cantidad vectorial. Resonancia magnética nuclear 2. Introducción Cuando un núcleo magnético se coloca en un campo magnético. o sentido opuesto.1.1. ΔE puede medirse aplicando radiación electromagnética de frecuencia ν que hace que los núcleos se ‘inviertan’ pasando del nivel de menor energía al superior siempre que se cumpla la condición de resonancia ΔE = hν. Asociado a él hay un momento magnético nuclear. La magnitud de μ no corresponde al valor clásico de una esfera cargada que gira y para el electrón es aproximadamente el doble del que generaría el momento angular orbital. la condición de resonancia es: ΔE = hν = ћγBo => ν = γBo/2π (2.7) . Fig. la radiación requerida para inducir transiciones de RMN se denomina campo de radiofrecuencia. La energía de un momento magnético es: E = -μ. de modo que los spins tendrán una escasa tendencia a ordenarse en el nivel de menor energía. La frecuencia exacta a la que ocurre la absorción nos da información sobre como es ese entorno. La constante giromagnética es una propiedad de cada núcleo o partícula. El eje de cuantización z ya no es arbitrario y coincide con el campo magnético.Análisis Instrumental Módulo Orgánico El momento magnético de un núcleo es paralelo (u ocasionalmente antiparalelo para núcleos con constante giromagnética negativa) al momento angular de spin. 2. Fig.6) La energía necesaria para reorientar los spins es pequeña comparada con la energía térmica.4 T (T = Tesla = 104 Gauss) es un campo magnético típico usado para RMN. es decir. Efecto de un campo magnético En el estado fundamental las 2I +1 orientaciones del momento magnético de un núcleo tienen igual energía. La magnitud y orientación de ambos están cuantizadas. Este valor cae en la región de radiofrecuencia del espectro electromagnético. En consecuencia. 2.B = -mћγB (2.7 puede simplificarse usando la aproximación e-x ≈ 1-x.1. El eje de cuantización z es arbitrario y el sistema está “desordenado”.1: E en función de Bo.Nβ)/(Nα + Nβ) = ΔE/2kT 69 (2.4) La regla de selección para RMN es Δm = ±1.B = -μz. Si colocamos el sistema dentro de un campo magnético los momentos magnéticos se alinean con él. para obtener la diferencia de población normalizada: (Nα .5) Al aumentar el campo magnético aumenta la diferencia de energía y la frecuencia a la que se produce la absorción. Para los núcleos de hidrógeno la Ecuación 2. las transiciones permitidas ocurren entre niveles adyacentes. 2.2. Con valores pequeños de ΔE/kT la Ecuación 2.1. Poblaciones de los niveles de energía Un conjunto de núcleos en un campo magnético se distribuirán entre los 2I + 1 niveles de energía de acuerdo a una distribución de Boltzmann. En una molécula los diferentes núcleos de H experimentan campos magnéticos ligeramente diferentes debido a los campos magnéticos locales del entorno.5 predice una frecuencia de resonancia ν = 4x108 Hz ó 400 MHz. Nα/Nβ = e-ΔE/kT (2. Entonces. Espectroscopía RMN Frecuencias de resonancia 9.2: Distribución de spins entre los niveles superior e inferior. los B locales generados por electrones de otros átomos. La escala del desplazamiento químico La escala en unidades de apantallamiento (σ).Bo. 70 (2. del nivel de menor energía al nivel superior con la misma probabilidad con que induce la transición inversa. es decir en un rango de 10 ppm de la frecuencia promedio esto puede solucionarse definiendo el “desplazamiento” relativo de la frecuencia de resonancia respecto de la frecuencia de alguna referencia: δ = 106 (ν – νref)/νref = 106 (σref – σ)/(1 – σref) δ ≈ 106 (σref – σ) Así. del campo que experimentaría un núcleo desnudo sin ninguno de sus electrones.1. ese movimiento inducido genera un pequeño campo magnético B’ en la dirección opuesta a Bo. un campo electromagnético excita moléculas.3: Representación del Apantallamiento del núcleo por los electrones que lo rodean.10) La constante de apantallamiento σ depende de 3 factores principales: la densidad electrónica alrededor del núcleo. átomos.134. La absorción neta de energía y en consecuencia.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Energía y sensibilidad En cualquier tipo de espectroscopía. distribución de cargas. electrones o núcleos según el caso. Apantallamiento nuclear Los desplazamientos químicos se originan porque el campo B experimentado por un núcleo en un átomo. Es muy importante. optimizar la intensidad de las señales usando campos magnéticos elevados.000 Hz. 2. de estado excitado a estado basal. En un átomo B es ligeramente menor que Bo porque el campo externo hace circular a los electrones en sus orbitales atómicos.000 Hz y 500. formación de puentes de H.75 Tesla la mayoría de los 1H de compuestos orgánicos aparecen entre 500.2. las corrientes (y en consecuencia los B locales) que esos electrones puedan generar.1.8) La frecuencia a la que ocurre la absorción de energía de un núcleo en RMN se llama frecuencia de resonancia o frecuencia de Larmor. Es decir influyen: electronegatividad de átomos/grupos cercanos. el campo sobre un núcleo puede escribirse: B = Bo – B’ = Bo(1 – σ) (2.1. frecuencia (ν) o campo magnético (B) no es conveniente porque las diferencias entre núcleos de un mismo tipo son muy pequeñas: a 11. En RMN el número de transiciones hacia arriba excede al de transiciones hacia abajo en sólo una en 104-106. 2. entonces. La frecuencia de resonancia del núcleo es en realidad: ν = γBo(1 . que a su vez se encuentra en una molécula. Se verán favorecidos los núcleos con una relación giromagnética grande y elevada abundancia natural: de allí la popularidad del 1H como un núcleo de RMN. la intensidad de la transición espectroscópica dependerá de la diferencia en las poblaciones de los dos niveles.2. (2. 2. interacciones con el solvente. Así. no depende de Bo. dado que B’ = σ. es decir. es como si detectáramos sólo un núcleo de cada 104-106.11) (2. hibridización.1. cercanía y orientación relativa de grupos funcionales. el desplazamiento químico δ.9) Donde σ.12) .129.2. Desplazamiento químico La relación giromagnética y la fuerza B del campo magnético que experimenta un núcleo. determinan en mayor grado su frecuencia de RMN: ν = γB/2π (2.2. la constante de proporcionalidad entre B’ y Bo. se denomina constante de Apantallamiento. difiere ligeramente del campo externo Bo.σ)/2π Fig. 2. efectos inductivos y de resonancia. El núcleo queda así apantallado o protegido del campo externo por sus electrones que lo rodean. El metano. El apantallamiento es más notable en los protones orto y para al sustituyentes. La magnitud de la corriente diamagnética está determinada únicamente por la función de onda electrónica del estado basal del átomo o molécula y depende marcadamente de la densidad electrónica en las cercanías del núcleo siendo la única contribución a σ para átomos esféricos de capa cerrada. como NH2 y OCH.5. La constante de apantallamiento puede escribirse como una suma de contribuciones diamagnéticas y paramagnéticas: σ = σ d + σp (2. Efectos paramagnéticos Se originan en circulación de electrones que involucran a orbitales moleculares con contribución importante de orbitales atómicos tipo p y d. dan lugar a apantallamiento.13) Con σd positiva y σp negativa. Los desplazamientos químicos de 1H de los halogenuros de metilo pueden entenderse fácilmente en estos términos. mientras que los grupos donadores de electrones. tal como surge de las estructura de resonancia. El origen de los desplazamientos químicos Un campo magnético puede inducir dos tipos de corriente electrónica en una molécula: diamagnética y paramagnética (un material diamagnético es aquel en que la magnetización inducida por un campo externo se opone a ese campo. De hecho. Los sustituyentes electropositivos aumentan el apantallamiento aún más.2. Se generan corrientes de electrones que involucran orbitales ocupados y vacantes. A medida que la electronegatividad del halógeno aumenta. los grupos con efectos mesoméricos de atracción de electrones. Las corrientes diamagnéticas y paramagnéticas fluyen en direcciones opuestas y dan lugar a apantallamiento y desapantallamiento respectivamente. existe una correlación lineal entre los desplazamientos químicos de 1H y las electronegatividades de Pauling de los halógenos. 2.1. en un material paramagnético la magnetización inducida aumenta el campo externo).4.1. como por ejemplo NO2 y CN desapantallan los protones del anillo. mayor apantallamiento y menor desplazamiento químico δ.2. que no tiene un grupo atractor de electrones. tiene un desplazamiento químico apreciablemente menor (0.Análisis Instrumental Módulo Orgánico 2. En los bencenos monosustituídos. Efectos diamagnéticos Las contribuciones de las corrientes diamagnéticas locales a los desplazamiento químicos son muy dependientes de la densidad electrónica alrededor del núcleo: a mayor densidad electrónica.2. El efecto sobre el núcleo es de desapantallamiento y depende 71 . al ir de yodo a flúor. El campo magnético distorsiona la distribución electrónica de la molécula de modo que para describirla correctamente debemos “mezclar” la función de onda del estado fundamental con funciones de onda que describen los estados excitados.3. Las corrientes diamagnéticas tienen su origen en el movimiento de los electrones dentro de los orbitales atómicos o moleculares.1.13 ppm) que el ioduro de metilo. 2. El efecto de desapantallamiento de los átomos electronegativos es de corto alcance. se quita densidad electrónica del grupo metilo desapantallando a los protones. electrónica se expresa en función χ de la susceptibilidad magnética de cada orientación.2. 2.Análisis Instrumental Módulo Orgánico de la diferencia de energía entre el estado fundamental y los estados excitados. Ya que el campo magnético en el centro de una pequeña espira por la que circula corriente es inversamente proporcional al cubo de su radio. Un campo magnético inducirá corrientes (y Blocales) de distinta magnitud según la orientación relativa del enlace. podemos esperar una dependencia similar para σp. Sólo son importantes para 1H debido a la baja densidad electrónica de su entorno (solamente un electrón 1s). Efectos de grupos vecinos Se originan en la circulación de electrones en grupos de átomos cercanos que presentan anisotropía magnética. El desplazamiento paramagnético también está relacionado a la distancia R entre el núcleo y los electrones que lo rodean. Es un efecto de magnitud despreciable para 1H porque ΔE es muy grande.7º que separa la zona de σ > 0 de la de σ < 0. 2. Para un enlace con simetría cilíndrica como el enlace simple C-C el campo local en cualquier posición del espacio se puede calcular fácilmente: El apantallamiento promedio de todas las orientaciones en cualquier punto del espacio puede aproximarse con la ecuación de McConell (se toma el origen de coordenadas en el centro de la distribución eléctrica del enlace): (2. reduciendo <R-3> y en consecuencia δ. La mayor repulsión electrónica hace que los orbitales alrededor de estos átomos se expandan. Así que en forma muy aproximada. (2. Los sustituyentes atractores de electrones desapantallan al carbono para y los donadores de electrones lo apantallan.6. Cualquier enlace químico es anisotrópico: tiene una dirección en el espacio y se ve diferente según de donde lo miremos. Los desplazamientos químicos en 13C de benceno monosustituído proveen un buen ejemplo de la dependencia de σp con <R-3>. Los valores relativos de χ┴ y χ║ determinan el signo de σ en cada región: 72 .14) Donde <…> indica un promedio sobre la distribución electrónica local. el efecto es de origen paramagnético y no diamagnético.1. no hay efecto. Sobre la superficie del cono σ = 0. La ecuación de McConnell describe un doble cono centrado en el centro eléctrico del enlace con θ = 54. La anisotropía magnética de la distribución Fig.4: Orientaciones posibles de un enlace.15) Si χ┴ y χ║ son iguales. Aunque ésta es la misma tendencia que se observa para los desplazamientos de 1H en estos compuestos. Los grupos donadores de electrones deslocalizan sus pares libres de electrones en el anillo aumentando la densidad electrónica en los carbonos orto y para. genera un B local opuesto al del enlace simple). C-S. Pero igual podemos hacer un análisis cualitativo: 73 . C-Hal. El H del triple enlace cae en la zona de protección y aparece a δ mucho menores de lo esperado por la electronegatividad del C(sp): Los enlaces simples C-C y C-H contribuyen apreciablemente al apantallamiento de 1H vecinos. Los 1H en las zonas de protección (σ > 0) aparecerán a δ menor Los 1H en las zonas de desprotección (σ < 0) aparecerán a δ mayor.Análisis Instrumental Módulo Orgánico En el triple enlace. χ┴ sigue siendo el dominante pero es > 0 (paramagnético. En un ciclohexano los H ecuatoriales están desapantallados respecto de los axiales por la anisotropía del enlace C-C vecino (el efecto también es importante en otros enlaces como C-O. C-N. etc): En el caso del doble enlace no hay simetría axial y χ┴ y χ║ son distintas. obtenida de datos experimentales. Sin embargo sigue observándose la desprotección en el plano y la protección por arriba y por abajo: 2. La ecuación de Pople permite un cálculo aproximado de la contribución al δ considerando el dipolo del anillo como puntual: (2.7. 74 .Análisis Instrumental Módulo Orgánico Los sistemas aromáticos tienen los efectos más pronunciados de anisotropía magnética. Los enlaces de hidrógeno intermoleculares suelen ser más débiles y producen efectos menores. dominante en enlaces fuertes (desapantallamiento). ya que generan corrientes muy intensas para la orientación perpendicular al plano del anillo: Los 1H en el plano del anillo estarán desprotegidos. el dipolo de un núcleo puede afectar el campo local sobre otro núcleo cercano.1. Los 1H por arriba y por abajo del anillo estarán protegidos. Los enlaces de hidrógeno intramoleculares producen los mayores efectos.1. En la práctica la superficie de σ = 0 se aleja del doble cono debido al tamaño del anillo aromático que no puede ser considerado un dipolo puntual. La presencia de sustituyentes también generará distorsiones al perderse la simetría del sistema.3. Interacción Spin-Spin La interacción entre los dipolos magnéticos de los núcleos produce cambios en la frecuencia de resonancia. Esta interacción (acoplamiento) puede ser de dos tipos: Directa Al igual que los dipolos generados por circulación de electrones.16) Donde ica es la intensidad de la corriente del anillo (es igual a 1 para benceno) y Cpople es constante de Pople. 2. importante en enlaces débiles (> ó < 0).2. Otros efectos El enlace de hidrógeno puede producir desapantallamientos importantes sobre el H del puente debido a: el efecto electrostático del átomo o grupo donor (por ej C=O). la anisotropía diamagnética del átomo o grupo donor. 2. la separación de niveles y la frecuencia a la que ocurre la absorción de energía dependerán del estado de spin del 1H. La interacción de contacto polariza un electrón de un enlace 13C-1H poniendo su spin antiparalelo al 1H y aumentando la probabilidad de ese spin cerca del núcleo: En las inmediaciones del 13C aumenta la probabilidad del spin opuesto para el otro electrón (principio de exclusión). Como el electrón tiene una relación giromagnética negativa (γe < 0) un núcleo con γn > 0 se estabiliza si los spins del núcleo y el electrón son antiparalelos (InIe < 0) y se desestabiliza si son paralelos (InIe > 0).Análisis Instrumental Módulo Orgánico Indirecta El efecto del dipolo de un núcleo se transmite a otro núcleo por polarización magnética de los electrones de los enlaces La interacción directa no se observa en los espectros en solución ya que la orientación del dipolo nuclear es independiente de la orientación de la molécula y el movimiento molecular promedia el efecto a cero (χ┴ = χ║).1. de una forma que sobrevive al efecto de promedio orientacional del movimiento molecular rápido. 75 . Desde el punto de vista de los niveles de energía del 13C. El estado de spin del 1H se transmite hasta el 13C y el efecto es recíproco.3. A distancias “grandes” el dipolo nuclear se aproxima a un dipolo puntual y la interacción se promedia con el movimiento molecular al igual que la interacción directa entre los dipolos de dos núcleos.17) Donde I son los vectores de momento angular de spin del núcleo y el electrón. La interacción indirecta o acoplamiento escalar da origen a las particiones observadas en los espectros en solución. Esta interacción isotrópica permite a un electrón percibir la orientación de un spin nuclear cercano. A distancias muy cortas (< 10-4 Å) el dipolo nuclear deja de ser puntual y la interacción con el electrón deja de ser anisotrópica: Interacción de contacto de Fermi α -γeγnInIe (2.1. El origen del acoplamiento escalar Los electrones tienen spin ½ y un dipolo magnético intenso que interacciona con el dipolo magnético de los núcleos. La energía de interacción entre cada par de núcleos 1H y 13C está dada por: EHC = h. y es independiente de Bo. Se obtiene J menor que cero. (2.Análisis Instrumental Módulo Orgánico La señal de carbono se divide en dos. las αα y ββ se estabilizan. corresponde a la separación ν’ entre las líneas del Cuando los núcleos no están directamente unidos la información de spin pasa de un enlace a otro a través de la interacción de intercambio que favorece electrones con spin paralelo: Las configuraciones βα y αβ se desestabilizan. es igual sobre el 13C y sobre el 1H la diferencia de energía (E’) y en consecuencia la separación entre las líneas (ν’) es igual para 13C y para 1H. 76 . Desde un punto de vista clásico podemos pensar que el dipolo del electrón cerca del 13C genera un B local que aumenta o disminuye el B efectivo sobre el núcleo y en consecuencia ν. la intensidad de las dos señales es igual. Como la cantidad de 1Hα es aproximadamente igual a las 1Hβ.IC = E’/4 doblete. una a frecuencia mayor y otra a frecuencia menor.IH.JHC.18) JHC es la constante de acoplamiento escalar 1H-13C. Como el B local es generado por los electrones debido a una distribución asimétrica de spin en el enlace. 1.2. El análisis detallado de los sistemas de spin y los acoplamientos resultantes requiere iden- 77 .1. Los acoplamientos deben ser entre núcleos del sistema de spin.3. Diagramas de energía 2. Núcleos equivalente Llamamos sistema de spines a un conjunto de n núcleos caracterizados por no más de n desplazamientos químicos δi y n(n -1)/2 constantes de acoplamiento Jij.4.Análisis Instrumental Módulo Orgánico 2. Puede ocurrir que dos núcleos tengan igual desplazamiento químico por una coincidencia casual. Para sistemas fuertemente acoplados usamos letras cercanas A. El caso extremo es cuando Δν = 0 que corresponde a núcleos químicamente equivalentes. Sistemas fuertemente acoplados En el análisis de multiplicidades de señales se ha usado una aproximación de 1er orden. X. Equivalencia magnética Dos núcleos con idéntico desplazamiento químico son magnéticamente equivalentes si las constantes de acoplamiento con cualquier otro núcleo de la molécula son iguales.1.1. Los núcleos del A2 se parten pero no podemos ver las líneas exteriores. Lo que observamos es una distorsión de los dobletes que a medida que se acercan se desplazan de sus ν reales. Esta es estrictamente válida cuando la diferencia en la frecuencia de resonancia de los núcleos acoplados es mucho mayor que la constante de acoplamiento entre ellos. Cuando esta condición no se cumple decimos que nuestro sistema de spins presenta acoplamiento fuerte. 2. Desde el punto de vista químicoestructural hay criterios establecidos de simetría que nos permiten determinar si dos átomos de una molécula ocupan posiciones equivalentes. M.5.B. La separación entre las líneas es J. … X.6. Desde el punto de vista de la RMN esos núcleos se comportarán como químicamente equivalentes.1. Los núcleos que cumplen esos criterios ocuparán entornos químicos idénticos y experimentarán los mismos apantallamientos. Se denominan en RMN químicamente equivalentes y tendrán idéntico desplazamiento químico. En los espectros de RMN no se observa el acoplamiento entre núcleos magnéticamente equivalentes (aunque J sea distinto de cero). Efectos del equilibrio conformacional Normalmente vemos los H de un CH3 como equivalentes (A3) sin embargo estrictamente no siempre lo son: 78 . Para identificar núcleos débilmente acoplados usamos letras distantes del alfabeto A. Las líneas exteriores se atenúan y las interiores se intensifican.Y. Sistemas débilmente acoplados: ΔνAX >> JAX ó ΔνAX/JAX ≥ 10. 2.7.Análisis Instrumental Módulo Orgánico tificar los conjuntos de núcleos que tienen un comportamiento equivalente. En la práctica podemos encontrar casos que van desde Δν << J hasta Δν >> J. 2. La rotación promedia los efectos del apantallamiento y solo vemos una señal para los 6 1H.2-disustituído: La rotación promedia los efectos de apantallamiento en cada CH2. En el cloroetano ocurre algo similar: La rotación promedia los efectos del apantallamiento en el CH3 y en consecuencia son químicamente equivalentes.1.1. La rotación también promedia las constantes de acoplamiento a 3 enlaces y en consecuencia los grupos de 1H son magnéticamente equivalentes. veremos una frecuencia promedio. El modelo vectorial 2. pero no promedia las J. Dos señales que difieren 1 Hz deben observarse durante 1 segundo para detectarlas separadas.seg-1: ωo = 2πν = γBo 79 (2. 2.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Los 1H del dimetil éter son equivalentes por la rotación rápida alrededor del enlace CO.19) En radianes . redes de difracción). Hay coincidencia de desplazamiento químico y en consecuencia son químicamente equivalentes (A6). Los métodos que usamos para medir frecuencias requieren que durante el proceso de medición dos ondas se desfasen al menos un ciclo para poder diferenciarlas y obtener sus frecuencias.1. Escala de tiempos de la RMN Vimos que la rotación alrededor de un enlace puede promediar desplazamientos químicos y acoplamientos. En un etano 1. El sistema es A2X3. sin y anti al carbonilo. El sistema rotante ¿Qué medimos realmente en RMN? Vimos que la absorción de energía en RMN se produce a una frecuencia dada por: ν = γBo/2π (2. telefonía celular. etc. Efectos similares se observan en el ciclos donde el equilibrio conformacional puede simplificar espectros. ¿Por qué vemos señales separadas en algunos casos y en otros no? Las ondas de radio no pueden ser enfocadas ni analizadas por métodos ópticos (lentes.9.20) .8. 2.9. su espectro de RMN1H es un singulete a temperatura ambiente. se deben usar antenas direccionales y circuitos electrónicos como en transmisores y receptores de radio y TV. eso nos obliga a medir durante períodos prolongados (segundos) si queremos buena resolución. En el caso del ciclohexano. Si durante ese tiempo los núcleos que originan esas señales se intercambian varias veces. si permanecen cada uno a su frecuencia los detectaremos como líneas separadas.1. En cambio en las amidas la rotación alrededor del enlace C-N es lenta y a temperatura ambiente se suelen ver señales separadas para los sustituyentes del N. La misma relación puede obtenerse considerando la interacción clásica entre el momento magnético μ y el campo Bo. proporcional a Nα – Nβ. 2. 2. Un espectrómetro de RMN logra esto por interacción de las componentes transversales con un segundo campo magnético que llamaremos B1. Fig.9. Eso lo conseguimos con una onda electromagnética de frecuencia νo= ωo/2π. Las componentes x e y de μ rotan a la frecuencia de precesión. A diferencia de μ. Como esas componentes rotan a velocidad ωo. Si hay transiciones α → β que alteran la distribución de poblaciones se modifica la magnitud de M. Bo incluye los efectos de apantallamiento y acoplamiento. M es una magnitud macroscópica clásica y no está cuantizada. el segundo campo también debe rotar a velocidad ωo en el plano xy para interaccionar con ellas. necesitamos que M se aparte del eje z. Fig.2. Esa interacción tiende a alinear μ con Bo pero como además el núcleo tiene un momento angular I se genera un movimiento llamado de precesión igual al de un trompo: 2. Una onda linealmente polarizada equivale a dos circularmente polarizadas que rotan en sentido inverso. Para poder medir la velocidad de giro de las componentes transversales a Bo debemos hacer que giren en forma sincronizada de modo que haya una componente neta en el plano xy. 80 .1. Nos interesa aquella en que el campo magnético rota en el plano xy a igual ωo que las componentes μxy.6: La onda tiene un campo magnético (B) y un campo eléctrico (E) oscilante.5: Macroscópicamente vemos la suma vectorial de los μ que corresponde a la magnetización neta Mo de la muestra. Magnetización macroscópica Los momentos magnéticos de los núcleos se orientarán con su componente z paralela o antiparalela a Bo pero las componentes x e y están distribuidas al azar. si podemos medir esa velocidad de giro obtendremos la frecuencia de Larmor del núcleo. es decir.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Donde para simplificar. Es más sencillo si nos ubicamos en un sistema de coordenadas que rota alrededor de Bo a la velocidad ωo: En ese sistema de coordenadas B1 y las componentes Mxy son estacionarios. 2. los acoplamientos spin-spin y el intercambio químico son los factores principales que determinan el aspecto de un espectro de RMN.10. Procesos de relajación Los desplazamientos químicos. Podemos analizar el sistema en forma clásica considerando la interacción entre la magnetización macroscópica M y B1. 2. 4.1.Análisis Instrumental Módulo Orgánico 1. B1 interacciona con Mo de forma similar a como los μ interaccionaban con Bo. 2.21) M precesiona alrededor de B1 a velocidad Ω. Relajación spin-red La relajación spin-red permite a los spins reorientarse desplazándose de un nivel de energía a otro de modo de alcanzar las diferencias de población de Boltzmann que se requieren para un experimento exitoso de 81 .10. se produce absorción de energía y Mz α Nα-Nβ disminuye. Más sutiles. pero no menos importantes son los dos procesos de relajación – spin-red y spin-spin – que permiten a los spins nucleares volver al equilibrio luego de alguna perturbación. 3. Ω = γB1 (2. Mxy rota a ωo = 2πνo.1.1. se generan componentes netas de M en el plano xy. Una antena puede captar la rotación de Mxy. La distribución de frecuencias disponibles en el sistema se representa mediante la función de densidad espectral: probabilidad de encontrar un componente de movimiento a una dada frecuencia. A medida que los núcleos se acercan al equilibrio. τc corto El sistema se mueve rápido y las frecuencias están distribuida en un rango amplio pero la densidad para una frecuencia dada es pequeña. las orientaciones son completamente al azar y se ha perdido toda ‘memoria’ de la orientación original. La relajación spin-red es eficiente. Al cabo de 5xT1 el sistema ha recuperado más del 99% de su magnetización de equilibrio (Mo). La relajación spin-red es pobre. el tiempo de relajación spin-red. es extremadamente lenta a las frecuencias de RMN. 2. Puede definirse un tiempo característico para este movimiento. siendo el acoplamiento bipolar la más importante. pueden inducir transiciones. 2.1. A tiempos mucho menores que τc. τc: es el tiempo necesario para que la rotación cuadrática media de las moléculas sea un radián. τc largo El sistema se mueve lentamente. las frecuencias disponibles están distribuidas en un rango pequeño y hay poca disponibilidad de frecuencias altas. sus spins nucleares permanecen alineados con el campo magnético en vez de reorientarse con la molécula. A medida que una molécula rota. hay más disponibilidad de frecuencias mayores a costa de las menores. La desactivación de estados excitados por colisiones moleculares también es despreciable porque los spins nucleares interactúan tan débilmente con el resto del mundo que se encuentran efectivamente desacoplados de los movimientos de las moléculas que los contienen.2. Si esos campos tienen componentes a la frecuencia de resonancia de los núcleos. La interacción dipolo-dipolo modulada por el movimiento molecular hace que los spins nucleares experimenten campos magnéticos locales variables (b). La relajación spin-red es pobre. la energía liberada se disipa en el entorno (la red). 82 . Fig. τc intermedio El sistema se mueve más rápido. La emisión espontánea (fluorescencia) cuya velocidad depende de la frecuencia de la transición al cubo. la mayoría de las moléculas están cerca de sus posiciones originales. El mecanismo de relajación del spin nuclear depende de las interacciones magnéticas. Tiempo de relajación spin-red (T1) Matemáticamente la relajación es un proceso exponencial de 1er orden La constante de tiempo del proceso T1 se denomina tiempo de relajación spin-red. La curva es asintótica. La interacción dipolo dipolo se da con aquella fracción de movimientos moleculares cercanos a la frecuencia de resonancia. Los mecanismos de relajación que operan en otras formas de espectroscopía no son efectivos en RMN.Análisis Instrumental Módulo Orgánico RMN. Estos cambios en las poblaciones se caracterizan por un tiempo T1. mientras que para t>> τc. el tiempo de correlación rotacional.10. Las frecuencias del movimiento molecular en un líquido cubren un rango amplio y solo las rotaciones ocurren a frecuencias comparables a las de resonancia de los núcleos.7: densidad espectral en función de la frecuencia. 10. 83 . 2. En los sistemas donde predominan movimientos lentos T2 < T1 2. 2.8: Mo en función de t. campos magnéticos estacionarios en el eje z (estos tienen ν = 0). Fig. 2.10: Densidad espectral en función de la frecuencia. Tiempo de relajación spin-spin (T2) Matemáticamente la relajación spin-spin es un proceso exponencial de 1er orden. En sistemas con movimientos muy lentos la relajación spin-spin es muy eficiente: T2 << T1 . A la relajación spin-spin contribuyen: las mismas componentes de movimiento que a la relajación spin-red.4. Relajación spin-spin La presencia de magnetización en el plano xy genera una condición de no equilibrio. En ese desfasaje no hay involucrados cambios en la distribución de poblaciones y el sistema no debe entregar energía. 2.1.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Fig. Esa magnetización decae a cero por desfasaje de las componentes x e y de los momentos dipolares de los núcleos que vuelven a una distribución al azar.10.1.9: T1 en función de τc. La constante de tiempo del proceso T2 se denomina tiempo de relajación spin-spin.3. Cuando ωoτc ≈ 1 la relajación es más eficiente y T1 es mínimo: Fig. La curva es asintótica a cero. En sistemas con movimientos rápidos la relajación spin-spin y spin-red dependen de los mismos procesos: T2 = T1. Al cabo de 5xT2 el sistema ha perdido más del 99% de su magnetización transversal (xy). 12: T1 y T2 en función de τc.1.5. 2. Fig.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Fig. 2. En 84 .11: Mxy en función de t. la señal se atenuará y en casos extremos puede desaparecer. Habitualmente medimos los espectros de RMN haciendo una secuencia del tipo: Las señales se suman para disminuir el “ruido” y luego de la transformación de Fourier se obtiene el espectro.10. cuanto más pronunciado (<T2) más anchas serán las líneas: T1 determina el tiempo que tarda el sistema en llegar a su distribución de equilibrio. 2. Si el tiempo de espera entre pulsos (irradiación) es corto respecto de T1 la magnetización no se recuperará entre una irradiación y la siguiente. Efecto de la relajación en los espectros T2 determina el decaimiento de la señal que medimos. 1. Efecto Overhauser nuclear Un efecto secundario de la irradiación es una alteración de las poblaciones de núcleos que tienen interacción dipolo-dipolo con los núcleos irradiados.13: Sistema AX homonuclear. Al aumentar la población del nivel 1 aumentan las transiciones 1 → 2 de X. Si en el sistema hay “disponibilidad” de frecuencias altas se inducirán las transiciones de 4 a 1.1. Esto se denomina relajación cuadrupolar y es la causa de las líneas muy anchas que suelen dar estos núcleos. 2. esto generará campos magnéticos fluctuantes (transmitidos por los electrones de enlace) que contribuyen a la relajación y también puede hacer que el acoplamiento (J) no se vea en el espectro. carbonilos) tendrán menor intensidad que los de menor T1. Si irradiamos al núcleo A hasta igualar sus poblaciones la diferencia de poblaciones entre los estados 1-4 y 2-3 cambia y las probabilidades W0 y W2 aumentan para las transiciones 4 →1 y 3 → 2. En los procesos de interacción spin-spin no hay absorción o emisión neta de energía y no están sujetos a la regla de selección Δm = ±1. En RMN 13C irradiamos los 1H para obtener un espectro “desacoplado” donde todos los 13C son singuletes. X podrá cambiar “libremente” entre sus estados α y β. La intensidad de la señal de X aumenta. Desacoplamiento spin-spin En un sistema AX con J ≠ 0 si irradiamos a X con una segunda radiofrecuencia contínua (ν2 con campo magnético oscilante B2). Al aumentar la población del nivel 2 disminuyen las transiciones 1 → 2 de X.Análisis Instrumental Módulo Orgánico una medición donde no se permite relajación total entre pulso y pulso las señales de núcleos de mayor T1 (por ejemplo C cuaternarios. W0 y W2 son las probabilidades que corresponden a las transiciones donde Δm es 0 y 2 respectivamente. Si en el sistema hay “disponibilidad” de frecuencias bajas se inducirán las transiciones de 3 a 2. Este cambio rápido de estados de spin hace que el efecto de J sobre A se promedie a cero y el acoplamiento desaparece del espectro. 2) sufre intercambio químico (por ej OH) y su spin cambia al intercambiarse con otros núcleos iguales. X puede cambiar su estado de spin muy rápido porque: 1) tiene spin > ½ y se relaja eficientemente por relajación cuadrupolar. Al disminuir la población del nivel 4 aumentan las transiciones 3 → 4 de X. En los núcleos de spin > ½ los campos de sus cuadrupolos eléctricos también pueden interaccionar con los μ y contribuir a su relajación. La intensidad de la señal de X disminuye. si un núcleo está acoplado escalarmente a otro que cambia su estado de spin rápido. Se usan técnicas especiales que permiten irradiar simultaneamente todo el rango de frecuencias que abarca el espectro de 1H.1.10. Fig. Este efecto se denomina Efecto Overhauser nuclear y se suele representar con la sigla en inglés: “NOE”.11. 2. Al disminuir la población del nivel 3 disminuyen las transiciones 3 → 4 de X. También existe la relajación escalar. 85 . Otros procesos de relajación Además de la interacción dipolo-dipolo otros procesos pueden contribuir a la relajación generando campos magnéticos fluctuantes. 2. Las W1 son las probabilidades que corresponden a las transiciones donde Δm = ±1.12. 2.6. Los ** representan los excesos de población en cada nivel. por ejemplo dos 1H. 14: Sistema AX homonuclear. En ésta técnica interesa tener el ion molecular intacto para luego fragmentarlo.2. Existen métodos de ionización suaves. La MS permite determinar pesos moleculares. La magnitud de η brinda información sobre la distancia espacial entre los núcleos En el caso de 13C-1H solo es importante para 13C directamente unidos a 1H. que sometido a la acción de E y/o B son perturbados de manera tal que la respuesta se puede asociar a la relación masa/carga del ión. Para 1H puede variar desde +0. dado que su comportamiento es conocido y sencillo. pero de manera más caótica. dada por un modelo físico químico que se aplica a una variedad de moléculas. En general: η = (i – io)/io (2. La interacción dipolo-dipolo depende de la distancia entre los núcleos.2. 2. 2. analizador de alto vacío. Q (cuadrupolo).Análisis Instrumental Módulo Orgánico Fig.2. Espectrometría de masa 2. En un sistema heteronuclear las separaciones entre los niveles 2-3 y 1-4 son grandes y ambas corresponden a movimientos rápidos.5(γA/γX) (2. 2. esto se logra con distintos métodos de ionización y diversos analizadores. en general no se utilizan para caracterización de compuestos. MS puede realizarse analizando cationes (modo positivo) o aniones (modo negativo).5 hasta -1. Componentes de un espectrómetro de masa Un espectrómetro de masa incluye cámaras de volatilización e ionización. El incremento por NOE (η) será máximo si el mecanismo de relajación entre esos núcleos es 100% dipolo-dipolo.1. y métodos de ionización fuertes.21) ηmax = 0.2. En el caso de 13C y 1H el aumento de intensidad de la señal de 13C varía entre 0 y +2. todos utilizados actualmente. bomba asociada y detector. fórmulas moleculares y estructuras químicas (con fragmentaciones). La MS puede reemplazar al análisis elemental si es de alta resolución. En un sistema homonuclear donde las diferencias de energía entre los niveles 2 y 3 son pequeñas el cambio de intensidad de la señal depende de los tiempos de correlación del sistema. 2) análisis que provee información de m/z a partir de los iones (se presenta un problema físico).22) Donde A es el núcleo irradiado y X el observado. El espectro es la gráfica de intensidad relativa en función de la m/z de los iones. Las fragmentaciones son independientes del modo en que ocurrió la ionización. Los aniones también sufren fragmentaciones. Introducción En otras espectroscopías se estudia la respuesta de un sistema a la radiación electromagnética. En espectrometría de masa (MS) se debe tener analitos en estado gaseoso e ionizado. para inducir las fragmentaciones. En general el estudio se hace sobre cationes radicales. irradiando el núcleo A hasta igualar sus poblaciones. Existen muchos métodos de ionización. 86 . depende de la estructura del compuesto. Existen cuatro analizadores fundamentales: TOF (time of flight). La MS consta de “dos partes”: 1) ionización/volatilización (se presenta un problema químico). IT (trampa iónica) y FTICR (Fourier transform ion cyclotron resonance). para estudiar al ion molecular. Las fragmentaciones con EI a 70 eV se utilizan como “huellas dactilares”. Con CI en ambos modos.N2O. MeOH2+. Es una técnica de ionización fuerte. No se trabaja en alto vacío porque el choque es menos eficiente. Cámaras de volatilización e ionización EI-MS (Electron ionization mass spectrometry) También conocida como impacto electrónico. etc. etc. Muchas veces el ion molecular puede no verse (éste es necesario para determina el peso molecular). El vació es necesario para evitar reacciones laterales (bimoleculares). La reacción con el analito es un intercambio de protón.(en el caso particular de CI. Se trabaja a alta presión y altas concentraciones del analito y el gas con que se bombardea. Se inyecta directamente en la cámara de ionización. Con este voltaje se ionizan eficientemente todos los grupos funcionales. La trayectoria del analito es perpendicular a la de los electrones. En modo negativo se utiliza amoníaco. A más de 70 eV la población fría es prácticamente nula. 70 eV→ CH4+• Como no está en alto vació. Ej: UV-MALDI- 2. a mayores voltajes hay más fragmentaciones y la técnica no sirve para caracterizar. de modo tal de que pueda existir la reacción bimolecular entre ambas. K+. AK+. Sí puede utilizarse como detector en CG. se puede determinar el peso molecular. CI-MS (Chemical ionization mass spectrometry) Es una técnica más débil que disminuye la población de estados vibracionales excitados y que por lo tanto aumenta la intensidad relativa de la señal del ion molecular intacto. Si se usa NH3 como gas de bombardeo se puede generar un anión radical si el analito tiene grupos ácidos. En cambio en modo negativo seguro que es AH. Si se usan potenciales menores de 15 eV no se suelen ionizar moléculas termoestables. La mayoría de los métodos de ionización generan iones monocargados: en modo positivo la señal puede ser AH+. etc. dado la limitación que presenta frente a ciertos compuestos. Al trabajar en alto vació la volatilización puede realizarse a menor temperatura (variable de ajuste). que se consigue comercialmente pero es muy corrosivo. para así maximizar la eficiencia. Lo que se genera es un pseudo ión molecular que en modo positivo se forma por fijación de H+. Luego se consigue la ionización por ganancia o pérdida de electrones.1. Módulo Orgánico El espectrómetro se define en función de la cámara de ionización y el analizador.2. puede reaccionar: CH4+•+ CH4 → CH5+ + CH3• CH5+ se puede sacar fácilmente.2. positivo y negativo. dado que caramelizaría). Obtener un ion con más de una carga es mucho más difícil termodinámicamente. Como gas de bombardeo se utiliza CH5+ o NH3. El requerimiento de calor para esta técnica es una gran desventaja. Los analitos se volatilizan mediante calor. en la que la muestra ya es gaseosa: sobre cada señal se realiza un espectro de masa completo. Na+. ANa+. También se puede utilizar NH4+ (se genera por impacto electrónico sobre el amoníaco) que forma aductos con compuestos ácidos. En ciertos casos se bombardea con NO. al ser impactados por electrones acelerados. En modo positivo se obtiene el gas de bombardeo por impacto electrónico: CH4 −e-. utilizada para conseguir fragmentaciones. Pero sólo sirven en casos muy particulares en los que se sabe que no interactuarán perjudicialmente con el analito. por ejemplo. pero en la cámara queda CH3• que puede originar reacciones radicalarias secundarias. Los iones gaseosos son impactados por una molécula gaseosa acelerada. Si se disminuye el voltaje de aceleración se reduce el grado de excitación vibracional y sólo se favorecen las fragmentaciones más probables (cambian las intensidades relativas y se pueden perder señales). No es un método universal (a diferencia de EI) ya que sólo ocurrirá la transferencia del protón si el analito tiene carácter básico. Es muy difícil generar un complejo estable en modo negativo (excepto para azúcares con Cl): el pseudión molecular en modo negativo se genera por pérdida de un protón. con lo que no es una técnica apta para sustancias termolábiles (Un azúcar. CH5+ se acelera y bombardea sobre el analito en otra cámara (de ionización) que tampoco está en alto vacío. en modo positivo siempre se forma con protón). Es un método fuerte y limpio. dando como consecuencia la ruptura de la estructura química. Una alta población de los iones obtenidos están vibracionalmente excitados. 87 . no puede ser atacada con un método como éste. dado que no se generan especies secundarias.Análisis Instrumental TOF. Las moléculas de analito que se acerquen a la punta del electrodo tienen una posibilidad no nula de intercambiar electrones por este efecto. sólo se puede aplicar a compuestos termoestables. FD-MS (Field Desorption Mass Spectrometry) Técnica análoga a FI. Muchas veces [AH]+ puede formarse por la ruptura de algún puente de hidrógeno. Si el signo del electrodo es positivo. la diferencia es que en FI se utiliza calor y alta presión. pero el producto no está vibracionalmente excitado. Del pseudo ion molecular pueden obtenerse clusters de alto peso molecular conformado por agregados de analito. pero con el analito depositado sobre el tip del electrodo. El cambio de estado es un fenómeno vibracional: se deforma la matriz del analito de modo tal que se reducen las interacciones intermoleculares. pero se incorpora a una cámara de ionización química un electrodo de este tipo para aumentar la ionización. Es un método sucio porque puede haber reacciones colaterales. Esto sólo ocurre para potenciales aceptables si el electrodo tiene una geometría tan particular. El radio de curvatura en la punta del electrodo debe ser muy pronunciado para generar un campo eléctrico no uniforme e intenso. En general se obtienen pseudo iones moleculares. dado que los hijos ya quedan fríos. prácticamente no hay fragmentaciones. Sirve para sólidos. un equipo que puede hacer FI también puede hacer FD. de bajo peso molecular pero muy polar. pero igualmente la eficiencia sigue siendo baja. Permite estudiar compuestos termolábiles: de alto peso molecular. las repulsiones coulombicas no alcanzan a vencer las interacciones intermoleculares. En general. Tras el efecto túnel la población es totalmente fría. con lo cual si en EI se ve un pico muy intenso pero no aparece en CI. El problema de esta técnica es que es muy poco eficiente: la superficie en la que puede haber intercambio electrónico es muy poca. Los electrodos aguja no suelen usarse como cámara de ionización. genera un catión radical y lo repele (modo positivo). Lo ideal es romper los clusters iónicos [AnH]+. Son en general técnicas sucias. El analito se deposita sobre un electrodo en alto vacío y se lo bombardea de modo tal que pasa al estado gaseoso y se ioniza. Se utiliza calor para pasar al analito a estado gaseoso. En la región en la que se genera el campo es posible el intercambio de electrones por efecto túnel (en la punta del electrodo aguja). Es útil en moléculas termoestables con grupos funcionales fácilmente eliminables y muy utilizado para compuestos con propiedades ácido base. porque además de desorber el analito pueden desorber otros compuestos que integren el sólido. sirve para MS cuando la ablación provee una alta población de ion molecular intacto. Esta técnica de desorción es la más suave que hay: la energía alcanza para romper interacciones intermoleculares. Técnicas de desorción Estas técnicas no requieren calor para pasar al analito a la fase gaseosa. Por este método no logran verse nietos de la secuenciación genética.Análisis Instrumental Módulo Orgánico En CI se busca tener el ion molecular intacto. mientras que en FD alto vacío. Es mucho más suave que CI. probablemente no se trate de una fragmentación directa del ion radical. El proceso es una ablación a través del bombardeo de un gas. La principal dificultad que presenta es la limpieza del electrodo. La cámara de ionización trabaja con vacío moderado. porque el sodio es difícil de eliminar. FD no suele utilizarse para compuestos con peso molecular por encima de 700. Es un método de ionización débil. 88 . FI-MS (Field Ionization Mass Spectrometry) Ocurre un intercambio de electrones por efecto túnel sobre la superficie de un electrodo. Es muy usado en compuestos organometálicos. En modo positivo se tiene habitualmente [ANa]+. Ésta puede aumentarse agregando agujas. por lo que se usan gases de bombardeo con menor energía cinética de modo tal de que no quede un pseudo ion molecular con alta energía vibracional. No se necesita un cuerpo auxiliar. éste toma electrones. líquidos viscosos de alto punto de ebullición o semisólidos. Puede haber contaminación con cationes y aniones radicales o bien pseudo iones moleculares con sodio. por lo que prevalece el pseudo ion molecular frío. Como la técnica es muy suave no hay formación de homoclusters. Consiste en un electrodo aguja cuyo signo determina el modo de operación. pasa al estado electrónico excitado. cuyo tiempo de pulso es menor a la duración del fenómeno. Puede ser UV o IR. la principal limitación es que el analito absorba a la longitud de onda de emisión del láser. pero cargada por efecto túnel.Análisis Instrumental Módulo Orgánico FAB (Fast Atom Bombardment) En esta técnica el analito es bombardeado con átomos acelerados. Puede ocurrir la ablación de muchos compuestos (producto. Se necesita la misma fuente que para FAB: en FAB se pasa inicialmente por el gas noble catiónico. analito. Los solventes mas usados son glicerol y alcohol nitrobencílico. Puede o no utilizarse un segundo cuerpo. y esa energía debe transformarse en calor para que ocurra la ablación. que se encuentra a presión atmosférica (es el único método de ionización que funciona en solución). SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry) Es la técnica más fuerte. existe la posibilidad de que el analito sufra una reacción fotoquímica. LD con láser IR no es una técnica universal de ionización. El problema es que se transforma en una técnica de desorción fuerte. Utiliza como haz de bombardeo un gas noble ionizado. sino hasta fulerenos catión radical. El segundo cuerpo tiene la capacidad de formar puentes de hidrógeno (de lo contrario no sería viscoso y de alto punto de ebullición) y puede originar inconvenientes: especies directas de la ablación. También se puede comparar el espectro total experimental con el que se debería obtener. Se forma una macrogota por la punta del electrodo. Si absorbe. Además. En ciertos casos puede haber un cambio de estado de agregación sin que se rompa una unión química. El problema es la formación de homoclusters por su posibilidad de formar puntes de hidrógeno. Ar o Ne acelerada. porque la energía es grande. ya que prácticamente no se ve el ion molecular. Al utilizar láser UV para provocar una ablación. Además se debe conocer el espectro del solvente puro. La eficiencia de la desorción es mayor cuando se agrega un segundo cuerpo. El haz de bombardeo es una corriente de He. Por lo tanto. El campo eléctrico externo comprime la gota 89 . etc. d modo tal que las colisiones induzcan la desorción. Actualmente no solo se usan gases nobles catiónicos. Se utiliza con fuente pulsada. En FAB la preparación de la muestra se realiza con un segundo cuerpo (solvente). es una técnica útil para polipéptidos pero no para hidratos de carbono. etc. Se deposita groseramente en el electrodo y se mezcla con un sólido. Disminuyendo la energía cinética de bombardeo es posible minimizar la formación de homoclusters del solvente y de heteroclusters (la probabilidad de formación de homoclusters del analito es menor porque está disperso). el cambio de fase debe ser más rápido que la elongación del enlace. con lo que el láser UV es una técnica de desorción fuerte. cuando éste reciba el choque – si no se desprende – transferirá energía cinética a moléculas vecinas. LD-MS (Laser Desorption Mass Spectrometry) El láser es un haz monocromático coherente de alta potencia. La desorción en general se alcanza si el peso molecular es menor a 1000 y si no hay muchos puentes de hidrógeno (de lo contrario se forman clusters mixtos). El haz acelerado del gas de bombardeo (gas noble) se genera en una cámara auxiliar por impacto electrónico. ESI (ElectroSpray Inoization) Usa el analito disuelto en un solvente y lo inyecta de manera continua en la cámara de ionización. haces de metales acelerados. pudiendo esto favorecer la desorción de una molécula de analito. Si el analito está rodeado por el solvente. se debe buscar un solvente que minimice las señales. El mapeo químico es el estudio de la intensidad relativa de una señal en distintos puntos de la superficie (escala: nm).). Esta técnica no sirve para determinar pesos moleculares. Sí se utiliza para caracterizar superficies sin estructura molecular: microscopía SIMS para mapear superficies. Es una técnica suave y sucia. El solvente es un líquido viscoso de alto punto de ebullición en el qye se suspende el analito (no se disuelve). Para ello. En FAB es difícil encontrar la energía cinética umbral a la cual el analito se desorbe y se obtiene el ion molecular intacto pero no se forman homoclusters del solvente. clusters superiores y clusters mixtos (además de clusters superiores del analito). el fácil acceso a la fuente de iones y el virtualmente ilimitado intervalo de masas. Recién entonces se pudo acoplar a crmatografía líquida. MALDI es la técnica por excelencia para los compuestos lábiles. termolábiles y en solución. pero retrasada. El solvente utilizado es agua. Desde el punto de vista de la resolución y reproducibilidad. son iones policargados. Estos impulsos tienen normalmente una frecuencia de 10 a 50 kHz y un tiempo de vida de 0. los iones positivos se producen periódicamente por bombardeo de la muestra con impulsos de electrones. Se generan especies monocargadas. En MALDI la excitación electrónica se transforma en calor y termina siendo abrasión térmica por parte de la matríz. Se evapora lentamente a consecuencia de su alto punto de ebullición. El electrodo está envuelto en dos camisas en las que circula gas en dirección a la punta del electrodo. Las biomoléculas (en general polares y termolábiles) no se pudieron analizar hasta el desarrollo de ESI. pero que no permite analizar mezclas. Sin embargo. mono y policargadas. Debido a que todos los iones que entran en el tubo tienen idealmente la misma energía cinética. La matriz y la muestra se colocan sobre el electrodo. Las especies monocargadas no se ven. de iones secundarios o de fotones generados por láser. absorben UV comportándose como moléculas. El analito no debe absorber a la longitud de onda de trabajo. que el impulso de ionización. si hay cationes en el medio se ven todas las especies. Cuanto más homogénea es la distribución de la matriz. se utiliza agua-acetonitrilo o agua-metanol. El analito se distribuye como “las pasas en el budín”.2. Varios fabricantes de instrumentos ofrecen actualmente instrumentos de tiempo de vuelo que en la actualidad se emplea rutinariamente en el campo del análisis de biomoléculas. En UV-MALDI las nanopartículas. ayudando a formar las gotas. Los iones producidos de esta manera son acelerados por un impulso de campo eléctrico de 103 a 104 V que tiene la misma frecuencia. sus velocidades en el tubo deberán variar de modo inverso a sus masas.2. Las buenas matrices favorecen la desorción y no alteran químicamente al analito. estaba restringido a la química orgánica. Con ESI y MALDI además se puede trabajar con poca masa (fg). Son fotoquímicamente estables (debido a sus estructuras). Como las matrices no son solubles en agua. Analizadores TOF (time of flight) En los instrumentos de tiempo de vuelo (TOF). hasta proteínas de más de 300KDa. MALDI es un método suave con una fuente muy potente. El analito termina gaseoso e ionizado. La especie predominante. A diferencia de ESI. Se caracterizan por ser compuestos orgánico que devuelven toda la energía como calor.Análisis Instrumental Módulo Orgánico hasta que la repulsión de Coulombs iguale la fuerza externa. independientemente de su naturaleza. Sí se podía ionizar con plasma para estudiar sales inorgánicas. mejores resultados se obtienen. algunas ventajas compensan parcialmente estas limitaciones como son la simplicidad y la robustez. La matríz también se ioniza (se ve en el espectro.2. La relación analito-matriz puede ir de 1:1000 a 1:10000. en compuestos de alto PM. dependiendo de la cantidad de grupos polares y el peso molecular. desde azúcares de menos de 1000 Da. Los tiempos de vuelo típicos están entre 1 y 30 μs. La matríz lo experimenta como una desorción laser: hace abrasión térmica y el analito sale ionizado. Las partículas aceleradas pasan entonces a un tubo analizador de un metro de longitud sobre el que no actúa ningún campo. debido a su tensión superficial que logra gotas perfectas.25 μs. ESI es una técnica de alta resolución. Ambos se disuelven en un solvente depositado sobre el electrodo (en gotas. La energía desorbida se devuelve como calor. empleando técnicas de ionización por desorción con láser tipo MALDI-TOF. método mezcla). la cámara de ionización no acota el valor máximo de m/z a analizar. MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Se utiliza una matríz fotosensibilizadora que absorbe los fotones del laser. y por tanto las partículas ligeras llegarán antes al detector que las pesadas. La pureza del analito es crítica. pero su peso molecular es menor a 200). 2. los instrumentos que utilizan separadores de tiempo de vuelo no son tan satisfactorios como los magnéticos y de cuadrupolo. 90 . Antes tampoco se podía trabajar con compuestos de alto peso molecular. siendo desviadas fuera del conjunto de barras. Sin embargo sufre de limitaciones en cuanto a su capacidad de resolución y otras relacionadas con la alta probabilidad de que puedan producirse interacciones ión molécula durante el prolongado tiempo de residencia de los iones en la cavidad. Consiste en un electrodo anular y un par de electrodos colectores. las órbitas de los iones más pesados llegan a estabilizarse. Todos los otros iones son neutralizados y eliminados como moléculas sin carga. Para que un ion atraviese el cuadrupolo hasta el detector. ωc. La parte esencial de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de iones en la cual los iones circulan en órbitas bien definidas durante largos períodos. IT (Trampa Iónica) Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden ser formados y confinados durante largos períodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos. mientras que las demás masas. pudiéndose de esta forma hacer experimentos con ellos. El cuadrupolo total transmite una banda de iones que tienen un intervalo limitado de valores de m/z. mientras que las de los iones más ligeros se desestabilizan. que están desfasados 180 grados. velocidades mayores y sensibilidad y resolución elevadas. es necesario considerar el efecto de los potenciales de corriente continua y de corriente alterna sobre la trayectoria de los iones cuando pasan a través del canal entre las barras. debe tener una trayectoria estable en los dos planos formados por cada par de electrodos opuesto. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Q (Cuadrupolo) Un cuadrupolo es parecido a un filtro de banda estrecha variable. La parte más importante del instrumento es el conjunto de cuatro barras cilíndricas de metal que sirven de electrodos del filtro de masas. ωc = v/r = zeB/m 91 (2. lo que causa colisiones con la pared del electrodo anular. La frecuencia angular de este movimiento se llama frecuencia del ciclotrón. ya que en unas determinadas condiciones de operación transmite sólo iones de un pequeño intervalo de relaciones m/z. Se han desarrollado varios tipos de trampas de iones que en general son cuadrupolos pero en el espacio. compactos y más económicos que los instrumentos de sector o de cuadrupolo. haciendo así posible el barrido espectral. El ión debe de ser suficientemente pesado para no ser eliminado por el filtro de paso de masa elevada en uno de los planos y suficientemente ligero para no ser eliminado por el filtro de masa baja en el otro plano. su movimiento llega a ser circular en un plano que es perpendicular a la dirección del campo. FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) Los espectrómetros de masas de transformada de Fourier proporcionan relaciones señal/ruido superiores. que lo que hacen es manipular iones y permitir hacer masas/masas. Las barras opuestas se conectan eléctricamente. un par al polo positivo de una fuente variable de corriente continua y el otro par a la terminal negativa. Debido a que los cuadrupolos funcionan por eliminación selectiva de iones. se aplican a cada par de barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia. Esto permitirá al ión m/z seguir una trayectoria rectilínea y cruzar el túnel alcanzando el detector. El centro de esta banda puede variarse ajustando los potenciales de corriente alterna y continua. Se aplica al electrodo anular un potencial de radiofrecuencia variable mientras que los dos electrodos colectores están conectados con tierra. Los espectrómetros de masas de transformada de Fourier comerciales aparecieron en el mercado a principios de 1980 y actualmente los ofrecen diversos fabricantes. en vez de analizadores de masas. Los iones con un valor apropiado de m/z circulan en una órbita estable dentro de la cavidad que está rodeada por el anillo. Tales cavidades se construyen aprovechando el fenómeno de resonancia de ion ciclotrón. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar el intervalo de valores m/z transmitidos. Los iones de la fuente son acelerados por un potencial de 5 a 15 V e introducidos en el espacio entre las barras. se llaman a menudo filtros de masas. Además. Para entender la capacidad de filtración de un cuadrupolo. Cuando un ión gaseoso es arrastrado o se forma en un campo magnético fuerte. Los espectrómetros de trampa de iones son robustos. Se sacan los iones que no interesan de la trampa y dejamos el que nos interesa estudiar que chocaría con el He y así se haría el masas/masas.23) . al ser inestables sus trayectorias. no alcanzan el detector. Cuando este dispositivo funciona como un espectrómetro de masas los iones quedan atrapados en el interior de la trampa mediante la aplicación de los voltajes y radiofrecuencias adecuados. La aplicación a cada par de barras opuestas de un voltaje y una radiofrecuencia posibilita un control de la trayectoria de los iones. En MSn se hace todo en un único analizador y se puede ir fragmentando sucesivamente para estudiar la secuencia genética. El movimiento circular coherente de los iones resonantes crea una llamada corriente imagen que puede ser observada convenientemente al finalizar la señal de frecuencia. Los espectrómetros de transformada de Fourier son instrumentos caros. el primer analizador funciona como filtro. analizándose los iones hijos con el segundo analizador. Los aumentos en la velocidad de un ion irán acompañados por el correspondiente aumento en el radio de rotación del ion. Ya que las medidas de la frecuencia se pueden hacer con elevada precisión. y en equipos más sofisticado hay MPIR o ECD. Con impacto electrónico se puede regular el voltaje de modo tal de que la fragmentación sea más o menos eficiente. La energía absorbida aumenta entonces la velocidad del ión (y por tanto su radio de giro). ya que se asume que sólo se obtiene el ion molecular intacto. De los cuatro métodos el más pobre es CID. Secuenciación genética En equipos con un solo analizador y un ionizador suave. la frecuencia del ciclotrón depende sólo de la inversa del valor m/z.2. Si se quieren tener fragmentaciones que no se ven en el espectro original. UV (laser) El laser UV se usa poco.3. se incluye una cámara entre la de ionización y el analizador que confina los iones un dado tiempo. luego se obtiene el espectro del ion molecular fragmentado en una cámara de CID (similar a FAB). los iones se mueven libremente sin confinamiento (como si fuera un solo analizador). ECD (Electron Capture Decomposition) La fragmentación también se puede conseguir con impacto electrónico. Un ión atrapado en una trayectoria circular en un campo magnético es capaz de absorber energía de un campo eléctrico de corriente alterna siempre que la frecuencia de campo sea igual a la frecuencia del ciclotrón. es posible una resolución extremadamente elevada (superior a 106). de modo tal de producir excitación vibracional e inducir su fragmentación.Análisis Instrumental Módulo Orgánico Nótese que en un campo fijo. La resolución en espectrometría de masas de transformada de Fourier está limitada por la precisión en la medida de la frecuencia mas que en las rendijas o en las medidas de campo. Luego. En este caso. No se hace una selección de iones previa a la cámara de confinamiento. entonces se requieren más analizadores que vayan aumentando la proporción de los hijos para que los nietos aparezcan. la secuenciación genética sólo se puede realizar con analizadores en tándem. El ion seleccionado ingresa a la cámara y allí se lo fragmenta. En esa cámara se bombardea con un haz de gas noble acelerado neutro. provocando reacciones fotoquímicas que no necesariamente provienen de las fragmentaciones. MPIR (Multiple Photonic InfraRed) La excitación vibracional también se puede conseguir con un láser IR. 2. se confinan los iones selectivamente en una cámara entre los dos analizadores. Otra posibilidad es usar un láser UV. 92 . En el primero experimento. Si se tiene un método de ionización más fuerte y la fragmentación ocurre en la cámara de ionización (fragmentación en la fuente). Su energía está muy por encima de la necesaria. El mas usado es CID. pero la energía es demasiado grande y pueden ocurrir reacciones fotoquímicas. CID (Collision Induced Decomposition) Primero se obtiene el espectro de banda ancha (sin confinamiento). Resonancia Magnética Nuclear. Módulo Orgánico Bibliografía usada . Principle and Applications 3rd edition.Análisis Instrumental 2. Hore. Manuales de Química. 2000. J. Wiley. 2007.3. .E.Teóricas de Gerardo Burton . Mass Spectrometry. V. Eudeba.Teóricas de Rosa Erra-Balsells 93 . Stroobant. de Hoffmann. UK. .P. 1) indica que el límite factible de definición h es inversamente proporcional a la A. Por medio de una óptica y técnicas especiales.1. proporciona una imagen que reproduce mucho mejor los detalles más finos.0005 mm) y A. La imagen de un objeto puntiforme no es un punto. Un objetivo capaz de aprovechar un gran cono angular de luz procedente de la muestra. La Ecuación (3. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular. Módulo Biológico 3.N. como vamos a explicar en el párrafo siguiente. 94 .95 proporciona el valor U más alto que todavía resulta útil. existen tres métodos para aumentar el poder de resolución o. Trabajando con filtros selectivos.Análisis Instrumental 3.1) En la cual λ es la longitud de onda de luz (aproximadamente 0. En el ocular se realiza el aumento final. esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. a fin de disminuir aún más los límites factibles de definición.1. lo que es lo mismo. Éste es un número adimensional que caracteriza el rango de ángulos para los cuales el sistema acepta luz. = 1. 0. Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas que nos permiten observar objetos de pequeño tamaño.2.1.N. también tiene poder resolutivo.N. siendo N el índice de refracción en el espacio objeto. aparte de tener la capacidad de dar aumento al tamaño de la imagen de la muestra. Parámetros ópticos Aumento y resolución Es importante recordar que un microscopio. tendrá mejor poder de resolución que un objetivo limitado a un cono de luz más pequeño. y el tercero en el incremento del índice N en el espacio objeto. Esto se aprecia mirando las imágenes comparativas. una pequeña mancha redonda de luz rodeada de aros luminosos. más altos de 0. El aumento se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular.N. el segundo en aumentar el ángulo U en el espacio objeto.61. Se demostró que la distribución de la luz de esta forma (la cual se conoce hoy bajo el nombre de disco de Airy) es de tal manera que el radio del primer aro oscuro una medida de la distancia resoluble dentro de la imagen.N. Valores de A. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Además puede demostrarse que esta distancia h’ en la imagen se corresponde en el objeto con una distancia h definida por la ecuación: h = 0.95 se consiguen por medio de líquidos de inmersión. El poder de resolución de un microscopio por lo general depende del diseño del objetivo. Principio de funcionamiento Las lentes de un microscopio óptico son el condensador. del objetivo. (o sea.1. El objetivo que recibe un cono de luz mayor.λ/A. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. Como indica la fórmula anterior. el objetivo y el ocular. es la 'apertura numérica' del objetivo. 3. El primer método consiste en la disminución de la longitud de onda λ.00) se ve limitada en la práctica. 3. debido al fenómeno de difracción. este efecto puede extenderse a la longitud de onda ultravioleta.N (3. Por definición: A. = N(sin U).N. La posibilidad de aumentar el ángulo U al máximo teórico de los 90°. para disminuir la distancia resoluble h. sino. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. Microscopía Módulo Biológico La microscopía es una técnica capaz de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. A. La lente apocromática de A. la longitud de onda puede disminuirse acercándose al extremo del espectro de la longitud de onda violeta o corta. Este margen se llama profundidad de foco del microscopio y varía considerablemente en función de la A.66). Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubreobjeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. solo una parte de la imagen estará en foco al mismo tiempo. hasta 1. la imagen entera puede estar en foco al mismo tiempo. Por el contrario. Contraste Diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio circundante. Objetivos secos y de inmersión Están colocados en el revolver.N. 10. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1.5).N. Con una profundidad de campo grande. El líquido de inmersión suele ser aceite (N = 1. una palanca de cierre de diafragma y tornillos reguladores de la platina. tornillos del condensador.Análisis Instrumental Módulo Biológico El método final de disminuir la distancia resoluble consiste en incrementar el índice N dentro del espacio objeto.33) y bromuro de naftalina (N = 1.1: Componente de un microscopio de campo claro.40.3.N. hay un margen finito por encima y por debajo de este objeto.60. en los objetivos denominados de inmersión el medio que separa al cubreobjeto de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al 95 . en el cual se visualizan nítidamente otros objetos. 3.52) aunque también suelen aplicarse de vez en cuando agua (N = 1. Puede aumentarse con tinciones. 40 y 100 (inmersión) aumentos. Son (configuración más común) de 4. Componente de un microscopio Fig. se han realizado objetivos con valores A. 3. Por medio de los baños de inmersión. Tienen un sistema de amortiguación (algunos). pero se ha comprobado que el límite útil corresponde a un valor de A. un tornillo que permite mover el cabeza. del objetivo. Un anillo coloreado indica los aumentos. Sistema de ajuste Consta de un anillo de ajuste de los oculares.1. Profundidad de campo Al enfocar un objeto por medio de un microscopio. Esto se consigue trabajando con "objetivos de inmersión” en los cuales se aplica un líquido entre el portamuestras y la lente frontal del objetivo. Con una profundidad de campo pequeña. de aproximadamente 1. La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo. donde se necesita un haz de luz intenso y controlado. el último argumento en favor de la iluminación crítica fue eliminado. ya que las primeras consideraciones teóricas indicaban que este tipo de iluminación debería permitir una capacidad de resolución más alta que otras formas de iluminación. Otra ventaja del sistema de iluminación Koehler estriba en que la distribución desigual de energía en la fuente de iluminación. Se aplica en la microscopía de alto poder de resolución. que posee un índice de refracción (n=1. En el exterior puede tener un filtro. Por ejemplo. la iluminación crítica ha sido reemplazada gradualmente por la iluminación de Koehler. Berek comprobó que los dos sistemas son teóricamente equivalentes en cuanto a capacidad de resolución. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados.Análisis Instrumental Módulo Biológico del vidrio. La iluminación crítica se consideró la mejor durante muchos años. está disminuida.33) o mejor aún aceite de cedro. en consecuencia la luminosidad de la imagen está aumentada. Muchos microscopios modernos tienen sistemas de iluminación integrados. Si se cierra mejora el contraste. y cuando M. estos sistemas son equivalentes a la iluminación de Koehler. Con los años. no resulta en intensidad de iluminación desigual en el campo visual. Condensador Concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación. la iluminación crítica ha sido reemplazada poco a poco por otra forma de iluminación intensa. En cuanto a la óptica. mientras que en los objetivos secos. y en la microfotografía. Sistema de iluminación Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable. Se enciende y apaga con un interruptor. Diafragma o iris Está dentro del condensador. En la mayoría de los casos funcionan con lámparas incandescentes de baja tensión con las cuales se obtiene un alto nivel de luminosidad. la llamada iluminación de Koehler. característica de la emisión térmica. Este líquido puede ser agua destilada (n=1. Estos sistemas están precintados para que no haga falta ningún ajuste por parte del microscopista. el sistema Koehler permite incluir el control del diafragma de campo. La iluminación crítica proporciona el tipo de fondo deseado puesto que proyecta directamente la fuente de luz en la muestra y los distintos puntos que componen la fuente de luz tienen la distribución de fase completamente aleatoria. 96 . pero empeora la resolución. Iluminación crítica La iluminación crítica es la forma de iluminación en la que la fuente de luz se proyecta en el plano de la muestra. en la microproyección. ya que la fuente se proyecta en el diafragma de apertura. La iluminación de Koehler tiene ciertas ventajas sobre la iluminación crítica por lo cual ha ido reemplazándola poco a poco. Esta hipótesis se fundó en la teoría de que dos puntos en una muestra que se hallen muy próximos podían separarse mejor si su fondo iluminado no tuviera una relación de fase punto a punto.515) casi idéntico al del vidrio. Por estas ventajas prácticas. Son fáciles de operar y aprender a usarlos. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás. También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia.Análisis Instrumental Módulo Biológico 3. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes. Se puede teñir específicamente. mientras que las partes de la célula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras. Microscopio de contraste de fases Es un microscopio óptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Microscopio de campo claro Es el microscopio más simple. Son pequeños y transportables. Los especímenes biológicos no suelen absorber demasiado naturalmente. es decir. Suele usarse en estudios que no requieren el estudio de especímenes vivos. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación 97 .1. Tipos de microscopios Micrioscopios ópticos Microscopio óptico simple Microscopio óptico compuesto Tipos Microscopios electrónicos - Lupa - Campo claro Campo oscuro Contraste de fases Fluorescencia Confocal Transmisión Barrido Efecto túnel o cuántico “de puntas” 3. Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminación de tal manera que la luz difractada por el material en observación tenga un camino óptico diferente. El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Microscopio óptico de campo oscuro Utiliza un haz de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen.1. invisibles con iluminación normal. mientras que las superficies y partículas se ven brillantes. usando estas técnicas sólo logran verse células muertas. sin matarla. dotado de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. Microscopía de fluorescencia El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio óptico.1. el material denso aparece brillante. El contraste está dado por la absorción de las muestras. Las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras. suelen usarse tinciones que en general necesitan fijarse a las células. Se logran aumentos de hasta 1000 veces o más. Microscopios ópticos Las ventajas de estos microscopios: - Son económicos. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar.4. Se obtienen imágenes nítidas. como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada.4. sin fijar la muestra. Con este método. Con lo cual. La longitud de onda más corta de la luz visible es de alrededor de 400 nm. entre el cátodo y el ánodo. los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz. su implementación es sencilla. es un microscopio que tiene una gran profundidad de campo. En un microscopio óptico.005 . Microscopio electrónico de barrido (SEM) El microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscopy). y pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. Permite la observación de las estructuras interiores de las células. cuya cantidad esta relacionada con la topografía y el tipo material en la superficie. para permitir el paso de los electrones). Tiene una resolución del orden del nm (se pueden ver objetos muy pequeños. La preparación de las muestras es relativamente fácil pues la mayoría de SEMs sólo requieren que estas sean conductoras.0. Su resolución está entre 3 y 20 nm. la potencia amplificadora está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Un haz de electrones es lanzado por un cañón en el que se establece una diferencia de potencial. Microscopio confocal El microscopio confocal es en principio un microscopio óptico que incluye como fuente de luz un láser y un sistema electrónico que ayuda a la captación de imágenes. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas. Usando epifluorescencia (confocal o no) pueden observarse simultáneamente diferentes estructuras celulares. En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado. siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo. La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0. que está colocada en una rejilla. Produce imágenes de alta resolución. consiguiendo así que el enfoque se realice sobre un único plano (confocal). y estas desviaciones son recogidas por la pantalla. Observamos la imagen a través de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo similar a la televisión). Un detector mide la cantidad de electrones secundarios que son producidos (o bien los electrones retrodispersados). Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. el microscopio confocal consigue un aumento en la resolución y obtener imágenes de secciones ópticas extremadamentes finas. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 100. eliminando así la interferencia que produce la luz que llega de los diferentes campos ópticos de todo el grosor de la muestra que se observa. A medida que el haz de electrones barre la muestra. Esto se puede hacer de manera simultánea o secuencial 3. Sirve para visualizar virus y bacterias con gran resolución. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. que significa que características espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificación. 98 .Análisis Instrumental Módulo Biológico primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Esta técnica presenta ciertas ventajas: es un método altamente sensible. dependiendo del microscopio. de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. no mayores de aprox.0003 nm. Los electrones chocan con la muestra y se desvían. la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. Cada punto leído de la muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada. Debido a esto.4. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia o sustancias marcadas con fluorocromos. El haz de electrones pasa a través de la muestra a observar. Microscopio electrónico de transmisión (TEM) El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Es importante el vacío dentro del cañón del microscopio electrónico. 200 nm. ya que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire. Las imágenes obtenidas son digitales. se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo.1.2.000 veces o más. mayor será el brillo del píxel en la pantalla. existen una gran variedad de marcadores celulares. y es barrida con electrones enviados desde un cañón. se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. incluyendo algunas moléculas grandes). Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Microscopios electrónicos En el Microscopio Electrónico la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (alto vacío. Resistencia (R): la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella. el tiempo de corrida disminuye así como la difusión. Así. Por esta razón solamente pueden ser observados organismos muertos. Intensidad (I): cuantifica el flujo de carga eléctrica. la movilidad molecular aumenta. dependiendo de la técnica que se use. La limitación de esto es que el desarrollo de calor no puede ser eficientemente disipado. Factores que afectan la electroforesis Campo eléctrico En general la electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este depende de distintos parámetros. los SEM denominados “ambientales” pueden fotografiar muestras no conductoras).3) La movilidad depende de la carga de la partícula que. Por lo tanto. Electroforesis La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa. 3.2) Diferencia de potencial (V): define el campo eléctrico. 99 . permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido metalizados antes de su observación (nota. entregando información morfológica del material analizado. la velocidad de avance es directamente proporcional a ella. es necesario controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra desnaturalizándola. La temperatura es otro factor que afecta significativamente a la electroforesis. Son ampliamente utilizados en la biología celular. Basándose en la ley de Ohm se tiene que: V = IR (3. Algunos efectos del aumento de la temperatura son: - Aumenta la difusión Disminuye la viscosidad y disminuye la resistencia. se relaciona directamente con la distancia recorrida por las moléculas. Si éste aumenta. Factores eléctricos y térmicos La velocidad de desplazamiento es proporcional al campo eléctrico aplicado. A partir de la ecuación de velocidad se obtiene que: (3. y no se puede ir más allá de la textura externa que se quiera ver. perdiendo así la actividad enzimática o inmunológica. la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.2. Los microscopios electrónicos sólo pueden ofrecer imágenes en blanco y negro puesto que no utilizan luz. depende del pH del medio en el que se encuentre. provocando aumento en la temperatura.1. Este instrumento permite la observación y caracterización superficial de materiales inorgánicos y orgánicos. a su vez. Por esta razón es necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad. Movilidad electroforética La movilidad molecular (μ) es una magnitud característica de la partícula o molécula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo. Aunque permite una menor capacidad de aumento que el microscopio electrónico de transmisión.2. 3. Pueden desnaturalizarse proteínas. Aumentan las corrientes convectivas.Análisis Instrumental Módulo Biológico Este tipo de microscopio es muy útil porque produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. Es importante tener en cuenta la neurotoxicidad del monómero. Medios soportes Suelen ser materiales insolubles en sistemas acuosos. los aniones se quedan fijos provocando un flujo de cationes. En estado estacionario la atmósfera iónica puede considerarse esférica. Cuando se usa riboflavina. Aumenta la conductividad. favorece la reacción. A menos de 10ºC el gel es inhomogéneo y a 50ºC los polímeros son cortos. Un iniciador alternativo es riboflavina más luz UV (genera radicales libre por una reacción fotoquímica).2. 3. Si bien no es imprescindible para la síntesis. es la carga negativa del soporte y una capa eléctrica positiva asociada a los mismos. que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. Se forma una doble capa eléctrica. El resultado es un flujo neto de líquido que se desplaza de ánodo a cátodo (FEO). Algunos problemas que pueden aparecer al variar el pH de la solución buffer son: cambios en la solubilidad de los compuestos. Se reduce así la carga neta efectiva.N'-metilén-bis-acrilamida). alteración de las propiedades inmunológicas y/o enzimáticas. Esto trae como consecuencia un menor tiempo de corrida y menor difusión. pudiéndose modificar el pH. porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos.N.2. utilizados para disminuir las corrientes convectivas. El tiempo de corrida aumenta. Inhibidores de la polimerización: oxígeno. 100 . la acrilamida y la bis-acrilamid (N.Análisis Instrumental Módulo Biológico Efectos del pH y de la fuerza iónica del buffer Del pH depende la variación de la carga eléctrica de las proteínas. Introducen tres efectos: - Adsorción. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas. desnaturalización de proteínas.N’N’-tetrametiletiléndiamina (TEMED) se utiliza como catalizador o propagador de la reacción acelerando la formación de radicales libres del iniciador.1. así como el sentido de la electroforesis. La N. elasticidad. en una polimerización vinílica iniciada por el persulfato de amonio. Estructura y síntesis de la matriz del gel La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos. Para ajustar la velocidad de polimerización se pueden variar las cantidades de persulfato y TEMED. Disminuye la capacidad buffer. Efecto de tamiz molecular.2. 3. dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia.2. Cuando se aplica un campo eléctrico. Aumenta la capacidad buffer. en contra de la dirección del campo. formándose así una red de porosidad bastante uniforme. Si la fuerza iónica es alta: - Aumenta la disolución. debiéndose aplicar menor diferencia de potencial. En un soporte de carga negativa. pH ácido retarda la polimerización por la presencia de ácido acrílico por hidrólisis. Al aplicar un campo eléctrico la simetría esférica de la atmósfera iónica se deforma. Electroendosmosis. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida. bloquea los radicales libres iniciados por el persulfato. luz y oxígeno son requeridos. La temperatura óptima es entre 25 y 30 grados. Si la fuerza iónica es baja puede ocurrir: - Disminuye la conductividad permitiendo una mayor diferencia de potencial. Se puede generar el efecto de arrastre: la atmósfera iónica se mueve en dirección opuesta a la del ion central. el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. al pH del gel concentrador.Sistema de gel discontinuo: Se fabrican geles con zonas de distinto T%. se van ubicando en zonas intermedias entre ambos iones de acuerdo con su movilidad electroforética específica y debido al gradiente de potencial que se genera en cada zona del gel concentrador. el pH es uniforme en todo el sistema. que se logran utilizando buffers de composición y pH diferentes.de modo tal que lo acerca al I.2. Sistemas discontinuos . son independientes de las concentraciones originales de cada especie. Estos requerimientos implican inhomogeneidad de los pHs y composición de las soluciones buffer.2. que migran en la misma dirección. Características de los sistemas en PAGE Sistemas homogéneos Se utiliza gel de una sola porosidad y un único buffer. en el gel y en el buffer.4) (3. antes de ser sometidos a separación en el gel de poro fino. Porosidad del gel T = (Acrilamidad + Bisacrilamidad) % (p/v) C = Bisacrilamida/(Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/p) (3. Las dos especies aniónicas (cloruro y glicinato). con un gradiente lineal de poro en el mismo gel. resistencia mecánica. fragilidad y elasticidad del gel. aunque de distinto pH.Análisis Instrumental Módulo Biológico 3. son designados iones inicial (I) o guía (“leading”) y terminal (T) o rezagado (“trailing”). Glicina. respectivamente.zI.e I-.migra rápidamente separándose de las demás especies iónicas. el ion I. mientras que el buffer de los compartimentos electródicos tiene distinta composición. los límites entre las zonas tienen capacidad de autorregulación frente a perturbaciones convectivas y. mayor campo eléctrico local. CI/CT = [mI. y por lo tanto. Estas zonas de límite definido establecen contacto entre los 101 . La concentración espontánea de las proteínas mediante este proceso resulta muy útil en el caso de muestras que incluyen proteínas en un amplio rango de concentraciones. Con T menor al 4% los geles son casi fluidos y con T mayor al 25% ó C mayor al 10% los geles son opacos y quebradizos. a veces. De acuerdo con el fenómeno de límite móvil y la función reguladora de Kohlrausch (ver más adelante). Como los iones de la muestra tienen movilidad intermedia entre T.y migra inmediatamente por detrás de éste y a la misma velocidad.(mI – mQ)] Función reguladora de Kohlrausch (3. al migrar. 3. dentro de cada zona. se utilizan para que los componentes de la muestra sean concentrados en zonas extremadamente estrechas durante su migración a través del gel concentrador de poro abierto.5) T y C influyen sobre el grado de reticulación (tamaño de poro). Al principio de la experiencia.2. Proceso de concentración y separación en el sistema discontinuo multifásico de buffers El objetivo es que en el gel concentrador se desarrolle una electroforesis de límite móvil y se alcance el estado estacionario en el cual se igualan las velocidades de migración (no las movilidades) de los iones involucrados. es decir. las concentraciones. dejando detrás una zona de menor conductividad.Sistema multifásico de buffers: Las discontinuidades de voltaje y pH en las distintas partes del gel. Los valores de pH deben seleccionarse de tal manera que todos los componentes de la muestra tengan movilidades electroforéticas intermedias entre las de los iones inicial (I-) y terminal (T-). Los mismos iones se encuentran presentes en la muestra (buffer de muestra). los constituyentes iónicos son iguales en las fases concentradora y separadora. ¿Qué ocurre en el gel concentrador? Cuando circula corriente eléctrica. Este efecto conduce a un poder resolutivo varias veces mayor que el obtenido en el sistema homogéneo y permite el empleo de muestras diluidas. . en distinta concentración.2.(mT + mQ)]/[mT. reguladas estrictamente.zT.6) Se debe fijar la relación entre las concentraciones de los iones inicial y final (cI y cT) y la movilidad efectiva del ion terminal (variando el pH para modificar el grado de disociación) de modo tal que las proteínas de la muestra se ubiquen entre ambos iones. tiene baja movilidad.2.3. o bien. Se forma un gradiente de potencial que acelera al T. aunque. zI. estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño. tanto para analizar mezclas de proteínas.EI = vi = mi Ei = vT = mT. Teniendo en cuenta que las condiciones de electroneutralidad en cada solución implican que: cT-.2. Finalmente. la ionización del T. se llega a: CI/ CT = mI.ET (3.2. a su vez. Sin embargo. proteínas con puntos isoeléctricos muy extremos (donde la carga intrínseca puede ser lo suficientemente fuerte para influir en la movilidad). ci = concentración del ion. Reemplazando en (3.se incrementa de tal modo que su movilidad aumenta hasta un valor cercano al del ion inicial. Se desarma el límite y comienza el desarrollo electroforético en el que cada proteína migra de acuerdo con su carga y tamaño molecular.2. probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE). Determinación del tamaño molecular con SDS-PAGE Se deduce de lo anterior que esta técnica permite estimar el peso molecular (PM) de una proteína. Como resultado.y T. Al pH del buffer en el gel separador.mQ)/ mT.(mI .8) La conductividad L es: L = e Σci.7) En donde Ei es el campo eléctrico en cada zona. Para la ruptura de puentes de hidrógeno se utiliza Urea 6-8M. Para la reducción de puentes disulfuro se usa 2-mercaptoetanol o DDT. donde la cadena proteica es distendida y solubilizada por el detergente.mi.mQ) (3. mi = movilidad electroforética del ion y zi = carga del ion.zi. como Tritón X-100. el campo eléctrico E en cada zona será inversamente proporcional a la movilidad efectiva del componente iónico. Los valores de I son iguales para todas las zonas puesto que las mismas están en serie. Tween 20 o glicerol al 70%. o proteínas altamente glicosiladas. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca). y viceversa. se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados.2. A veces suelen usarse para la desnaturalización detergentes no iónicos. zQ+ (3. resulta: mT/LT = mi/Li = mI/LI (3. Por lo tanto: vI = mI. Estas determinaciones poseen un margen de error de ~10%.Análisis Instrumental Módulo Biológico aniones de la muestra y los aniones del buffer.zT.solamente.= .4.5. y ejemplificando con los iones I. En este estadio el límite entre las zonas separadas se mantiene si se cumple la función reguladora de Kohlrausch. la conductividad difiere de una zona a otra porque las soluciones contienen distinto número de iones. por ej. El campo eléctrico. 3.7) los valores de E en cada zona. 102 . Electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida. Algunos tipos de proteínas pueden mostrar una migración atípica en esta técnica.cQ+. cargados negativamente.10) ¿Qué ocurre cuando se alcanza el gel separador? Cuando la región del límite móvil alcanza la interfase entre los geles concentrador y separador encuentra una discontinuidad abrupta de pH y de tamaño de poro. siendo e = carga del electrón. donde I es la intensidad de corriente y L la conductividad. como para ser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1. Este proceso electroforético en el que todos los iones migran en zonas adyacentes a la misma velocidad se denomina isotacoforesis. Los complejos proteína/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastón. comparando su movilidad electroforética con la de proteínas de PM conocido.9) Q+ es el contraion común presente en todo el sistema.(mT .4 g SDS/g proteína (unión de una molécula de SDS cada dos residuos de aminoácidos). puede ser expresado como E = I/L. En la ténica de SDS-PAGE. en bandas estrechas debido a la concentración sufrida previamente. mayor movilidad de la proteína.zT. se llega a un estado estacionario (electroforesis de límite móvil). 3. Interacción (agregación. fuerza iónica y temperatura. en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende. Además. en condiciones no-reductoras. Estructura (proteínas oligoméricas. dependiendo de la forma y los pliegues causados por los enlaces disulfuro. que seguirían intactos aún después de la interacción SDS-proteína. facilidad para ser densitometrado. Transparente. Separación de isoenzimas. puentes disulfuros). a diferencia de los geles de poliacrilamida. entre la distancia recorrida por el colorante azul de bromofenol (u otro punto de referencia arbitrario). Modificaciones postraduccionales (glicosilación.2.e inter-catenarios son disociados. Químicamente inerte frente a moléculas biológicas. Resistencia a agentes desnaturalizantes. la estructura cuaternaria se pierde y las subunidades se separan como cadenas peptídicas individuales. Ventajas y desventajas de los geles de poliacrilamida Ventajas - Tamiz molecular: tamaño de poro variable.2. Mecánicamente estable. No obstante. carbamilación). El Rf se calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestión. Es importante la elección del %T del gel de separación de acuerdo con el tamaño de los compuestos a analizar para conseguir efecto de tamiz molecular (separación por PM).7.2. se ha distendido toda la cadena proteica para su interacción con el SDS. Proteómica: segunda dimensión en electroforesis 2D. los geles de agarosa no presentan toxicidad. Fácil de almacenar.2.2. Estable en amplio intervalo de pH. 3. Los geles (termoreversibles) se forman cuando las cadenas del polímero se unen entre sí formando una matriz tridimensional rígida que mantiene unidas las moléculas de agua mediante puentes hidrógeno.3. Control de calidad (adulteración de alimentos). Desventajas - Toxicidad de los monómeros. Electroforesis en geles de agarosa La concentración e integridad del ADN extraído. Trazando un gráfico con estándares de PM conocido. Fuerza electroendosmótica reducida.6. 3. así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo. productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa. fosforilación. En tal caso. cadenas proteicas. Aplicaciones - Determinación de tamaños moleculares. Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como el ditiotreitol). 3. se obtiene una línea de referencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. Amplia versatilidad para la detección de compuestos analizados. Bajo estas condiciones.Análisis Instrumental Módulo Biológico La determinación del PM de proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades). Separada de la agaropectina. Es un técnica insustituible para electroforesis de ácidos nucleicos. Identificación. aunque guarda una cierta relación con el PM. en ocasiones es útil analizar muestras no reducidas de una proteína. La agarosa es un polisacárido proveniente de algas marinas rojas (Gelidium). la migración de las moléculas obedece fundamentalmente a su PM. disociación. no necesariamente corresponde con su PM exacto. se obtiene con diferentes grados de pureza. ligando-receptor). por ejemplo. Esta 103 . para evaluar su composición de subunidades. la movilidad electroforética en SDS-PAGE. Una alternativa es utilizar gradiente de poro. Entre sus características se encuentran su punto de fusión y grado de FEO. Estudios de heterogeneidad molecular (variantes genéticas). La movilidad electroforética relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del PM. El material no puede ser recuperado. los enlaces disulfuro intra. 3.1. Temperatura. La técnica se fundamenta en la separación de grandes fragmentos de DNA induciendo su reorientación mediante cambios periódicos en el campo eléctrico cuya duración determina el intervalo de tamaños que pueden ser separados. Se utiliza para fragmentos de ADN de entre 20 Kb a 10 Mb. Pero en estos casos los fragmentos de ADN deben ser pequeños u oligonucleótidos. Agarosa y buffer de electroforesis. La relación entre longitud del fragmento a separar y la duración del E aplicado es directamente proporcional. disuelto. 3.4.Análisis Instrumental Módulo Biológico estructura rígida con poros de gran tamaño 3-10 nm retarda el paso de las moléculas. Preparación de la muestra. Voltaje. La duración de los diferentes IC que se alternan determina el intervalo de los tamaños de DNA a separar.2. Aplicaciones de PFGE - Análisis de contaminación ambiental (biomarcadores).2.4. más tarda en volver al estado relajado. 3. Utilidad de PFGE – – Electroforesis bidimensional: Mapeo génico de grandes regiones de DNA o de cromosomas pequeños enteros pudiéndose construir bibliotecas genómicas específicas de cada cromosoma. 3. Mapeo génico de grandes regiones de DNA o de cromosomas pequeños enteros (construcción de bibliotecas genómicas). El ADN siempre se encuentra cargado negativamente por la presencia de grupos fosfatos. Equipo para PFGE – – – – – – Cubeta con un conjunto de electrodos cuya disposición y diseño posibilitan las orientaciones del E. la relación carga/masa es constante. Control de manipulación y almacenamiento de alimentos. Sistema de recirculación del buffer a temperatura estrictamente controlada.2.2. La movilidad electroforética de los fragmentos de ADN es inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño expresado en pares de bases (pb).4. efecto que desaparece si cesa E. Electrodos de platino de mayor grosor. Al ser sometidos a E (campo eléctrico). junto con agarosa fundida o en bloques de agarosa sólida. Factores que afectan la resolución de PFGE – – – – – Intervalo de cambio. 3. Cuanto más largo es el fragmento.4. El ADN también puede analizarse en geles de poliacrilamida. Geles de agarosa de bajo FEO y elevada resistencia.4. Forma preparativa. DNA se carga en el gel. y el efecto de retardo se da por el tamaño molecular. El ángulo de reorientación determina cuánto deben girar los fragmentos de DNA cada vez que se cambie la orientación del E (100 a 120°).2.4. Identificación de cepas resistentes a antibióticos. Análisis de moléculas mayores a 10 nm. Estudios epidemiológicos: infecciones hospitalarias. Fuente de tensión: sistema para producir alternancia del E. intoxicación alimentaria. 104 .2. los fragmentos de ADN adquieren una forma elongada. El intervalo de cambio (IC) o duración del pulso es el período durante el cual se mantiene un E en una dirección dada.3. Electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) Es una electroforesis en gel con aplicación de campos eléctricos reorientados. pequeños rangos de pH y altos voltajes aplicados dan una alta resolución en IEF. 3.2.2. Medios soporte para IEF Es necesario para IEF que los compuestos anfotéricos puedan desplazarse libremente. Efectos de temperatura y disolución de CO2. 3. los medios soportes deben ser no restrictivos. En general pueden usarse geles de poliacrilamida con T% = 5%. la aplicación de voltajes altos dan un menor tiempo de corrida. Generan gradientes de pH estable. Así. En electroforesis capilar se utilizan capilares recubiertos. anfolitos carrier o buffer de acrilamida.2. El buffer utilizado está compuesto por derivados de acrilamida que contienen grupos carboxilo o de amina terciaria. la proteína no tendrá carga neta y no migrará en un campo eléctrico. Durante la migración a través del gradiente de pH. Así. Isoelectroenfoque (IEF) Isoelectroenfoque es un método electroforético en el cual las proteínas son separadas según su punto isoeléctrico.5. Determinación de pI - Se mide el gradiente de pH con electrodo de superficie (gráfico pH vs. Técnica de concentración en la zona de pH = PI. más un contraión que es usado para ajustar el pH.4.2. La desventaja de estos es la gran cantidad de calor que provoca. Son el principal componente del buffer. Poder resolutivo de IEF Tanto el gradiente de pH como el campo eléctrico aplicado determinan el poder resolutivo de un corrida en IEF: ∆pI α[(gradiente de pH)/(gradiente de voltaje)]1/2 (3. Elevado poder resolutivo. policargadas. además no interaccionan con componente de la muestra y no son tóxicos. la proteína tendrá carga neta positiva y migrará hacia el ánodo.5. Efectos de temperatura y disolución de CO2.11) Así.5. El electrodo debe ser de diámetro pequeño.5. Los anfolitos carrier son una mezcla de moléculas alifáticas.2. El uso de anfolitos carrier es la manera más común y simple de generar gradientes de pH.5. negativa o cero. se inmovilizará. se lo llama gradiente inmovilizado de pH. con pIs cercanos y alta conductividad. Copolimerizan con la matriz del gel. A pH mayor que su pI. la proteína tomará o perderá protones. Cuando la proteína llegue al punto en el que el pH es igual a su pI. Elevada manualidad. Además. Estos anfolitos se incluyen directamente en los geles para IEF. y la distancia entre los electrodos. Ventajas y aplicaciones de IEF - Técnica de equilibrio y punto final.5. Incorporación de marcadores de pI (gráfico pI vs.5. “inmovilinas”. distancia recorrida). 3. su carga neta y movilidad disminuirán. Gradiente de pH El gradiente de pH se logra con dos tipos de moléculas diferentes. de ánodo a cátodo. con grupos amino y carboxilato. o geles de agarosa. 3. En el caso que el pH del medio sea igual a su pI. en este caso la proteína migra hacia el cátodo durante la electroforesis. En un campo eléctrico los anfolitos se particionan en un gradiente de pH lineal. pero sólo pueden usarse con poliacrilamida como soporte. Medición del gradiente de pH por elución del gel (gráfico pH vs. Las proteínas se encuentran cargadas positivamente en medios cuyo pH sea menor a su pI. inicialmente migrará hacia el electrodo de carga opuesta.2. distancia entre electrodos). Las proteínas pueden tener carga neta positiva.3. 105 . Si el gradiente se genera con buffer de acrilamida. otra característica importante es que presentan escasa absorción a 280nm.2. Además de la buena capacidad buffer que tienen los anfolitos carrier en su pI. La pendiente de este gradiente lo determina el intervalo de pH cubierto por los anfolitos carrier de la mezcla.Análisis Instrumental Módulo Biológico 3. Cuando una proteína se encuentra en un medio con un gradiente lineal de pH y es expuesto a un campo eléctrico.1. 3. migrando mas lentamente. distancia entre electrodos). Son pequeñas. Hace uso de la propiedad de las proteínas de que su carga neta está determinada por el pH del medio. y cuando se encuentran en proporciones óptimas forma un precipitado. la distancia recorrida dependerá del exceso relativo de antígeno sobre el anticuerpo. La técnica es cuantitativa: la altura del pico es proporcional a la concentración de antígeno. El diámetro de este círculo es un reflejo de la concentración de anticuerpos que teníamos en la muestra de suero. Inmunodifusión Inmunodifusión pasiva Reacciones en geles. Curva de titulación de proteínas. que tienen movilidad electroforética semejante. Al cabo de 24 horas se ha creado un precipitado fruto de la reacción entre antígeno y anticuerpo que se muestra en la placa como una línea blanca rodeando al pocillo (en ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar su vision). Inmunoelectroforesis bidimensional Los antígenos son separados en una primera corrida en base a su movilidad electroforética. 3. aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. 3. El antígeno es transportado por electroforesis hacia la zona que contiene al anticuerpo.1. Inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicos a través de arcos de precipitación.6.6. de modo que a mayor diámetro. El antígeno y el anticuerpo migran por difusión uno hacia el otro.3. 3. el complejo antígeno-anticuerpo forma un precipitado visible. mayor concentración de anticuerpo.2. Luego de un período de difusión en cámara húmeda. 106 . La inmunoelectroforesis se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas: 1) la muestra de proteínas se somete a separación electroforética y 2) terminada la electroforesis. El área bajo los picos está relacionada con la concentración de antígeno. con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) que contendrán la muestra de suero. Difusión simple (una dimensión) La solución de anticuerpo es cuidadosamene situada sobre una solución de antígeno. Control de pureza. Electroforesis Rocket En esta técnica el antígeno es corrido en un gel que contiene al anticupero (se agrega antes de la gelificación).2. Inmunodifusión radial El antígeno en suspensión se mezcla con agar-agar en estado líquido y luego éste se vierte sobre una placa (generalmente un portaobjetos de microscopía).6. La distancia desde el pocillo de siembra hasta el frente del arco con forma de cohete está relacionada con la concentración de antígeno en la muestra. La segunda separación se realiza a 90º de la primera. Así. de tal manera de que se formen eventualmente picos de precipitina. Con el tiempo en la interfase donde las dos capas se encuentran. de manera tal que no se mezclen. Una vez solidificado. Técnicas bidimensionales (2D: proteómica).2. La inmunoprecipitación antígeno-anticuerpo se da al mismo tiempo que ocurre la electroforesis.Análisis Instrumental Módulo Biológico Aplicaciones: - Método de referencia para identificación (PI).6.2. Estudios de microheterogeneidad y mutaciones. esta segunda separación lleva a los antígenos dentro de un gel que contiene los anticuerpos (anticuerpos purificados o un antisuero). 3.2. pero poseen diferente peso molecular y/o diferentes determinantes antigénicos. Se deja incubar de modo que el suero con anticuerpos se difunda por la placa de agar y reaccione con el antígeno embebido en la placa. las proteínas son precipitadas con antisueros poli o monoespecíficos. se observan arcos de precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína. el que es llamado flujo electroosmotico (FEO). La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis. Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas. y compuestos de pequeña masa molecular. Flujo electroendosmótico (o electroosmótico) Todos los solutos. Esta migración se llama electroósmosis. y está lleno de una solución buffer. El tubo capilar de sílice tiene normalmente grupos OH expuestos. Moléculas positivas. 3.2. Condiciones de la electroforesis capilar - Se utilizan altos voltajes 10-30 kV. 10-100 μA) .2.300 μm diámetro externo.1.2. Mientras que cuando el flujo es producido por una bomba.2. Todos los solutos van a pasar eventualmente frente al detector. donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz. Son detectores similares a los usados en cromatografía liquida. 3. básico (borato). De ella resulta el movimiento masivo del solvente. sin importar la carga. no hay ensanchamiento de picos. el perfil de flujo es parabólico. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar. El flujo electroosmótico crece con el pH del medio electroforético. El tubo capilar tiene 30-100 cm de longitud. bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado. migraran hacia el electrodo negativo del sistema.7. Electroforesis capilar La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los procedimientos más tradicionales de electroforesis. – – – – Absorción UV/Visible Fluorescencia Espectrometría de masas Electroquímico 3. que muestra el registro de la composición de la muestra. sin importar que carga tengan. negativas o neutras (todas las neutras salen juntas) pueden separarse.4. fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150μm). Los grupos hidroxilos de la sílice se disocian dejando el tubo con una carga negativa.7. Tipos de electroforesis capilar Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE) Es el procedimiento de electroforesis más habitual.7. como en cromatografía líquida. La separación se realiza en un tubo capilar de sílice fundida cubierta con poliamida para darle flexibilidad. Es una característica de la electroforesis capilar producida por la presencia de cargas negativas en la superficie del capilar. 3. Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC) En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. El capilar oscila entre 20 y 80cm. portadoras de una carga eléctrica global. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma. dado que en condiciones normales. Solo las especies que se dirigen hacia el cátodo serán detectadas. cerca del compartimiento catódico.2. El perfil de flujo es plano. todas las especies se desplazan hacia el cátodo por el FEO.Análisis Instrumental Módulo Biológico 3. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen 107 . entonces. o anfótero (carácter ácido y básico). en el cual el capilar es recorrido por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato). Se necesitan detectores muy sensibles para acoplarlos a esta técnica. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución. Cuando se aplica voltaje continuo. el exceso de iones con carga positiva migra hacia el cátodo. debido a los efectos de borde y la inercia.2. difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte.7. Detectores Los detectores se colocan del lado del cátodo. (>500V/cm. 25-100 μm de diámetro interno y 100.7.3. En electroforesis capilar la superficie con gel se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos. La longitud del polímero y su concentración determina las características de la separación. 3.). SDS-PAGE u otras). que contiene un grupo 3’-OH libre. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una amplificación enzimática. 3. Los oligonucleótidos.). como es el caso de algunos enantiomeros. isoelectroenfoque.7. menos consumo de reactivos. Ventajas y desventajas de la electroforesis capilar Ventajas - Puede ser un método alternativo al HPLC. consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico.02 unidades de pH. no hay caminos múltiples. por afinidad hidrófila-hidrófoba.6. Se puede usar de diferentes maneras (capilar vacío. 108 . Separaciones rápidas (1 a 45 min. Bajas concentraciones difíciles de medir. etc. de una región de ácido nucleico.2. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a migrar sin separación.3. gel. Electroforesis capilar en gel (CGE) Esta es la transposición de la electroforesis en gel de poliacrilamida o de agarosa.7. Más simple mecánicamente que el HPLC. Tiene problemas de reproducibilidad. también conocida como electroforesis en soporte.5.Análisis Instrumental Módulo Biológico a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz. Desventajas - 3. se desplazan las especies separadas hacia el detector. Especies difíciles de disolver en medios polares. Al no haber partículas. El “Gel” no esta unido a la pared del capilar y puede cargarse en el capilar por presión. Los polímeros no están entrecruzados (como si lo están al usar otras técnicas electroforeticas. Isoelectroenfoque capilar (CIEF) Esta técnica. Un “cebador” o primer es una secuencia corta de ácido nucleico.2. Alta eficiencia de separación (105 a 106 platos teóricos). por extensión de primer. se pueden separar de este modo. El capilar está relleno con un electrolito que contiene al gel. Pequeños volúmenes de muestra (1-10 nl inyectados). mediada por primers. poco frágiles. Separación de ADN con electroforesis capilar Son separaciones basadas en tamaño. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente. puede ser reemplazado antes de cada corrida electroforetica. de secuencias clonadas específicamente o de ADN genómico. Es una síntesis repetitiva bidireccional de ADN. Fácilmente acoplable con MS. Permite cuantificar (respuesta lineal). No puede ser utilizado como método preparativo. Puede ser automatizado. Compuestos pegajosos (“Sticky”) son problema. debido a la interacción de cadenas de ADN (por ejemplo) con cadenas mas o menos entrecruzadas de un polímero. que forma pares de bases con una hebra molde complementaria y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde (replicación del ADN). Se produce un efecto de filtración que relentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0. Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. es decir. permitiendo así el alineamiento. Dos cebadores o iniciadores (en inglés. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Inicio Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema). La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador. corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. 3. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN. Termociclador. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C). Iones monovalentes. y la temperatura de unión de los cebadores. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. como también del largo de la misma. es decir. como el potasio. serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización. Son secuencias cortas. Este paso puede realizarse de diferentes modos. el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. que permiten que la polimerasa inicie la reacción. y empieza a sintetizar ADN. para mutagénesis de ADN mediante PCR. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. complementarios a una de las dos hebras del ADN.2. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq). Ciclo de amplificación . La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende. o algún otro catión divalente. así como la longitud del ADN que se desea amplificar. el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. ADN molde. Alineamiento o unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del cebador. primers). Delimitan la zona de ADN a amplificar. Actúan como cofactores de la polimerasa. El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso). la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción. raramente empleados en la técnica de la PCR.3. de la proporción de G+C que tenga la hebra.Análisis Instrumental Módulo Biológico 3. de entre seis y cuarenta nucleótidos. Se suele usar magnesio (Mg2+). Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Iones divalentes. Otros métodos. Desnaturalización En primer lugar. se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. sustratos para polimerizar nuevo ADN. siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. También se puede emplear manganeso (Mn2+). Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. que se mantiene durante 1-9 minutos.3. por ejemplo. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor. oligonucleótidos que son. Reactivos para PCR Para realizar la técnica se necesitan: - - - Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP).1. que contiene la región de ADN que se va a amplificar. cada uno. Extensión o elongación de la cadena 109 . normalmente de 18 a 22.Esquema general de la PCR. agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2). la electroforesis capilar. Limitaciones y requerimientos En la práctica. y. Conservación Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.3 El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto.2-0. El producto se llama Amplicon. a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa. así que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad. la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.5 mL que se colocan en el termociclador. para los más pequeños. y. Eficiencia: Máxima amplificación en función del número de ciclos. La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Sensibilidad: Mínima cantidad de ADN necesaria para obtener una gran cantidad de copias. Para la polimerasa Taq. la PCR puede fallar por varias razones. Plateau: No se acumula más producto debido a agotamiento de los reactivos y/o de la enzima La PCR también puede ocurrir con un ciclo de sólo dos temperaturas. Fidelidad: Mínimo número de errores que cometa la ADN polimerasa durante la copia. longitud. 3.Análisis Instrumental Módulo Biológico Actúa la ADN polimerasa. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). La contaminación con ADN extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente distintas etapas.3. Elongación final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias. el proceso de la PCR puede dividirse en 3 etapas: - Amplificación exponencial: En cada ciclo la cantidad de producto se duplica (asumiendo 100 % de eficiencia). y que se corre en el gel junto con los productos de PCR. El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3'. el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido.4. que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga. en acrilamida. uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). 3. de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente. Enlentecimiento (levelling off ): La reacción se hace más lenta cuando la ADN polimerasa pierde actividad y cuando el consumo de reactivos (dNTPs y primers) hace que se vuelvan limitantes. para fragmentos grandes. se emplean técnicas de electroforesis. consistente en desnaturalización y alineado/extensión. en pequeños tubos de 0. En general. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL. entre ellas: la PCR es una técnica de gran sensibilidad. tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.3. en menor medida y dependiendo de la matriz empleada. Características deseable de PCR - Especificidad: Generación de un único producto de amplificación.3. esto es. y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente 110 . es decir. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse). por supuesto. y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas. . del inglés melting temperature). o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. utilizando un par de primers interno a la primera amplificación (↑especificidad. mantenimiento y ubicación será clave. ↑ sensibilidad). . Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica. Además. además de diversas facilidades de manejo. 3.El termociclador. Ensayo de presencia de inhibidores con dilución de ADN. debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello. su manejo. respectivamente.Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas. Medidas para reducir falsos negativos - Control (+) de un gen humano (β-globina). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes. diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas. y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación 111 . que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre.6. que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo. En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente. Controles positivos y negativos Medidas para reducir falsos positivos – – Control negativo (sin ADN) de reactivos de PCR. La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR). . presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET).3. o se formarán dímeros entre ellos.Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. Por ejemplo. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son: . Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen. de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada.3. con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia.5. Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo).Análisis Instrumental Módulo Biológico Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos. . KCl 50 mM y iones Mg deben estar presentes para proveer adecuada fuerza iónica y actuar como cofactor de la enzima. Muestra de ADN que no contiene el ADN blanco. Dentro del laboratorio. PCR en tiempo real Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original. que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos.Existe una gran variedad de polimerasas disponibles.Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí. o para identificar con una muy alta probabilidad. . PCR “encapsulada” o nested: se realiza una segunda reacción de PCR a partir del amplicón. A diferencia de la PCR convencional (en punto final). cuando la sonda está intacta. muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm. 3. La especificidad del reconocimiento biológico permite que muchos de los biosensores puedan operar en matrices complejas.Mediciones rápidas y equipos portátiles han sido diseñados.Altamente específicos (enzimas y anticuerpos). o más o menos inespecíficos (microbianos).4.3. 3. 3. Biosensores Una posible definición: “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas y permiten su cuantificación”. . . sistemas analiticos de amplio espectro –inespecíficos-.4. Métodos de inmovilización del material biológico - Componente biológico siempre en contacto íntimo con el transductor. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado.4.Análisis Instrumental Módulo Biológico (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia.El “listado” de posibles compuestos tóxicos en el ambiente aumenta continuamente.1. . Ventajas de los biosensores . Biosensores y técnicas bioanalíticas 3.4.Es necesario. El material biológico más utilizado son las enzimas.2. Propiedades deseables de un biosensor 3.4. . La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos".Permiten medir un analito sin purificación previa. . es decir.La información obtenida es mucho más “real” que con los métodos analíticos clásicos (biodisponibilidad).4. 3. 112 . permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados. entonces. Atrapamiento (matriz de gel.De onda evanescente. La frecuencia de resonancia se encuentra en el rango de los 10 MHz (radiofrecuencia). . Membrana delgada recubriendo superficie de detección.Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones. Microencapsulación (membranas). . o La forma en que fue cortado. Biosensores piezoeléctricos El efecto piezoeléctrico es la producción de un campo eléctrico por separación de las cargas positivas y negativas en algunos tipos de cristales al someterlos a ciertas tensiones. usados por diabéticos.4.Inmunosensores.Análisis Instrumental - Módulo Biológico Unión covalente o no covalente. 3. La frecuencia de resonancia depende de: o La composición del cristal.Biosensores celulares.Biosensores ópticos.Biosensores enzimáticos.4. Biosensores enzimáticos Son los más importantes (+90% mercado mundial) son los que miden glucosa.1. . Entrecruzamiento (agente bifuncional). Los sensores con acetilcolinesterasa detectan insecticidas fosforados y otros inhibidores (inhibición). - Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo eléctrico se deformará. . Unión covalente (enlaces químicos entre componente biológico y transductor). . . . 3.5. pasta o polímero). Si se inmovilizan enzimas sensibles a determinado compuesto o grupos de compuestos. .5. . . Tipos de biosensores Se clasifican por el tipo de transductor y el tipo de material biológico utilizado. Si un cristal piezoeléctrico se somete a un campo eléctrico que oscila a una frecuencia determinada vibrará con una frecuencia característica.2.Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones.4. .Biosensores piezoeléctricos. estos podrían ser medidos. Adsorción a la superficie (más simple).Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox. .5. o El grosor.Biosensores termométricos.Resonancia de plasmón superficial (SPR).Biosensores electroquímicos. Distancia entre lugar de reacción y lugar donde ocurre la transducción eléctrica. 3. 113 . 3.5. que se halla en contacto con el vidrio.4. se puede determinar qué tipo de moléculas fluye por el canal.5. y la luz emitida por ellos volverá a la fibra óptica. los transductores calorimétricos son universalmente aplicables en biosensores enzimáticos (también de utilidad en biosensores microbianos). La medida se compara con un cristal de referencia con cristal sin material biológico. 114 . Se detectan variaciones muy pequeñas en la frecuencia de resonancia: cantidades de hasta un ng/cm2. La diferencia en temperatura del analito que entra y el producto que sale es determinada por los termistores interconectados. Resonancia de plasmón superficial Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de conducción de un metal. La reacción antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ab) es: - La base de los métodos de inmunoanálisis. La resonancia de plasmones superficiales es un fenómeno óptico que ocurre cuando una luz polarizada se dirige desde una capa de mayor índice de refracción (un prisma) hacia una de menor índice de refracción. 3. La reacción tiene lugar en un pequeño reactor.5. Está definida por una constante k de equilibrio. Se excitan fluorocromos unidos a la superficie mediante la onda evanescente. en principio desconocidas. Es específica.4. La reacción está confinada en dispositivos termoaislados. Se hace que una lámina metálica de oro (con un espesor de unas decenas de nanómetros) crezca sobre un sustrato de vidrio. Por ello. 3. Las propiedades de este plasmón superficial vienen determinadas por el tipo de moléculas adsorbidas por el metal en la superficie.6. Los cambios ambientales no afectan a los cambios de temperatura detectados. que pasa por un prisma e incide sobre la superficie del metal. 3. Inmunoensayos Los inmunoensayos son técnicas basadas en la formación de un complejo termodinámicamente estable formado por antígenos y anticuerpos.Análisis Instrumental Módulo Biológico Un cristal piezoeléctrico varía su frecuencia de resonancia cuando se adhieren moléculas a su superficie.4. Por la superficie del metal expuesto al aire se hace circular un fluido compuesto por moléculas. Es más o menos reversible. Transductores térmicos Las reacciones catalizadas enzimaticamente exhiben los mismos cambios en entalpía que las reacciones químicas espontáneas. La cantidad de muestra necesaria es mínima. Hay una considerable liberación de calor (5-100kJ/mol). Analizando la razón de dependencia de la intensidad de la luz reflejada respecto del ángulo de incidencia y de la longitud de onda utilizada. Biosensores ópticos Inmunosensores de onda evanescente Están especialmente indicados para inmunoensayos: no es necesario separar el resto de los componentes de una muestra clínica. Este haz de luz genera un plasmón superficial. 3. La onda solo penetra hasta el complejo antígeno anticuerpo. Se manda luz. que corre por la superficie de arriba (dentro de ciertas condiciones de ángulo y longitud de onda). Biosensores termométricos La producción de calor es una propiedad general de muchas reacciones enzimáticas.4. La corriente del analito pasa a través de un intercambiador de calor. Es una reacción de alta afinidad. Análisis Instrumental Módulo Biológico Los inmunoensayos son técnicas muy utilizadas cuando: se requiere una medición y evaluación rápida; número muy grande de muestras deben ser procesadas; solo otros métodos analíticos muy complejos y caros están disponibles. (3.12) (3.13) 3.5.1. Terminología Antígeno: Sustancia capaz de ser reconocida por los anticuerpos. Anticuerpo (inmunoglobulina): Una molécula biológica (proteína) que específicamente reconoce una sustancia “extraña” (antígeno), formando parte de un sistema de defensa de los organismos (sistema inmunológico). Tamaño ca. 150 kDa Inmunogeno: Sustancia capaz de generar una respuesta inmune. Hapteno: Sustancias no-inmunogenicas. Usualmente de bajo peso molecular. Inducen la formación de anticuerpos cuando están acopladas a una molécula mayor denominada “carrier”. Puede unirse a un anticuerpo. 3.5.2. Anticuerpos: producción y marcado Los animales tienen un gran número de células productoras de anticuerpos, produciendo diferentes anticuerpos. Cuando un animal (conejo, ratón y otros son muy utilizados para la producción) es inyectados con un antígeno, se promueve la producción y proliferación de células que producen el correspondiente anticuerpo. La sangre de este animal inmunizado contiene anticuerpos, originados por las diferentes células, por ello con pequeñas variaciones pueden ser marcador por radio-isótopos, enzimas, marcas fluorescentes. Los anticuerpos pueden ser: - Policlonales: Anticuerpos que son colectados del suero de un animal inmunizado, reconoce múltiples sitios antigénicos del compuesto inyectado. Monoclonales: Un hibridoma individual de linfocitos B es clonado y cultivado. Los anticuerpos secretados son colectados del medio de cultivo. Reconoce solo un sitio antigénico del compuesto inyectado. 3.5.3. Características de la interacción antígeno anticuerpo - Reversibilidad: dada por interacciones no-covalentes. Especificidad: permite diferenciar moléculas muy similares. Afinidad: medición de la fuerza de la unión; mayor o menor facilidad de asociación y disociación. Avidez: se llama así al incremento de la afinidad dado por la unión multivalente. Es la suma de múltiples afinidades. 3.5.4. Uniones no covalentes en la interacción antígeno-anticuerpo. 115 Análisis Instrumental Módulo Biológico 3.5.5. Ensayos basados en el uso de anticuerpos ELISA ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Un resultado positivo indica que el anticuerpo está en la sangre e implica que la persona ha contraido una determinada enfermedad. En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Strip de flujo lateral 116 Análisis Instrumental Módulo Biológico 3.5.6. Inmunosensores Los anticuerpos, antígenos o haptenos pueden ser utilizados para construir un tipo especial de biosensor denominado inmunosensores. 3.6. Citometría de flujo Un citómetro de flujo es un aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de células y organelas celulares (partículas biológicas) que fluyen en una suspensión celular. Los “sorters” tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citómetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar partículas selectivamente. La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de células o partículas en suspensión. Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología y medicina y son la identificación de antígenos celulares mediante técnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular. 3.6.1. Principio Un rayo de luz (láser) de una única frecuencia (color) es dirigido hacia una corriente de fluido por donde viajan las partículas. Cada partícula suspendida dispersa la luz. Compuestos fluorescentes presentes en la partícula pueden ser excitados y emitir luz de menor frecuencia. La luz dispersada y/o emitida es recibida por los detectores. 3.6.2. Componentes básicos de un citómetro de flujo Fluídos - Células en suspensión. Flujo en una fila simple. Ópticos - Un volumen iluminado donde las partículas dispersan luz y emiten fluorescencia. La luz es colectada, filtrada y convertida a valores digitales. Electrónicos 117 FL4…etc. FL3 . ( FL1. lípidos. 2. Los más destacados: . o bien otras moléculas biológicas. – Hoechst 33342 (Unión a A-T. Se relaciona con la complejidad interna de la célula y su granularidad. 3. o determinadas bases. Alto rendimiento cuántico (emisión de luz). DIPI (A-T).PE llamado FL2 (Ficoeritrina).APC llamado FL4 (Aloficocianina). . – Olivomicina (G-C). Modo de uso: 1. Se detecta en un ángulo de 90º con el haz del láser. Fluorocromos que varían sus características en función del microambiente que les rodea. Intensidades relativas de emisión de fluorescencia. y ésteres de succinimida. . 118 . clorotrirzinil.) .Side Scater (SSC): luz reflejada y refractada. Velocidad de medida – – Es la velocidad media máxima a la que las células pueden ser medidas sin exceder una frecuencia determinada de coincidencias (dos células detectadas como una sola).Análisis Instrumental - Módulo Biológico Valores que son guardados y analizados por una PC. ARN. Unión covalente del fluorocromo a moléculas que se unen específicamente a componentes celulares. Se detecta en el eje de incidencia del láser. 3.4. Marcadores fluorescentes De unión covalente Son fluorocromos que reaccionan y se usan para marcar proteínas. Parámetros medibles en citometría de flujo - El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC).6. función y vitalidad de las células. En los citómetros láser oscila alrededor de 5. Elevada fotoestabilidad. Se relaciona con la superficie y área celular. mitramicina (G-C).3. Deben ser suficientemente selectivos y reactivos. La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC). Propiedades ideales de un fluorocromo: - Alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación (probabilidad de absorber la luz).FITC también llamado FL1 (Isotiocianato de fluoresceina). 3. – DAPI (A-T). Fluorocromos Ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la estructura.5. Fluorocromos que se unen no-covalentemente a estructuras celulares Debido a su composición molecular se unen a determinados componentes celulares. .Foward Scater (FSC): luz difractada. . – Cromomicina A3 (Unión a G-C).6.PerCP llamado FL3 (Piridin clorofil proteína). . Por su capacidad de unión se emplean cromóforos con grupos isotiocianato.Marcadores del contenido en ADN y ARN: – Según el tipo son más o menos específicos para el ADN.6. vital).000 células/segundo. El estado de excitación decae rápidamente. FL2. NADH. y se atribuye a las flavinas y otras coenzimas. . olivomicina.6.Análisis Instrumental – – Módulo Biológico Naranja de acridina se une al ADN y ARN pero tiene la particularidad de emitir en diferente longitud según al tipo de ácido nucleico al que está unido. . mitramicina. Cromomicina y similares Como la cromomicina A3. – pH (6-carboxi-fluoresceína. También hay que eliminar el ruido producido por el aparato con filtros ópticos eficientes y compensación de color. – Potencial rédox (diclorofluoresceína. Bismenimidazoles y afines Tipo Hoechst.Disminuye su intensidad con el pH ácido (que aumenta la unión secundaria).El DAPI y DIPI se usan para hacer las bandas cromosómicas.4-dihidroxidenceno. . naranja de acridina). fura-2.1. pueden teñir células vivas. y la unión secundaria.2. naranja de acridina (unión al ADN y ARN bicatenario. 2. bromodeoxiuridina. hidroxipireno trisulfato). – Se unen a las bases CG del ADN. – Polaridad (anilino-naftalina-sulfato o ANS). indo-1). Se emplean para la determinación de diversos estados funcionales celulares.5. Depende también de la longitud de onda del láser (disminuye al aumentar la longitud de onda). Unión preferente a CG (mitramicina. Ioduro de propidio (unión intercalante) que se excita con un láser de 488 nm. Otros Quinacrina (intercalante). Se clasifican en función de su mecanismo de unión en: – – – Intercalantes (bromuro de etidio. Incremento de la relación señal/ruido Disminución del background y ruido: Autofluorescencia.3-diciano-1.Excitación en el ultravioleta-azul.Marcadores del potencial de membrana: Cianinas y la rodamina 123. – Viscosidad/fluidez. – Requieren del ión magnesio (Mg) para la unión. ioduro de propidio. DAPI y DIPI. .Tienen elevada especificidad por el ADN y se unen a las bases AT. – Calcio (quin II. . olivomicina.Marcadores de membrana y lípidos: marcadores que diferencian compartimentos con distinto pH: poco usados en citometría de flujo. . Hoechst). 119 . La cantidad de autofluorescencia depende del tipo celular y de sus estado de activación . – Excitación en el espectro ultravioleta-azul/verde. NADPH). Fluorocromos en el análisis de ADN La señal fluorescente es proporcional a la unión estequiométrica del fluorocromo al ácido nucleico. cromomicina A3). concentración en exceso. emisión diferencial). – Actividad enzimática (substratos que por acción del enzima varían su fluorescencia o espectro).6. También marcar mitocondrias debido a la alta diferencia de potencial entre su membrana. Marcadores fluorescentes que son sensibles al microambiente que les rodea Varían su espectro de absorción o emisión en función de las características del microambiente que les rodea. DIPI. – No afecta el pH. Tiñen células vivas. 3. 3. Unión preferente a AT (DAPI.5. Se debe comprobar para todas las señales y llegar a un compromiso entre ellas porque a veces cuando una aumenta la otra disminuye. etc. incluso del fluorocromo. . es el tamaño menor o índice de refracción que puede ser medido con cierta precisión. Se usan para alinear o calibrar las prestaciones del citómetro de flujo. sin desviaciones producidas por interferencias de la señal.7. Para cuantificar hay que correlacionar los canales con resultados de muestras conocidas. Prestaciones de los Citómetros de Flujo Sensibilidad: – – – Cantidad mínima de moléculas de un fluorocromo determinado que pueden ser medidas con cierta precisión (resolución). Controles para inmunofluorescencia - Se necesitan controles negativos para descartar unión inespecífica del fluorocromo y seleccionar el umbral de autofluorescencia. . Alineamiento y prestaciones El uso de estándares de alineamiento proporciona un buen método para detectar cambios y problemas en la configuración óptica y señal de un día a otro.Análisis Instrumental Módulo Biológico 3.6.6.Es el equivalente a reseleccionar el citómetro a una escala de intensidad relativa constante. Compensación de color o electrónica En las aplicaciones citométricas con dos o más fluorescencias nuestro objetivo es marcar las células con fluorocromos distintos que reflejen las diversas propiedades celulares diferentes y detectar la señal proporcional a la primera fluorescencia (FL1) en un detector y la de la segunda (FL2). las células muertas. Los “controles de isotipo” son para descartar reacciones antígeno-anticuerpo no-especificas (“background”). debrís. 3. . 120 . Los fluorocromos tienen espectros de emisión que en ocasiones se superponen y los filtros no son perfectos. y también FL3 (ioduro de propidio) a FL2 y FL1 (fluoresceína). Hay comerciales o se los puede preparar uno mismo.El método más sencillo consiste en ajustar el voltaje del fotodetector (produce cambios exponenciales o no-lineales de la señal) y/o ganancias (crecimiento lineal) para conseguir un pico de una intensidad determinada de un standard estable cada día. Las señales producidas por estas reacciones no-especificas deben ser descontadas para obtener el valor real buscado. Estándares y controles Estándares (Patrones de normalidad) - Un estándar es un material estable que tiene valores determinados de fluorescencia o dispersión de luz. no absoluta.También es útil hacer una calibración cruzada de escalas logarítmicas y lineales. Depende de muchos factores. Son causas de tinción no-específica los fragmentos Fc de las inmunoglobulinas. . Generalmente se debe extraer FL1 (fluoresceína) de FL2 (ficoeritrina).6.El citómetro de flujo se considera alineado cuando se consigue una elevada fluorescencia o señal con un bajo CV. por ello los citómetros poseen un sistema informático de compensación o sustracción de señal. Calibración (ajuste de escalas) Los citómetros de flujo ofrecen una información relativa. . etc. Es difícil predecir teóricamente el grado de compensación y hay que ajustarlo individualmente. Para la luz dispersada. En farmacología: estudios de cinética celular. - En hematología: conteo celular. En oncología: diagnóstico/pronóstico. análisis de médula ósea. estimulación linfocitaria. 3. fórmula leucocitaria. Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología y medicina y son la identificación de antígenos celulares mediante técnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular. monitoreo del tratamiento.8. Aplicaciones La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de células o partículas en suspensión. 121 . conteo reticulocitario.6. En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico. sensibilidad a antibióticos. En inmunología: subpoblaciones T.Análisis Instrumental – Módulo Biológico La sensibilidad aumenta si se disminuye la velocidad de flujo (paso) manteniendo constante el diámetro del flujo interno (muestra). Módulo Biológico Bibliografía usada - Teóricas de la cursada.Análisis Instrumental 3. 122 .7. - Wikipedia < - Apuntes que encontré googleando cada tema.