Universidad Nacional autónoma de México Facultad de estudios superiores Cuautitlán Departamento de Ciencias Biológicas Sección de Bioquímica y Farmacología HumanasAsignatura Anatomía e Histología Humanas Grupo 1302 Bioquímica Diagnostica Procesamientos de muestras histológicas Integrantes Flores Pérez Luis Ángel Rodríguez Gómez Lucía Ruiz Moreno Raymundo Iván Equipo No 10 Profesoras: M en C, Tais Nopal Guerrero María Verónica Vázquez Cianca 02/ Septiembre / 2013 09/ Septiembre / 201 Objetivos Aprender las técnicas para la manipulación de muestras histológicas realizando una inclusión con los órganos de Rata en parafina y comprender el fundamento de los artefactos que podrían llevarse a cabo en el proceso. Introducción "La fijación es esencialmente un método para la preservación de la morfología y composición química de la célula. Durante la fijación, las sustancias albuminoides del tejido pasan del estado sol, como se encuentran en vida, al de gel, cuyo contenido de agua es menor. De esta manera, se detienen los procesos post-mortem y las estructuras se conservan con un mínimo de artificios, preparándolas para tratamientos ulteriores (Thompson 1966, García del Moral 1993, Eltoum et al. 2001)". DESHIDRATACION La función principal de este proceso es la extracción del agua del tejido. -Se realiza antes de la inclusión y antes del montaje. Es necesaria para la utilización de medios no acuosos (hidrofóbicos) como la parafina, celoidina y algunos plásticos, porque no infiltran en tejidos con agua. Una excesiva deshidratación produce un tejido duro difícil de cortar. Una deshidratación incompleta produce que el agente aclararte no actué apropiadamente y se obtendrán bloques blandos, además produce la mayor cantidad de problemas en los pasos posteriores del procesamiento histológico. (L. Carson, 2006) Las sustancias que actúan como agentes desecantes se eligen dependiendo de la sustancia que deseemos secar, pudiendo así ser de tipo ácidas, neutras, o básicas. Entre todos los agentes desecantes existentes, los más frecuentes suelen ser los desecantes para desecadores y los desecantes utilizados para disoluciones. (Ángeles Méndez, 2011) Por otro lado tenemos la parafina, la cual se utiliza debido a su gran afinidad y capacidad de absorción, en cuanto a disolventes apolares se refiere, como por ejemplo, el hexano o el benceno. (Ángeles Méndez, 2011) ACLARAMIENTO Los reactivos usados tienen un alto índice de refracción y pone a tejido claro o transparente. Miscible en agentes deshidratantes y medios de infiltración. El uso de agentes aclarantes durante largos periodos produce endurecimiento. Una aclaración excesiva produce desnaturación de proteínas dificultando la microtomía. Ejemplos- Xileno, Tolueno, Benceno. (L. Carson, 2006) . INFILTRACION Mantiene a las células y estructuras celulares en su relación propia al ser cortadas en secciones finas. Medios de inclusión solubles en agua (hidrofilos), Polietilglicol (PEG) / Carbowax. Infiltra directamente después del fijador, sin pasar por deshidratación y aclaramiento, por lo que la grasa no se disuelve, sin embargo, esto no ocurre en tejidos con gran cantidad de grasa (ej. tejido adiposo).Se infiltran los tejidos con estos medios cuando quedan muy blandos. (L. Carson, 2006) INCLUSION *Es esta etapa se forma un bloque encapsulando al tejido en el medio de inclusión usado para procesar y permitir al medio solidificar. Debe tenerse en cuenta la orientación del tejido con la que posteriormente se cortará. (L. Carson, 2006) En resumen, un fijador tiene como misión: * Evitar la autolisis debida a los propios enzimas. * Proteger el corte o la pieza del ataque bacteriano. * Insolubilizar los componentes celulares que se desean estudiar. * Preparar a las distintas estructuras para posteriores tratamientos. * Evitar la disolución de determinados compuestos en el fijador. * Conservar o provocar determinadas reacciones químicas. Diagrama de Flujo (2005). Histología Básica. Barcelona, España: Masson S.A. pag. 54 EL procedimiento se llevó a cabo hasta el punto 5 en el diagrama. las propiedades físicas.DDiagrama de Flujo Observaciones y Resultados: 1- ¿Durante el proceso de deshidratación y aclaramiento del tejido observaste algún cambio de color o apariencia? Evidentemente se notó un cambio en cuanto al color de la muestra, la consistencia se hizo más rígida, en nuestro caso era el testículo de la rata y fue bastante notoria el color más claro, y en cuanto al tejido Liposo fue disminuido. 2- A tu parecer y en comparación a lo observado en la práctica anterior de un tejido sin fijar y un tejido fijado ¿Existe algún cambio que hayas observado, cuáles? En el Tejido fijado hay mayor facilidad en cuanto a su manejo puesto que es rígido y a simple vista es más resistente cabe mencionar que el tejido ya no puede tener algún cabio de putrefacción y nos facilita su corte. En el tejido sin fijar es un tanto incomodo en su manipulación puesto que es un tejido frágil, que puede sufrir cambios Post-Mortem, los cortes no se pueden llevar a cabo muy bien. 3- ¿Desacuerdo a lo anterior consideras que la fijación realizada fue correcta? Nuestra fijación como tal no fue la correcta, al momento de terminar la aclaración con el Xilol y al comenzar la infiltración con la parafina no alcanzo parafina suficiente para nuestra muestra. - Testículo de Rata - 1.5 cm de Diámetro No se llevó a cabo la infiltración por falta de parafina. Análisis de resultados En la práctica pudimos observar que el tejido de los testículos de la rata fijado con formol al 10% es más fácil de manipular debido a que el fijador evita la autolisis que es una alteración de las características estructurales de la célula. Se tiene que utilizar un fijador para resistir su posterior manipulación. Observamos que el fijador le dio a nuestra muestra firmeza. A la muestra se le agrego de manera creciente alcohol etílico que es un agente deshidratante muy comúnmente utilizado. Esto se hizo con concentraciones al 80%, 95% y 100% durante 30 minutos, esto para que las concentraciones de agua disminuyan. Al momento de realizar la deshidratación se logró observar un cambio en cuanto al color del tejido ya que antes de deshidratar nuestro tejido este tenía un color gris y al ir avanzando la deshidratación el tejido se volvió blanco, este tuvo una consistencia rígida. También notamos que el tejido adiposo disminuyo levemente. Es necesario mencionar que el proceso de deshidratación se tiene que realizar gradualmente ya que cambios drásticos en la concentración del alcohol etílico puede propiciar que el protoplasma de contraiga provocando distorsiones en las celular y tejidos. Largas exposiciones a soluciones de altas concentraciones o soluciones anhidras también contraen los tejidos y causan rupturas internas. Es por eso que se tiene que aplicar la metodología adecuadamente para que esto no suceda. Se tiene que realizar el aclaramiento para servir como solvente de la parafina. El equipo no pudo realizar la infiltración/inclusión debido a que no alcanzamos parafina, pero este paso es muy necesario ya que penetra los tejidos uniformemente logrando que los cortes se realicen mas fácilmente. Conclusiones Al llevar a cabo las técnicas de deshidratación, aclaramiento e infiltración, aunque esta última solo se haya llevado a cabo solo en una pequeña parte de nuestra muestra hemos dejado en óptimas condiciones la muestra para posteriormente llevar a cabo un corte en el micrótomo. Nos dimos cuenta que es necesario seguir detalladamente cada paso ya que si no lo hacemos de esta manera el tejido puede perder sus propiedades físicas y químicas, alterando nuestros resultados a la hora de observar la muestra en el microscopio. Bibliografía Luiz C. Junqueira, Jose Carneiro. (2005). Histologia Basica. Barcelona, España: Masson S.A. Maria Elsa Gomez De Ferraris, Antonio Campos Muñoz. (2000). Histologia y Embriologia Bucodental. Madrid, España: Medica Panamericana. www.uv/univirtual. (Agosto de 2009)