MÓDULO DE SEPARAÇÕES ANALÍTICASUNICAMP ± Instituto de Química Experimento 3 ± Determinação Qualitativa de compostos voláteis de ingredientes culinários por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas. 1. Parte experimental 1.1. Materiais e reagentes y GC-MS contendo biblioteca de dados NIST 2005 e Wiley 2005 y Fibra de SPME (Polidimetildiloxano ± PDMS 100 µm) y Amostrador (holder) de SPME para injeção em GC y Vials de 40 mL y Tampas com septo y Suporte universal com garras y Amostras de temperos culinários: Louro, Orégano e Cominho em pó. 1.2. Procedimentos 1.2.1. Amostragem Pesou-se na faixa de 200 ± 350 mg de cada tempero culinário (um por vez) em vials de 40 mL e deixou-se em repouso por 5 min. Inseriu-se a agulha de SPME no frasco de amostragem deixando-a exposta ao hadspace e esperou-se mais 5 min. Após a extração, recolheu-se a fibra para o interior da agulha retirando-a do logo após do frasco de amostragem. Com o cominho, fez-se uma quarta amostra e deixou-a em repouso por 10 min (pré-concentração) 1.2.2. Separação e identificação Imediatamente após a extração, inseriu-se a agulha no injetor do cromatógrafo, deixando a fibra exposta por 5 min. Os compostos foram transferidos para o interior da coluna cromatográfica, onde foram separados e detectados pelo espectrômetro de massas. A identificação dos compostos foi realizada mediante uso da biblioteca de dados. 2. Resultados e discussões SPME: O processo de amostragem neste experimento foi feito utilizando-se a técnica de SPME (Solid Phase Microextraction ± Microextração em Fase Sólida). A SPME é uma microtécnica na qual o analito é extraído e pré-concentrado1. O dispositivo básico utilizado consiste em um bastão de fibra ótica de sílica fundida com 100 µm de diâmetro e 10 mm de uma extremidade à outra, recoberto com um filme fino de um polímero (no caso PDMS - dimetilsiloxano), ou de um sólido adsorvente1. A figura 1 representa um dispositivo comercial utilizado2: Figura 1. Dispositivo comercial para SPME: 1 ± fibra ótica externa; 2 ± agulha de aço; 3 ± corpo do aplicador; 4 ± septo de silicone; 5 ± guia do aplicador; 6 ± guia do êmbolo; 7 ± êmbolo. No experimento fez-se uma extração SPME do headspace do vial que continha as amostras. Na extração headspace a matriz deve ficar em repouso durante um período determinado. Durante este tempo, as substâncias de interesse presentes na matriz se volatilizam e vão para o headspace (espaço vazio do vial), até um momento em que ocorre um equilíbrio da concentração do analito entre a matriz e o headspace, chamado de pré-equilíbrio1 . Após este período, a agulha de aço deve ser introduzida no vial, e então a fibra deve ser Esse elétron colide com outro elétron da eletrosfera da molécula. Este equilíbrio depende da volatilidade do analito (quanto maior. Para que todo o analito presente na fibra seja dessorvido na coluna. o dispositivo pode ser retirado do cromatógrafo. o que leva a conclusão de que como cada analito possuí características únicas. Apenas íons de razão m/z (massa/carga) ressonantes passam pelo . Uso do amostrador de SPME para o processo de extração e o de dessorção do material extraído para análise por GC. mais rápido e mais fácil será o equilíbrio). dos equilíbrios de partição entre as três fases e dos coeficientes de difusão do analito nessas fases1. o tempo de equilíbrio também é único para cada analito. no sistema fibra-headspace-matriz1. e contados2. Em um MS de fonte de ionização EI. Agora. por um elétron de energia típica de 70 eV. As moléculas são fragmentadas e ionizadas pela fonte e analisadas e detectadas pelo multiplicador de elétrons3 . a fibra deve ser novamente exposta para que o analito seja dessorvido para a coluna cromatográfica. GC-MS: A figura 3 apresenta um esquema completo de GC-MS3: Figura 3. arrancando-o e transformando a molécula em um radical positivo. Na figura 4 pode-se observar mais detalhadamente o esquema de um espectrômetro de massas de fonte de ionização por EI (Electron Ionization ± Ionização por elétrons) e analisador de massas quadrupolo2: Figura 4. o dispositivo pode ser retirado do frasco de amostragem e a agulha deve ser colocada imediatamente no injetor do cromatógrafo a gás. ou seja. Esquema de um instrumento GC-MS. Neste instrumento. sendo que o processo de dessorção é favorecido pela temperatura do injetor e por analitos que não sejam termicamente estáveis2 . Transcorrido o tempo adequado de dessorção. de acordo com suas massas moleculares.exposta ao headspace para que o analito seja sorvido na fibra2. Esse radical positivo se fragmenta para aliviar a sua energia interna e esses fragmentos são separados magneticamente no quadrupolo. a fibra deve ficar exposta por um tempo determinado. moléculas da amostra são bombardeadas. a fibra pode ser recolhida para dentro da agulha. Tendo ocorrido o equilíbrio trifásico. A figura 2 ilustra todas as etapas citadas no procedimento de amostragem e neste texto explicadas1: Figura 2. normalmente. Esquema de um espectrômetro de massas de fonte de ionização EI e analisador quadrupolo de massas. a amostra é injetada pela porta de injeção e o efluente penetra em uma entrada de um espectrômetro de massas tipo quadrupolo. Agora deve-se obter um equilíbrio de concentração do analito no sistema trifásico. O -pineno também é um monoterpeno encontrado em quase todas as plantas e amplamente empregado na obtenção de aromas e fragrâncias9. O pico 1 possuí uma área de 289931. fórmulas moleculares (estes dados foram retirados do anexos.85% do total. não sendo assim observado no espectro. O espectro de massas do pico 2 está em anexos. Massas utilizadas para cada tempero no experimento. Utilizando-se os bancos de dados NIST 2005 e Wiley 2005. O íon molecular pode ser visto no espectro. figura 3) e fórmulas estruturais.8 Análise e identificação das amostras de temperos: Para cada pico majoritário identificado nos cromatogramas dos temperos utilizados foi obtido um espectro de massas. é gerado um sinal eletrônico que é transformado em um espectro. figura 3.70%. foram identificados possíveis compostos correspondentes a razão m/z encontrada do íon molecular. característica dos monoterpenos. que como foi utilizado uma fonte de ionização EI. De acordo com a área e a intensidade do pico no cromatograma da figura 1. como está indicado na tabela 6 dos anexos. Quando os íons incidem no detector. Amostra de Louro: Observando-se o cromatograma da amostra de louro presente em anexos. As identificações feitas pelos bancos de dados estão em anexos. Um espectro típico de massas contém tanto o íon molecular quanto seus fragmentos. Nomes. representando 4. não foi possível afirmar qual realmente está presente na amostra do tempero pois seus perfis de fragmentação são praticamente idênticos. os compostos Ocimeno ou -pineno estão presentes em pequena quantidade na folha de louro.9 297. . Na tabela 2 são apresentados os compostos que foram identificados para os picos 1 e 2. CAS number e fórmula estrutural dos dois possíveis compostos para os picos 1e 2 da amostra de Louro.3 Orégano 241.6 Cominho em pó 231. O pico com maior intensidade no cromatograma é o pico 2.+) é instável e sofre um processo dissociativo exotérmico. que apresenta área igual a 5484964 e uma porcentagem correspondente de 91. O íon molecular aparece no espectro com razão m/z 154. Massas (mg) Tempero Massa 1 Massa 2 Louro 220. CAS number (Chemical Abstracts Service number). dentro de certa porcentagem estabelecida no experimento. figura 2. sendo o íon de m/z 136. que são hidrocarbonetos formados por duas unidades isopreno C5 7. Os bancos de dados comparam o padrão de fragmentação de cada pico do cromatograma com o padrão dos compostos existentes em sua biblioteca. O Ocimeno é um monoterpeno acíclico que é encontrado em óleos de folhas de Louro da espécie Pimenta Acris8. Pico Nome CAS number Fórmula Molecular Fórmula Estrutural Ocimeno 1 -pineno 2 Eucaliptol 127-91-3 470-82-6 C10H16 C10H18O (5) (6) 502-99-8 C10H16 (4) Os dois possíveis compostos identificados para o pico 1 possuem fórmula molecular igual a C10 H16. Tabela 1. mas em alguns casos. o íon molecular (M. No experimento foi utilizado um gás de arraste inerte apolar na GC. Os espectros de massas de cada pico estão nos anexos. em anexos. que no caso foi de uma semelhança mínima de 80%. portanto os analitos foram separados por volatilidade. A tabela 1 contém as massas utilizadas de cada tempero no experimento. nos casos em que foram identificados mais de um composto para um mesmo pico. Tabela 2 . figura 2. a razão m/z é sempre igual à massa molecular.quadrupolo e chegam ao detector2. há três picos majoritários. Porém. figura 1. sendo que os mais voláteis saíam primeiro da coluna e os menos voláteis ficavam por último. com seus respectivos nomes. bronquite e doenças virais. Estudos sugerem que o eucaliptol também contém propriedades repelentes10.-terpineol Cis. foram considerados apenas os quatro picos de maior intensidade.29% da composição da amostra de orégano analisada.98%. conforme indicado no cromatograma da figura 4. fórmulas moleculares e fórmulas estruturais. Amostra de Orégano: Para o orégano foram identificados 13 picos majoritários no cromatograma. CAS number (Chemical Abstracts Service number).-terpineol (estereoisômero) 5 Thujanol (isomer) Thujanol Trans-thujan-4-ol Cis. que de acordo com as fórmulas estruturais da tabela 3. 12. não foi identificado nenhum composto químico correspondente. respectivamente áreas iguais a 3766789. de acordo com a tabela 7 em anexos. febre. que apresenta área igual a 206564 e porcentagem de 3. Estes quatro picos juntos representam 74.45%. 8. monoterpenos e alcoóis . Na tabela 3 são apresentados os compostos que foram identificados para os picos 4. 2766101. Nome. e além de todas essas aplicações. Pico Nome CAS number Fórmula Molecular Fórmula Estrutural Mosleno (-)-Cis-2-Careno 4 (1S. Para o pico 3. Porém.-terpineol (estereoisômero) 7 Thujanol (isomero) Thujanol Trans-Thujan-4-ol 1-terpinen-4-ol 10 Cis. CAS number e fórmula estrutural do composto identificado para os picos 4. 3941452 e 13611994. 7 e 10. que pode ser visualizado na figura 4 em anexos. 5. As identificações feitas pelos bancos de dados estão em anexos. possuem. figura 6. ele também é amplamente utilizado como fragrância em vários produtos.16% e 41.62%. basicamente. com seus respectivos nomes.3R.53%. Os espectros de massas de cada pico estão em anexos. podendo ser utilizado em tratamentos de doenças como asma. 5. 5. em anexos. Tabela 3. 7 e 10 da amostra de Orégano. como pode ser observado na figura 3 que está em anexos.-terpineol -terpinoleno 5208-49-1 99-85-4 7299-41-4 7299-40-3 513-23-5 546-79-2 7299-41-4 7299-40-3 513-23-5 546-79-2 562-74-3 7299-41-4 586-62-9 C10H16 C10H16 C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H18O C10H16 (16) (17) (13) (11) 99-85-4 5208-49-1 C10H16 C10H16 (12) (11) (12) (14) (15) (16) (13) (14) (15) (13) (18) Os picos 4. figura 5. esta porcentagem é composta por. 7 e 10.O Eucaliptol é um éter cíclico (epóxi).6R)-(-)-4-Careno Mosleno Cis.-terpineol Cis. e porcentagens de 11. 73. possuem massa 136u e os alcoóis cíclicos de fórmula C10H18 O possuem massa 154u. Os picos 5 e 7. Amostra de Cominho em pó: A amostra de cominho em pó foi utilizada no estudo do tempo de préconcentração. Para a primeira amostra.46%.6-Dimetil-2metilenobiciclo[3. Pico Nome CAS number Fórmula Molecular Fórmula estrutural o-Cimeno p-Cimeno 3 m-Cimol t-Butilbenzeno o-Cimeno Mosleno Mosleno 5 6. 170272751 e 17400362. que está na figura 7 em anexos. pode ser um álcool cíclico ou um monoterpeno. respectivamente e porcentagens iguais a 5.3R. A primeira amostra de cominho de 231. ficou em préconcentração por 10min.49%.1]heptano (-)-CIS-2-CARENO (1S. igual aos outros temperos analisados. O pico 4 de acordo com a identificação realizada pelos bancos de dados. com seus respectivos nomes. ficou em repouso por 5min na fase de préconcentração. 5. são alcoóis cíclicos e já o pico 10. Na tabela 4 são apresentados os compostos que foram identificados para os picos 3.1. Tabela 4. certamente é um monoterpeno. CAS number e fórmula estrutural do composto identificado para os picos 3. 10 e 11. figura 8 e as identificações feitas pelos bancos de dados estão em anexos. Os espectros de massas de cada pico estão em anexos. 10 e 11.cíclicos.02%. fórmulas moleculares e fórmulas estruturais. OISOPROPENYL1-Isopropenil-2metoxibenzeno 2-Caren-10-al 11 2-Caren-10-al C10H14O (29) 527-84-4 99-87-6 535-77-3 98-06-6 527-84-4 99-85-4 99-85-4 2437-95-8 5208-49-1 5208-49-1 122-03-2 122-03-2 10278-02-1 - C10H14 C10H14 C10H14 C10H14 C10H14 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H12O C10H12O C10H12O C10H12O C10H12O C10H14O - (19) (20) (21) (22) (23) (12) (12) (24) (25) (25) (26) (27) (27) (28) (29) .6R)-(-)-4-Careno Cuminal 2-metil-3-fenil-Propanal 10 Cuminal ANISOLE. que podem ser observadas na tabela 8 que está em anexos. 10 e 11 da amostra de Cominho em pó.9 mg. CAS number (Chemical Abstracts Service number). Já a segunda amostra de 297. Foram considerados apenas os picos 3. 5. 5. Nome. foram identificados 12 picos majoritários no cromatograma.8 mg. conforme indicado no cromatograma da figura 7 em anexos. 20951440.32% e 7. 9. Os monoterpenos de fórmula molecular C10H16 . figura 9. que apresentaram áreas de 12675482. 7. que está na figura 10 dos anexos. 72.19%. fórmulas moleculares e fórmulas estruturais.29% da composição total do cominho e de acordo com a tabela 4. o composto 5 é um monoterpeno.60% e 9. CAS number (Chemical Abstracts Service number). figura 12. CAS number e fórmula estrutural do composto identificado para os picos 2. O composto 3 é hidrocarboneto aromático. que podem ser observadas na tabela 9 em anexo. Esses quatro picos juntos representam 93. Nome. 289258675 e 36630505. Pico Nome CAS number Fórmula Molecular Fórmula estrutural o-Cimeno p-Cimeno 2 m-Cimol p-Cimeno p-Cimeno Mosleno Mosleno 5 -Terpineno Mosleno Mosleno Cuminal 14 Cuminal 2-metil-3-fenil-Propanal 527-84-4 99-87-6 535-77-3 99-87-6 99-87-6 99-85-4 99-85-4 99-86-5 99-85-4 99-85-4 122-03-2 122-03-2 C10H14 C10H14 C10H14 C10H14 C10H14 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H12O C10H12O C10H12O (21) (19) (20) (20) (20) (12) (12) (32) (12) (12) (26) (26) (27) . Foram considerados apenas os picos 2. com seus respectivos nomes. 14 e 16.28% da composição do cromatograma do cominho.3-Caren-10-al 3-Caren-10-al 3-Undecen-5-yne. hidrocarbonetos aromáticos e cíclicos e aldeídos. conforme indicado no cromatograma da figura 10 em anexos. 5. respectivamente e porcentagens iguais a 4. para o pico 5 a massa foi de 136u. Na tabela 5 são apresentados os compostos que foram identificados para os picos 2. possuem massa 134u. o cominho contém basicamente.28%. figura 11 e as identificações feitas pelos bancos de dados estão em anexos. Para a segunda amostra foram identificados 20 picos majoritários no cromatograma. que apresentaram áreas de 17052564. Todos os compostos identificados para o pico 3. 5. 14 e 16 da amostra de Cominho em pó. 5. 5. (E)- 74744-29-9 C10H14O C10H14O C11H18 (30) (30) (31) Os picos 3. para o pico 10 a massa foi de 148u e para pico 11 a massa foi de 150u. Os espectros de massas de cada pico estão em anexos. 14 e 16. 10 e 11 representam 95. o 10 pode ser um aldeído ou um metóxi e o composto 11 pode ser um aldeído ou um alceno. Tabela 5.21%. 28726522. Cuminal Cuminal 2-Caren-10-al 2-Caren-10-al 16 3-Caren-10-al 3-Caren-10-al 6. a identificação de compostos por GC-MS fornece apenas possibilidades na maioria dos casos. Como o tempo de repouso foi o dobro para a amostra 2. Outras qualidades da técnica é o fato de que os extratos saem limpos. esse resultado é refletido nos cromatogramas. e devido ao pequeno tamanho da fibra extratora. . O tempo a partir do qual o perfil cromatográfico da amostra não muda mais. Portanto. GC-MS. que ficou 5 min em repouso. A extração SPME ideal¶. No experimento não se sabia o tempo de pré-equilíbrio para a amostra de cominho. nem diluída. que pode ser observado nas figuras 3. no caso. A porcentagem de semelhança para a maioria dos compostos ficou na faixa de (80 ± 90)% como pode ser visto nas figuras 3. pois mais compostos serão sorvidos na fibra e posteriormente identificados no cromatógrafo e no massas. ou seja. No cromatograma da amostra 1 (figura 7). sendo que as dúvidas podem ser aniquiladas utilizando-se padrões dos supostos compostos identificados34. 10 e 11 da tabela x1 com os picos 2. porém isso demora um determinado tempo para ocorrer. Além disso. maior será a sensibilidade da técnica. há 20 picos majoritários. sendo que quanto maior o percentual de semelhança. e este é o tempo ideal/ correto em que as extrações SPME devem ser realizadas.1]hept-2-eno-2carboxaldeído 122-03-2 122-03-2 564-94-3 C10H12O C10H12O C10H14O C10H14O C10H14O C10H14O C10H14O (26) (26) (29) (29) (30) (30) (33) Comparando-se os tempos de retenção dos picos 3. foi realizada uma amostragem mais real do cominho. pôde ser mais detalhada. pois a porcentagem máxima de semelhança entre os cromatogramas e espectros experimentais com os da biblioteca foi de 95% e para poucos compostos. Conclusão Através do experimento realizado pode-se adquirir conhecimento sobre uma nova técnica de amostragem. A SPME é uma técnica de amostragem onde praticamente não há manuseio da amostra: não precisa ser digerida.6-dimetil-Biciclo[3. 6. mais próximo do equilíbrio headspace-matriz ela estará. é o tempo de equilíbrio. Para determinar o tempo de repouso. há 12 picos majoritários. a sensibilidade da técnica é elevada. Conseqüentemente. quanto maior o tempo de repouso da amostra.1. o equilíbrio da amostra que ficou 10 min em repouso é maior do que a que ficou apenas 5 min. é aquela feita no vial em que há o pré-equilíbrio headspace-matriz. compostos menos voláteis e de coeficiente de difusão menores também foram para o headspace. 3. e portanto. O ponto negativo da técnica é o tempo gasto para que ocorra o pré-equilíbrio e o equilíbrio. mais confiável é a identificação realizada pelo banco de dados. A maneira pela qual a técnica GC-MS foi utilizada no experimento mostrou-se eficiente até certo limite. 9 e 12 em anexos. 6. deve-se testar vários tempos. e esse tempo é ainda maior para concentrações baixas. 5. Os resultados obtidos nos cromatogramas das amostras de cominho em pó indicaram que quanto mais próximo do equilíbrio o sistema fibra-headspace-matriz estiver. que é a SPME e também uma técnica de análise. a SPME não funciona muito bem com analitos termicamente estáveis pois a dessorção térmica desses analitos é muito pequena2. A maneira ideal de se utilizar esta técnica é com a utilização de padrões dos supostos compostos para uma identificação mais exata. enquanto que no cromatograma da amostra de 10 min (figura 10). sendo que a maioria ficou na faixa dos (80-90)%. a sua composição com o tempo de repouso de 10 min. 5. mas. nota-se que são os mesmos picos. gerando-se uma quantidade e variedade relativamente pequena de resíduos. 14 e 16 da tabela x2. 2 e 9 em anexos. Assim. gov/cgi/cbook.cgi?ID=29050-33-7&Units=SI [12] http://webbook. [3] D. Quím.Porém.cgi?ID=502-99-8&Units=SI [5] http://webbook.nist.nist. 523-530. G. vol.nist. Wiley. 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