Relatório 2 Caracterização de Proteínas (1)

INTRODUÇÃOA caracterização de proteínas pode ser realizadas de várias maneiras, porém, apenas duas formas serão o embasamento para o relatório: caracterização por reações de coloração e reações de precipitação[1]. A caracterização por meio da coloração pode ser analisada através da reação com a ninhidrina e da reação com o Biureto. A reação com a ninhidrina resulta em um produto de cor violeta, tanto para proteínas como aminoácidos[2]. Nesta reação, duas moléculas de ninhidrina reagem com a molécula do aminoácido ou proteínas, estequiometria da reação 2:1. Além do produto formado (cor violeta), há a formação de moléculas de água e dióxido de carbono (gás carbônico). A reação desta caracterização está descrito no esquema a seguir: O O R H3N - N HO H + O O + 2 +  HO O O R C H + 3 H2O + 3 O C HO O Esquema 1: Reação do aminoácido com a ninhidrina. A reação com Biureto ocorre necessariamente com proteínas, pois identifica ligações peptídicas[3]. A proteína reage com o “reativo de Biureto”, uma mistura da solução de sulfato de cobre com hidróxido de sódio que possui coloração azul, e forma um complexo violeta. A figura do complexo formado é mostrada em seguida: Figura 1: complexo violeta formado através da reação de Biureto Nas reações de caracterização através da precipitação pode ocorrer com desnaturação ou sem desnaturação da proteína. A desnaturação da proteína faz com que esta perca sua função ativa, ou seja, sua atividade biológica. As reações de precipitação com desnaturação ocorrem através do calor e de ácidos fortes. O calor aumenta a energia do sistema e quebra as ligações fracas. Já a presença de ácidos fortes, rompe a ponte salina (NH 3+ ----- -OOC )e ocorre a protonação na carboxila, eliminando as ligações eletrostáticas. O solubilizando-a e como consequência uma aparência líquida. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3. 1. uma menor solubilidade e a precipitação da proteína. um solvente orgânico. OBJETIVOS Os objetivos para o experimento “caracterização de proteínas por meio de reações de coloração e precipitação” são:    Caracterizar a presença de proteínas em material biológico. no qual os íons do sal irão solvatar a proteína diminuindo a força eletrostática das cargas das proteínas e como consequência.1  REAGENTES Solução de proteínas a 10% . é 30. que aumenta a solubilidade da proteína e diminui a solubilidade respectivamente. que interfere no estado físicoda proteína. Para explicar melhor. A adição de sais provoca os efeitos de salting-ine de salting-out. Enquanto a constante dielétrica da água é 80. Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais. surge o efeito “salting-out”. F= q 1× q 2 2 ε ×r EQUAÇÃO I Onde: F = força eletrostática q1 e q2 = cargas de interação ε = constante dielétrica r = distância entre as cargas Cada solvente possui uma constante dielétrica específica. Demonstrar as reações de coloração para proteínas. Já no caso do etanol. A adição de solventes orgânicos na proteína interfere na força eletrostática da proteína.As reações de precipitação sem desnaturação ocorrem através da adição de sais. Analisando a equação I. o efeito de “salting-in” ocorre até a presença de uma concentração do sal no qual a solubilidade da proteína irá aumentar. 2. pode-se concluir que um solvente com maior constante dielétrica diminuía força eletrostática entre as cargas na proteína. Ao ultrapassar essa concentração. adição de solventes orgânicos (etanol e acetona) e do ponto isoelétrico. Estrutura e isolamento de proteínas. que está eletricamente carregada. o valor da constante dielétrica do etanol. há um aumento da força eletrostática. ou seja. uma aproximação das proteínas e por seguinte a precipitação desta. adicionou-se 2mL da solução saturada de sulfato de amônio.5 mol/L Solução de sulfato de cobre a 1% Álcool etílico absoluto Solução saturada de sulfato de amônio ((NH 4)2SO4) Solução de ácido tricloroacético (TCA) 3. adicionou-se 1 mLdeágua destilada. 2. B: Efeito da adição de sais Colocou-se em um tubo de ensaio (Tubo 5) 2 mL de solução de proteínas. No segundo tubo (Tubo 3). . 5 gotas de NaOH 2. adicionou-se 2 Ml de ninhidrina e 5 gotas de proteínas a 10%. foram adicionados 1 mL de proteínas a 10%.2 Reações de precipitação A: Reação com solventes orgânicos Em um tubo de ensaio (Tubo 4). denominado “branco”. 5 gotas de NaOH 2. B: Reação de Biureto Para esta reação. manteve-se o tubo em banhomaria por 5 minutos a uma temperatura de 100°C.3 PROCEDIMENTO 2. utilizou-se dois tubos. tubo 2.2 MATERIAIS           Béquer de 50 mL 1 pipeta Pasteur 3 pipetas de 1 mL 4 pipetas de 5 mL 7 tubos de ensaio Béquer de 250 mL Bastão de vidro Tripé e tela de amianto Bico de Bunsen Fósforo 2.5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%. Pelas paredes do tubo.1% Hidróxido de sódio (NAOH) 2.3. Após a adição.1 Reações de coloração A: Reação com a Ninhidrina Em um tubo de ensaio (Tubo 1).      Solução de ninhidrina 0. adicionou-se 1 mL de proteínas a 10% e 3 Ml de álcool etílico (solvente orgânico). No primeiro.5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre a 1%.3. que ao adicionar solução saturada de (NH 4)2SO4 teve um precipitado na interface. misturou-se a solução por inversão. o precipitado formado anteriormente desapareceu. 5. porém. essa molécula pode ser observada na Figura 1. não misturando-se e obtendo-se a diminuição da solubilidade da proteína (Salting-out). ou seja. Isso se dá por uma reação sem desnaturação da proteína. obteve-se uma cor azul claro. Assim. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na reação de Ninhidrina. Todos os tubos 4. Já no tubo 2. após a adição de água em ácido tricloroacético (TCA). Nesse tubo. foram adicionados 0. Esse efeito caracteriza-se por precipitação com desnaturação da proteína. observou-se uma coloração lilás claro.Após observar e anota o resultado. adicionou-se 2 Ml de água destilada ao tubo e. confirmando a presença de proteína nas composições. Este tubo foi levado a um banho-maria fervente por 5 minutos. C: Precipitação por ácidos fortes Da solução de proteínas foi coletado o volume de 1mL e colocado em um tubo de ensaio (Tubo 6). não ocorrendo a reação de Biureto. através de um papel alumínio. com a adição de água. representando testes positivos em ambos os experimentos. foi levado a banho-maria por aproximadamente 5 minutos e conseqüente formação de um precipitado branco também. Outra desnaturação da proteína pode ser observado no tubo 7. obteve-se outro precipitado branco. já que não foi adicionada a proteína. o mesmo pode-se observar a formação de um precipitado branco. caracterizando um resultado positivo para o teste. 3. o tubo 3 preparou-se a fim de identificar a diferença das cores para resultados positivos e negativos. 6 e 7 tiveram a presença de um precipitado branco. caracterizada pelo tubo 1. No tubo 4. explicada pela reação do Esquema 1. Já nos tubos 1 e 2 os testes positivos também estiveram presentes. Retirou-se o tubo e avaliou-se os resultados. onde obteve-se uma reação com solventes orgânicos. com a presença da mudança de colorações. observou-se a formação de um produto com coloração roxo escuro/azulado.5 mL da solução de ácido tricloroacético e 0. Referente ao tubo 6.5 mL de água destilada. Porém. devido ao efeito de salting-in. D: Precipitação pelo calor (desnaturação) Em um tubo de ensaio (Tubo 7) foi colocado 5 mL da solução de proteínas. o mesmo referente ao tubo 5. contendo as substâncias. . Neste mesmo tubo. quando o recipiente. . V. como o esperado. . Canesin. V. adição de sais. M. pode-se concluir sucesso na realização da prática.. ácidos fortes e de desnaturação por calor.Lívia Bracht. 2015. de aulas práticas: Bioquímica [2] . foram confirmados devido aos testes de: Reação da Ninhidrina. Reação de Biureto e das precipitações de proteínas através de solventes orgânicos. Pág 9 – 10. G. D. [3] – Almeida. R. Determinação de aminoácidos totais em amostras de plantas empregando multicomtação. CONCLUSÃO Com a realização dos experimentos. Química Nova na escola.4.2005. Pág 34-40.2013.Oliveira. Vol. Suzuki. 35. A.. E. Programa de Pós-Graduação em Química. a presença de proteína nos variados tubos. Análise qualitativa de proteínas em alimentospor meio de reaçãode complexação do íon cúprico.Pág 1316. Centro de Ciências Exatas de Tecnologia. Palioto. Departamento de Química. Nº 1. Apostila experimental. B. F. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] . Com isso. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Carlos. 5. já que foram observados mudanças de colorações e precipitados.