Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónicaBioquímica Experimental I Departamento de Química e Bioquímica Licenciatura em Bioquímica Docente: Carla Real Afonso Trabalho realizado por: Alexandra Salvado, nº 40267 Andreia Sousa, nº 40261 Telmo Paiva, nº 40243 PL 3 26 e 27 de Setembro de 2011 Ano Lectivo 2011/2012 Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Índice Resumo …………………………………………………………………………... 3 Material é Métodos………………………………………………………………. 4 Material …………………………………………………………………. 4 Métodos ………………………………………………………………….. 5 Resultados e Discussão ………………………………………………………….. 12 Conclusão ………………………………………………………………………... 33 Bibliografia ………………………………………………………………………. 35 Anexos …………………………………………………………………………… I Página | 2 Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Resumo Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um processo de purificação enzimática através da realização da purificação parcial do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Posteriormente à purificação realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinação do grau de purificação do enzima (através de uma electroforese SDS-PAGE), a determinação da actividade enzimática de algumas fracções recolhidas durante a cromatografia e, por último, o cálculo do rendimento deste processo. Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Nesta cromatografia usou-se como fase estacionária um permutador catiónico fraco, o CMSephadex G-25 e como fase móvel utilizaram-se dois tipos de tampão com diferentes valores de pH. O primeiro tampão utilizado, o tampão Tris (pH 8,2) foi usado para a lavagem da coluna e para as proteínas de pI inferior a 10 serem eluídas. O segundo tampão, o tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5), foi usado para a eluição das proteínas com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluída com o segundo tampão, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10. Como também já foi referido, neste trabalho realizou-se também uma electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propósito de determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparação com um padrão do enzima puro. Como será possível ver mais à frente, nota-se umas marcas de arrastamento no poço do lisozima recolhido, pelo que é sinal da existência de impurezas (nomeadamente outras proteínas). Por fim, é de notar que nas fracções onde as actividades enzimáticas foram superiores é de suspeitar a existência do enzima. O rendimento associado à cromatografia de troca iónica foi de 112,2% e o grau de purificação obtido foi de 2002,7 vezes, os quais são incomportáveis com o esperado, pois foi usada uma absorvância de PCO de outro grupo, visto terem sido os únicos a medi-la. Página | 3 75mm) e pentes (0.6 cm Bomba peristáltica Cronómetro Espectrofotómetro UV-Vis Cuvettes de quartzo Aparelho medidor de pH Gaze Material corrente de laboratório Doseamento da actividade enzimática Homogeneizador de Potter-Elvejam Cuvettes de plástico Pipeta automática Pipeta graduada de 5mL SDS-PAGE Sistema de polimerização de géis Placas de vidro para electroforese (mini) Tina de electroforese vertical (mini) Espaçadores (0.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Material e Métodos Material Cromatografia de troca iónica Coluna Cromatográfica 40 x 2.75mm) Fonte de alimentação (500V/150mA) Pipetas automáticas Página | 4 . medindo o volume eluído em 2 min. até encher completamente Abrir a válvula de saída da coluna. • Manter a sua saída fechada Verter a mistura do gel em tampão na coluna. com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro. mantendo um caudal de tampão Tris constante (1.2) 0. assim como o diâmetro da mesma Página | 5 .Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Métodos Cromatografia de troca iónica Montagem da Coluna Num Kitasato.05 M Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10 mL do tampão anterior. deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25% tampão sobrenadante) • Guardar num recipiente com rolha a 4oC Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8.1.6 .05 M com NaCl 0.8 mL/min Medir o fluxo de tampão através da coluna. • ATENÇÃO: Nunca deixar secar o topo da coluna Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura Equilibrar a coluna através da passagem de um volume de tampão inicial de eluição aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada Medir a altura do gel. 8 mL/min Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total Depois da amostra penetrar toda no gel.05 M (diluição 1/8) Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL.6 .Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Preparação da Amostra Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8. • O nome do filtrado será Preparado da Claro do Ovo (PCO) Manter o PCO a 4ºC. abrir a saída da coluna e iniciar a sua eluição.1. bem identificado até ao final do trabalho Aplicação da Amostra Calibrar um aparelho medidor de pH Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão para 1.05 M com NaCl 0. • Cuidado para não secar o gel! Página | 6 .2) 0. 5 Reduzir. 2 vezes o volume da coluna Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução tampão de eluição Tris-HCl (pH 8. • Ler também as absorvências do tampão Tris e de carbonatos de sódio Conservar as fracções bem identificadas Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio (pH 10.5) 0.5 Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o zero com água destilada).02 % (m/v) através da coluna Indicar na coluna qual o último tampão utilizado Página | 7 .2 M igual a . o volume de cada fracção para 5 mL Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções estabilizar perto de 10.5) 0. depois. pelo menos. só depois. Colocá-las. • Controlar o fluxo! Medir o volume de pH de cada fracção recolhida.2) 0.2 M Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8.05 M com NaCl 0.05 M e NaN3 0. em gelo! Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Recolher fracções de 15 mL em diferentes provetas até passar na coluna um volume total de tampão aproximadamente igual ao volume da coluna preparada. 1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por inversão.9 mL de substrato de parede celular a uma célula de absorção Adicionar 0.0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de separação Página | 8 . os espaçadores e os pentes com etanol e secar Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaçadores colocar a placa de vidro mais pequena Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas Marcar com uma cante um traço 1.0) 0. tapando o topo da célula com parafilm Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um minuto SDS-PAGE Lavar muito bem as placas de vidro.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Doseamento da actividade enzimática Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7.1 M Adicionar 2. que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize Depois de polimerizado. inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer toda a água da superfície do gel Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar Deixar a repousar para polimerizar Marcar a posição dos poços do pente no gel Quando o gel de concentração polimerizar.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Preparação dos géis Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio de uma pipeta de Pasteur Introduzir um pouco de água destilada • Evita a formação de uma superfície de polimerização irregular. tirar o pente lentamente e com cuidado Lavar os poços do gel com água destilada Página | 9 . 1h30) Página | 10 .Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Montagem da câmara electroforética Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da câmara de electroforese Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara de electroforese Electroforese Colocar a tampa da câmara electroforética Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!) Colocar a voltagem nos 100 V Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h . Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Remoção do gel Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese Deitar a peça central da câmara de electroforese na bancada e remover a peça auxiliar de montagem Remover a "sandwich" Puxar um dos separadores para fora. sem o remover totalmente Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel Remover a placa O gel ficará agarrado a uma das placas Cortar um dos cantos do gel Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de bromofenol Página | 11 . 7. ligam-se a uma resina aniónica. Ao aumentar o pH do tampão de eluição proteínas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como tal são também eluídas com o tampão. bem como o pH da solução com que se fez a lavagem da coluna. por terem pI inferior ao pH. a lisozima liga-se à coluna enquanto as restantes proteínas. ou seja. o valor de pH é inferior ao pI (ponto isoeléctrico). é necessário que tenha carga global positiva. Página | 12 . o valor de pH é superior ao pI (ponto isoeléctrico). a carga global destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. ligou as proteínas que apresentavam carga global positiva. para que esta adira à coluna. sendo eluídas com a solução inicial. obtêm-se as diferentes proteínas contidas na PCO variando o pH das soluções. Como a composição em resíduos de aminoácidos varia de proteína para proteína. As outras proteínas. ao aplicar a PCO na coluna. uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Como a resina é de troca catiónica. adicionando cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio (KCl). como a resina é de troca catiónica. como não se ligam à coluna foram eluídas com o tampão. apresentam a carga global igual à da coluna e como tal não se ligam. Assim: as proteínas que apresentam carga global positiva. Desta forma.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Resultados e Discussão Gráfico de eluição da cromatografia realizada apresentando a absorvância a 280 nm e valor de pH de cada fracção em função do volume eluído. ou seja. Assim. Assim. o pH da solução utilizada na preparação da PCO teve de ser inferior ao valor de pI da proteína. logo. Se a variação do pH não for suficiente para eluir as proteínas da coluna. ou seja. Discussão do gráfico obtido face às propriedades da técnica cromatográfica Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca catiónica. A proteína que se pretendeu purificar tem pI igual a 10. ligam-se a uma resina catiónica. a competição entre as partículas do sal e a proteína aumenta e o sal começa a ligar-se à coluna obrigando as proteínas a ser eluídas com o tampão. pode-se aumentar a força iónica do tampão. as proteínas que apresentam carga global negativa. 23 8.275 0.69 8.108 0.872 0.041 0. Valores das absorvâncias (a 280 nm) e de pH das fracções recolhidas na eluição da coluna.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 1. Volume de cada fracção 15 mL 20 mL 10 mL 5 mL Volume de eluição total 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 Fracções 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Absorvância a 280 nm 0.042 0.270 0.291 0.21 8.16 8.078 0.35 10.044 0.031 0.89 9.936 0.21 8.056 pH 8.45 10.58 8.032 0.67 8.14 8.032 0.032 0.95 10.63 8.18 8.69 8.52 9.080 0.049 0.098 0.189 0.17 8.037 0.033 0.5 Diluição 1:2 1:3 - Página | 13 .36 8.16 10.15 8.65 8.040 0. 5 0. dos 15 aos 65 mL eluídos. sendo eluída com o tampão de eluição. sendo a absorvância (a 280 nm) e o valor de pH de cada fracção em função do volume de eluição. ou seja. Como é visível no gráfico anterior (Figura 1).3 0. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa. alterou-se a carga global das proteínas e como tal a sua ligação com a coluna. Página | 14 .Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Absorvância e valor de pH VS volume de eluição 1.8 0. que ficou com carga nula.2. seguindo-se o lisozima. é quando se observa maior absorvância.6 0. à excepção da Lisozima e da Avidina. Como o pH do tampão inicial é de 8.2 1.5).1 0 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 Volume eluído /mL 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 pH Absorvância pH Figura 1. Gráfico de eluição da cromatografia realizada. na fracção 3. são eluídas juntamente com o tampão.4 0. todas as proteínas. pois não se ligam à coluna por terem carga negativa (como é visível no quadro abaixo – quadro 2). havendo um pico de absorvância quando o volume eluído é 45 mL. o enzima que se pretendia separar.7 0.1 1 0.9 Absorvância a 280 nm 0. ou seja. da fracção 1 à 4.2 0. Ao alterar a solução tampão de eluição para uma com pH superior (pH 10. As fracções recolhidas começaram a ter valores de pH mais altos. e não descontínua como foi o caso.2) 0. Ponto isoeléctrico (pI) das principais proteínas presentes na clara do ovo.5 Ovalbumina 6.5) 0.7 Lisozima 5.ver anexos – I) Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10.1 Ovoinibidor Ovomacroglobulina 4.05 M (utilizado nas primeiras 4 fracções – volume equivalente ao volume da coluna . A forção iónica das soluções tampão utilizadas podem ser calculadas através da seguinte expressão: Onde espécie. está relacionada com a concentração de electrólitos.05 M com NaCl 0.5 3. é a concentração da espécie com carga e é a carga da respectiva Página | 15 . a variação que se veria nas fracções seria contínua.1 Ovomucoide 10. catiões e aniões. Cálculo da força iónica das soluções tampão utilizadas. aumentando-se o seu pH gradualmente.05 Ovotransferrina 4.2 M (restantes fracções) Se o tampão de eluição utilizado não tivesse sido trocado.9 Ovoglicoproteína 10 Avidina Explicação da variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na cromatografia de troca iónica e a compactação reversível sofrida pelo gel na coluna durante este processo cromatográfico. Proteínas pI 4. Assim.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 2. A força iónica (I) é a medida do campo eléctrico devido aos iões presentes em solução. A variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na cromatografia de troca iónica deve-se a terem sido utilizados dois tampões diferentes: Tampão Tris-HCl (pH 8. A utilização de dois tampões de eluição diferentes influenciou a altura da coluna inicial (11 cm) devido às diferentes forças iónicas dos dois tampões. 05 M As equações que representam o equilíbrio do tampão são: 1.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Força Iónica do Tampão Tris-HCl (pH 8.2) 0. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga Através da equação de Henderson-Hasselbalch.05 M com NaCl 0. Cálculo da força iónica Página | 16 . obtém-se: 2. unem-se mais aos iões Na+ do tampão de carbonatos de sódio por a concentração destes catiões ser superior neste tampão.2 M As equações que representam o equilíbrio do tampão são: 1. Página | 17 . Cálculo da força iónica Visto que a força iónica do segundo tampão é maior que a do primeiro. o que em conjunto com outros iões presentes em solução aumenta a força iónica causando a compactação da coluna. o segundo tampão causa o compactamento da coluna. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga Através da equação de Henderson-Hasselbalch. As partículas de gel carregadas negativamente.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Força Iónica do Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10. obtém-se: 2.5) 0. Este processo de compactação é reversível – basta adicionar um tampão com menor força iónica para que a coluna descompacte. Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Cálculo da concentração proteica de cada fracção e do PCO usando as leituras de Absorvância a 280 nm Para o cálculo da concentração das fracções foram utilizados dois valores de coeficiente de absorção molar. Exemplificando: Fracção 1 (mistura de proteínas) (mistura de proteínas) Fracção 17 (lisozima) (lisozima) No caso em que existiu diluição das soluções para a obtenção de uma absorvância mais rigorosa. em que existe uma mistura de proteínas (fracções 1 – 16 e 20 – 22). deve multiplicar-se a concentração obtida pelo factor da diluição. a fracção 2: (mistura de proteínas) Página | 18 . (mistura de proteínas) (lisozima) Nas fracções em que se suspeita que exista lisozima (fracções 17 – 19) utilizouse o segundo valor apresentado anteriormente. Por exemplo. utilizou-se o primeiro valor. nas restantes. 18 8. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.23 8.844 0.5 1.16 10.033 0.037 0.049 0.032 0.744 2.36 8.093 0.189 0.872 0.032 0.042 0.15 8.89 9.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Como a solução foi diluída com factor 2.35 10.275 0.17 8.040 0.080 1.017 0.63 8.093 0.108 0.032 0.041 0.080 0.14 8.037 0.16 8.21 8.049 0.270 0.044 0.487 0.078 0.012 0.936 0.808 0.108 0.45 10.032 0.031 0.95 10.040 0.3 8.031 0.65 8.033 0.041 0.21 8.69 8. a concentração real da fracção é: Quadro 3.056 17.078 0.014 0.52 9.044 0.189 0.032 0.042 0.032 0.67 8. Doseamento Proteico Volume da Amostra Fracção (mL) PCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 15 15 15 20 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Volume de eluição Total (mL) 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 pH Abs280nm Diluição do ensaio 1:12 1:2 1:3 - [Prot] (mg/mL) 8.291 0.056 Página | 19 .58 8.69 8. O princípio do método de Lowry baseia-se numa mistura contendo o reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas. A sua principal vantagem é a de apresentar uma alta sensibilidade na determinação das concentrações das mesmas. Estes interferentes causam. não é possível quantificá-las. PCO). na presença do catalisador cobre (II). o mesmo possui algumas desvantagens. Resumir os cálculos num quadro. como muitas enzimas não são encontradas puras. como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de interferentes. o aumento da absorvância do branco. para além deste método ser muito menos sensível que o método apresentado anteriormente. diminuição da absortividade específica ou formação de precipitados. No entanto. No entanto. Sugestão de um método mais rigoroso para a determinação proteica de cada amostra. normalmente.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Discussão das aproximações realizadas nos cálculos anteriores. Para a determinação da concentração proteica de cada fracção obtida na cromatografia de troca iónica. a velocidade da reacção medida é proporcional à quantidade de enzima presente no extracto (neste caso. já que este é um dos poucos interferentes para este método (porque reage com o Cu 2+ presente na mistura). foi medida a absorvância de cada uma delas e seguidamente calculou-se a concentração utilizando a lei de Lambert-Beer ( ). No entanto. pelo que os resultados são expressos em termos de unidades de actividade (UA). seria afectado pelo tampão Tris-HCl. O método utilizado pode induzir em erro. que são definidas Página | 20 . visto que a concentração medida não foi apenas das proteínas mas sim de todo o conteúdo existente nas fracções. para a determinação mais correcta da concentração proteica deveria ter sido utilizado um método específico de doseamento de proteínas. Representação da actividade enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da PCO e ainda para a fracção que apresentava maior actividade enzimática. Assim. por exemplo o método de Lowry. Outro método que poderia ser utilizado na determinação proteica é o método do Biureto (ver anexos – II). Em condições adequadas. apesar do método de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as proteínas. Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica arbitrariamente como a quantidade de enzima capaz de variar 0. pois são as que se espera registar maior actividade enzimática. mas como o espectrofotómetro apresentou o tempo medido em segundos (60 segundos). Neste caso. Figura III). Ainda assim mediu-se a actividade enzimática para outros picos de absorvância (Figura 1) para concluir se tinham a lisozima ou não. em que a unidade é U.001. Assim. . Para calcular .001 unidades por minuto. fez-se uma regressão linear das rectas obtidas na realização dos ensaios enzimáticos.001 unidades de absorvância por minuto.min-1 Nos ensaios enzimáticos realizados. onde representa o declive dessas rectas. Para exemplificar os cálculos efectuados tome-se como modelo os seguintes cálculos: PCO diluição 1:5 O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver Anexos – III. Para se fazer o cálculo das unidades enzimáticas é utilizada uma fórmula que relaciona a variação de absorvância (∆Abs) e a variação do tempo (∆t). a unidade enzimática é dada pela quantidade de centros catalíticos que conduz a uma variação de absorvância a 450nm de 0. sendo este U = µmol. Nesta fórmula o tempo vem em minutos. de modo a obter-se o número de unidades enzimáticas. só a PCO e a fracção 17 foram diluídas. a fórmula para calcular o número de unidades enzimáticas é: . Relativamente à lisozima. Página | 21 . foi necessário converter-se esse valor para variação de absorvância por minuto. Estes valores foram também divididos por 0. Neste caso. Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0. a actividade é dada por: Fracção 17 diluição 3:5 O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver Anexos – III.1 mL. O número de unidades enzimáticas é: . O número de unidades enzimáticas é: . a actividade é dada por: Fracção 2 O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver Anexos – III. Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica O número de unidades enzimáticas é: Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0. Neste caso.1 mL. Figura IX). a actividade é dada por: Página | 22 . Figura XII).1 mL. 0048 0.844 8.922 3.0002 0.744 2.4461 0.0024 1.0004 0.0006 0.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 4.0096 0.5688 1.0008 0.0002 0. Amostra Diluição realizada 1:1 1:2 [Prot] (mg/mL) 17.8 0.044 0.014 |∆Abs450nm/∆t| (UA/min) 0.017 0.0008 0. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fracções correspondes aos picos do gráfico 1.808 0.0004 Actividade (U/mL) 420 360 240 120 120 120 480 480 420 360 240 1.0001 120 60 Página | 23 .36 48 PCO 1:5 1:10 1:20 1:40 1:1 4:5 Fracção 17 3:5 2:5 1:5 Fracção 2 Fracção 3 Fracção 8 Fracção 18 Fracção 19 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 0.0002 0.0007 0.8922 0.012 0.0002 0.7844 0.0072 0.0006 0.0007 0. 4461 0.5688 8. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO.0048 0.0024 0. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da fracção 17.0096 0.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Actividade Enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO 450 400 Actividade Enzimática (U/mL) 350 300 250 200 150 100 50 0 0.8922 1.7844 3.844 Concentração de Proteína (mg/mL) Actividade Enzimática Figura 2.922 17. Actividade Enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da fracção 17 600 Actividade Enzimática (U/mL) 500 400 300 Actividade Enzimática 200 100 0 0. Página | 24 .0072 0.012 Concentração de Proteína (mg/mL) Figura 3. tem-se que: . apenas foi possível calcular a actividade enzimática e a actividade específica para estas fracções. Em seguida demonstra-se um exemplo do cálculo da actividade específica para uma das fracções: Fracção 8 Página | 25 . para a actividade específica da PCO e de cada fracção eluída. onde as unidades enzimáticas são dadas por U. Assim. Desta forma.mg-1.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Determinação da actividade específica (SA) da PCO e de cada fracção eluída da coluna A actividade específica de um enzima (SA) corresponde ao nº de moles de substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de enzima. Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvância a 450 manómetros durante 1 minuto para as fracções que apresentavam maior concentração proteica. Por outras palavras podemos dizer que é igual à actividade enzimática por unidade de massa de enzima usada no ensaio. 21 8.032 0.67 8.032 0.89 9.080 1.13 pH .189 0.040 0.73 0.275 10.17 8.21 8.014 0.65 8.30 8.95 1.58 8.54 12 272.056 Página | 26 SA (U/mg) 1.936 0.844 0.033 0.031 0.808 0.017 0.108 10.45 0.093 0.078 10.0002 0.69 8.078 0.16 0.041 0.093 0.189 0.049 0.037 0.049 0.032 0.031 0.18 8.0001 480 120 60 40000 7058.52 9. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica Doseamento Proteico Diluição do ensaio Volume da Fracção (mL) Volume de eluição Total (mL) [Prot] (mg/mL) Amostra Abs280nm Doseamento da actividade enzimática Actividade (UA/min) (U/mL) 1.042 0.35 0.872 0.291 0.041 0.03 0.744 2.056 0.033 0.037 0.080 0.040 0.042 0.0008 0.032 0.15 8.270 1:12 1:2 1:3 - 17.108 0.8 0.71 10.63 8.012 0.69 8.82 4285.044 0.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 5.36 8.50 0.36 PCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 15 15 15 20 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 8.0007 420 23.487 0.14 8.032 0.032 0.044 0.23 8.16 8. já que nas fracções em que se esperava obter o enzima. que não é o caso do lisozima.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Gráfico de eluição da cromatografia realizada representando a concentração de proteína e SA de cada fracção em função do volume de eluição. ou seja.5 3 2. Este gráfico mostra então que a separação da lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica foi eficiente. Página | 27 . enzima do qual se está a calcular a actividade específica.2.5 1 0.5 Concentração da Proteína (mg/mL) 4 3. Como é visível no gráfico anterior (Figura 4).5 2 1. pois estas foram as primeiras fracções a serem recolhidas e só as proteínas com carga negativa foram eluídas.5 0 30 45 105 160 165 Volume de Eluição (mL) 170 45000 Actividade Específica (SA) (U/mg) 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 [Prot] (mg/mL) SA (U/mg) Figura 4. ou está presente em muito pouca quantidade. Gráfico representativo da concentração de proteína e SA em função do volume de eluição. Discussão dos resultados obtidos. a actividade específica é maior onde a concentração proteica é menor. Apesar de haver uma maior concentração proteica na primeira parte do gráfico (volume de eluição de 20 a 105). a enzima não está presente. todas as que tem pI inferior a 8. existe actividade enzimática. Concentração de Proteína e SA em função do volume de eluição 4. que dissocia as cadeias e as ligações persulfureto. foram preparados dois tipos de gel. A camada superior. por comparação. uma boa separação dos diferentes componentes de uma mistura. O gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). Estes géis também têm a vantagem de serem fáceis de preparar e corar. tem poros mais pequenos. pois este apresenta uma grande resolução originando. que é um detergente). Foi utilizado o gel de poliacrilamida. Desta forma. permitindo a identificação aproximada. o gel concentrador. as proteínas maiores. portanto. enquanto o gel resolvente.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Estudo do electroforama obtido e identificação das principais proteínas em cada pista. permitindo revelar e identificar facilmente os compostos separados. a camada inferior. A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese unidimensional em gel de SDS. tem poros maiores. Esta electroforese foi realizada sob condições desnaturantes (devido ao SDS.poliacrilamida (SDS-PAGE). do tamanho da proteína Figura 5. Relação do electroforama com os cromatogramas anteriores. com maior massa molecular Página | 28 . Na realização do gel para a electroforese. Electroforama obtido no SDS-PAGE. a ordem de colocação das amostras nos poços é a seguinte: 1. aquecidos durante 5 minutos. colocou-se logo.IV). enquanto as proteínas de menores dimensões passam para a camada inferior. tampão e β-mercaptoetanol.56 0.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica ficam retidas na camada superior. tampão e β-mercaptoetanol. No electroforama obtido. tampão e β-mercaptoetanol.52 0. aquecidos durante 5 minutos.75-0. Quadro 6. aquecidos durante 5 minutos.Amostra de β-globulina. aquecidos durante 5 minutos: 9. Em cada poço seria suposto colocar de proteína. Proteínas que constituem o marcador. 8.80 0.Amostra de β-globulina.84 Erro 0.Amostra do pico 3 (Fracção 17). tampão e β-mercaptoetanol.36 0.Amostra do pico 2 (Fracção 8). Através da comparação das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro 6).32-0. é possível verificar se a fracção que se suspeita ter lisozima está pura.Marcador. 3. na .44 0. podendo ter no máximo da solução proteica. Como algumas fracções possuem concentrações muito baixas. tampão e β-mercaptoetanol.47 0. 5.Amostra do lisozima.70 0. o volume a colocar nos poços era muito maior que 10 impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos . tampão de aplicação.65 0.Amostra de PCO. aquecidos durante 5 minutos. aquecidos durante 5 minutos. tampão e β-mercaptoetanol. 7.66-0. 4.58-0.46-0.Amostra de β-globulina. tampão e β-mercaptoetanol. cujas massas moleculares são conhecidas.40 0.75 0.Amostra do pico 1 (Fracção 3). 2. tampão e β-mercaptoetanol. aquecidos durante 5 minutos.91 Página | 29 . 6.39-0.4 Rf 0. Proteína Fosforilase b BSA Ovalbumina Anidrase carbonica Inibidor de tripsina α-lactalbumina Mr (KDa) 94 67 43 30 20 14. em comparação com o marcador. quando fica sujeita à acção de agentes desnaturantes. é de esperar que as amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde. e duas para cada uma das subunidades. é possível observar várias bandas a diferentes massas moleculares. 4 e 5 contem uma percentagem notável de lisozima.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Sabendo que a lisozima tem massa molecular 14. Nas restantes amostras. 18 e 19.4 KDa. as duas subunidades separam-se. o que significa que o βmercaptoetanol desnaturou a proteína de tal forma que para além das subunidades se separarem uma da outra. o lisozima. pois é nestas fracções que se encontra a maior parte do enzima que se pretendia purificar.3 KDa. ou seja.4 KDa). o efeito do β-mercaptoetanol (7) e o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8) na β-globulina. o electroforama apresenta 3 bandas. e duas para cada uma das subunidades (a subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do electroforama). A β-globulina é construída por 2 subunidades. Assim. mostrando no electroforama três bandas distintas. No caso em que se estudou o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8). Página | 30 . respectivamente. a massa molecular é 14. já que apresentam actividade específica 40 000. obteve-se aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior. No caso em que foi estudado o efeito do β-mercaptoetanol (7). é possível concluir que as amostras colocadas no poço 1. fracções com tamanhos variáveis. Na amostra aplicada ao poço 8. ainda se dividiram em fracções com tamanhos variáveis (desde 94 a 14. a proteína também desnaturou dando origem a 4 bandas distintas. uma banda para a proteína não desnaturada (a primeira banda). Uma banda para a proteína não desnaturada. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o descrito anteriormente.71. As fracções seleccionadas foram a 17.82 e 4285. foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9). mas obteve-se menos bandas. Quadro de purificação final do lisozima da clara do ovo Para determinar o rendimento e a purificação do enzima seleccionaram-se as fracções com maior actividade específica. 7058. 3. 2. Fracção 17 Sendo a actividade total o somatório de todas as actividades totais de todas as fracções. Página | 31 . procedeu-se a este cálculo para a fracção 17. sendo o cálculo para as outras fracções e para a PCO semelhante.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Para exemplificar o cálculo do rendimento e da purificação do enzima. Sendo a actividade específica total o quociente entre a actividade total e a soma das massas totais de enzima purificado. deveria ser maior que aquele que obtemos do outro grupo.2 Passo de Purificação PCO 17 Fracções 18 19 Total 7*1 5 5 5 15 17.86*3 2002.085 0.91 0.7 47 142. Página | 32 Purificação (x) Actividade (U/mL) Actividade Total (U) SA (U/mg) [Prot] (mg/mL) .012 0.7 *1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna.06 0.07 0. Volume Total (mL) Massa Proteica total (mg) Rendimento (%) 112. colocou-se 7 mL.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Quadro 7. *2 O valor de concentração total é a média dos valores de concentração obtidos em cada fracção. Durante a realização deste trabalho experimental não se mediu a absorvância da solução da PCO utilizada e como tal. *3 Como é visível no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a purificação dão valores bastante mais altos que o esperado.014 0. No entanto. foi utilizado o valor de absorvância registado por outro grupo.844 0.54 40 000 7 058.8 4 285. Desta forma o valor da concentração e consequente absorvância da PCO para a solução utilizada durante o trabalho.014* 2 124. para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido.017 0.215 420 480 120 60 660 2 940 2 400 600 300 3 300 23. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). foi possível identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima) na sua constituição. Após a sua análise. luteus.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Conclusão Globalmente. tal como se esperava. Calculou-se também a actividade enzimática e actividade específica das diferentes diluições da amostra da PCO e das fracções correspondentes a picos de absorvância. Doseamento da concentração de proteína. A cromatografia de troca iónica permitiu-nos separar diferentes fracções da amostra da clara de ovo (PCO) e. o pico 3 (fracção 17) continha lisozima na sua constituição. verificar experimentalmente a actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactéria em questão. Por fim. foi possível medir o decréscimo da absorvência a 450 nm e. Doseamento da actividade enzimática. às quais se adicionou substrato de parede celular de células de M. na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos três picos. concluir que foi possível purificar o lisozima. de facto. Através da determinação da actividade enzimática de cada fracção. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir que. diferentes soluções constituídas por diferentes conjuntos de proteínas. assim. ao serem medidas as absorvâncias das fracções. Através das fracções com maior actividade específica determinou-se o grau de purificação do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores Página | 33 . Este método permitiu. como tal. pela realização da electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais proteínas presentes em cada poço. enquanto que os restantes (eluídos inicialmente) continham outras proteínas que fazem parte da constituição da clara de ovo. este trabalho laboratorial foi constituído por quatro etapas principais: Cromatografia de troca iónica. A partir daí foi possível analisá-las mais detalhadamente e avaliar diversos parâmetros que nos permitiram estimar a presença e o comportamento do lisozima. nomeadamente. desta forma. Desta forma. não correspondendo à realidade daquilo que foi observado.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica obtidos para estes parâmetros não podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos. Página | 34 . apesar de não ter sido possível quantificar o rendimento nem o grau de pureza do lisozima obtido. uma vez que para efectuar os cálculos foi necessário recorrer ao valor de absorvância da PCO de outro grupo. pode fazer-se um balanço positivo relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificação do lisozima da clara do ovo. foi possível verificar qualitativamente a sua presença e observar a sua actividade catalítica. Em suma. e Garrity.. Cambridge University Press. (Wilson. The Benjamin/Cummings Publishing Co. Cap. D. 8.. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in Fundamental Methods. J. D. Ninfa. Página | 35 .H.Purificação do Lisozima da Clara do Ovo por Cromatografia de Troca Iónica Bibliografia Boyer. 3rd. pp. 199-206. 2ª ed. 95-104. (1998) Analytical Biochemistry. W. Holme. e Peck. MA. RF (1993) Modern Experimental Biochemistry. L. Freeman: New York. Switzer. (1998) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology.J. Cambridge. e Ballou. Addison Wesley Longman: New York. A.J. Redwood City..P. pp. K (1994) Principles and Techniques of Practical Biochemistry.. Wilson. K e Walker. ed. eds.) 4ª ed. Fitzgerald Science Press: Bethesda. H. R.
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