1. Forma y dimensión.(a) La tropomiosina, una proteína muscular de 70 kd, está formada por un superhélices de hélices α con dos hebras. Calcular la longitud de la molécula. (b) suponer que un segmento proteico de 40 residuos se pliega en una estructura β antiparalela de dos hebras con un giro en horquilla de 4 residuos. ¿Cuál es la longitud máxima de este motivo? 2. Contraste entre isómeros. La poli-L- leucina es hélice α en un disolvente orgánico como el dioxano, mientras que la poli L-isoleucina no lo es. ¡Por que estos aminoácidos con el mismo número y tipo de átomos tienen diferentes tendencias para formar hélices? 3. De nuevo activo. Una mutación que cambia sin residuo de alanina por valina en el interior de una proteina produce perdida de actividad. Sin embargo, la actividad se recupera cuando una segunda mutación en una posición diferente cambia un residuo de isoleucina por glicina. ¿Cómo podría esta segunda mutación conducir a un restablecimiento de la actividad? 4. Ensayo desconcertante. Se ha aislado un enzima llamado proteina disulfuro isomerasa (PDI) que cataliza las reacciones de intercambio disulfuro-sulfhidrilo. El PDI convierte rápidamente la ribonucleasa revuelta en ribonucleasa enzimáticamente activa. Por otra parte, la insulina se inactiva rápidamente por PDI. ¡Que implica esta importante observación en la relacion entre la secuencia de aminoácidos de la insulina y su estructura tridimensional? 5. Extender una diana. Una proteasa es una enzima que cataliza la hidrolisis de los enlaces peptídicos de las proteinas diana. ¿Cómo puede la proteasa unirse a la proteína diana de modo que la cadena principalmente del péptido se extienda completamente en la cercanía del enlace peptídico vulnerable? 6. A menudo irremplazable. La glicina es un residuo de aminoácido muy conservado en la evolución de las proteinas ¿Por qué? 7. Socios potenciales. Identificar los grupos de una proteina que pueden formar puentes de hidrogeno y enlaces electrostático con una cadena lateral de arginina a pH 7. 8. Ondulación permanente. La forma del pelo está determinada en parte por el patrón de puentes disulfuro de la queratina, su proteína principal. ¿Cómo se pueden crear rizos? 9. La ubicación lo es todo. Las proteinas que atraviesan las membranas biológicas contienen a menudo hélices α. Habida cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofóbico, predecir qué tipo de aminoácidos habría en esas hélices. ¿Por qué una hélice α es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una membrana? 10. Rasgos de estabilidad. Las proteínas son muy estables. LA vida media de un enlace peptídico en disolución acuosa es casi 1 000 años. Sin embargo, la energía libre de la hidrolisis de las proteínas es negativa y muy grande. ¿Cómo se puede justificar la estabilidad del enlace peptídico teniendo en cuenta el hecho de que la hidrolisis libera una gran cantidad de energía? 11. Especies menores. Es un aminoácido como la alanina, la forma principal a pH 7 en disolución es la zwitteriónica. Suponiendo un valor de pKa de 8 para el grupo amino y un valor de pKa de 3 para el ácido carboxílico, calcular la proporción entre la concentración de la forma neutra del aminoácido (con el ácido carboxílico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitteriónica a pH 7. 12. Cuestión de convención. Todos los L-aminoácidos tienen una configuración absoluta S, excepto la L-cisteína que tienen una configuración R. Explicar por qué se considera que la L-cisteína tienen una configuración absoluta R. 13. Mensaje oculto. Traducir la siguiente secuencia de aminoácidos en código de una letra: Glu-Leu-Val-Ile-Ser-Ile-Ser-Leu-Ile-Val-Ile-Asn-Gly-Ile-Asn-Leu-Ala-Ser-Val-Glu-Gly-Ala-Ser. 14. ¿Quién va primero? ¿Se esperaría que los enlaces peptídicos Pro-X tendieran a adoptar una configuración cis Como los enlaces X-Pro? ¿Por qué si o por qué no? 15. Emparejamiento. Para cada uno de los derivados de aminoácidos mostrados abajo (A-E) encontrar su correspondiente seria de valores 𝜙 y 𝜓 (a-c). 16. ¿Cuál es el enlace que puede formarse entre dos cisteínas en proteinas secretadas? ¿Por qué este enlace no forma ordinariamente parte de proteínas intracelulares? ¿Cómo difiere esta interacción de las interacciones que pueden ocurrir entre las cadenas laterales de otros aminoácidos? 17. Una mutación que ocurre en DNA puede causar una sustitución en la codificación de la proteina. Las sustituciones de aminoácidos son descritas como conservativas cuando el aminoácido en la proteina mutada tiene propiedades química similares al aminoácido que fue reemplazado. ¿Cuál de los siguientes aminoácidos es en reemplazo conservativo para el aminoácido tirosina? A) B) C) D) 18. La formacion de un enlace peptídico es un ejemplo de reacción de condensación. Explica lo que significa esta afirmación y por qué la formacion de enlace peptídico es también una reacción de deshidratación. 19. Describe como una cadena β difiere de un β sándwich. terciaria o cuaternaria lo que más difiere entre estas dos proteinas? 21. Para los siguientes aminoácidos. sugiere si es más probable encontrarlos en el encerrados o expuestos en un plegamiento estable de un dominio proteico. en células de levadura tiene la siguiente secuencia de elementos en su cadena polipeptídica a. y – indican el grado de crecimiento/complementación. Considera un ligando que es estructuralmente similar al sustrato de una enzima y que une débilmente en el sitio activo. ¿Cómo realzan las enzimas el índice de una reacción? 27. Describe la significancia de RRMs La modularidad de la proteina sugirió la siguiente serie de experimentos. Describe la característica inusual de la interacción de LEF-1 con DNA. afirma si la interacción o enlace es roto por el tratamiento con urea. . +. Un dominio amino terminal conteniendo motivo de reconocimiento de RNA (RRM) b. Enlace iónico b. La estructura globular de la mioglobina y cada monómero de hemoglobina involucra ocho segmentos α hélice. Un segmento central con siete secuencias repetidas plegadas ricas en aminoácidos básicos y ácidos. 26. Los resultados de tales experimentos son mostrados en la tabla de abajo. 25. a. Una región carboxi-terminal sin evidente homología con motivos o dominios. 24. llamado Tif3 o eIRF4B. a. Interacciones de van der Waals 23. c. Las proteinas de unión a oxigeno hemoglobina y mioglobina difieren en que la hemoglobina funciona como un tetrámero en eritrocitos. Por adición un gen que codifica un fragmento de la proteína. Una factor de traducción. mientras que la mioglobina es un monómero en células musculares. Para cada interacción o enlace abajo. Metionina 22. Tú tratas una proteina con urea (desnaturalizante). secundaria. Células con una deleción del gen TIF3 no crecen a 37 °C. Enlace peptídico e. Enlace disulfuro d. Puentes de hidrógeno c. Arginina c. pero crecen normalmente a 30°C. en las cuales ++. Glutamina d. Predice el efecto de sustitución de uno o más de las cisteínas o histidinas conservadas en un dedo de zinc Cys2His2 con alanina. ¿Cuál es la diferencia entre tal “inhibidor competitivo” y un inhibidor alostérico? 28. A. excluyendo al sustrato normal.20. Fenilalanina b. Describe la importancia de las argininas y lisinas en la interacción entre Gcn4 y DNA. este es posible por un ensayo por complementación-la capacidad que confiere el fragmento al tipo silvestre creciendo a 37°C. para analizar los roles de sus diferentes partes. ¿Es la estructura primaria. Los resultados están mostrados en la tabla de abajo. Reactivos valiosos. d) Ruptura de enlaces peptídicos en el extremo carboxílico de la metionina. el cual muestra el porcentaje de la traducción in vitro en relativa a la reacción con la máxima longitud de Tif3 Tif3 Actividad traductora (%) Longitud máxima 100 RRM + primeras tres repeticiones 43 RRM + primera repetición 0 Todas las siente repeticiones + segmento 0 carboxiterminal C. . De estos datos.Tif3 Crecimiento a 37 °C Longitud máxima ++ RRM + primeras tres repeticiones ++ RRM + primera repetición - Todas las siente repeticiones + segmento carboxiterminal + B. Los siguientes reactivos se utilizan habitualmente en química de proteínas: CNBr Urea Mercaptoetanol Tripsina Ácido perfórmico HCl 6 N Ninhidrina Feniltiocianato Quimotripsina ¿Cuál es el más adecuado para cumplir con cada una de las siguientes funciones? a) Determinación de la secuencia de aminoácidos de un péptido pequeño b) Desnaturalización reversible de una proteína desprovista de puentes de disulfuro. ¿Qué reactivo adicional se necesitaría si hubiese puentes disulfuro? c) Hidrolisis de enlaces peptídicos en el extremo carboxílico de residuos aromáticos. ¿Cómo es que estos resultados comparados con los resultados de complementación de la parte B? ¡modifican tu conclusión de los experimentos genéticos? 29. ¿Cuál región de la proteína es requerida para el crecimiento del tipo silvestre a 37 °C? Un adicional grupo de experimentos involucran un ensayo de traducción in vitro. usando un extracto de una cepa que carece del gen TIF3. LA reacción fue iniciada por adición de la proteina Tif3 purificada o una forma truncada de esta. La absorbancia está relacionada con el coeficiente de absorción molar (coeficiente de extinción) ε (en M-1 cm-1). En busca de un extremo. Determinación del tamaño.62 en este gel? 36. una proteína. Clasificación de células. Espectrometría. Por ejemplo un anticuerpo específico marcado fluorescentemente para una . sedimenta más lentamente que la hemoglobina (65 kd). Las movilidades electroforéticas relativas de una proteína de 30 kd y una de 92 kd utilizadas como estándar en un gel de SDS-poliacrilamida son respectivamente 0. La etilenimina reacciona con las cadenas laterales de cisteína en las proteinas para formar S-aminoetil derivados. e) Hidrolisis de enlaces peptídicos en el extremo carboxílico de residuos de arginina y lisina. ¿una asociación nueva? El gen que codifica una proteína que tiene un único puente disulfuro experimenta una mutación que sustituye un residuo de serina por uno de cisteína.41.6S y 4. 30. Sus coeficientes de sedimentación respectivos son 2. La hidracina anhidra (H2N-NH2) se ha utilizado para romper los enlaces peptídicos en las proteinas. ¿Cuál es la característica estructural responsable de la lentitud de la tropomiosina en la sedimentación? 34. Proponer un experimento que resuelva esta cuestión. una proteína muscular de 70 kd. ¿Cuáles son los productos de la reacción? ¿Cómo podría utilizarse esta técnica para identificar el aminoácido carboxilo terminal? 31. La tropomiosina. ¿Cuál es la absorbancia de una disolución de 1 mg/ml con un paso de 1 cm? ¿Qué porcentaje de la luz incidente se transmitirá en esta disolución? 33. 37. ¿Por qué? 32. Esferas que sedimentan.80 y 0. Movimiento lento. Un nuevo sitio de ruptura. La clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) es una técnica eficaz para separar células de acuerdo con su contenido en moléculas determinadas. ¿Cuál es la masa aparente de una proteína que tiene una movilidad de 0. la concentración c (en M) y el paso óptico l (en cm) por la expresión A= εlc El coeficiente de absorción de la mioglobina a 580 nm es 15 000 M -1 cm-1. Los enlaces peptídicos del extremo carboxilo de estas cisteínas modificadas son susceptibles de hidrolisis por tripsina.31S. La absorbancia A de una disolución se defina como: A= log10 (I0/I) Donde I0 es la intensidad de la luz incidente e I la intensidad de la luz transmitida. Se quiere comprobar si el apareamiento de sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la proteína original. ¿Cuál es la dependencia entre el coeficiente de sedimentación S de una proteína de 80 kd que una de 40 kd? 35. Completa la tabla. Estructura cuaternaria. Procedimiento Proteína Actividad total Actividad Nivel de Rendimie de purificación total (mg) (unidades) especifica purificación nto (%) (unidades mg-1) Extracto crudo 20 000 4 000 000 1 100 Precipitación con 5 000 3 000 000 (NH3)2SO4 Cromatografía 1 500 1 000 000 DEAE-celulosa Cromatografía 500 750 000 de exclusión molecular Cromatografía 45 675 000 de afinidad. 40. La determinación del peso molecular por cromatografía en presencia de urea 6 M da un valor de 30 kd. (a) El octapéptido AVGWRVKS se digirió con tripsina. ¿Qué molécula marcada fluorescente prepararíamos para identificar estas células? 38. Escoger la columna. Problema de purificación de proteinas. Divide y vencerás. Explica. ¿Sería el intercambio iónico o la exclusión molecular la técnica más apropiada para separar estos productos? Explicarlo. Explicar cómo se puede incrementar la cantidad de actividad total. 41. proteína de la superficie celular se puede utilizar para detectar células que contengan dicha molécula. 39. Una proteína se purifico hasta homogeneidad. 42. La determinación de la masa de una proteína por espectrometría de masas no permite a menudo se identificación completa entre todas las proteinas posibles de un proteína completo. ¿Sintetizar más enzima? Durante la purificación de una enzima un investigador realiza un paso de purificación que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que está presente en el extracto crudo. Supongamos que se quiere aislar células que poseen un receptor que les permite detectar productos de degradación bacteriana. Sin embargo no se dispone todavía de un anticuerpo contra este receptor. . (b) supongamos que el péptido se digiere con Quimotripsina. ¿Cuál sería la técnica de separación optima? Explicarlo. pero la determinación de las masas de todos los fragmentos que se produce tras digestión con tripsina casi siempre nos conduce a una identificación única. a. G. (F. Digestión por carboxipeptidasa: No hay digestión e. A. I. Explicar esta transición conformacional dependiente del pH. Y) b. R. S. K. M. V. 44. ¿Cómo sintetizaríamos tal ordenamiento peptídico? (Sugerencia: utilizar luz en vez de ácido para desproteger el grupo amino terminal en cada ciclo de síntesis. . L. Y)(2S. 2L. F. metionina detectada como homoserina. Digestión por quimotripsina: (A. L. a. I. Este ordenamiento de alta densidad se puede ensayar con una proteína marcada fluorescente para averiguar que péptidos se reconocen. En la figura se muestra la unión de un anticuerpo a un ordenamiento de 1 024 péptidos diferentes que ocupan una superficie similar a la de una uña. T. Digestión por quimotripsina: (A. V. W. Análisis N-terminal: S c. Digestión por carboxipeptidasa: L d. Y) y (R. S) 46. F. Y) d. I. Digestión por quimotripsina. Determinar la secuencia de un péptido de 14 aminoácidos en base a los siguientes datos. aparece una especie molecular única de 15 kd. S f. Digestión por tripsina: (3S. Digestión por tripsina: (R.S). Cuando se repite la cromatografía en presencia de urea 6 M y β-mercaptoetanol 10 mM. los aminoácidos se separan con una coma. Análisis N-terminal del hexapéptido: A c.W) M*. Y) b. Tratamiento con bromuro de cianógeno: (2S. Secuenciación de proteinas II. Composición de aminoácidos (4S. K. Secuenciación de proteinas I. Y) e. (b) Predecir la dependencia del pH en la transición hélice-ovillo del poli-L-glutamato. F. Péptidos en un chip. V. I. W) (G.) 45. M. T. A. Se pueden sintetizar un gran número de péptidos diferentes en una pequeña área sobre un soporto sólido. Determinar la secuencia de un hexapéptido en base a los siguientes datos. 2L. pero se transforma en hélice α cuando el pH se eleva por encima de 10. S. S) f. Describir la estructura de la molécula. M*. Transiciones hélice-ovillo. Nota: cuando no se conoce la secuencia. T. Y) y (R. 43. Composición de aminoácidos: (2R. G. S. V) y (R. R. K.(a) Las medidas de NMR han demostrado han mostrado que la poli-L-lisina es un ovillo estadístico a pH 7. Pro. (b) ¿Qué carga sería de esperar aproximadamente a valores de pH de 11. Una forma mutante de la hormona polipeptídica angiotensina II tiene la composición de aminoácidos siguiente (Asp. Termolisina 51. Tripsina b. Met. Val) Se realizan las siguientes observaciones: La tripsina produce un dipéptido que contiene Asp y Arg. a. Quimotripsina c) Sugerir un método para separar los péptidos producidos por el tratamiento con tripsina. CNBr ii. ¿Qué péptidos cabe prever que se produzcan cuando la α-melatropina se fragmenta por la a. La fragmentación de la β-melatropina con tripsina produce los siguientes péptidos y acido aspártico libre. α-melatropina. Existe otra hormona estimulante de los melanocitos denominada β-melatropina.47. tiene la siguiente secuencia. Tripsina iii. 5 y 1? (c) Calcular el punto isoeléctrico de la α-melatropina. Dado el péptido siguiente: Ser-Glu-Pro-Ile-Met-Ala-Pro-Val-Glu-Tyr-Pro-Lys a) Calcular la carga neta a pH7 y a pH 12 b) ¿Cuántos péptidos se producirían si este péptido se tratase con: i. y un hexapéptido que contiene todo el resto. Tyr. b. Escribir la secuencia utilizando las abreviaturas de una letra.Val. . La hormona peptídica estimulante de los melanocitos. Phe. 53. Calcular el peso molecular de la α-melatropina. 50. (a) Esbozar la curva de titulación que sería de prever para la α-melatropina. CNBr c. Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Gly-Lys. 48.Pro. La amida de alanina se trató con fenilisotiocianato para formar PTH-alanina. Escribir un mecanismo para esta reacción. Arg. ¿Cuál debe ser la secuencia de esta última? 52. WGSPPK DSGPYK MEHFR Si se supone una homología de secuencia máxima entre la α-melatropina y la β- melatropina. Ile. ¿Por qué este resultado no es exactamente correcto a pH neutro? 49. Degradación de Edman. La poliglicina. 𝜓 = +150°. Tyr. ¿Cuál es la secuencia? 54. Phe. Val) y (Ile. La fragmentación con bromuro de cianógeno produce un dipéptido que contiene Phe y Pro. Se sabe que la apamina no reacciona con yodoacetato. Se ha secuenciado una proteina tras la destrucción de los enlaces -S-S-.(AB. y un hexapéptido que contiene todos los demás. ¿Dónde está (o están) el enlace o los enlaces S-S? 56. Suponga que la fragmentación con tripsina produce dos péptidos. Met. La única metionina y el único aminoácido aromático (Phe) de esta proteína se encuentran en las posiciones indicadas. (Asp. La apamina es una pequeña toxina proteica presente en el veneno de las abejas. Arg. describa esta hélice en cuanto a . Pro) El dipéptido de composición (Pro. A partir de la representación de Ramachandran. Su secuencia es la siguiente CNCKAPETALCARRCQQH a. ¿Cuántos enlaces disulfuro están presentes? b. puede formar una hélice con 𝜙 = -80°. situados del modo que se muestra a continuación Sin embargo solo uno de ellos es un -SH libre. un polipéptido simple. La fragmentación de la proteína intacta (con el puente S-S intacto) con bromuro de cianógeno o quimotripsina no divide la proteína en dos péptidos. Phe) no puede fragmentarse por la quimotripsina ni por la carboxipeptidasa. La quimotripsina fragmenta la hormona en dos tetrapéptidos con la siguiente composición.BC o AC)? 55. Se sabe que contienen 3 residuos de Cys. ¿Dónde está el puente -S-S. dos de ellos forman parte de un enlace S-S. aproximadamente cada tres o cuatro residuos de aminoácido hay uno hidrófobo. (a) Se ha observado que en algunas de las áreas de hélice α de la hemeritrina.6 residuos/vuelta en los ovillos enrollados. (b) ¿Cuál sería el efecto de una mutación que colocase un residuo de prolina en el punto A de la estructura? (c) Esbozar un mecanismo razonable (esto es. ¿Qué valor sugiere que podría tener la cifra de residuos/ vuelta en un ovillo enrollado? 58. Si también se sabe que la hélice α está ligeramente distorsionada respecto a sus habituales 3. Se presenta a continuación una estructura esquemática de la subunidad de la hemeritrina (una proteína que une oxígeno presente en los animales invertebrados). 57. Sugiera un motivo estructural para esta observación. . (a) su lateralidad (b) su número de residuos por vuelta. Algunas secuencias polipeptídicas que muestran una tendencia pronunciada a dimerizar en una estructura de ovillo enrollado antiparalela presentan una repetición exacta de leucina cada 7 residuos. una serie de pasos) para el plegado de la hemeritrina desde un ovillo aleatorio hasta la estructura que se presenta. proponga un mecanismo para la dimerización. Considere una pequeña proteína que contiene 101 residuos de aminoácidos. Suponga que son posibles tres orientaciones alrededor de cada uno de estos enlaces. (c) A partir de sus respuestas a las preguntas (a) y (b). y cada mol de enlaces de H contribuye con -5 kJ/mol a la entalpía. probablemente menos de 5 kJ/mol. Sobre la base de estos supuestos. 62. Sugiera una explicación de esta diferencia. 61. calcule el ΔGplegado para esta proteína a 25°C. A pesar de que la energía de enlace para el enlace de hidrógeno en el vacío es de aproximadamente 20 kJ/mol. (a) Basándose en una respuesta más conservadora al problema anterior (2. (b) Si la proteína se pliega por completo formando una hélice a con enlaces de H como único origen de entalpía de estabilización. calcule el cambio de entropía conformacional del plegado de un mol de esta proteína para dar una estructura con una sola conformación. Obsérvese que no se pueden formar 4 enlaces de H en un extremo. En la proteína adenilato quinasa. calcule el ΔHplegado. El cálculo obtenido en (a) seguramente es demasiado grande. Sugerir un posible motivo para la periodicidad de su espaciamiento. a la entalpía de estabilización de la proteína. ¿aproximadamente cuántas conformaciones de ovillo aleatorio serán posibles para esta proteína? b. Dé una razón que lo explique. la región C-terminal es una hélice α con la secuencia Val–Asp–Asp–Val–Phe–Ser–Gln–Val–Cys–Thr–His–Leu–Asp–Thr–Leu–Lys– Los residuos hidrófobos de esta secuencia se presentan en negrita. observamos que cada uno de los enlaces de hidrógeno de una proteína plegada contribuye mucho menos. La proteína tendrá unos 200 enlaces alrededor de los cuales puede producirse rotación. ¿Es estable la forma plegada de la proteína a 25°C? . 60.7 X 1092 conformaciones).59. a. como la hemoglobina. calcule el coeficiente de extinción e (en unidades de cm2/mg) para la vasopresina. (a) Indique dos simetrías posibles para esta molécula.6 y la Tabla 5. (b) ¿Cuál cree que es la más probable? Explíquelo. ¿Cuál es en este caso la simetría más elevada posible? 65.63.1. que mide el contenido de hélice a (2) utilizando calorimetría de barrido diferencial Observa un ΔH considerablemente mayor por calorimetría del que registra con dicroísmo circular. (c) Para la simetría más probable. RRPVVLMAACLRPVVFITYGDGGTYYHWYH 64. . está formado por dos pares de dos tipos de cadenas. ¿qué tipo de interacciones (isólogas. ¿Qué clases de interacciones (isólogas o heterólogas) estabilizarían a cada una de ellas? (b) Suponga que un tetrámero. En condiciones fisiológicas. Un investigador estudia la desnaturalización térmica de la hemeritrina mediante dos métodos: (1) utilizando dicroísmo circular. La secuencia siguiente es parte de una proteína globular. Sugiera un motivo para esta diferencia. La hormona peptídica vasopresina se utiliza en la regulación del equilibrio hidrosalino en muchos vertebrados. utilizando radiación con l = 280 nm. Utilizando las reglas de Chou- Fasman. la proteína hemeritrina existe como un octámero de ocho cadenas del tipo que aparece en el problema 58. (a) Se comprueba que una proteína es un tetrámero de subunidades idénticas. heterólogas o ambas) esperaría? ¿Por qué? 66. a y b. 67. La vasopresina porcina (de cerdo) tiene la siguiente secuencia: Asp–Tyr–Phe–Glu–Asn–Cys–Pro–Lys–Gly (a) Utilizando los datos de la Figura 5. predecir la estructura secundaria de esta región. Indique dos simetrías posibles para una molécula de este tipo. Se observa que su absorbancia a 280 nm es de 1. . estequiometría de las subunidades y tipos de enlace (covalente.5 cm de grosor. A partir de estos datos. presenta un peso molecular. Cuando la misma proteína se estudia por electroforesis en gel con SDS en ausencia o presencia del agente reductor β- mercaptoetanol (BME). describa la proteína nativa. de 140 000 g/mol. ¿Cuál es la concentración de vasopresina. (b) Una disolución de vasopresina se coloca en una cubeta de 0. mediante medidas de equilibrio de sedimentación. en lo relativo a tipos de subunidades presentes. pH y temperatura próximas a las condiciones fisiológicas. en mg/cm3? (c) ¿Qué fracción de luz incidente pasa a través de la cubeta en (b)? 68. no covalente) que existen entre las subunidades. en condiciones de composición de amortiguador. La calle C contiene estándares del peso molecular indicado.3. se observan los patrones de las calles A y B respectivamente. Una proteína. Explicar estos resultados en términos de un modelo para la proteína. Configuración absoluta de la citrulina. es 8.314 X 107 erg/K·mol. ¿Es un aminoácido D o L? Explique por qué.12 X 10-13 s 𝑣 = 0. mientras que cuando está presente el BME. Una proteína da una única banda en la electroforesis con SDS. 71.69. ¿qué implicaciones tiene sobre los esquemas predictivos como los de Chou y Fasman? 72. La citrulina aislada de la sandía tiene la estructura que se muestra a continuación. Existe poco efecto. Se ha postulado que la forma normal (no infecciosa) del prión se diferencia de la forma infecciosa únicamente en la estructura secundaria/terciaria. Cuando se trata con la enzima proteolítica trombina y se somete a electroforesis en ausencia de BME. En una ultracentrífuga analítica se han obtenido los siguientes datos para la 𝛾-globulina humana a 20°C: S = 7.718 mL/g D = 4. la proteína corre un poquito más lenta. si es que lo hay. en unidades CGS. como se observa en las calles 1 y 2 más abajo. la proteína migra un poco más rápidamente (calle 3). con la adición de β- mercaptoetanol (BME) en el gel.00 X 10-7 cm2 s-1 𝜌 = 1. si hay algo. 70. se encuentran dos bandas que migran mucho más rápidamente (calle 4).00 g/cm3 ¿Cuál es el peso molecular de la 𝛾-globulina? Obsérvese que la constante de los gases R. (a) ¿Cómo podría demostrar que se producen cambios de la estructura secundaria? (b) ¿Cómo podría comprobar los cambios de la estructura cuaternaria? (c) Si este modelo es correcto. . La glicina está presente predominantemente como una mezcla 50:50 de +H3N-CH2- COOH y +H3N-CH2-COO- m. El pH es igual al pKa del grupo carboxilo. Una disolución de 100 ml de glicina 0. (a) a (o) identifique el punto clave adecuado de la titulación y justifique su elección. f. La carga neta media de la glicina es -1. b. Para cada una de las afirmaciones siguientes. Corresponde al punto isoeléctrico n. El grupo carboxilo ha sido completamente titulado (primer punto de equivalencia). Relacion entre la curva de titulación las propiedades ácido-base de la glicina. l. La glicina tiene su máxima capacidad tamponante. i. a. g. La mitad de los grupos amino están ionizados.1 M a pH 1. Corresponde al final de la titulación o. Se registró el pH y los resultados se representaron como se muestra en la siguiente gráfica. d. La glicina está presente predominantemente en la forma +H3N-CH2-COOH. La carga neta media de la glicina es +1/2.72 se tituló con una disolución de NaOH 2 M. La carga neta media de la glicina es igual a cero. e. c. El pH es igual al pKa del grupo amino protonado. Representa la peores regiones de pH en cuanto al poder tamponante. . La especie predominante es +H3N-CH2-COO- k.73. Los puntos clave de la titulación se señalan como I a V. h. La glicina está totalmente titulada (segundo punto de equivalencia) j. pero la forma predominante de la alanina a su pI es zwitteriónica. El análisis de mezclas de aminoácidos empieza separando la mezcla de sus componentes mediante cromatografía de intercambio iónico.0 a. 8 y12. ¿Qué fracción de alanina está presente en su pI como forma completamente descargada? Justifique sus respuestas. 75. 4. Dibuje las estructuras de la histidina en cada estado de ionización. Estado de ionización de la histidina. cargado o neutro. Glu y Val . la carga neta de la alanina es cero. Arg y Met c. ¿Por qué la alanina es predominante zwitteriónica y no está completamente descargada en su pI? b. La histidina tiene tres grupos funcionales ionizables. 8 y 12? Cuando se coloca en un campo eléctrico a cada uno de estos valores de pH. En una columna con resina de intercambio catiónico que contienen grupos sulfonato (-SO3-) los aminoácidos fluyen a diferente velocidad debido a dos factores que influyen en su movimiento: (1) la atracción iónica entre los residuos sulfonato de la columna y grupos funcionales cargados positivamente en los aminoácidos y (2) las interacciones hidrofóbicas entre las cadenas laterales de los aminoácidos y el esqueleto fuertemente hidrófobo de la resina de poliestireno. ¿Cuánta alanina está presente como especie completamente si carga? A un pH igual a su punto isoeléctrico. ¿Se desplazará la histidina hacia el ánodo (+) o hacia el cátodo (-)? 76. Se puede dibujar dos estructuras con carga neta de cero. c. ¿Cuál es la carga neta de la histidina a pH 1. La carga eléctrica del grupo funcional viene determinada por la relacion entre su pKa y el pH de la solución. Esta relacion viene descrita por la ecuación de Henderson-Hasselbalch. Separación de aminoácidos por cromatografía de intercambio iónico. 4. Para cada par de aminoácidos señalados. Escriba las ecuaciones de equilibrio para sus tres ionizaciones y asigne el pKa adecuado para cada ionización. Dibuje las estructuras de los estados de ionización de la histidina predominantes a pH 1. Asp y Lys b.74. a. determine cual eluirá antes en una columna de intercambio catiónico con un tampón a pH 7. ¿Cuál es la carga neta de la molécula de histidina en cada estado de ionización? b. Cada grupo ionizable de un aminoácido puede existir en uno de dos estados posibles. Observe que el estado de ionización puede ser obtenido aproximadamente tratando independientemente cada grupo ionizable. a. Dibuje la estructura de Ala-Ala-Ala. Identifique los grupos funcionales asociados con pK1 y pK2. Calcule la masa molar mínima de BSA (es decir suponiendo que haya un solo residuo de triptófano por molécula de proteína) b. respectivamente.58% en peso de triptófano (Mr 204) a. La filtración en gel de la BSA da una estimación de masa molecular de unos 70000. ¿Por qué aumenta el valor de pK1 a cada adición de un residuo Ala al oligopéptido de Ala? c.39 8. Nomenclatura de estereoisómeros de la isoleucina. Numero de residuos de triptófano en la albumina de suero bovino. La estructura del aminoácido isoleucina es: a.69 Ala-Ala 3. ¿Cuántos isómeros ópticos? c. Tamaño de las proteinas.30 Ala-Ala-Ala 3. ¿Cuántos centros quirales tiene? b.03 Ala-(Ala)n-Ala. Dibuje fórmulas de perspectiva de todos los isómeros ópticos de la isoleucina. Aminoácido o péptido pK1 pK2 Ala 2. Gly y Leu e.42 7.69.y oligopeptidos mayores de la alanina también muestra la ionización de solo grupos funcionales aunque los valores experimentales de pKa son diferentes. La curva de titulación de la alanina muestra la ionización de dos grupos funcionales con valores de pKa de 2. La tendencia de los valores de pKa se resume en la tabla. Un análisis cuantitativo de aminoácidos indica que la albumina de suero bovino (BSA) contiene =. d. ¿Cuál es la masa molecular aproximada de una proteina de 682 residuos aminoácidos en una cadena polipeptídica? 80.94 a.34 9.12 8. b. ¿Cuántos residuos de triptófano hay en una molécula de albumina de suero? . 78. Ser y Ala 77. correspondientes a la ionización de los grupos carboxilo y aminoprotonado. n>3 3. tri. Comparación de los valores de pKa de la alanina y polialanina. La titulación de di-. ¿Por qué disminuye el valor de pK2 a cada adición de un residuo Ala al oligopéptido de Ala? 79.34 y 9. b. Un bioquímico descubre y purifica un enzima nuevo generando la siguiente tabla de purificación: . la proteina muestra tres bandas moleculares 180. Carga eléctrica neta de los péptidos. Un péptido tiene la secuencia Glu-His-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly a. Si se analiza mediante electroforesis en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS). Solubilidad de los polipéptidos.0 d. fuertemente unidas al DNA. ¿Cuál es más soluble el pH indicado? a.8. Cuando la electroforesis se realiza en presencia de SDS y ditiotreitol se observan otras tres bandas de masas moleculares 160. Purificación de un enzima.0 86. (Ala –Ser-Gly)5 o (Asn-Ser-His)5 a pH 6.0 c. De los pares de polipéptidos siguientes. ¿Cuál es la carga neta de la molécula a pH 3. (Gly)20 o (Glu)20 a pH 7. (Lys-Ala)3 o (Phe-Met)3 a pH 7. 8 y 11? (utilice los valores de pK a para las cadenas laterales y grupos amino y carboxilo terminales dados en la tabla de la pregunta 67. especialmente del número de grupos ionizados: cuantos más grupos ionizados haya más soluble será el polipéptido. que disuelve la materia en forma de partículas de la comida. permitiendo que la pepsina corte enzimáticamente moléculas individuales de proteina. Composición de subunidades de una proteína. alrededor de 10. Una proteina tiene una masa molecular de 400 kD medida por filtración en gel. 82. el cual tiene muchos grupos fosfato. 160 y 60 kD. Se da el nombre de pepsina a varios enzimas digestivos secretados (en forma de proteinas precursoras mayores) por las glándulas que recubren el estómago. 90 y 60 kD. ¿Qué aminoácidos deben estar presentes en número relativamente elevado en las histonas? ¿en qué forma contribuyen estos residuos a la fuerte unión entre las histonas y el DNA? 85. Las histonas son proteinas que se encuentran en el núcleo de las células eucarióticas. El pI de las histonas es muy elevado.81. Punto isoeléctrico de las histonas. Punto isoeléctrico de la pepsina. 83. Determine la composición subunitaria de la proteina.0 b. Estime el pI de este péptido. Un método utilizado en la separación de polipéptidos se basa en sus solubilidades diferenciales. (Ala-Asp-Gly)5 o (Asn-Ser-His)5 a pH 3. La mezcla resultante de comida. HCl y enzimas digestivos se denomina quimo y tiene un pH cercano a 1.5. La solubilidad en agua de los polipéptidos grandes depende de la polaridad relativa de sus grupos R. ¿Qué pI predeciría para las proteinas de tipo pepsina? ¿Qué grupos funcionales han de estar presentes para proporcionar este pI a la pepsina? ¿Qué aminoácidos pueden aportar tales grupos a las proteinas? 84. Estas glándulas secretan también ácido clorhídrico. . Arg 10%. 89. Ile 5%. Phe 5%. Ser 5%. Ser 5%. Gly 10%. b. A partir de la información dada en la tabla... b. Cl. Las moléculas e iones pequeños (como Na+. Estos péptidos se conocen como opioides debido a . Tyr 5%. Al llegar la diálisis al equilibrio. Cys 5%. Phe 5%. Met 5% y Cys 5% Proteina C: Ala 10%. ¿Hay alguna indicación basada en los resultados de esta tabla de que el enzima tras el paso 6 sea ya puro? ¿Qué más se podría hacer para evaluar la pureza de la preparación enzimática? 87. Lys 5%. Lys 10%. Phe 5%. Glu 5%. Val 5%.Cromatografía de 45 675 000 exclusión molecular a. Diálisis. A pH 7. produce el máximo incremento relativo en pureza)? c. Leu 5%. Si la muestra original de 1 ml se dializara dos veces sucesivas frente a 100 ml del mismo tampón Hepes con 0 mM de NaCl. His 5%. Asp 10%. Ser 5%. Asn 5%. His 5%.. Proteína B: Ala 5 %. pero la proteína no. Glu 5%. Met 5%. Procedimiento Proteina total (mg) Actividad (unidades) 1. Tyr 5%. A partir de tejido cerebral normal se ha aislado un grupo de péptidos que influyen sobre la transmisión nerviosa en ciertas partes del cerebro.-Cromatografía de 200 800 000 intercambio iónico 5. Arg 5%. Gly 10%. Glu 10%. 6. Thr 5%.y Hepes) pueden difundir a través de la membrana de diálisis. Val 5%. Pro 5% y Trp 10%. Una proteina purificada se encuentra en un tampón Hepes (N-(2hidroxietil) piperazina-N´-(2 ácido etanosulfonico) a pH 7 con NaCl 500 mM. Precipitación (pH) 4 000 1 000 000 4.Cromatografía de 50 750 000 afinidad. a. Arg 5%. Pro 5%.Extracto crudo 20 000 4 000 000 2. Gly 5%. Thr 5%. Leu 5%. Determinación de la secuencia del péptido cerebral leucina-encefalina. ¿Cuál de los procedimientos de purificación es el menos efectivo? d. ¿Cuál sería la concentración final de NaCl en la muestra? 88. Una muestra (1 ml) de la disolución de proteina se coloca en un tubo hecho con una membrana de diálisis y se dializa frente a 1 L del mismo tampón Hepes con 0 mM de NaCl. Ile 10%. Pro 10%.Precipitación (sal) 5 000 3 000 000 3. Trp 5%. Asn 5% y Gln %%. ¿Cuál es la concentración de NaCl en la muestra de proteina? Asuma que no se producen variaciones de volumen durante la diálisis. ¿Cuál de los procedimiento de purificación utilizados con este enzima es el más efectivo (es decir. Asp 5%. Leu 10%. Purificación de péptidos.0 ¿Cuál sería el orden de elución de los tres péptidos siguientes de una columna llena de polímero intercambiador de cationes? Sus composiciones de aminoácidos son: Proteína A: Ala 10%. Tyr 5%. calcule la actividad específica de la solución enzimática después de cada procedimiento de purificación. La hidrolisis completa por HCl 6M a 110 °C seguida de análisis de aminoácidos indica la presencia de Gly. La estructura de este péptido se ha determinado a partir de las siguientes observaciones. seguido de hidrolisis completa y cromatografía. Estructura de un antibiótico peptídico de Bacillus brevis. leu.dinitrobenceno seguido por hidrolisis completa y cromatografía indico la presencia del 2.fluoro-2. La digestión completa del péptido con quimotripsina seguido de cromatografía dio lugar a tirosina y leucina libres. Cuando se trató con el enzima carboxipeptidasa el péptido no experimento hidrolisis alguna. Tiene la estructura. Phe. Algunos investigadores consideran que estos péptidos son los inhibidores del dolor propios del cerebro. que se fijan a receptores que se unen también a drogas opiáceas.4. La masa molecular del péptido se calculó en alrededor de 1. tales como la morfina o la naloxona. El tratamiento del péptido intacto con 1-fluoro-2. El tratamiento del péptido con 1. Utilizando la información que se da a continuación. b. Los extractos de la bacteria Bacillus brevis contienen un péptido con iones metálico y. interfiere en el transporte iónico a través de las membranas celulares de otras especies bacterianas. La hidrolisis completa del péptido enseguida de análisis de aminoácidos produce cantidades equimolares de Leu. a. Este enzima cataliza la hidrolisis del residuo carboxilo terminal de un polipéptido a menos que el residuo sea Pro o no contenga carboxilo libre por alguna razón. dio solo aminoácidos libres y el siguiente derivado: . Phe y Tyr en una proporción molar 2:1:1:1. Orn. matándolas. a. determine la secuencia de aminoácidos del opioide leucina-encefalina.dinitrofenil derivado de la tirosina. Explica por qué su estructura está de acuerdo con los datos aportados. c. De este modo los opioides imitan algunas de las propiedades de los opiáceos. No se encontró tirosina libre. aparentemente. b.4. Orn es ornitina. más un tripéptido que contenía Phe y Gly en una proporción 1:2 90.200 c. d. Pro y Val. un aminoácido que no se halla presente en las proteinas pero se encuentra en algunos péptidos.4-dinitrobenceno. demuestre que es coherente con cada una de las observaciones experimentales. asumiendo en esta ocasión una eficiencia del 99% para cada ciclo. 92. A continuación se muestran dos representaciones de esta secuencia firma: a.) e. La hidrolisis parcial del péptido seguida de separación cromatográfica y análisis de secuencia dio lugar a los di y tripéptidos siguientes (el aminoácido amino-terminal siempre se encuentra a la izquierda): Dada la información anterior. aunque uno de ellos aparece con mayor frecuencia que los demás. ¿Qué porcentaje de los aminoácidos liberados en el cuarto ciclo seria leucina? Haga el cálculo de nuevo. Un péptido con la estructura primaria Lys-Arg-Pro- Leu-Ile-Asp-Gly-Ala se secuencia por el procedimiento de Edman. Las proteinas denominadas chaperonas moleculares ayudan en el proceso de plegamiento de las proteinas. ¿Qué aminoácidos son invariantes (conservados en todas las especies) en esta secuencia? b. En una de las posiciones puede haber cualquier aminoácido. ¿En qué posición(es) está la naturaleza del aminoácido limitada a los de cadena lateral con carga positiva? ¿Qué aminoácido se encuentra con más frecuencia en cada posición? c. Todas las chaperonas Hsp90 contienen una “secuencia firma” de 10 aminoácidos que permite su rápida identificación en las bases de datos secuenciales. Comparación de secuencias. ¿En qué posiciones se restringen las sustituciones a los aminoácidos con cadena lateral de carga negativa? ¿Qué aminoácidos predomina en cada posición? d. Exponga sus razonamientos.4-dinitroferlil derivado implica el grupo amino de una cadena lateral y no el grupo α-amino. deduzca la secuencia de aminoácidos del antibiótico peptídico. ¿Qué posición es esta y cuál es el aminoácido que aparece más a menudo? . 91. Una clase de chaperonas presente desde bacterias a mamíferos es la proteína de choque térmico 90 (Hsp90). Cuando haya llegado a una estructura. Eficiencia de la secuencia de péptidos. Sugerencia: observe que el 2. Si cada ciclo de Edman tuviera una eficiencia del 96%. Añade más sulfato amónico al sobrenadante. Siguiendo el protocolo. pero esta vez se queda con el pellet. y descarta el resto de fracciones que eluyen de la columna posteriormente. Siguiendo un protocolo de purificación. Pasa la disolución dializada a través de una columna de cromatografía de exclusión molecular. ¿Cuál es la lógica que aconseja la adicción de sal en dos pasos? d. decanta el sobrenadante.2 M. recoge la primera fracción de proteina que sale de la columna. que es más transparente que el lisado. Recoge 20 kg de corazones de buey de un matadero cercano (las células musculares son ricas en mitocondrias que proporcionan la energía para la contracción del músculo). A lo largo del trabajo. Homogena el tejido de los corazones de buey y con un triturados de alta velocidad en un medio que contiene sacarosa 0. ¿Qué le dice sobre la proteina el hecho de recoger la primera fracción? ¿Por qué es la absorción en el UV a 280 nm una buena forma de medir la presencia de proteina en las fracciones eluidas? . pasa sus primeras semanas lavando material de vidrio y etiquetando tubos de ensayo. Centrifuga una vez más la muestra. Somete el homogenado de corazón resultante. que es denso y opaco. que es menos denso que el homogenado pero aun opaco. a una serie de pasos de centrifugación diferencial. una sal muy soluble. su primera purificación de proteina. Solubiliza el pellet de sulfato amónico que contiene las proteinas mitocondriales y dializa a lo largo de una noche frente a volúmenes grandes de una disolución tamponada (pH 7. Finalmente.2) ¿Por qué no se incluye sulfato amónico en el tampón de diálisis? ¿Por qué utiliza disolución tamponada en lugar de agua? e. un estudiante con más experiencia le pregunta acerca de la base de cada procedimiento. Dele las respuestas.2 ¿Por qué utiliza tejido de corazón de buey. Añade sulfato amónico. ¿Qué consigue con esto? c. puesto que contiene la proteina de interés. consiste principalmente en membranas mitocondriales y el contenido interno de las mitocondrias. y en tan gran cantidad? ¿Cuál es el propósito de mantener frio y suspenderlo en sacarosa 0. lleva a cabo los pasos que se explican a continuación. Siendo el estudiante más nuevo y menos experimentado de un laboratorio de investigación de bioquímica. Se trata de un enzima del ciclo de ácido cítrico. Transporta los corazones en hielo y realiza todos los pasos de la purificación en una cámara fría o sobre hielo. Detecta la proteina midiendo la absorción en el UV (a 280 nm) de las fracciones. a.2? ¿Qué le pasa al tejido al homogenarlo? b. al lisado a una concentración determinada. Prosigue con la purificación utilizando la fracción del sobrenadante que contiene mayoritariamente mitocondrias intactas. A continuación lisa osmóticamente las mitocondrias. le dan la responsabilidad de purificar una proteina. A continuación lisa osmóticamente las mitocondrias. Centrifuga la disolución.93. localizada en la matriz mitocondrial.2 M. tamponado a pH 7. El lisado. A continuación se gradúa para preparar tampones y disoluciones madre para su utilización en diversos procedimientos de laboratorio. la citrato sintasa. Protocolos de bioquímica. a pH 7. y descarta el pellet. Cromatografía en papel. Cuando Sanger y sus colegas comenzaron su trabajo en 1945 se sabía que la insulina era una proteina pequeña con dos o cuatro cadenas polipeptídicas unidas por enlaces disulfuro. Esta estructura fue determinada por Frederick Sanger y colaboradores. La figura muestra la secuencia de aminoácidos de la hormona insulina. ¿Por qué no estaba seguro de la pureza de la banda de proteina única en su gel con isoelectroenfoque? ¿Qué le dicen los resultados del gel de SDS? ¿Por qué es tan importante realizar la electroforesis en gel de SDS después del electroenfoque? 94. de dipéptidos. Sanger y sus colaboradores habían desarrollado una serie de métodos simples para secuenciar proteinas. Determinación de la secuencia de aminoácidos de la insulina. permitiendo la identificación de aminoácidos individuales y. pero decide realizar otro ensayo de la pureza de la proteina. añade una disolución de lavado de pH mayor a la columna y recoge la fracción que eluye inmediatamente. La mayor parte de su trabajo se describe en una serie de artículos publicados en Biochemical Journal entre 1945 y 1955. Analiza una pequeña muestra de su fracción. La cromatografía en capa fina separa también péptidos más grandes. el gel muestra tres bandas finas. Corta la banda de pI 5. en ocasiones. De acuerdo con el protocolo.6 y la somete a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Hirviendo una proteina durante varias horas en HCl al 10% se hidrolizaron todos su enlaces peptídicos y amida. f. El FDNB (1-flouro-2. Tratamiento con FDNB. cuanto más largo era el tratamiento. . en un gel de isoelectroenfoque. g. que ahora tiene un volumen muy reducido y es bastante transparente (aunque teñida de rosa). La proteina se resuelve como una única banda. Tratamientos más cortos generaban polipéptidos cortos.4-dinitrobenceno) reaccionaba con los grupos amino libres (pero no con los grupos amido o guanidino) de las proteinas produciendo derivados dinitrofenilo (DNP) de los aminoácidos: Hidrolisis ácida. Esta versión primitiva de la cromatografía en capa fina separaba compuestos en base a sus propiedades químicas. Coloca la fracción recogida en (e) en una columna de cromatografía de intercambio catiónico. Oxidación de las cisteínas. Cuando se tiñe. la proteina de interés es la que tiene un pI de 5. Después de descartar la fracción inicial que sale de la columna. El tratamiento de una proteina con ácido perfórmico rompía todos los enlaces disulfuro y convertía todos los residuos Cys en ácido cisteico. Explique lo que está haciendo. más completa era la hidrolisis de la proteinas en sus aminoácidos.6. ¿Cuáles son los primeros cuatro aminoácidos de la cadena B (el extremo amino terminal)? Explique su razonamiento.fenilalanina. α-DNP- fenilalanina. Como se describe en su primer artículo (1945) Sanger hizo reaccionar insulina con FDNB e hidrolizó la proteina resultante. valina B4: acido aspártico. b. A la cadena que empezaba con Gly la llamo “A” y a la que empezaba con Phe la llamó “B”. Explique cómo justifican los experimentos de Sanger sus conclusiones. Hizo reaccionar la cadena B con FDNB IV. En base a estos datos. Llevo a cabo una hidrolisis fuerte de cada DNP-péptido para obtener aminoácidos libres. VI. a. Sanger y sus colaboradores usaron estos y otros métodos relacionados para determinar la secuencia completa de la cadenas Ay B. para analizar la cadena B. Sanger describió el modo en que utilizo estas técnicas para determinar los primeros aminoácidos (el extremo amino-terminal) de cada cadena de insulina. ¿son estos resultados consistentes con la estructura de la insulina? En un artículo posterior (1949). III. Por ejemplo. Su secuencia para la cadena A era como sigue (extremo amino a la izquierda) . Hidrolizo la proteina suavemente en medio acido para producir algunos péptidos más cortos. Una de las dos cadenas también contenía un residuo de lisina pero no en su extremo amino. α-DNP-fenilalanina. Oxido la insulina para separar A y B. valina B3: acido aspártico. α-DNP. Separo los DNP-péptidos de los que no contenían grupos DNP. valina c. y ε. ¿coincide el resultado con la secuencia conocida de la insulina? Explique las discrepancias que hay. II. d. V. Identifico los aminoácidos de cada péptido mediante cromatografía en papel. acido glutámico. Obtuvo los resultados siguientes B1: Solamente α-DNP-fenilalanina. Encontró muchos aminoácidos libres pero solo tres DNP- aminoácidos: α-DNP-glicina (con el grupo DNP unido al grupo α-amino). I. De estos resultados Sanger dedujo que la insulina constaba de dos cadenas de proteina: una con Gly y otra con Phe en el extremo amino terminal. B2: α-DNP-fenilalanina. Preparo una muestra de cadena B pura por cromatografía en papel. que recibieron los nombres B1 a B4 VII. Aisló cuatro de los péptidos DNP. VIII.DNP-lisina (con el grupo DNP unido al grupo ε-amino). llevo a cabo los pasos siguientes. determine la secuencia de aminoácidos de la cadena A. respectivamente (no se conocía su exacta identidad en el péptido). Es posible que los péptidos no fueran completamente puros por lo que los números eran aproximados. En base a estos datos. A continuación se muestran algunos de los resultados para la cadena A. para preparar péptidos más cortos. A continuación determino el número de grupos amino presente en cada péptido cuantificando el NH4+ liberado cuando el péptido era sometido a hidrólisis ácida. Explique cómo obtuvo la respuesta. Sanger soluciono este problema usando enzimas proteolíticas que rompen enlaces peptídicos.Al haberse convertido los residuos Asn a Asp y todos los residuos Gln a Glu a causa de la hidrolisis acida hubo que designar a estos residuos como Asx y Glx. aunque suficientemente buenos para el propósito de Sanger. . e. pero no los enlaces amida de Asn y Gln.