Fecha de entrega: Jueves 22 de Abril de 2015INSTITUTO TECNOLOGICO DE TEPIC Practica 9: “Reacciones de oscurecimiento enzimático” Miguel Ángel Rubio Sánchez Ing. Bioquímica Ciencia de Alimentos M.C. Rosa Castro Martínez Laboratorio de Análisis de Alimentos Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica 9 Índice Introducción Objetivos Material y reactivos Metodología Análisis y resultados Conclusión Bibliografía Cuestionario 2 3 3 3 8 16 16 17 . la transformación del difenol en quinona. fenolasa o tirosinasa. la reacción de pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores: Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte Bajando al temperatura Reduciendo el pH Desnaturalizando el enzima Generalmente estos factores actúan de forma combinada.El pardeamiento enzimático es un conjunto complejo de reacciones. desde las bacterias al hombre. EC 1. catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prácticamente todos los seres vivos. ya que en ellos la tirosina es el principal substrato. que se inicia por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática. el descenso de pH puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima . El enzima se encuentra en los plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores). Así. La polifenoloxidasa. en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales.9 Introducción El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como substrato el oxígeno molecular. La enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de polifenoloxidasa. corte o congelación y descongelación.14. la reacción de pardeamiento se puede producir. Además de manteniendo la compartimentalización. cuando el sustrato presente es un monofenol. es su transformación en difenol. También se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción. Cuando se rompe la compartimentalización por un daño mecánico. El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos.18.1 tiene dos actividades enzimáticas. mientras que los compuestos fenólicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. como el triturado. una hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando difenoles a quinonas. La segunda. y también en el citoplasma celular. La primera de ellas. Identificar factores que favorecen e inhiben. Identificar grados de pardeamiento. preparar el jugo de manzana Pelar y quitar las pepitas con rapidez Pesar 75 gr Homogenizar con 150 ml de agua destilada durante 10-15 seg Usar rapidamente Filtrar con gasa .9 Objetivos Reconocer el pardeamiento enzimático. 1% Ácido clorhídrico Sulfato acido de sodio 6. Material y reactivos Materia 2 Cuchillos 2 Vasos de precipitado 250 ml 1 Gradilla 1 Termómetro 10 Cajas Petri 5 Vidrios de reloj 1 Pipeta de 10 ml 1 Tripie 1 Mechero 1 Rejilla 2 Tablas para picar 16 tubos de ensayo Reactivos Equipos Manzana roja Gala Licuadora Catecol al 1% Agua destilada Ácido cítrico al 1% y 5% Carbonato acido al 1% Ácido ascórbico al 5. 2. Identificar sustancias que favorecen e inhiben.2% Pirogallol al 1% Fenol al 1% Metodología Antes de comenzar.4.5. Cuando el trozo entere este marron dividirlo en 3 partes por rotura y por corte. iii. Poner 10 ml de jugo de manzana en un tubo de ensayo y en una caja petri Observar en cual se presenta mayor oscurecimiento . Cortar 1/4 de manzana en 2 trozos Desmenuzar uno de los trozos y ponerlo en un vidrio de reloj junto al otro entero Comparar el oscurecimiento producido Observar el color del interior del troxo de manzaa Hallar cual pardea mas rapidamente ii.9 Experimento A: “El tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en la reacción de obscurecimiento” i. Tratamiento por calor” i.9 Experimento B: “El efecto del calor en la reacción” Poner 10ml de jugo de manzana en los tubos A. Fenol 1% y agua destilada Observar los troxos y comparar el oscurecimiento Experimento D: “Para controlar las reacciones de pardeamiento enzimático. . Piragallo 1%.B.D Caletar el tubo A en el mechero Hervir durante 1 min Mantener el tubo D a temperatura ambiente Poner el tubo C en un baño de agua a 100°C Poner el tubo B en baño de agua a 50°C Comparar el grado de oscurecimiento en los 4 tubos Al final hervir trozos de manzana 1 min Exponer al aire y observar Experimento C: “Investigación de las sustancias de la manzana causantes de la reacción de pardeamiento” Poner 4 trozos de manzana en varios vidrios de reloj Remojar cada uno con una de las siguientes soluciones: Catecol 1%.C. Acido citrico 0. 60 seg respectivament e Enfriar con agua Observar el oscurecimeinto en cada tubo Añadir a cada tubo 1 gota de Catecol 1 % Poner 4 trozos de manzana en agua hirviendo durante 30. 30. 90 y 120 seg. Experimento E: “El efecto del pH” Poner 5 trozos de manzana sobre vidrios de reloj Remojar cada uno con una de las siguientes soluciones: Acido citrico 1%. Agua y Carbonato acido de sodio Dejar reposar y comparar el pardeamiento . 10. Jugo de limon. 15.9 Mantener los tubos en la llama durate 5. Enfriar con agua y cortar por la mitad Agregar Catecol 1% en los cortes Comparar sabor y textura con los de la manzana fresca Repetir la prueba omitiendo la adicion de catecol Observar Poner 5 ml de jugo de manzana en 5 tubos de ensayo ii.5%. 60. de carbonato 2%. al 4% y al 2%.5%.9 Experimento F: “Efecto del ácido ascórbico” Poner 5 trozos de manzana sobre vidrio de reloj reloj Tratar casa uno con las siguientes soluciones: Acido ascorbico 5%. agua y acido clorhidrico 2M Anotar el tiempo en que un trozo se ponga mas marron que el trozo con acido clorhidrico Experimento G: “Efecto del sulfito acido de sodio” Tomar 4 tubos de ensayo Agregar una Agregar una de de las las siguientes soluciones: 1 ml de sulfito acido de sodio al 6%. Acido ascorbico 2. yy 11 ml ml de carbonato acido de sodio acido de sodio al al 12% 12% Añadir a cada tubo 5 ml de jugo de manzana Experimento H: “Efecto de las sustancias naturales existentes en diferentes variedades de manzana” Conseguir un lote con diferentes clases de manzana Cortar trozos de cada una Comparar el grado de oscurecimiento . Acido ascorbico 1%. lo que acelera la reacción.9 Análisis y resultados Experimento A: “El tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en la reacción de oscurecimiento” Manzana en proceso de oxidación En la primera parte de este experimento. Esto se puede apreciar en la imagen superior en el extremo derecho . o en este caso picada (debido a la composición física de esta) se oxido más rápido que la entera debido a que hay más superficie de contacto con el oxígeno. la manzana desmenuzada. Experimento B: “El efecto del calor en la reacción” .9 La manzana troceada se oxidaba más. El pardeamiento visible tuvo lugar a los 30min después del corte o trozado El jugo de la caja Petri fue más oxidado debido a su mayor superficie. en cambio la cortada es un corte más uniforme donde no hay tanta superficie de contacto con el oxígeno por lo que fue menor su pardeamiento. lo que da cavidad a la acción del oxígeno. que la del tubo. que la cortada. debido a que el trozado da lugar a muchas formas irregulares de corte. Color claro Puso en un baño de agua a 50 °C Color un poco más claro que el tubo B Puso en un baño de agua a 100 °C Muy intensificado su color. de oxidación.9 En las imágenes se puede apreciar el momento en que se le dio a cada tubo el tratamiento térmico correspondiente especificado en el diagrama de flujo del experimento Tub o A B C D Tratamiento dado. . cierto grado Mantuvo a temperatura habitación. Observaciones Calentó a la llama del mechero e hirvió No presenta cambios contenido 1min. 9 Como se puede observar en la tabla el grado de oxidación enzimática va de acuerdo a la temperatura. Experimento C: “Investigación de las sustancias de la manzana causantes de la reacción de pardeamiento” . como en la temperatura de habitación es óptimo para que se lleven las reacciones enzimáticas. Para los trozos de manzana que se hirvieron y partieron no hubo cambio ya que la temperatura fue tanta. que la manzana se coció un poco y la enzima no tuvo un sustrato viable en el cual trabajar. el tubo que se hirvió por 1min no mostro cambios debido a que el calor desactivo la enzima. y terminamos con el agua obtuvo el último puesto. seguida de la de piragallol que obtuvo el segundo puesto en coloración. Tratamiento por calor” Tubos con jugo de manzana y Catecol después del tratamiento térmico En la imagen superior se aprecian la serie de tubos con Catecol post tratamiento térmico y se observó más oxidación pero con el mismo principio de más duración del tratamiento igual a menor actividad enzimática.9 En la imagen se pueden apreciar los grados de pardeamiento La imagen es muy clara y se puede observar que la solución de catecol fue un acelerador de la reacción de oxidación . Experimento D: “Para controlar las reacciones de pardeamiento enzimático. . siguiendo con el fenol que fue poco el cambio pero apreciable. como se prueba en las imágenes. es por eso que está un poco desordenada la última imagen. A los 90seg.9 Manzanas antes del tratamiento Manzanas después del tratamiento En las dos últimas imágenes de las manzanas cortadas se ve el antes y el después del tratamiento. Experimento E: “El efecto del pH” . si no se agrega el Catecol a los 60 seg. ya que los trozos de las manzanas estaban muy grandes y el calor no llegaba totalmente al centro . de tratamiento fue el tiempo suficiente para detener un poco la reacción. por lo que el pardeamiento si pudo se presentarse. Nota: Hubo algunos problemas al momento de comparar los trozos que tenían Catecol y los que no. de tratamiento es suficiente para que no se oxide. Analizando el procedimiento observo que era necesario mas tiempo de tratamiento. Para un mejor entendimiento la eficiencia de las soluciones se evaluó en una escala 1-10. el ácido ascórbico es un antioxidante natural.9 Para este apartado quedó más claro que cuando se acidifica el medio la enzima puede desnaturalizarse y/o inhibirles. ya que aunque si inhibieron la enzima . por lo que no se lleva a cabo su reacción de oxidación. pero llega un momento en que el mismo llega a oxidarse y de esta manera se inutiliza su reacción. Momento en que los antioxidantes actúan sobre las manzanas Experimento F: “Efecto del ácido ascórbico” En la imagen anterior se aprecia el momento en que el ácido ascórbico actúa sobre la manzana Se puede apreciar en la imagen superior. Esto último lo podemos apreciar en los 3 trozos de manzana que se les aplico dicho acido. Jugo de limón Agua Carbonato ácido de sodio al 1% Eficiencia anti oxidación 1-5 4 8 2 6 10 El carbonato acido de calcio de sodio resulto ser el mejor antioxidante de las soluciones propuestas. Tub o A B C D E. Ácido cítrico al 0.5%. Tratamiento Ácido cítrico al 1%. que como lo dice el manual de prácticas. por ser tan agresivo aunque sea excelente. Inhibió Experimento G: “Efecto del sulfito acido de sodio” La imagen muestra los resultados obtenidos En la siguiente tabla se muestran los resultados del experimento: Tub o A Sustancia Agregada 1ml de Sulfito ácido de sodio 6 Coloración Amarillo muy claro . Ácido ascórbico al 2. Ácido ascórbico al 1% Agua Ácido Clorhídrico 2M. esto fue solo por un tiempo.5%. Por razones obvias no se puede usar un antioxidante como al ácido clorhídrico al 2M. En todos los tratamientos la enzima fue inhibida menos en el agua que muestra un característico cambio de coloración. Tratamiento Ácido ascórbico al 5%. ya que la acción del ácido inhibe la enzima aun sea al 1%. Los resultados se muestran en la siguiente tabla: Tubo A B C D E.9 evitando la oxidación. Resultado Inhibió Inhibió Inhibió Enzima activa. conocimos las a fondo las características. Experimento H: “Efecto de las sustancias naturales existentes en diferentes variedades de manzana” Lote con 3 variedades de manzanas Después de realizar tonos los experimentos anteriormente analizado. al utilizar se observó que a tan bajas concentraciones como lo fueron al 2% inhibía estas reacciones indeseables. las propiedades y el comportamiento de la manzana al momento de que .9 B C D % 1ml de Sulfito ácido de sodio 4% 1ml de Sulfito ácido de sodio 2% 1ml de carbonato ácido de sodio al 12% Beige Sin cambio Café Los sulfitos son los más utilizados en la industria como antioxidantes enzimáticos. 5 http://milksci. Es por esto que se utilizan diferentes antioxidantes como lo son los sulfitos. y para la industria alimentaria el pardeamiento u oxidación enzimática es muy grave aún. ya que al exponer al ambiente los trozos de las diferentes variedades. ya que pierde valor nutricional y visual.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.9 la enzima polifenol oxidasa actúa sobre ella. El ácido ascórbico es un agente oxidante pero no es muy bueno ya que no es muy estable conforme el tiempo pasa por lo que se usa este agente en acción con otros. o tratamientos térmicos para desnaturalizar esta enzima. y se realizaron muchos experimentos para observar qué pasa en diferentes situaciones y soluciones. Cuestionario . Bibliografía Salvador Badui Dergal 4ta edición. existen niveles de pardeamiento que van de un beige a un negro lo que es nada a atractivo al ser humano. Al momento de comparar todas estos resultados con los de nuestros compañeros. Conclusión La enzima polifenol oxidasa está presente en la mayoría de las frutas. Cada procedimiento nos mostró las diferentes maneras de inhibir o acelerar los efectos de dicha enzima. ácidos. ya que los antioxidantes también cumplen con el sinergismo. También al agregar ácidos no se puede incrementar mucho su concentración ya que degradará proteínas presentes por ser agresivos.unizar. Capitulo 4.7.html Cuadernillo de Prácticas de Laboratorio ciencia de los alimentos. podemos definir que la oxidación se presenta en menor medida en nuestra manzana (Gala). Esta práctica fue larga pero muy interesante. la red delicious fue la que se oxido más rápido. como ejemplo de inhibición podemos mencionar que los tratamientos térmicos retrasaban la oxidación. 2..9 1. 4... pero al pasar el tiempo este se oxida y comienza a pardearse. 5.Cuales son los sustratos del obscurecimiento enzimático? Monofenoles 3...Como actúan los sulfitos? Actúan como buenos inhibidores enzimáticos.Escriba los compuestos intermediarios y productos finales Del monofenol forma difenol y después quinonas. .Que es la PFO? Es la enzima que cataliza la reacción Polifenol oxidasa.Explique el efecto de los ácidos en la inhibición de la PFO El ácido ascórbico es un antioxidante natural por lo que nos e pardea.