TEMA: CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS 3.3.1 INTRODUCCION Y CROMATOGRAFIA EN PAPEL Y CAPA FINA MÉTODOS CROMATOGRAFICOS La cromatografía es un proceso fisico dinamico en el cual las sustancias que componen una mezcla son separadas debido a sus diferentyes afinidades por dos sustancias a las que se denomina fases, una es fija o estacionaria y la otra movil. La fase movil puede ser liquida dando origen a un grupo de tecnicas conocidas como cromatografía liquida o puede ser un gas, en el cual el caso de la tecnica fundamental se conoce como cromatografía de gases. Ambas tecnicas son de inmenso valor para el analista de alimentos. Cromatografía LIQUIDA La cromatografía liquida es una tecnica de separacion en la cual los compuestos son repartidos entre dos fases: una estacionaria que tiene una gran superficie y una fase liquida movil que fluye sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un solido activo o liquido inmóvil. De acuerdo con la selección de la fase movil, el tipo de partícula que se usa en la fase estacionaria y las condiciones de operación, los componenrtes de la mezcla viajaran a diferentes velocidades, debido a lo cual son separados. La cromatografía liquida se puede dividir en cuatro tipos prioncipales: cromatogafia de absorción o cromatografía liquido/ sólido basada principalmente en las diferencias de afinidad relativa de de los compuestos por el adsorbente sólido usado como fase estacionaria. Las separaciopnes que se obtienen se determinan casi totalmente por interacciones polares. Cromatografía de partición o cromatografía liquido/liquido, esta basada en las caracteristicas de solubilidad relativa de los solutos entre la fase movil y una fase estacionaria liquida. La fase liquida impregna un soporte poroso inerte. La cromatografía de intercambio ionico esta basada en la afinidad de los iones en solucion por los sitios de polaridad opuesta en la fase estacionaria. La cromatografía de exclusión la cual se conoce también como permeacion de gel, filtración por gel o tamizado molecular, se base en la capacidad de materiales Las manchas tienden a ser difusas. adaptable y rapida que la cromatografía en papel y las separaciones cromatograficas son más eficientes y pueden ser semicuantitativas. La CCF* es mas sensible. En el caso de sustancias coloridas. la separcion puede ser evidente sin el uso de agentes reveladores. cromatografía en columna y cromatografía liquida de alta presion. algunas de las cuales pueden destruir rapidamente el papel. 1961) usando sustancias pulverizadas que se adhieren al vidrio. con limitaciones por el uso de agentes que se rocian.de porosidad regulada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas. Sobre el papel se seca una gota de extracto de la muestra. Los principios de la cromatografía liquida se aplican en cuatro técnicas analíticas. películas plasticas rigidas y hojas delgadas de aluminio. Para evitar evaporación se cuelga el papel dentro de una camara en forma tal que la mancha pueda ser irrigada con la fase movil. por ejemplo sílice y kieselguhr. La fase movil es una solucion que consiste en un disolvente o de una mezcla de varios liquidos que contiene agua. Se pueden preparar o adquirir en el comercio . La cromatografía en capa fina de adsorbentes se ha mejorado (Stahl y Kaltenbach. tales como colorantes para alimentos. La cromatografía de en papel es una tecnica barata. hacia arriba u horizontalmente por capilaridad. en la cual la fase estacionaria es el agua absorbida y adsorbida que hay en el papel y el soporte es el mismo papel. tanto hacia abajo por gravedad. Se dispone de aparatos para recubrir placas de vidrio para la CCF*. Esto ha permitido usar otros soportes con diferntes propiedades. cromatografía en papel. Las sustancias no polares también se pueden separar cubriendo el papel con compuestos no polares y utilizando disolventes polares como fase movil. pero por lño general lenta. Cromatografías en papel y en capa fina La cromatografía en papel es una forma de cromatografía d4e partición combinada con cromatografía de adsorcion. se saca el papel de la camara y se desarrolla el cromatograma por aspersión de sustancias. que lo hagan visible. cromatografía en capa fina . existentes en el comercio. pero ahora se estan usando ampliamente placas de vidrio prerecubiertas. Cuando la fase movil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada para lograr la separacion. La alta resolucion de los geles de sílice con microparticulas que se usan. Se cuenta con una revision reciente de la cromatografía en capa fina. Estas placas requieren cargas menores de la muestra y se pueden realizar más pruebas por placa con menores corridas de desarrollo (30 a 60 mm) y los analisis son mas rapidos. ** La CCF puede ser totalmente cuantitativa. Esta puede estar formada por tres compuestos. La CCF es el método mas barato y a menudo el mejor para aislar e identificar componentes menores de los alimentos.placas que no contengan materia orgánica y produciendo la visualizacion de las manchas por carbonización con acido sulfurico. El componente separado puede ser raspado de la placa. como en la determinación de acido erucico. Más recientemente se ha aplicado la tecnología usada en la preparación del empaque con microparticulas para columna en la cromatografía liquida a alta presion a la CCF introduciendo la llamada Cromatografía en Capa Fina Alta Presion (HPTLC)* (CCFAP) . posibilitan la CCF cuantitativa directa. naftaleno. Ha aparecido una revision INTRODUCCIÓN En esta práctica se pretenden identificar los componentes de una disolución. Puede ser muy efectiva la visualizacion bajo luz UV después de haber rociado la placa con un reactivo fluorescente. extraido del material de ésta y después sometido a analisis por espectrometria o por cromatografía gas – liquido. veratrol o acetanilida. siendo las cantidades de cada compuesto desconocidas para . cuando los compuestos que se han separado destruyen o modifican la fluorescencia. Se cuenta con placas prerrecubiertas para CCFAP quen presentan resolucion y sensibildad más elevadas que las placas normales. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. los cuales tienen colores definidos. La técnica a utilizar no se corresponde de manera específica con su nombre. puesto que no apreciaremos ninguna diferencia de color entre los diferentes componentes. ya que no consiste en escribir con colores. Hay que indicar que el nombre de la técnica es incorrecto. Para ello el método a utilizar será la cromatografía. Este nombre proviene de la primera experiencia cromatográfica realizada. Esta diferencia será la que nos permita tanto identificar cuantos componentes tiene una disolución como separarlos. la cual puede ser sólida o líquida. No obstante. la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. FUNDAMENTO TEÓRICO La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria.nosotros siendo la mezcla completamente aleatoria. El nombre de la técnica deriva de los primeros ensayos en los que se separaron pigmentos de plantas como la clorofila. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verde en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. La técnica se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos al ser arrastrados por una fase móvil sobre una estacionaria que puede ser sólida o liquida. Con este método experimental podremos separar los componentes de una disolución desconocida para luego compararlos con diferentes disoluciones patrón. no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta 1930 cuando khun y Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando . Estos primeros pasos los dio el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos de las plantas. en estas diferencias. uno remoto y otro próximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad. adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos). Para explicar el fenómeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de fundamento. reactividad química o bioquímica. y que. denominada fase móvil. Se eligen las condiciones . Por tanto. una de las fases. se basa la separación cromatográfica. a la que se denomina fase estacionaria. carga. o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido liquido. al menos en una extensión esta en equilibrio con la fase móvil. que pueden ser muy pequeñas.El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so “movilidad” entre si y con respecto a la fase móvil.Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. . La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades. Si se transforma la idea del equilibrio estático establecido entra las dos fases en un equilibrio dinámico. Como se ha indicado anteriormente. Fue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografía. que permanece inmóvil. Deben cumplirse las condiciones siguientes: . etc. Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico . se tiene la realidad del fenómeno cromatográfico.como adsorbentes alúmina y carbonato de calcio. tamaño. volatilidad.químicas frente a un sistema cromatográfico dado. fluye a través de la otra. Clasificaciones: Para clasificar globalmente los procesos cromatográficos es necesario atender a dos criterios básicos: Fundamento del proceso cromatográfico. por tanto. es decir. del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible Puede hacerse una primera distinción entra las técnicas cromatográficas atendiendo a la integración continua o no del sistema de detección. lo que constituye las distintas técnicas cromatográficas Tipos de cromatografías: Si es un sólido. La base de la separación cromatográfica será. auténticos instrumentos. la diferencia en la velocidad de migración de los mismos. lo que conduce a los tipos de cromatografías Forma de realizar el proceso cromatográfico. Así. La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. mientras que cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo. por tanto. De hecho las técnicas de separación y no suelen dividirse La en dos grandes de una grupos: técnica cromatograficas cromatograficas. cabe distinguir entre: Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals) . la cromatografía no conlleva a un sistema de detección. elección cromatográfica concreta dependerá de la naturaleza y cantidad de la muestra.experimentales y las fases cromatográficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. utilizada especialmente en bioquímica. cromatografía liquida. Si es un fluido supercrítico. se trata de la Cromatografía de partición. Según la naturaleza de la fase móvil. • Cromatografía gas-sólido (CGS). pero simultáneamente comprimido a una presión . cromatografía de gases. exclusión. (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura crítica. se trata de una cromatografía de partición. afinidad).Cromatografía de cambio iónico: el sólido es un cambiador de iones (fuerzas electrostáticas) Cromatografía de exclusión (o de geles). el sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño. por tanto. Cromatografía de afinidad: es un tipo especial de cromatografía de absorción. • Cromatografía liquido-sólido (CLS) en la que la fase estacionaria es sólida (adsorción. cambio iónica. que es una cromatografía de adsorción. un indicador enzimático o un anticuerpo Si es un líquido que se encuentra soportado en un sólido inerte. que es una cromatografía de partición. en la que un sólido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo. la técnica cromatográfica correspondiente recibe el nombre de dicha fase móvil: Si es un líquido. puede ser: • Cromatografía gas-liquido (CGL). cabe distinguir: • Cromatografía liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y. Si es un gas. El soluto se reparte entra la fase móvil (liquido o gas) y la fase estacionaria. cabe distinguir dos tipos de técnicas cromatograficas: en columna y plana. Es de destacar que en la actualidad. Se divide en dos tipos generales: • Cromatografía en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria (cromatografía de partición). se trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS). aunque una de sus dimensiones es muy reducida. aunque incorrectamente. en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil (liquido o gas) a través de la estacionaria se consigue: 1)por presión.mayor que su presión critica). por lo que ésta siempre es líquida. Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico. En la cromatografía plana queda excluido el uso de un gas como fase móvil. El flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente). . 3) por gravedad. es decir. que puede ser de partición o de adsorción. Técnicas cromatográficas: Según la forma de llevar a cabo la separación cromatográfica. el término de cromatografía en columna suele aplicarse a la cromatografía liquida para distinguirla de la cromatografía plana ya que. Cromatografía plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional. obviamente la cromatografía de gases solo puede realizarse en columna. según el dispositivo utilizado para conseguir entre la fase móvil y la estacionaria. generalmente de vidrio. • Cromatografía en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografía de partición). 2)por capilaridad. se extiende en una capa delgada sobre una placa. por lo que puede considerarse bidimensional. manteniendo todo el sistema cromatográfico en una cámara cerrada. . El flujo de la fase móvil se produce: Por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente) Por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente) Esta clase de cromatografía es considerada la más simple de todas las técnicas cromatograficas.Cromatografía plana: La cromatografía plana es un tipo de cromatografía liquida en la que la fase estacionaria esta extendida sobre la superficie de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. cambio iónico o exclusión). Generalmente. en cromatografía plana el analito no abandona el lecho cromatográfico. Cabe distinguir dos tipos de cromatografía plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF). es el mismo para ambas técnicas En la cromatografía plana. a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. mientras que la fase estacionaria puede ser un líquido soportado en un sólido (cromatografía de partición) o un sólido sorbente (cromatografía de adsorción. el extremo del plano próximo a la misma se pone en contacto con la fase móvil. la disolución de la muestra a separar se sitúa sobre el plano que contiene la fase estacionaria en forma de mancha. En lo que se refiere al fenómeno en que se fundamenta la separación. La diferencia principal con la cromatografía en columna es de tipo técnico. Una vez seca la mancha o banda. o a veces de banda. es decir. a diferencia de la cromatografía en columna. La separación se produce por migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en que se mueve la fase móvil. de forma que el proceso se detiene cuando la fase móvil ha alcanzado una determinada zona del plano. La fase móvil siempre es un líquido. para separar mezclas no demasiado complejas. con cambiadores ionicos) o tratadas químicamente (v. denominada cromatografía en capa fina de alta resolución (CCFAR o HPTLC en la bibliografía inglesa). No obstante. un sólido. Hasta hace relativamente poco tiempo. pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras técnicas cromatográficas como la CLAR. debido a los cambios introducidos en esta técnica. se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie rígida. que amplían la aplicabilidad de esta técnica. el interés por la CCF ha vuelto a renacer. equipos para aplicar y la muestra y sistemas de detección. la (CCF) era considerada una técnica cualitativa simple y rápida. Sin embargo. normalmente una capa de vidrio o polietileno. de forma que la fase móvil fluye a través del mismo. adsorción. Dependiendo de las características del sólido utilizado.i. con silicona para separaciones en fase invertida.i. actualmente. sorbente o soporte de la fase estacionaria. Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas técnicas cromatográficas se dedican a la cromatografía en papel. como gel de sílice o alúmina. siendo considerada una técnica útil para separar y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas. al igual que ocurrió cuando se mejoro la capacidad de resolución de la cromatografía liquida en columna. la cromatografía será de partición. cambio iónico o exclusión.La cromatografía en papel tuvo su máximo desarrollo en. os años cincuenta pero en la actualidad se encuentra prácticamente eclipsada debido a la mayor rapidez. grupos cambiadores incorporados al esqueleto polimérico de la celulosa). En cromatografía en capa fina. también existen en el comercio papeles impregnados (v. la celulosa actúa como soporte de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografía de partición). En esta técnica. eficacia y versatilidad de la cromatografía en capa fina. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la técnica. en lo que se refiere a la calidad de los solventes. pasando a denominarla cromatografía liquida de alta resolución (CLAR o HPLC) . rincondelvago. Proceso de Adsorción La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals. Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de alúmina y luego aplicaron extractos vegetales. cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar. efectos inductivos.html CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA Historia El botánico ruso Mikhail Tswett estableció las ventajas de la cromatografía y qué el primero en utilizar este término. etc).com/cromatografia_2. se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. Egon Stahl (1956) dió el nombre de Cromatografía de Capa Fina. a bajo costo y eficiente. equipos y adsorbentes dando un auge a la técnica simple. dando así la primera forma de Cromatografía de Capa Fina. Estandarizó los procedimientos. puentes de Hidrógeno. Adsorbentes Los adsorbentes más utilizados en la Cromatografía de Capa Fina son: • • Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida. neutra ó básica) . Luego. Es recordado como el Padre de la Cromatografía.http://html. Plástico ó Metálicos (Ej. x 20 cm. Hay placas que contienen un indicador de Fluorescencia: F254 ó F366. El número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado.• • • Tierra Silícea ó Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas Estos adsorbentes deber tener las siguientes características: • Tamaño de Partícula o o o Volumen de Poro Diámetro de Poro Área Superficial • • Homogeneidad Pureza Preparación de la Placa Cromatográfica Se usan como soporte del adsorbente láminas de: Vidrio. 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm.: Aluminio). Los tamaños de la placa para TLC convencional son: 20 cm. Aplicación de la muestra La muestra se aplica en la placa según el objetivo: Analítico ó Preparativa en: • • Banda Punto ó Mancha Desarrollo de la Placa Es un proceso mediante el cual son trasportados a través de la fase estacionaria por la fase móvil. Elección del Solvente . Cámaras para Desarrollo Existen varios tipos de cámaras: • • • • • • Normal Doble Compartimiento Sándwich Horizontal Vario KS U Detección ó Visualización Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de métodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Se obtienen derivados Físicos (ópticos). Estos métodos son: • Químicos (por inmersión o rociado). Generalmente se utiliza radiación UV coloreados o fluorescentes • Evaluación de un Cromatograma de Capa Fina Análisis Cualitativo • • • Medida de Rf Comparación Visual de Color/Intensidad Propiedades UV/IR/MS/NMR Análisis Cuantitativo • Semi-cuantitativo o Comparación visual del diámetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie de manchas patrones de concentración conocida . También se conoce este procedimiento como Revelado. . habitualmente sólida. Medida de luz Medida de Emisión.) que. etc. solubilización en cada fase. cada componente tiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros. en último extremo.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Thin. llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases. la separación será buena. Naturalmente. para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrón. reflejada desde la substancia Espectrofotometría Fluorescencia Fluorescencia con "quenching" http://www. la relación entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es constante. experimenta una serie de procesos (adsorción en fase sólida.• Cuantitativo o o Indirecta Directa Densitometría Medida de Transmisión. así como de las condiciones de la cromatografía. Medida de luz transmitida a través de la substancia. Si en una mezcla. una de ellas.relaq. en ciertos casos.htm CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA INTRODUCCIÓN Las técnicas cromatográficas se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y. En el equilibrio. dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases. La base de la técnica es que cuando un determinado soluto interactúa con dos fases. arrastre por la fase móvil. y se denomina coeficiente de reparto. llamada fase estacionaria. sobre todo. que emigra por la fase estacionaria debido. MATERIAL. o los azúcares de la 1. En su movimiento. característico de cada sustancia. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones. la placa se revelará mediante la reacción con ninhidrina. y relacionado con él. Las más insolubles tendrán. En esta práctica. definido como la relación entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase móvil. arrastra más o menos a los componentes de una mezcla en función de sus mayores o menores coeficientes de reparto. un Rf próximo a cero. Para aminoácidos. alúmina. emplearemos aminoácidos. en cada caso cambiaría la fase móvil empleada y los reactivos reveladores. en el disolvente empleado. En su lugar. El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. pero podrían emplearse los distintos fosfolípidos obtenidos de la yema de huevo de la práctica 2. llamada así porque la fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de sílice. etc. Lógicamente. a la capilaridad. reacción que se explica en la práctica 3.) extendida para su manejo mecánico sobre un soporte inerte. La cromatografía en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomoléculas. mientras las más solubles se acercarán a uno.Una de las técnicas cromatográficas más sencillas es la que se realiza en capa fina. Placa fina de celulosa Cubeta para el revelado Pinzas de madera Regla de 20 cm Micropipeta de hasta 10 µ l Cubeta cromatográfica Lápiz nº 2 Secador de cabello . se emplea el denominado Rf. Muestras de aminoácidos al 1% Ninhidrina (1mg/ml en acetona) Fase móvil: n-butanol-acetona.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Medicina/PracticasLaborat orio/Practica05.acético-agua (35/35/20/10) http://www.um.htm Silverio mas balan Angeles garcia castillo Maria del carmen piña canche .REACTIVOS.