QuimotripsinaINSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA CINÉTICA QUÍMICA BIOLÓGICA UNIDAD 4: CINÉTICA ENZIMÁTICA. QUIMOTRIPSINA PRESENTA: AVEDOY CORTÉZ ISIS. CÁRDENAS CASTRO ALICIA PAULINA. FLORES JIMÉNEZ NITZIA THALÍA. LÓPEZ MONTEÓN CYNTHIA JAZMÍN. M.C. SALVADOR YUNIOR AGUILAR RAMÍREZ. Isis Avedoy Cortéz; Alicia Paulina Cárdenas Castro; Nitzia Thalía Flores Jiménez; Cynthia Jazmín López Monteón. 1 Quimotripsina INTRODUCCIÓN Las enzimas son catalizadores específicos que participan y tiene vital importancia en la regulación química de las células y los organismos. La catálisis es esencial para hacer que muchas reacciones bioquímicas y biológicas de importancia crucial se produzcan en condiciones fisiológicas a velocidades útiles y de la manera correcta. La vida aprovecha hábilmente el hecho de que la mayoría de las reacciones deban estar catalizadas. En el complejo medio de la célula, hay innumerables reacciones posibles entre las moléculas. La célula se aprovecha de la catálisis específica para canalizar las sustancias hacia rutas que sean útiles en vez de reacciones colaterales despilfarradoras. Las enzimas son, entonces, unas moléculas esenciales para la buena salud producidas por el cuerpo. A cada instante millones de ellas trabajan en el organismo para que podamos respirar, saltar o comer. Un grupo muy importante de enzimas son las digestivas ya que favorecen la digestión y absorción de los nutrientes a partir de los alimentos que ingerimos. El páncreas también participa en la digestión y absorción de los alimentos mediante la secreción de enzimas al intestino conocidas como las enzimas pancreáticas. En la degradación de proteínas, en el aparato digestivo de mamíferos y de otros organismos, participan un cierto número de enzimas proteolíticos 1. Una de estas enzimas es la quimotripsina; esta es una enzima digestiva (proteasa pancreática) que rompe selectivamente los enlaces peptídicos contiguos al extremo carboxilo de aminoácidos hidrofóbicos voluminosos, como triptófano, tirosina, fenilalanina y metionina. La quimotripsina es secretada por el páncreas como un precursor inactivo llamado quimotripsinógeno, el cual forma parte del jugo pancreático. El quimotripsinógeno (quimotripsina inactiva) es enviado a través del ducto pancreático al duodeno (intestino delgado) donde es activado como quimotripsina. Isis Avedoy Cortéz; Alicia Paulina Cárdenas Castro; Nitzia Thalía Flores Jiménez; Cynthia Jazmín López Monteón. 2 Isis Avedoy Cortéz. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Cynthia Jazmín López Monteón.Quimotripsina Esto último es una de las características más interesantes de esta enzima y es tan sólo un poco del amplio estudio que se le ha hecho a la quimotripsina. 3 . Alicia Paulina Cárdenas Castro. 2004). Alicia Paulina Cárdenas Castro. Cynthia Jazmín López Monteón.Quimotripsina CLASIFICACIÓN Para comenzar con la amplia descripción de la quimotripsina es necesario primero conocer la clasificación de esta enzima. Pertenece a este grupo la quimotripsina. Figura 1: Resumen de las Clases enzimáticas y de las principales Subclases (Devlin. Isis Avedoy Cortéz. •Se sintetizan en una forma inactiva denominada zimógeno. Hidrolasas •Su acción consiste en transferir el grupo escindido del sustrato al hidroxilo del agua. en la figura 1 se muestra dicha clasificación. 4 . Serina Proteasas Diagrama 1: Clasificación de la quimotripsina. El grupo al que pertenece la quimotripsina se presenta (desglosa) en el diagrama 1. las enzimas se clasifican de manera general en seis grupos. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Peptidasas2 (Proteasas) •Enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos. el porqué de su denominación es importante. posee un significado adicional como miembro de una familia importante de proteínas (Stryer. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Isis Avedoy Cortéz. Cada una de las serina proteasas corta preferentemente una cadena polipeptídica en el lado carboxilo de aminoácidos específicos. Una cuarta característica del lugar activo difiere de una serina proteasa a otra. Es la naturaleza de este bolsillo lo que le da a cada serina proteasa su especificidad (Mathews. Cynthia Jazmín López Monteón. Las serina proteasas constituyen la familia de enzimas comprendida en su totalidad como resultado de su examen extenso en un período de casi 50 años por técnicas cinéticas. 1995). pero que los bioquímicos utilizan en los estudios cinéticos. 5 . Para introducir al grupo de las serina proteasas. En concreto. Alicia Paulina Cárdenas Castro. la trombina. Se trata de un “bolsillo” que está situado siempre cerca de la serina del lugar activo. siempre existe un residuo de aspartato. Algunos miembros de la familia de las serina proteasas son la tripsina. Las serina proteasas hidrolizan también una amplia gama de ésteres. un residuo de histidina y un residuo de serina agrupados alrededor de la depresión del lugar activo. 2009).Quimotripsina Serina proteasas. La mayoría de las serina proteasas tienen unas estructuras tridimensionales semejantes y una relación evolutiva evidente. Las regiones del lugar activo de todas las serina proteasas tienen diversos factores comunes. 2006). Quimotripsina. una enzima de la coagulación y la quimotripsina. hecho este que tiene poca importancia fisiológica. Se denominan serina porque tiene un mecanismo catalítico común caracterizado por la posesión de un residuo Ser peculiarmente reactivo que es esencial para su actividad enzimática. Estas enzimas se denominan proteasas porque catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos en los polipéptidos y las proteínas. químicas. físicas y genéricas (Voet. la cual. una enzima digestiva. La quimotripsina está constituida por tres cadenas polipeptídicas conectadas mediante dos puentes disulfuro intercatenario3. Isis Avedoy Cortéz. His 57 y Ser 195 (figura 3). En la quimotripsina. Alicia Paulina Cárdenas Castro. El bolsillo de la quimotripsina está recubierto de residuos hidrófobos para acomodar una cadena lateral hidrófoba como la de la fenilalanina (figura 4). Los residuos catalíticamente señalan en color. Los residuos que se encuentran en la quimotripsina (características de las serina proteasas) son: Asp 102. Cynthia Jazmín López Monteón. La estructura tridimensional del enzima fue resuelta por David Blow con una resolución de 2 Å (figura 2). El papel biológico de la quimotripsina consiste en catalizar la hidrólisis de proteínas en el intestino delgado. 6 . importantes se La quimotripsina es selectiva para los enlaces peptídicos contiguos al extremo carboxílico de las cadenas laterales aromáticas de tirosina. triptófano y fenilalanina de grandes residuos hidrofóbicos como la metionina. Nitzia Thalía Flores Jiménez. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA. La molécula es un elipsoide compacto de dimensiones 51 x 40 x 40 Å.Quimotripsina La quimotripsina es un enzima digestivo de 25 kD. La quimotripsina contiene varias regiones de hojas plegadas β antiparalelas y una s pocas de hélice α. el bolsillo es más ancho en comparación con el de la tripsina. Figura 2: Estructura tridimensional de la quimotripsina. Esto es lo mencionado como “bolsillo” (lugar activo) en las serina proteasas. con un carboxilato cargado negativamente en su parte inferior. el cual es profundo y estrecho. Los aminoácidos cruciales del lugar activo se indican en rojo y azul. El bolsillo del lugar activo se encuentra situado inmediatamente por debajo y a la derecha de la Ser 195 Figura 4: Bolsillos de los lugares activos de las serina proteasas.Quimotripsina Figura 3: Estructura de la quimotripsina. Isis Avedoy Cortéz. 7 . Proteasas pancreáticas: Activación mediante ruptura: Zimógenos. Cynthia Jazmín López Monteón. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Alicia Paulina Cárdenas Castro. puede describirse mediante el ejemplo de las proteasas pancreáticas. es una enzima activa. de alguna manera. no se sintetizan en su forma final activa. Este cambio desencadena a su vez otros Isis Avedoy Cortéz. denominado π. En su lugar. grupo al que pertenecen diversas enzimas como la tripsina. El péptido N-terminal continúa unido al resto de la molécula debido al enlace disulfuro entre los residuos 1 y 122. en respuesta a una señal hormonal generada cuando el alimento sale del estómago. La forma en que la ruptura de un enlace peptídico transforma una proteína totalmente inactiva en una activa puede comprenderse ahora como resultado de los estudios de difracción de rayos X detallados del zimógeno y la enzima. El quimotripsinógeno está constituido por una sola cadena polipeptídica de 245 restos que se mantiene unida mediante cinco puentes disulfuro intracatenarios.Quimotripsina Un tipo completamente distinto de activación enzimática covalente.quimotripsina. la tripsina rompe el enlace entre la arginina 15 y la isoleucina 16. puesto que una batería de potentes proteasas libres en el páncreas causarían una digestión del jugo pancreático. proelastasa. En el primer paso. Estas enzimas se degradan tras haber cumplido sus fines. Sin embargo. Los nombres que se dan a los zimógenos de las enzimas citadas anteriormente con tripsinógeno. denominadas zimógenos. El producto. catalíticamente inactivas. Todas se sintetizan en el páncreas. se elaboran en forma de moléculas ligeramente más grandes. por lo que no ponen en peligro el tejido intestinal. procarboxipeptidasa y quimotripsinógeno respectivamente. Los zimógenos deben romperse proteolíticamente en el intestino para producir enzimas activas. carboxipeptidasa y la quimotripsina. que también está. elastasa. Cynthia Jazmín López Monteón. y se segregan a través del duodeno del intestino delgado. La activación del quimotripsinógeno a quimotripsina es uno de los ejemplos más complejos y mejor estudiados de la activación proteolítica de un enzima. Alicia Paulina Cárdenas Castro. protegido por su superficie glucosilada. 8 . que es el adyacente al lugar activo Ser 195 (véase figura 3). Nitzia Thalía Flores Jiménez. La ruptura del enlace peptídico entre los residuos 15 y 16 crea un nuevo residuo N-terminal cargado positivamente en Ile 16. la ruptura proteolítica. Este residuo desplaza su posición y forma un puente salino con Asp 194. junto con la pepsina del estómago y otras proteasas secretadas por las células de la pared intestinal. carboxipeptidasa y quimotripsina. 9 . en esta hidrólisis se liberan dos dipéptidos. La quimotripsina no está completamente “terminada” con esta ruptura. se hallan situados en dos cadenas diferentes. los dos restos específicos que son esenciales para la actividad catalítica. gracias a la acción consecutiva de la tripsina y de la quimotripsina. Se producen nuevas rupturas autocatalíticas que eliminan de la molécula los residuos 14-15 y 147-148. tripsina. y autodigestión. 1991). de manera que nunca llegan a acumularse concentraciones Isis Avedoy Cortéz. Las propias enzimas están sometidas continuamente a una digestión mutua. Esta batería de enzimas. Nitzia Thalía Flores Jiménez. elastasa. que pueden absorberse por el epitelio intestinal. mediante análisis por rayos X de la estructura terciaria de la quimotripsina. Así. Así pues. El quimotripsinógeno se convierte en -quimotripsina activa por la hidrólisis enzimática de cuatro enlaces peptídicos. 2009). tanto el bolsillo de unión como el lugar catalítico se forman correctamente sólo después de que se haya roto el enlace peptídico entre Arg 15 y Ile 16. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Cynthia Jazmín López Monteón. para producir la α-quimotripsina final. en la figura 6 se muestra la representación lineal de la conversión del quimotripsinógeno en quimotripsina. que es la forma principal y totalmente activa de la enzima que se encuentra en el tubo digestivo (Mathews. La quimotripsina activa producida por este método está constituida por tres cadenas polipeptídicas que se mantienen unidad mediante dos puentes –S-S-. se ha podido establecer directamente.Quimotripsina reordenamientos conformacionales en la proximidad del lugar activo. que ambos restos se hallan realmente muy próximos en la conformación del enzima nativo (Lehninger. la histidina 57 y la serina 195. es capaz de digerir finalmente la mayor parte de las proteínas ingeridas a aminoácidos libres. En la figura 5 se muestra la activación del quimotripsinógeno. Estos cambios incluyen el modelado correcto del bolsillo del lugar activo y el movimiento de los grupos amino de la cadena principal de los residuos 193 y 195 a un lugar en el que puedan establecer enlaces de hidrógeno con el sustrato oxianión (átomo de oxígeno carbonílico cargado negativamente) en el estado de transición tetraédrico. Sin embargo. incluso los zimógenos inactivos son una posible fuente de peligro para el páncreas4 (Mathews. La posterior eliminación de los segmentos que se indican en negro produce α-quimotripsina.Quimotripsina elevadas de estas enzimas en el intestino. La ruptura inicial entre los aminoácidos 15 y 16 (flecha) da lugar a la formación de π quimotripsina. 2009). Cynthia Jazmín López Monteón. Figura 6: Representación del lineal de la a conversión quimotripsina. quimotripsinógeno MECANISMO DE ACCIÓN Isis Avedoy Cortéz. 10 . con los enlaces disulfuros que continúan manteniendo la estructura unida. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Una serie de rupturas dan lugar a la enzima quimotripsina. Figura 5: Esta figura muestra esquemáticamente la molécula de quimotripsinógeno. dejando en la serina una carga negativa. sino también la esteroespecificidad de las serina proteasas. esta transferencia sería improbable debido a los pKa elevados de los grupos alcohol-OH. una molécula de agua se coloca entre el grupo Isis Avedoy Cortéz. Hasta este punto. En la figura 7 se ilustra cómo se produce la catálisis de la hidrólisis del enlace peptídico por una serina proteasa. La porción C-terminal del polipéptido extrae el protón (que originalmente era el protón de la serina) de la histidina. alejándose del receptáculo. estabiliza la protonación del anillo de histidina adyacente. que. pero parece facilitarse por Asp 102. Esta parte de la cadena del sustrato no está unida por si misma de manera fuerte a la enzima. ya que está muy próximo a His 57. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 11 . dado un intermediario acilo-enzima en el que la parte N-terminal del sustrato polipeptídico se une de forma covalente a la enzima. En primer lugar. cerca de los aminoácidos D. hidroliza enlaces éster además de los enlaces peptídicos. pues. al igual que muchas proteasas. Las serina proteasas no cortarán. En el paso 4. Normalmente. Este bolsillo define no sólo la posición del corte. la cadena lateral se proyectaría en la dirección incorrecta. Cynthia Jazmín López Monteón. pero éste se encuentra en un entorno poco habitual. por su carga negativa. pero la cadena lateral del residuo del lado N-terminal (Ile 16) del enlace peptídico que se va a romper debe ajustarse al bolsillo del lugar activo. formando el estado de transición tetraédrico (que se muestra en el paso 2 de la figura 7). el H2O no ha entrado en acción. para formar un nuevo grupo amino terminal. Si hubiera un aminoácido D en esta posición. pero sí lo hace ahora para desplazar la porción C-terminal de la cadena y posteriormente romper el intermediario acilo. Los residuos de serina no suelen ser reactivos. Alicia Paulina Cárdenas Castro. La serina activada es un fuerte nucleófilo y puede atacar al carbonilo del sustrato. Esta unión es muy específica de un tipo concreto de aminoácido sitúa a la serina del lugar activo próxima al grupo carbonilo del enlace a romper. la cadena polipeptídica que se rompe se una a la superficie enzimática (paso 1). La mayoría de los polipéptidos se unen de manera inespecífica. El protón de la serina se transfiere al anillo de histidina (paso 2).Quimotripsina La quimotripsina. La ruptura del enlace peptídico (paso 3) se produce en este estado activado. 12 . Nitzia Thalía Flores Jiménez. La zona indicada en marrón corresponde a la enzima. Obsérvese que este proceso es esencialmente una inversión de la formación del intermediario acilo inicial. y que la molécula de agua desempeña el papel de la parte liberada de la cadena polipeptídica. en el paso 5 se transfiere un protón a la His 57 y. y se libera el resto de la cadena polipeptídica. ¿Por qué son tan estables? Una posibilidad muy probable surge de los estudios detallados de las estructuras de rayos X de los compuestos intermedios atrapados. Cynthia Jazmín López Monteón. 2009). se une al intermediario acilo para formar un segundo estado de transición tetraédrico. que señalan que los protones amino del esqueleto de los residuos Ser 195 y Gly 193 pueden formar enlaces de hidrógeno con uno de los oxígenos del complejo tetraédrico. La enzima vuelve a su estado original y está preparada para catalizar la hidrólisis de otra cadena. Isis Avedoy Cortéz. Por último (paso 6) el protón se transfiere desde la histidina de nuevo a la Ser 195 5. De esta forma. Una clave de la catálisis de las serina proteasas se encuentra en la estabilidad de los dos estados intermedios tetraédricos. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Este oxígeno es el que estaba en el carbonilo del sustrato. y el enlace de hidrógeno puede producirse sólo con la formación del estado tetraédrico. que son muy semejantes a los estados de transición esenciales.Quimotripsina acilo y la His 57. este enlace de hidrógenos estabiliza dichos intermediarios (Mathews. a continuación. Figura 7: Catálisis de la hidrólisis del enlace peptídico por la quimotripsina. E-P2. el pnitrofenol. es el intermediario covalente y P2 el fragmento ácido del sustrato (figura 11 y 12). En general. Alicia Paulina Cárdenas Castro. seguida por la formación del producto a una velocidad mucho más lenta en régimen de estado estacionario (figura 8). 13 . Esta segunda etapa denominada desacilación. En la reacción comentada con anterioridad un grupo acetilo queda unido covalentemente al enzima. Un aspecto característico de este mecanismo es la aparición de un intermediario covalente. El enlace éster del sustrato se rompe. Esta etapa es la denominada de acilación. E-P2 es un intermediario acil-enzima (Stryer. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 1995). es mucho más lenta que la primera. pero eso es lo que determina la velocidad total de hidrólisis de ésteres por quimotripsina. el complejo acetil-enzima para producir ión acetato y regenerar el enzima (figura 10) la producción rápida explosiva inicial de p-nitrofenol corresponde a la formación del complejo acetil-enzima. La primera etapa es la combinación del acetato de p-nitrofenilo con la quimotripsina para formar el complejo enzimasustrato (ES). El agua ataca entonces. el grupo ligado a la quimotripsina EP2 es un grupo acilo. el complejo acetil-enzima es lo suficientemente estable para poder ser aislados bajo condiciones apropiadas. el mecanismo catalítico de la quimotripsina puede representarse por el esquema adyacente. Cuando se emplean grandes cantidades de enzimas se produce una explosión rápida inicial del producto pnitrofenol.Quimotripsina PARÁMETROS CINÉTICOS La quimotripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos o éster en dos etapas distintas. corresponde a la hidrólisis del complejo acetil-enzima para regenerar el enzima libre. donde P1 es el fragmento amina (o alcohol) del sustrato. Isis Avedoy Cortéz. Cynthia Jazmín López Monteón. Uno de los productos. mediante la investigación sobre la cinética de hidrólisis del acetato de p-nitrofenilo. Por ello. De esta manera. La producción más lenta de p-nitrofenol. Esto fue descubierto. en el estado estacionario. queda liberado de la enzima mientras que el grupo acetilo del sustrato queda ligado al enzima de forma covalente (figura 9). en primer lugar. De hecho. Quimotripsina Figura 8: Al mezclar quimotripsina y acetato de dos p-nitrofenilo fases en se la distinguen formación de p-nitrofenol Figura 9: Acilación: formación del intermediario acetil-enzima en la catálisis por quimotripsina. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Figura 11: Esquema del mecanismo catalítico. 14 . Figura 10: Desacilación: hidrólisis del intermediario acetil-enzima. Cynthia Jazmín López Monteón. Isis Avedoy Cortéz. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 15 . Alicia Paulina Cárdenas Castro. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Isis Avedoy Cortéz.Quimotripsina Figura 12: Catálisis covalente en el centro activo de la quimotripsina. Cynthia Jazmín López Monteón. para luego decaer. por tanto. No obstante. ¿Qué hay acerca de la base más fuerte que. la velocidad alcanza un máximo. de la que se cree que es la implicada en la actividad enzimática. ambas están libres. Si se construye el gráfico de la velocidad de hidrólisis en función del pH de la solución. Cynthia Jazmín López Monteón. El análisis secuencial del éster de la enzima demostró que el grupo acetilo del sustrato estaba unido a la Ser 195. esto es. La velocidad de la hidrólisis por la catálisis enzimática cambia con la variación de la acides del medio reaccionante.4 (el pH fisiológico) y es más lenta tanto en solución más ácida como más básica. la enzima reacciona en el grupo –OH de dicho aminoácido en particular. La hidrólisis alcanza su velocidad máxima cuando la base más débil está mayormente libre y cuando la más fuerte se encuentra casi totalmente protonada.Quimotripsina ¿Cuál es la estructura del éster intermediario que se forma con la enzima? Para dar respuesta a esto se crea una concentración estacionaria apreciable del éster intermediario. de Kb de aproximadamente 3 x 10-5. a un grupo amino α que no esté comprometido en una unión Isis Avedoy Cortéz. el examen de la conformación de la quimotripsina demuestra que hay un residuo histidina muy cercano a la Ser 195: His 57. a pH elevado (solución básica). estudios que comprenden la catálisis por medio del propio imidazol. La Kb de la base más débil iguala la del anillo imidazólico de la histidina y hay pruebas adicionales de que es efectivamente ésta la base: por ejemplo. ambas bases están protonadas. El análisis de los resultados experimentales indica lo siguiente: la hidrólisis requiere de la presencia de una base libre. se obtiene una curva con forma de campana: a medida que aumenta el pH. y de una base protonada. A pH bajo (solución ácida). estaría involucrada en forma protonada? Su Kb se ajusta al grupo amino α de la mayoría de los aminoácidos. que puede aislarse si se detiene la reacción con ácido. Ahora bien. hay pruebas de que otros residuos de aminoácidos también son vitales para la acción enzimática. Nitzia Thalía Flores Jiménez. de Kb alrededor de 10-7. Alicia Paulina Cárdenas Castro. según la cinética. 16 . La velocidad es máxima para un pH de 7. Los intermediarios tetraédricos formados se ilustran en la figura 13 (Devlin. Dado que el centro activo fija el estado de transición con una mayor afinidad que el sustrato. se supone que este grupo amino no debe acetilarse. (a) Modelo de intermedio tetraédrico #1 que precede a la formación del intermedio de acil-enzima (b) Modelo de intermedio tetraédrico #2 resultante del ataque del agua sobre el intermedio de acil-enzima. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Luego. Estabilización del estado de transición. 2004). salvo uno: isoleucina 16. Nitzia Thalía Flores Jiménez. (a) (b) Figura 13: Intermedios tetraédricos.Quimotripsina peptídica. Isis Avedoy Cortéz. pueden acetilarse todos los grupos amino (libres) en la quimotripsina. respectivamente. Cynthia Jazmín López Monteón. por acción de masas. sin que se pierda la actividad por completo. la unidad N-terminal de la cadena B. sino quedar libre para que pueda protonarse cumpliendo así con su parte de la tarea (Morrison y Boyd. la pequeña fracción de moléculas de sustrato que existe con la geometría del estado de transición será convertida rápidamente en producto. Sin embargo. Cualquier factor que incremente la población de moléculas de sustrato que se asemeja al estado de transición contribuirá a la catálisis. 17 . 1990). De este modo. todo el sustrato puede ser convertido rápidamente en producto. Nitzia Thalía Flores Jiménez. La His 57. La serina vuelve a formar un enlace de hidrógeno con la His 57 (Mckee. El paso (a) de la figura muestra el complejo inicial enzima-sustrato. se descompone para formar el intermediario acil-enzima unido covalentemente paso (c). Alicia Paulina Cárdenas Castro. En ausencia de enzimas. de períodos de reacción prolongados y de temperaturas elevadas. El estudio cuantitativo de este efecto conduce a la conclusión de que la hidrolisis del éster se verifica en dos etapas: 1) Quimotripsina + acetato de p-nitrofenilo acetil-quimotripsina + p-nitrofenol 2) Acetil-quimotripsina + H2O acetato + quimotripsina En la figura 14 se detalla de manera resumida el mecanismo de acción de la quimotripsina. la Hs 57 y la Ser 195 están alineados. se forma un intermediario tetraédrico (oxianión). que se muestra en el paso (b). 18 . se cree que facilita esta descomposición. En los pasos (d) y (e). Isis Avedoy Cortéz. El intermediario tetraédrico. promovida por la catálisis acido-base general en el centro activo (Lehninger. la hidrólisis de los enlaces peptídicos precisa de concentraciones muy elevadas de H+ o de OH-. 2003). está estabilizado por enlaces de hidrógeno con el NH amida de la Ser 195 y la Gly 193. El Asp 102. Cynthia Jazmín López Monteón. En el paso (f) (el complejo final enzima-producto) se ha roto el enlace entre el oxígeno de la serina y el carbono carbonilo. 1991). el anillo aromático del residuo de fenilalanina del sustrato está asentado en un bolsillo de unión hidrófobo. actuando como ácido general. y el enlace peptídico del sustrato tiene un enlace de hidrógeno con los grupos NH amida de la Ser 195 y la Gly 193. El oxígeno del hidroxilo nucleófilo de la Ser 195 desencadena un ataque nucleófilo sobre el carbono carbonilo. Además.Quimotripsina En resumen. se invierten los dos pasos previos. mientras que la hidrólisis de los enlaces peptídicos por la quimotripsina se realiza rápidamente a pH neutro. Con el agua actuando como nucleófilo atacante. Quimotripsina Figura 14: Mecanismo probable de la acción de la quimotripsina. 19 . Nitzia Thalía Flores Jiménez. Cynthia Jazmín López Monteón. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Isis Avedoy Cortéz. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Un inhibidor irreversible es la N-tosil-L-fenilalaninaclorometil cetona (TCPK). la reacción TCPK no se produce en urea 8M. En las enzimas inhibidas por el DFP. El grupo clorometilcetona fijado al sitio activo es un agente alquilante fuerte. La TCPK es un excelente inhibidor de la quimotripsina. el inhibidor está unido de forma covalente sólo a la Ser 195 y no a ninguna otra de las otras 29 serinas. En esta técnica. Es más. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Un residuo importante por su actividad catalítica se descubrió por medio de la marcación por afinidad. Por su semejanza con el residuo Fe (fenilalanina. 20 . La quimotripsina fija en forma específica la tosil-L-fenilalaninaclorometil cetona (TCPK) (figura 15). Estas observaciones establecen que His 57 es un residuo del sitio activo esencial de la quimotripsina. en la que se bloquea el sitio activo. o con DIP-quimotripsina. puesto que el grupo fenilo se Isis Avedoy Cortéz.Quimotripsina TIPOS DE INHIBICIÓN Las serina proteasas se inhiben de forma irreversible por el diisopropilfluorofosfato (DFP). estos análogos de sustrato reactivos se describieron como los “caballos de Troya” de la bioquímica). uno de los residuos preferidos de la quimotripsina). un inhibidor competitivo de la quimotripsina que tal vez compita con TCPK por su sitio de fijación enzimático. donde reacciona para formar un enlace covalente estable con un grupo susceptible cercano (por consiguiente. Los grupos marcados por afinidad pueden identificarse con posterioridad por un mapeo del péptido. Figura 15: TCPK. de ese modo inactiva la enzima. Cynthia Jazmín López Monteón. reacciona con His 57 (figura 16). un reactivo desnaturalizante. un análogo del sustrato que posee un grupo reactivo de fija de modo específico en el sitio activo de la enzima. La reacción TCPK es inhibida por β-fenilpropianato (figura 17). Figura 17: β-fenilpropianato. Isis Avedoy Cortéz. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Figura 16: Reacción de TCPK con quimotripsina para formar un alquilo de la His 57. colocando el cloro para el desplazamiento nucleófilo por un nitrógeno del anillo imidazol de la His 57. Cynthia Jazmín López Monteón. 21 . Alicia Paulina Cárdenas Castro.Quimotripsina ajusta exactamente en el bolsillo del lugar activo. y ii) una etapa de purificación adicional. y II) una etapa de purificación adicional que comprende los pasos de: i) montar. ajuste de la concentración final de sólidos en el orden de 20-25% y secado final -si requiere-. de tripsina y quimotripsina a partir de tejido pancreático porcion o bovino. por lo que se estudió la posibilidad de realizar su purificación mediante la utilización de resinas de intercambio hidrofóbicas. iv) suspensión con 2. ii) equilibrar la resina hidrofóbica con una Isis Avedoy Cortéz. El método de obtención comprende i) una etapa de extracción y purificación parcial. total o parcial. tienen carácter hidrofóbico. La tripsina y la quimotripsina así obtenidas. viii) activación de los zimogenos (si se requiere). Ambas proteínas. ix) diafiltración.ajustando la concentración final de sulfato de amonio a 200 g/dm3 V) precipitación mediante tratamiento con cloruro de calcio del líquido recuperado para eliminar el ion sulfato. tanto en la forma cruda como la purificada. empacar y preparar una columna cromatográfica con una resina de tipo hidrofóbica determinada. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Nitzia Thalía Flores Jiménez. vii) concentración mediante ultra filtración del líquido obtenido hasta llegar a una concentración de sólidos disueltos del 20 a 25% en peso. o para una purificación total de ambas proteínas. la cual según las condiciones de trabajo. 22 . vi. se emplean en la preparación de composiciones farmacéuticas de dosificación oral o inyectable. puede utilizarse para realizar una purificación parcial regulando las condiciones para que sólo se una la quimotripsina a la columna cromatográfica. Cynthia Jazmín López Monteón. respectivamente Un método de obtención y quimotripsina a partir de tejido pancreático animal comprende: I) una etapa de extracción y purificación parcial que comprende los pasos de: i) obtención de un extracto de páncreas ii)precipitación a partir del extracto original utilizando una concentración de sulfato de amonio que puede variar entre 360 y 400 g/dm3. iii) recuperación del sólido por filtración.2 volúmenes d agua acidulada -etapa N-.) eliminación del sólido por filtración.Quimotripsina MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Método de extracción y purificación. Tripsina y quimotripsina en las heces es un análisis fecal que pueden observar cantidades menores a lo normal en una muestra de materia fecal. 23 . vi) agregar en forma continua la solución proteica desplazando de la resina la tripsina por medio de la quimotripsina. v) pasar la solución del material a purificar hasta que la columna se sature con los componentes de la mezcla. x) colectar y reservar el material eluido para la recuperación de la tripsina.Quimotripsina solución salina a pH 3.0. iv) clarificar por filtración o centrifugación la solución del material a ser purificado obtenido en la etapa I) antes del sembrado de la columna.0-5.0. vii) lavar la columna con una solución en condiciones salinas y de pH idénticas a las de la siembra.0. xiii) A) si el material de origen estaba activado. ix) eluir el material retenido en la columna por medio del agregado de una solución salina de 80-120 g/dm3 y a pH3. Nitzia Thalía Flores Jiménez. o B) si el material de origen no estaba previamente activado. Determinación de quimotripsina en las heces fecales. concentrar ambas soluciones por separado hasta una concentración de sólidos del orden de 20%.0-3. tripsina y quimotripsina.0-5-0. Los pasos del método son los siguientes: Isis Avedoy Cortéz. xii) colectar y reservar el material eluido para la recuperación de la quimotripsina. un test directo de función pancreática en la que se valora la capacidad secretora del páncreas exocrino. iii) se ajusta la concentración salina del material crudo a purificar de 80 a 220/ g/dm3 y a pH 3. acidular los líquidos obtenidos a pH 3.0-5.0-5. Cynthia Jazmín López Monteón. viii) descartar el material que eluyó de la columna durante la etapa de siembra y lavado. activar hasta llegar a la actividad específica buscada. El test se conoce como “Secretina-Ceruleina (CCK-Pz). La tripsina y la quimotripsina (como lo hemos descrito) son sustancias secretadas desde el páncreas durante la digestión normal y cuando este órgano no las produce en cantidad suficiente puede existir un problema pancreático. Alicia Paulina Cárdenas Castro. concentrar y secar ambas soluciones hasta llegar a un residuo en forma de polvo.5. dializar y secar hasta obtener cada una de las proteínas al estado de polvo. xi) eluir el material retenido en la columna por medio del agregado de agua acidulada a pH 3. Administrar secretina-ceruleina (CCK-Pz) I. Cynthia Jazmín López Monteón.Quimotripsina Precisa intubar al paciente con una sonda de doble luz a estómago y duodeno. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 24 . quimotripsina. Se recoge la secreción pancreática.V. Alicia Paulina Cárdenas Castro. lipasa y bicarbonatos. Isis Avedoy Cortéz. Se determina en ella volumen. ya que se utiliza dichas enzimas para formular antitrombióticos. (Kembhavi et al. 1993) clarificación de cerveza. concentrados proteicos y producción de hidrolizados proteicos.. además de emplearse enzimas proteolíticas en la síntesis enzimática de péptidos y ésteres con actividad biológica y formulación de los llamados detergentes biológicos (Prado et al. ya que pueden ser utilizadas en procesos productivos como en la industria de los detergentes. 1999). Vázquez et al.Quimotripsina USOS INDUSTRIALES La importancia de las proteasas radica en su gran inclusión en el mercado al constituir uno de los grupos más importantes de las enzimas industriales debido a que ocupan una posición primaria en el campo comercial.. 25 . 1993) por lo que han adquirido especial relevancia. de alimentos y del cuero (Smith y Brekke. 2004) fabricación de productos fermentados de soya y de pescado. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Otros usos son el depilado de pieles en curtiduría y la recuperación de la plata de las películas fotográficas y radiográficas ya utilizadas. 1984). esto es con la finalidad de lograr una hidrolisis más completa. (Kembhavi et al. (Sánchez. galletería. En las industrias de producción de alimentos más del 60 % de las enzimas utilizadas son proteasas por poseer aplicaciones más prácticas y variadas ya que ocasionalmente son combinadas con péptidasas. ablandadores de carne. Las proteasas son ampliamente utilizadas para la fabricación de bebidas. saborizantes. así como en la elaboración de quesos. 2008). adicionalmente una variedad de proteasas contienen importantes aplicaciones farmacéuticas (la quimotripsina) (Chandrasekaran y Dhar 1986. panificaciones. Cynthia Jazmín López Monteón. Isis Avedoy Cortéz. aceleradores de la coagulación sanguínea y para la activación del plasiminógeno. coadyuvantes digestivos. síntesis del aspartame. antiinflamatorios. Alicia Paulina Cárdenas Castro... Además de se aplica de manera importante en la industria farmacéutica. Cynthia Jazmín López Monteón. tras ello se liberan los productos. muchas preguntas que resolver y más soluciones médicas qué proponer. uno o más sustratos se unen al lugar activo de una enzima. se han realizado grandes logros en la industria alimentaria y farmacéutica. todo ello y mucho más se encuentra estrictamente operado. La quimotripsina es una enzima digestiva que se encuentra bien estudiada y gracias a ello. Alicia Paulina Cárdenas Castro. En la catálisis enzimática. Nitzia Thalía Flores Jiménez. y por esto. las enzimas son proteínas. mecanismo. Isis Avedoy Cortéz. regulado y finalizado. se debe dar más impulso e interés en la investigación del funcionamiento biológico y bioquímico del cuerpo humano pues aún falta mucho por descubrir. La mayoría. para formar el complejo enzima-sustrato. las enzimas forman parte de la dinámica de la vida. son parte fundamental de la catálisis y control de las reacciones bioquímicas y la falta de una sola de ellas podría traer consecuencias fatales. El cuerpo humano es considerando la “máquina perfecta” pues las millones de reacciones que ocurren en el organismo día a día. Aunque el cerebro sea el órgano que coordine el cuerpo humano y sus funciones. las funciones que realizan todos los órganos. 26 . sin embargo.Quimotripsina CONCLUSIONES Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan las velocidades de los procesos bioquímicos mientras se mantienen inalteradas. aunque no todas. etc. tuvieron que pasar más de 50 años para encontrar cómo es su estructura. Páginas: 222-224. 1997. 450-452. hidrolizando los enlaces peptídicos con diferentes grados de intensidad y de selectividad. Alicia Paulina Cárdenas Castro. con la consecuente eliminación de una molécula de agua (Guadix et al. Isis Avedoy Cortéz. Argentina. Manual de técnicas de histoquímica básica. L. C. Editorial Pearson. Página: 533 y 535. M. Editorial Reverté.. Páginas: 416-419. 446-448. C. K. 27 . Ediciones Omega. Mckee. Cuarta edición. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 434. y Mckee. España. Editorial McGrawHill. T. España. R. Páginas: 415. 1998. Editorial Pearson. Un enlace peptídico es la unión que se realiza entre el grupo ácido de un aminoácido con el grupo amino de otro.uadec. Cynthia Jazmín López Monteón. L. México. Cuarta edición. y colaboradores. Mathews. Tercera edición. Morrison y Boyd. Bioquímica. Quinta edición.mx/CienciaCierta/CC27/6. 1995. Fecha de consulta: 4 de mayo del 2013. http://www. Lehninger. Bioquímica. Bioquímica. J. Editorial MÉDICA panamericana. Montero. Stryer.html. 2004. Editorial Universitaria Potosina.postgradoeinvestigacion. México. México 2009. 2003. Página: 122. Bioquímica.. Páginas: 227-250. Bioquímica. Editorial Reverté. Bioquímica.T. 2003). Química Orgánica. REFERENCIAS 1 Las enzimas proteolíticas (comúnmente llamadas proteasas) pertenecen al grupo de las hidrolasas (Guadix et al. España. Voet. 2006. Decimoquinta reimpresión. Tercera edición. México. 2000). 2000) ya que degradan las cadenas polipeptídicas de las proteínas-sustrato (Carrera. A.Quimotripsina BIBLIOGRAFÍA Devlin. Páginas: 1357-1358. 1991. Páginas: 186-188. Tercera edición. la presencia de una sola molécula activa de tripsina podría poner en marcha toda la cadena de manera prematura… [ ] Las enzimas activas inician entonces una digestión del propio tejido pancreático. denominado pancreatitis aguda. Cynthia Jazmín López Monteón. es decir. “Intercatenarios” es entre cadenas distintas. se fomenta la abstracción de un protón por el grupo imidazol). El grupo carboxilo del Asp 102 polariza a la His 57. El anillo imidazol de la His 57 se encuentra entre el grupo carboxilo del Asp 102 y el grupo –CH2OH de la Ser 195. es extremadamente doloroso y a veces resulta mortal. Isis Avedoy Cortéz. 5 La reactividad especial de la Ser 195 se atribuye a la proximidad de la His 57 y del Asp 102. 4 Dado que la activación de la tripsina puede ser autocatalítica. por ejemplo). Esta recomendación es adoptada por Barret et al. Aunque en algunos textos siguen denominándolas proteasas. son los puentes que se dan entre aminoácidos de las distintas cadenas. 3 Los puentes intercatenarios estabilizan la estructura cuaternaria. permitiéndolo de esta manera actuar como una base general (es decir. cuando existe una proteína conformada por más de una cadena polipeptídica (la hemoglobina.Quimotripsina 2 La Enzyme Commission (EC) del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB. El trastorno. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Alicia Paulina Cárdenas Castro. 28 . 1992) recomienda el término general peptidasas para todas las enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos. (1998) en un tratado actual sobre el tema.