PURIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS.Sin perjuicio que un preparado enzimático puede consistir en el mismo extracto o caldo fermentado que sólo se somete a una clarificación y concentración (preparado liquido) o desecación (preparado sólido) se recurre también a métodos de aislamiento y purificación de enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos: Adsorción selectiva con hidróxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no todas las proteínas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con agua o solución salina y luego sé eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante otra solución salina, por ejemplo, de fosfato. Por precipitación, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adición de sales a cierto pH y a elevada concentración iónica o por solventes orgánicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La sal más usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la viscosidad de la solución. Diálisis por gradientes de concentración a través de membranas semipermeables. Ultrafiltración por aspiración o presión a través de membranas de porosidad fina como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura . Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidón, agar o dextrano. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en columna con intercambiadores iónicos, geles o tamices moleculares. Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensión, cataforesis y electrodiálisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas. El control de todas estas etapas en su forma más rigurosa, es necesario para asegurar el máximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimáticos obtenidos. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificación. A) MÉTODOS DE ESTIMACIÓN - UNIDADES El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorársela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y después de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Sólo en términos cuantitativos se puede saber si se ha producido algún progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima está dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una operación rápida; es preferible sacrificar precisión por rapidez en las determinaciones. Pueden encontrarse a) en “solución” dentro de una memrana y pueden ser extraídas después de la . etc. estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. lapureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminación de los componentes particulados. en forma cuantitativa. Para estudios mecanísticos generales. por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. B) FUENTE DE LA ENZIMA La actividad de una enzima varía considerablemente en diferente organismos y aún en los diversos tejidos de un mismo organismo. La unidad enzimática se define en forma particular para cada reacción según sea conveniente.). de modo que la velocidad sea independiente de la concentración de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima. dado que la mayoría de las enzimas se deterioran rápidamente. En estos casos. una enzima puede estar presente en una proporción de 1/10 a 1/100 del material total. mitocondrias. La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas. Enzimas en solución verdadera en el citoplasma. concentración. La ruptura de las células en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio. A veces resultará conveniente la medición de la aparición de un producto y otras la medición de la desaparición de sustrato.La naturaleza del ensayo dependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. II. particularmente en tejidos animales. En general. Es necesario usarlo en concentración tal que sature la enzima. en los tejidos. la fuente debe ser fresca. La elección del sustrato es muy importante: debe ser barato. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas. de fácil determinación. Frecuentemente una buena elección de la fuente de enzima permite simplificar la extracción y purificación de la enzima. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada cantidad de producto (desaparición de reactivo) en un tiempo dado. debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura. pH. Es necesario definir una unidad enzimática arbitraria para poder expresar. C) IMPORTANCIA DE LA LOCALIZACION INTRACELULAR DE LA ENZIMA Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos: I. etc. d) Desintegración química: se utilizan agentes que atacan la pared celular. . En general. licuadora. riñón. D) EXTRACCION DE ENZIMAS Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solución son a menudo críticas y requieren el estudio de muchas variables. que implica la destrucción de la célula y el pasaje de las enzimas a solución o suspensión.9%. isopentanol.destrucción de la misma. Al descongelarse. mortero. a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina. Para pasarlas a solución debe disociarse el complejo. eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras moléculas. isotónico (sacarosa 0. b) Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca cambios de presión de miles de atmósferas.15 M) o ligeramente hipertónico. El conocimiento de la localización intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extracción diferencial que facilitan la purificación. de la naturaleza de las mismas depende el método a emplear. el primer paso consiste en la obtención de un homogenato. destruyendo la estructura. que rompen la pared celular. para determinados tejidos animales (bazo. b) asociadas a material lipoproteico insoluble. c) Desintegración t¬érmica: El congelamiento y descongelamiento rápidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. en un buffer adecuado para controlar el pH. KCl 0. a veces. éter de petróleo. Es necesario destruir las células. NaCl 0. Esto puede llevarse a cabo por: a) Homogenización mecánica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio. como el etanol. las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido. arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado. en muchos complejos enzimáticos están involucradas fuerzas específicas. A veces es necesario pasarlas a solución como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificación. eritrocitos). Por congelación se forman cristales de hielo intracelulares.25 M. Aunque la dispersión de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecánicos. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza acetona en frío. La elección de un determinado procedimiento es un problema de prueba y error: hay que probar procedimientos y seleccionar. generalmente por centrifugación. Una centrifugación diferencial permite la separación del homogenato en varias fracciones. El primer paso consiste en la separación de los distintos componentes intracelulares. Un esquema tipo es el siguiente: Cada una de las fracciones precipitadas puede tratarse con agentes químicos para solubilizar las enzimas que fuesen particuladas. Los procesos de purificación utilizan las técnicas clásicas de fraccionamiento proteico y pueden basarse en el movimiento de sustancias en una fase líquida (electroforesis o filtración en geles) o en la transición de sustancias de una fase a otra (cromatografía o precipitación). E) PURIFICACION Los métodos a elegir dependen de la fuente biológica y de la concentración de la enzima. En general. ya sea en forma sucesiva o interpolando otros pasos.e) Homogeneización por deshidratación: se basa en la precipitación de proteínas por solventes orgánicos. Las partículas que difieren en densidad o tamaño sedimentan a distintas velocidades por aplicación de una fuerza centrífuga (campo gravitacional. g). A partir de aquí comienza la purificación. la repetición de un paso es ventajoso. aunque a . y se basan en las distintas propiedades fisicoquímicas de las proteínas. Una vez llevado a cabo un paso satisfactorio. que se haga al principio. es lógico. por lo tanto. Existen sin embargo ciertas restricciones que hacen que haya un orden lógico. el calentamiento tiene por objeto eliminar grandes cantidades de proteínas inespecíficas y no requiere el agregado de grandes volúmenes de líquido. la cantidad de material resultante debe ser manejable antes de pasar al paso posterior. Para calcular el grado de purificación. o bien porque no aumenta el grado de purificación. debe obtenerse primero el valor de actividad específica alcanzado en cada paso. pueden investigarse con métodos analíticos la homogeneidad y pureza de la preparación obtenida. Aparentemente los métodos pueden usarse en cualquier orden y el mejor orden se determina experimentalmente. G) CRITERIOS DE HOMOGENEIDAD Cuando una purificación enzimática ha alcanzado la etapa donde posteriores purificaciones o pasos no producen un incremento en la actividad específica. Si se considera la actividad específica inicial como unidad de purificación. deben calcularse la recuperación y el grado de purificación alcanzados. Por ejemplo. Considerando las unidades enzimáticas totales de la etapa inicial como el 100% puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales.veces provoca grandes pérdidas de actividad total. Pueden utilizarse . F) ANÁLISIS DE LOS DATOS Para juzgar si un método de purificación es adecuado. En muchos casos no es practicable por la inestabilidad de la enzima o por la presencia de enzimas proteolíticas que la dañarían mucho al elevar la temperatura. el grado de purificación de cada etapa se calcula haciendo el cociente entre la actividad específica de dicha etapa y la del primer paso. .métodos cromatográficos. focalización isoeléctrica. La obtención de un único pico proteico es indicativo de homogeneidad. si esto ha sido comprobado por varios métodos. electroforesis. ultracentrifugación.
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