Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas, a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol25 de Mayo de 2012 Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas, a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol M. en C. Escalante Rendiz Diana Yamily, Br. Chin Lizama Reina Guadalupe, Br. Muñoz González Dalia Selene, Br. Osorio Tuz Mariana Azucena, Br. Solís Uicab Ilse Victoria, Universidad Autónoma de Yucatán, Facultad de Ingeniería Química, Microbiología General 25 de Mayo de 2012 Resumen La contaminación de los suelos por la presencia de agentes tóxicos como los plaguicidas constituye un problema ambiental. Actualmente la recuperación de suelos degradados con la acción de microorganismos constituye una estrategia potencialmente viable. A partir del suelo de un plantío de papaya Maradol, se aislaron cepas del género Pseudomonas capaces de degradar plaguicida. La muestra tomada del suelo del municipio de Dzidzantún, Yucatán, se sometió a un cultivo de enriquecimiento con el plaguicida organofosforado, Dimetoato (Ditiofusfato de O,O-dimetilo, S-(N-metilcarbanol) metilo), como única fuente de carbono, para consecuentemente aislar los microorganismos en medios de cultivo King A y King B. Para la identificación de los microorganismos pertenecientes a este género, se realizaron pruebas macroscópicas, bioquímicas y fisiológicas. Se obtuvieron 20 cepas de las cuales, las cepas P06 y P09 dieron resultados que coinciden con las características correspondientes al género Pseudomonas. Palabras clave: Pseudomonas, plaguicida, papaya Maradol, biodegradación. Introducción Los plaguicidas (herbicidas, fungicidas, insecticidas) sonbiocidas y, por lo tanto son sustancias tóxicas y peligrosas. Esta peligrosidad afecta al medio ambiente y al consumidor. Son ampliamente utilizados en la agricultura y la industria en todo el mundo debido a su alta actividad (Mostafa, 2010), lo que ocasiona su 1 y muestran una alta capacidad de reacción a señales físico-químicas y biológicas (Cornelis. tomando la parte del suelo ubicada entre 4 y 10 cm de profundidad (Cornelis. de muestra. Son capaces de procesar. Por consiguiente. et al. Para el cultivo de enriquecimiento se tomó 250 g de la muestra de suelo y se le añadió 250mL de agua mineral no 2 . flores y frutos. que van desde tratamientos físicos hasta tratamientos biológicos y procesos avanzados de oxidación. 2007). 2008). por lo que es evidente que se requiere de altos niveles de fertilización y uso de plaguicidas en períodos cortos. Son bacilos gram negativos. aerobios. Las bacterias del género Pseudomonas sintetizan una cantidad de enzimas inusualmente grande y pueden metabolizar una amplia variedad de sustratos. Se mezcló una porción de la rizósfera de 3 plantas diferentes. 1998). de bajo costo y eficientes para la eliminación in situ de estos contaminantes en el ambiente (OMS. las plantas. son cultivos de alta actividad fisiológica durante la mayor parte de su vida.. dada la producción temprana y abundante. 2002). los cuales sean capaces de degradar los plaguicidas utilizados en dicho cultivo. Una de las medidas biocorrectoras más empleadas es la utilización de microorganismos para la descontaminación de suelos (Marivela. por lo que es urgente el desarrollo de tecnologías simples. es probable que contribuyan de manera significativa a la descomposición de sustancias químicas poco frecuentes.Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas. a partir de suelos en plantíos de papaya. 2005). Existen diversas tecnologías para la destrucción de plaguicidas. como los de la papaya Maradol. 2006). Algunos cultivos. et al. como plaguicidas. Se recolectaron aproximadamente 500 g. Habitan en el agua dulce. se busca obtener Pseudomonas spp. en la tierra y en los alimentos que ingerimos (Escriche. 8 horas antes de su análisis en el laboratorio. 2007). Materiales y Métodos La muestra de suelo se tomó de un plantío de papaya Maradol ubicado en el municipio de Dzidzantún. pues en ella coinciden el rápido crecimiento. que se agregan al suelo (Tortora. Ésta se almacenó en una bolsa estéril hasta el momento de su procesamiento. el suelo. Yucatán. a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol 25 de Mayo de 2012 presencia en el agua. El uso indiscriminado de estos compuestos ha producido que en la actualidad se detecten sus residuos en el ambiente. Por lo tanto en este estudio. et al. materia orgánica en descomposición y aguas negras (Fontanillas. en el aire. Están ampliamente distribuidas en la naturaleza. 2008). et al. que se mueven por medio de flagelos polares (Tortora. la emisión de hojas. integrar y reaccionar a una amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio ambiente. et al. 1. . Para la purificación se tomó cada una de las colonias con apariencia distinta y se sembró por la técnica de estrías en su medio correspondiente. 0. a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol 25 de Mayo de 2012 carbonatada esterilizada. El medio de cultivo King B se preparó con la siguiente composición en g/L: Triptona de soya. 0. se realizaron las siguientes pruebas: Tinción de Gram. motilidad. dando prioridad a las que presentaron fluorescencia y coloración amarilla en King B. MIO y reducción de nitratos.Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas. (Guía Uruguaya para la protección y fertilización vegetal). Para la identificación de las colonias aisladas en los medios King A y King B. 2004).S-(N-metilcarbanol)metilo). 1.03. 2005).1mL y se sembró por triplicado mediante la técnica de extensión en placa sobre el agar King A y King B. . 15 (PseudomonasagarF ). 10. 1. 0. la existencia de microorganismos capaces de degradar el plaguicida Dimetoato (Ditiofusfato de O. . 0. En el medio King B se debe observar un pigmento de color amarillo. amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o se extiende por todo el medio (Romero. 20. Comprobando así.O-dimetilo. TSI. la cual se esterilizó. Al agua mineral se le agregaron 200 μl de plaguicida Dimetoato (Ditiofusfato de O.5. polipeptona 10.73. se realizaron diluciones seriadas tomando 1mL de la solución anterior (primera dilución) y se mezcló con 9mL de agua mineral estéril hasta obtener una dilución de10-5. De cada una de las diluciones se tomó 0. agar. agar. se tomaron 10mL del cultivo de enriquecimiento y se mezclaron con 90mL de agua mineral no carbonatada esterilizada. sulfato de magnesio.03. Para el aislamiento de las colonias. S-(N-metilcarbanol) metilo) y se homogeneizó para dar una concentración final de 800 ppm.4.02.5. 1.1. Resultados y Discusiones Se observó crecimiento en los medios de cultivo King A y King B. 1999). oxidasa. En el medio de cultivo King A se debe observar un resultado positivo con la aparición de pigmentos de piocianina (zona de color azul. azul-verdoso que rodea la colonia) y/o piorrubina (zona de color rojo alrededor de la colonia).Se incubó el cultivo durante 3 días en una incubadora a 37+ 2°C con agitación constante (Santacruz. catalasa.O-dimetilo. El medio de cultivo King A se preparó con la siguiente composición en g/L: peptona de gelatina. . et al. fosfato dipotásico. sulfato de potasio. 0.68: . .a 121°C por 15 minutos (Carrillo. 1. 10. LIA. con composición en g/L: . 15 (Pseudomonas agar P). cloruro de magnesio. Se han realizado estudios que demuestran la capacidad del género Pseudomonas spp como las bacterias más efectivas para la 3 . A partir de esta nueva solución. provenientes del medio de enriquecimiento que contenía plaguicida como única fuente de carbono. 2008). en su estudio realizado utilizando las técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) y un novedoso modelo que consistía en un serie de cuarzo de cristal piezoeléctrico (SPQC) fueron exitosamente aplicados para monitorear la degradación del dimetoato. rojos. a 15 se les realizó Tinción de Gram para identificar los posibles microorganismos pertenecientes al género de Pseudomonas. usado como única fuente de carbono. además. compuestos orgánicos derivados del petróleo y compuestos organoclorados u organofosfatados (Cornelis. Las 5 restantes no mostraron un aislamiento adecuado para realizarles pruebas de identificación En la Tabla 1. gracias a que estos microorganismos se alimentan a partir de los átomos de carbono del plaguicida. Según Xiang. se indican las características morfológicas y los resultados de la Tinción Gram de las diferentes cepas aisladas. 2008). ya que algunas especies de Pseudomonas pueden presentar colonias lisas. a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol 25 de Mayo de 2012 degradación de las compuestos tóxicos derivados de las plaguicidas. Características macroscópicas de la colonia Características Microscópicas Tinción Gram Forma Color P01 P02 P03 P04 P05 P06 + + + + King B King B King B King B King B King B Amarillo huevo Blanca Blanca Blanca Transparente Blanca Amarillo Apariencia Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa Tamaño 1mm 2mm 1 ½ mm 2 ½ mm 1 mm 2mm Forma Redonda Redonda Redonda Redonda Redonda Redonda • • • • + - • • • • Bacilos cortos y anchos Bacilos largos 4 . 1999). redondas. destrozando las cadenas químicas que formaban las compuestos tóxicos hasta transfórmalos en moléculas de CO2 y agua (Colin y Beyer. De los microorganismos obtenidos. (2009). et al. azules. se purificaron 20 cepas. con pigmentos verdes. Otros estudios. mucoides. al menos parcialmente. contienen Cepas Fluorescencia Medio de Cultivo plásmidos en las que se encuentran codificadas enzimas capaces de degradar. han demostrado que varias especies de Pseudomonas spp. en el crecimiento de una especie de Pseudomonas (P. Puede observarse que no se tomó un solo tipo de colonia. en este estudio se observó que altas concentraciones del plaguicida puede tener un efecto contraproducente en el crecimiento de este microorganismo debido a que la concentración máxima de tolerancia del plaguicida es del 2%.Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas. rugosas. negros o/y amarillos en agar King A y coloración amarilla en King B (Romero. aeroginosa). alargadas. Con la prueba de Tinción Gram (Tabla 1) fue posible seleccionar las primeras cepas. con células de una longitud que varía de 1 a 5 µm y un espesor de 0. a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol 25 de Mayo de 2012 P07 P08 P09 + + - King B King B King B King B transparente Blanca Amarillo huevo Amarillo transparente Amarillo huevo Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa con halo transparente alrededor colonia Cremosa Cremosa Cremosa 3mm 1 ½ mm 3 mm Amorfa Redonda Redonda - y delgados Bacilos largos Bacilos largo Bacilos largos P10 - 1mm Amorfa + Bacilos corto y delgado Bacilos pequeño Bacilos con esporas Bacilos cortos y chicos en cadenas Bacilos pequeños y cortos Bacilos cortos Bacilos largos Bacilos cortos P11 P12 P13 + - King B King B King A Blanca Blanca Crema transparente Blanca transparente Blanca Crema Blanca Blanca Crema transparente Amarillo huevo 2 ½ mm 1 ½ mm 3 mm Redonda Redonda Amorfa + - King A P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 King A King A King A King A King A King A Cremosa Cremosa Seca Seca c/grumos Cremosa Seca Cremosa 1 mm 1 mm ½ cm 1mm 2 mm 1mm ½ mm Redonda Redonda Amorfa Amorfa Redonda Redonda Redonda + + + • + - • Bacilos largos Bacilos largos pequeños Tabla 1.-Características macroscópicas y microscópicas de las 20 cepas aisladas • El crecimiento de la cepa no fue adecuado para la realización de pruebas bioquímicas. et al. rectos o ligeramente curveados (Figura 1.Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas. 5 . que posiblemente pertenecían al género de Pseudomonas. pues éste grupo de bacterias tienen la característica de ser Gram Negativos (Cornelis. la mayor parte de estas bacterias presentan forma de bacilos delgados. 2009). 2008).5 a 1 µm (Forbes.e). Además. P08.* + + + P10 + + + + + + + Pseudomonas spp. Los bacilos de a. Ocho de las quince cepas resultaron ser Gram Negativos. es decir gran positivo y negativo. Tinción Gram. lo que sugiere una contaminación.La imagen c) muestra dos colores.Indol(No hay cambio de color) +Ornitrinadescarboxilasa(No hay cambio de color) 6 .. + + + + + Movilidad (Difusión del crecimiento en la línea de siembra) . (MacFaddin. 2000). P08. Los resultados de las pruebas bioquímicas se enuncian en la siguiente tabla: Tabla 2. Pruebas/ Cepas Oxidasa Catalasa Motilidad Reducción nitratos LIA (Descarboxilación lisina) Motilidad MIO Indol Ornitol P06 + + + + + P08 + + + + + + P09 + + + +. P09 y P10 tenían forma de bacilos largos y pequeños (Figura 1). Por consecuente. b y c son más largos que los de d . a)P06b)P08 c)P09 d)P10 e) Pseudomona aeruginosa ( Centers for Disease Control and Prevention (CDC)) En las 5 imágenes se observan bacilos delgados.Comparación de los resultados de las cepas P06. se realizaron las demás pruebas bioquímicas a estas cuatro cepas. y de éstas sólo las cepas P06. con los resultados comunes en Pseudomonas ssp. P09 Y P10 en las pruebas bioquímicas.Observación microscópica. a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol 25 de Mayo de 2012 Figura 1..Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas. ésta cepa tuvo la capacidad de sobrevivir en una solución con una concentración de 800ppm de plaguicida Dimetoato. para conocer su capacidad de degradación sobre éstos. Conclusión Se logró la obtención de una cepa P06. no se puede determinar que sean o no de éste género hasta haber realizado una prueba biológica molecular. que permita el uso sustentable de los suelos expuestos a este tipo de plaguicidas. la cual posee una gran probabilidad de pertenecer al género Pseudomonas. Por tanto. De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 2. a pesar de coincidir con las características de este grupo de bacterias. las cepas P08 Y P10 no pueden pertenecer al género de Pseudomonas. permitiendo diferenciarla de las demás Pseudomonas. En todas las cepas el resultado fue el mismo en ambas muestras. hay una alta probabilidad de que P06 y P09 pertenezcan al género de Pseudomonas. pues no hay fermentación de azucares (MacFaddin. con los resultados comunes en Pseudomonas. Sin embargo. con P09 sería conveniente realizar otra purificación para un nuevo análisis. La diferencia entre los resultados de la cepa P06 en la prueba LIA. así como someterla a otros plaguicidas. Las Pseudomonas son bacterias no fermentadoras. Algunos estudios sobre esta especie. en la prueba TSI.Obtención de cepas del género Pseudomonas degradadoras de plaguicidas. radica en la posibilidad de que la cepa pertenece a una especie como la P. 2005). 2003). Con esto se busca una posible alternativa para la bioremedación. usando la Subunidad ADNr 16S. 2006). presentaron cambios de coloración del medio. et al. a partir de suelos en plantíos de papaya Maradol 25 de Mayo de 2012 Glucosa TSI Lactosa Sacarosa - + + - + + - * Las pruebas se realizaron por duplicado. Oryzihabitans. (Tayeb L.Así mismo. donde se obtuvieron resultados diferentes en cada muestra. por lo que el medio de TSI no debe mostrar cambio de coloración. Seria conveniente realizar en un estudio posterior. pues. es decir. 7 . una cinética de la degradación del plaguicida Dimetoato por la cepa aislada. codificada para el gen rrs o 16S ADNr para la identificación de los microorganismos pertenecientes a este género (Gillespie y Hawkey. indican que se obtienen resultados diferentes en las pruebas bioquímicas aplicadas a ésta. la fermentación de sacarosa y lactosa. a excepción de P09. (2006).htm[20 12. Gillespie S.britanialab. Disponible en: http://www. Pseudomonas agar F. Lilia A. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica (3ª ed. (2a Ed.. Gestión Del Autocontrol en la Industria Agroalimentaria. 5. 69-75.). Arias. II Simposio Internacional Sobre Agricultura Sostenible. identificación y evaluación de un cultivo mixto de microorganismos con capacidad para degradar DDT. The Open Electrochemistry Journal: 2.España: Médica panamericana. 14. (2006). (2010).).Funkey Case. MacFaddin. H. E. 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