PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA (INFORME) 2004 INTRODUCCIÓN Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia orgánica a partir de elementos inorgánicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medio en que se encuentren, y de ahí que en el interior de estos ocurran una serie de reacciones de síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las cuales reciben el nombre de metabolismo. A partir de estas características metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la identificación de microorganismos y productos obtenidos de la relación microorganismomedio. Otro de los aspectos importantes de la realización de estas pruebas, es que a partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación de los alimentos por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímica han proporcionado una herramienta útil para la detección directa de los microorganismos contaminantes. La identificación bacteriana se puede realizar por medio de una serie de análisis que necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies bacterianas que contaminan los alimentos o las aguas. A continuación, se desarrollan diferentes técnicas para la identificación de algunos microorganismos y productos obtenidos en la relación ya mencionada, microorganismomedio. OBJETIVOS OBJETIVO GENERALES Realizar y analizar las diferentes técnicas de identificación bacteriana. OBJETIVOS ESPECIFICOS Caracterizar en cada medio de cultivo el fundamento de la técnica empleada. Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una previa interpretación. 1. TEORÍA RELACIONADA Metabolismo Bacteriano La capacidad de utilizar y transformar la energía es una de las propiedades fundamentales de los sistemas vivientes. La energía puede hallarse en muchas formas, pero aprovechables a los organismos vivos solo muy pocas. La energía mecánica se libera, por ejemplo, durante movimiento celular, agitación de cilios y flagelos, y las alteraciones de la forma celular; la energía electromagnética se encuentra en forma de radiaciones (la luz es la fuente de energía primaria para los organismos sintéticos como las algas y las plantas), la energía térmica es producida por la agitación molecular y, la energía química que es la contenida en los enlaces de sustancias y puede ser liberada de los compuestos orgánicos e inorgánicos a través de ciertas reacciones. Las reacciones químicas son acompañadas por cambios en el nivel energético. La energía requerida para que una reacción inicie se llama energía de activación. Otros aspectos importantes a considerar es la necesidad de la célula de poseer, además de catalizadores, una reserva de energía, esta servirá para los procesos de síntesis celular y en la conversión de sustratos a formar actividades. En la célula ocurre dos importantes y opuestos procesos, y la generación de energía y utilización de ella en los procesos de síntesis celular, los cuales constituyen el metabolismo, este es la suma de transformaciones de la materia que ocurre en el interior de las células y que da lugar a la síntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas. El metabolismo puede dividirse para su mejor estudio en tres aspectos diferentes pero íntimamente ligados; el catabolismo que es la suma de reacciones exergónicas que permiten liberar la energía contenida en los nutrientes o sustratos y ser acumuladas en forma de ATP, u otros compuestos, el metabolismo intermedio que es el conjunto de reacciones de los productos de hidrólisis del catabolismo y algunos nutrientes son transformados en ácidos orgánicos, esteres fosfóricos y otros compuestos como aminoácidos, y el anabolismo que es la parte del metabolismo implicado en la síntesis e macromoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, sustancias de reserva y otros, todos reacciones endergónicas). Ensayos Bioquímicos La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados. Los sistemas comerciales más comúnmente usados son: * BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas. * OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas. * API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana. Otros sistemas: Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias. API 10S, versión miniaturizada del API 20 E API Listeria API NH (Neisseria - Haemophilus) Existen también sistemas de identificación comerciales para levaduras: API 20 C (Para levaduras del género Candida) Auxacolor de Diagnostics Pasteur Fongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificación de levaduras de interés médico) b) En la Cátedra se desarrolló un sistema para la identificación de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioquímicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies más frecuentemente aisladas de muestras clínicas. Está integrado por las siguientes pruebas: producción de H2S en agar triple azúcar hierro (TSI), fenilialanina deaminasa, producción de indol, descarboxilación de lisina, descarboxilación de ornitina, crecimiento en citrato, fermentación de arabinosa, fermentación de sorbitol y producción de acetoína (VP). En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica: 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación. 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existe una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente. 1) Enzimas vinculadas con la respiración a) oxidasa b) catalasa 2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros 2.1) Requerimientos de oxígeno OF (óxido-fermentación) Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Producción de ácido, o ácido y gas Fermentación de carbohidratos 2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico) d) Esculina e) Hipurato 3) Fuente única de carbono a) citrato b) malonato c) hipurato para coliformes 4) Utilización de compuestos nitrogenados 4.1) Reducción de nitrato a) asimilación b) denitrificación 4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros a) indol b) H2S c) Fenilalanina d) Lisina, arginina, ornitina e) Urea 5) Ensayos combinados a) TSI (Triple Azúcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina 6) Detección de exoenzimas a) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas e) desoxirribonucleasas f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas) 7) Misceláneos a) KCN b) Bilis c) producción de pigmentos 8) Test de crecimiento o inhibición a) Temperatura b) NaCl c) Antibióticos 2. FLUJOGRAM AS 2.1 TSI o KIA Sembrar en medio Incubar Observar resultados 2.2 CITRATO Sembrar en medio Incubar Observar resultados 2.3 INDOL Sembrar en medio Incubar Agregar reactivo Agitar Observar resultados 2.4 ROJO DE METILO Sembrar en medio Incubar Caldo RM.VP 37ºC, (2-4días) Caldo peptona tripticasa 37ºC, (24,48h) Kovacs Simmons Citrato 37ºC, (24,48,72h) TSI o KIA 37ºC por 24h Agregar indicador Observar resultados 2.5 DESCARBOXILASA Sembrar en medio Incubar Observar resultados 2.6 VOGES PROSKAUER Sembrar en medio Incubar Agregar 0.6ml ∞Naftol al 5% Agregar 0.2ml ∞KOH al 40% Agitar Exponer al aire Observar resultados 2.7 MOTILIDAD Y H2S Sembrar en medio Incubar Agregar reactivo Agitar rojo de metilo LIA 37ºC, (28-48horas) Caldo RM.VP 37ºC, (2-4días) 15 min SIM 37ºC, (28-48horas) Kovacs Observar resultados 2.8 CAT ALASA Extraer colonias Colocar en portaobjetos Agregar H2O2 Observar resultados 2.9 UREASA Sembrar en medio Incubar Observar resultados 2.10 GELATINAZA Sembrar en medio Utilizar un tubo de control Incubar Observar resultados 37ºC, (1-5días) gelatina urea Christensen 37ºC, (1-6días) TABLA DE RESULTADOS Pruebas bioquímicas TS I Medios de cultivos TSI Rango de pH 7,4 ± 0,2 Indicador Rojo de fenol Color inicial Rojo oscuro Color final Negro Resultado + KLIGER Citrato Indol Kliger Simmons citrato Caldo peptona tripticasa Caldo RM VP LIA Caldo RM VP SIM 6,9 ± 0,1 6.9 Rojo de fenol Azul de bromotimol Kovacs Café vino Verde Incoloro Café vino Azul(pico de flauta) y verde(profundidad) Rosado sin anillo + - Rojo de metilo Descarboxilasa Voges proskauer Motilidad y H2S Rojo de metilo Púrpura de bromocresol Anaranjado Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Rojo (superficie) y amarillo(fondo) Amarillo coaguloso(superficie) y negro(fondo) + + Tiosullfato de sodio y sulfato ferroso Amarillo Catalasa Gelatinaza Ureasa Nitrato Baird parker agar H2O2 Gelatina Urea Christensen Nitrato Baird parker agar M ac Conkey Hektoen Enteric Agar Endo C 6.8± 0.2 7.1 ± 0.1 7.7± 0,1. 7.4 ± 0.2 Rojo de fenol Griess-ilosvay y Kovacs Cloruro de lítio y telurito Rojo neutro Azul de bromotimol y fucsina ácida Fucsinasulfito Amarillo Amarillo transparente Piel de ante transparente Amarillas (colonias) Amarillas (colonias) Amarillas (colonias). Amarillas (colonias) Blanco efervescente Amarillo transparente fucsia Amarillo Café oscuro (colonias) + + + Mac Conkey Hektoen Enteric Agar Endo C Rosado (colonias) + + Negro con verde brillante(colonias) Rojo (colonias) + ANÁLISIS DE RESULTADOS Las pruebas bioquímicas realizadas en el laboratorio arrojaron los siguientes resultados: En la prueba TSI (hierro tres azucares) el medio está constituido por tres azucares: lactosa, glucosa y sacarosa, de las cuales la lactosa y la sacarosa se fermentan en medio aerobio y la glucosa en medio anaerobio. Al inocular el microorganismo (Pseudomona) se observó una coloración café-amarillo en el pico de flauta lo cual indica la producción de ácido por la fermentación de los tres azucares y negro en la profundidad que demuestra la formación de H2S, además se observó un rompimiento del medio lo que indica la desprendimiento de gas (CO 2 y H2). (ver anexo 1) Para la prueba Kliger, el medio ya se encontraba de un color café vino y con rompimiento, al inocular la Pseudomona no mostró cambio alguno. Por lo tanto, no podemos sacar conclusiones, de ahí que los resultados sean negativos, pues consideramos que el medio no estaba en condiciones óptimas para realizar esta prueba. (ver anexo 2) En la prueba citrato, el medio simmons citrato con la Pseudomona se notó un cambio de color de verde a azul en el pico de flauta y verde en la profundidad, por lo tanto hubo proliferación de microorganismos, estos utilizaron el citrato presente en el medio como fuente de carbono para la realización de sus reacciones metabólicas, por lo tanto el resultado fue positivo. (ver anexo 3) La prueba de Indol realizada con la E. Coli fue negativa, después de habérsele adicionado el reactivo de kovacs, no presentó ningún anillo, lo que indica que el microorganismo no desdobló el triptófano presente en el caldo peptona tripticasa para convertirlo en Indol.(ver anexo 4) La prueba rojo de metilo realizada al microorganismo E. Coli se observó un color amarillo, lo que indica la incapacidad del organismo de producir ácidos a partir de la fermentación de la glucosa, siendo la prueba negativa.(ver anexo 5) En la prueba de descarboxilasa realizada con el microorganismo Pseudomona no presentó cambio de color, se puede considerar como especie LD negativa debido a que no origina aumento alguno del pH y por lo tanto, no se produce un viraje del indicador a causa del débil crecimiento condicionado por este motivo.(ver anexo 6) En la prueba Voges-Proskauer, se observó un anillo rojo en la superficie lo que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto es una prueba VP positiva.(ver anexo 7) En la prueba de Motilidad y H2S, con la inoculación de la Pseudomona, presentó un color amarillo coaguloso en la parte superior, lo que indica motilidad a lo largo de dicho canal, y un negro en el fondo que se refiere a la formación de H2S.(ver anexo 8) Para la catalasa, realizada con Pseudomona, la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva, esto quiere decir que hay presencia de la enzima catalasa.(ver anexo 9) En la prueba ureasa, el resultado fue positivo. la degradación de la urea produce amoniaco e hizo variar el color del indicador de piel de ante a fucsia, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.(ver anexo 10) En la prueba gelatinaza, arrojó un resultado negativo debido a que no se licuó e medio gelatina.(ver anexo 11) En la prueba del nitrato, la reacción fue negativa lo que indica que no se ha producido degradación alguna del nitrito o que este se ha reducido hasta nitrógeno o hasta amoniaco.(ver anexo 12) En la prueba de baird-parker, las colonias se observaron café oscuro con halos claros, por lo tanto se considera un prueba positiva.(ver anexo 13) En la prueba de MacConkey, se produjeron colonias rosas, el aislado fue capaz de fermentar la Lactosa, por tanto la prueba resultó positiva.(ver anexo 14) En la prueba de Hektoen Enteric Agar, el resultado dió positivo, se vió una coloración negra en las colonias, lo que indica que eran H2S positivas.(ver anexo 15) Para la prueba de Endo C, se observó una coloración rojas en las colonias debido a que el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, el resultado de esta prueba fue positiva.(ver anexo 16) PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Fundamento de las pruebas realizadas TSI (Triple Sugar Iron) El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de enterobacterias. El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia. La porción inclinada del tubo que está expuesta al oxígeno atmosférico tiende a tornarse alcalina (roja por el rojo fenol) por la utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo, donde no hay oxígeno, la degradación proteica es mínima y se pueden detectar pequeñas cantidades de ácido por la aparición de un color amarillo (indicador: rojo fenol). En ausencia de fermentación de carbohidratos, no se formarán ácidos y por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo. Esto se da en organismos no fermentadores. El medio está diseñado de tal forma que la glucosa se encuentra en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación a partir de la glucosa será baja porque la concentración de glucosa es baja. Al principio se producirá viraje del indicador al amarillo en tubo, pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la degradación aerobia de las peptonas antes descrita. Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares es 10 veces mayor, se producirá mayor cantidad de ácido que no puede ser revirado por la producción de aminas en la superficie por metabolismo aerobio. La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitar el Fe +2 del sulfato ferroso. Como esta reacción se da sólo en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la producción de gas, como burbujas en el fondo del tubo. Microorganismos Escherichia coli Citrobacter freundi Enterobacter cloacae Shigella flexneri Salmonella thyphimurium Salmonella enteriditis Proteus mirabilis Proteus vulgaris Crecimiento Bueno Bueno Bueno Bueno Bueno Bueno Bueno Bueno Columna vertical Amarillo Amarillo y negro Amarillo Amarillo Amarillo-negro Amarillo-negro Amarillo-negro Amarillo -negro Sup inclinada For de H2S Amarillo Amarillo + Amarillo Rojo Rojo + Rojo + Rojo + Amarillo + Interpretación Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc) No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras. Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/H 2S +) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Pico ácido/fondo ácido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-. AGAR KLIGER Medio nutritivo de ensayo, para identificación de bacterias intestinales gram negativas. pH: 7.4±0.1 La degradación de azúcar, con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador o por un viraje de tojo intenso en caso de alcalinización. CITRATO La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. CRECIMIENTO Positivo: medio de cultivo Azul oscuro Negativo o inhibido MICROORGANISMOS Citratos - positivos: Enterobacter, S. parathyphi, S. enteriditis, S. typhimurium, Arizona. Klebsiella, Serratia. Citratos – negativos: Shigella, Escherichia, S. paratyphi y otros. Interpretación El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. INDOL El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich descriptos más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente Interpretación El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. ROJO DE METILO Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H 2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. Reacción cromática De anaranjado a rojo De anaranjado a amarillo Rojo (positivo) Sin reacción (negativo) Interpretación Microorganismos Eschericha coli citrobacter y otros Enterobacter aerogenes Enterbacter cloacae Enterobacter coli La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. DESCARBOXILASAS Medio de cultivo LIA se utiliza para la demostración simultánea de lisina descarboxilasa de la formación de sulfuro de hidrógeno. Sirve para identificación bioquímica de enterobacterianceas. Este medio de cultivo ajustado a pH 6, muestra un color amarillo debido a su contenido en púrpura de bromocresol, que actúa como indicador de pH. A este pH las enterobacterias, solo crecen escasamente, las especies LD positivas lo alteran debido a la formación de cadaverina por descarboxilación de la lisina cerca del punto de la neutralización, produciéndose condiciones más favorables para el crecimiento. Este efecto conlleva un viraje de pH, que pasa de amarillo a violeta, las especies con capacidad para reducir el tiosulfato formando ácido sulfhídrico, causan el ennegrecimiento del medio cultivo violeta, por la precipitación del sulfuro de hierro que tiene lugar. Las especies LD negativas no originan aumento alguno del pH y por lo tanto, no se produce un viraje del indicador a causa del débil crecimiento condicionado por este motivo, las especies H2S positivas tampoco producen ácido sulfhídrico. Las especies LD negativas no pueden ser reconocidas como tales. Colonias Negras – eventualmente con la zona limítrofe visible en tono violeta Violeta Amarillo sin alteración de color: crecimiento retardado. VOGES-PROSKAUER En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Interpretación Microorganismos LD-positivos: Salmonella y Edwardsiella. LD-positivos y H2S negativos: Escherichia, Klebsiella, Hafnia. LD-negativos: Shigella, Citrobacter, Enterobacter, Proteus. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva. MOTILIDAD Y H2S Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formación del sulfuro, la formación de indol y motilidad en el marco del diagnóstico de entero bacteriaceas. El medio de cultivo es ampliamente recomendado para el análisis de alimentos. La motilidad se pone de manifiesto de turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicho canal. La formación de H 2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento, la demostración del indol se demostrará mediante el reactivo según Kovacs. La formación del indol da lugar a una coloración rojopúrpura de la capa del reactivo. Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles. Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+). Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+). MICROORGANISMOS Escherichia Enterobacter Klebsiella Salmonella Serratia Shigella H2S + - INDOL + +/- MOTILIDAD +/+ + + - CAT ALASA La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Químicamente, la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción: H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-) Interpretación 1. Prueba cualitativa: la rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. 2. Prueba semicuantitativa: las determinaciones cuantitativas de catalasa se llevan a cabo más comúnmente en la identificación de micobacterias. Se mide la altura que alcanza la formación de burbujas de gas en el tubo, luego de añadir el peróxido de hidrógeno. Una columna de burbujas de 50 mm o más, se considera una reacción fuertemente positiva. UREASA Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa. Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación. Colonias Rojo-fucsia Amarillo Microorganismos Urea – positivos: Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Urea – negativos: Shigella, Salmonella, Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Providencia. GELATINAZA Para la determinación del número total de gérmenes y para la investigación, en aguas de gérmenes que licuan la gelatina. Hay aparición de halos de aclaración alrededor de las colonias que licuan la gelatina. Microorganismos Escherichia coli Proteus vulgaris Staphilococcus aureus Enterococcus faecalis Bacillus cereus Caldo Nitrato Cuotas de recuperación (%) 170 170 170 170 170 Medio de cultivo de ensayo para la demostración de la reducción del nitrato y formación del indol con los correspondientes reactivos en la identificación bioquímica de microorganismos. La coloración roja corresponde a la cantidad de nitratos formada. Si la reacción es fuerte el color pasa de rojo a amarillo. La reacción negativa indica que no se ha producido degradación alguna del nitrito o que este se ha reducido hasta nitrógeno o hasta amoniaco. Baird parker agar Para el aislamiento y la diferenciación de estafilococos en materiales y materiales farmacéuticos. Este medio de cultivo contiene cloruro de lítio y telurito para la inhibición de la flora acompañante, en tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de estafilococos. Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de estafilococos muestran dos características diagnósticas por lipólisis y proteolisis, se producen halos y anillos característicos y, debido a la reducción del telurito a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-positividad, y por tanto, pueden utilizarse como índice de esta última. Colonias Negras, lustrosas, convexas, con borde extrecho blanquecino, rodeado por un halo claro. Negras, lustrosas, pero de forma irregular. Crecimiento ocasional: muy pequeñas, pardas hasta negras, ausencia de halos de clarificación. Pardo-oscuras, mates, presencia a veces de halos de clarificación. Blancas sin halos de clarificación. MacConkey Microorganismos Staphilococcus aureus. Staphilococcus epidermis. Micrococcus. Bacillus. Levaduras. Medio selectivo para BGN. Lactosa+indicador El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la detección de organismos coliformes y patógenos entéricos. La fórmula del agar MacConkey II se diseñó especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el “swarming” de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la combinación de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contario. LECTURA: colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa) Hektoen Enteric Agar Agar selectivo para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas. Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosapositivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosanegativas. Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante, y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias H2S positivas. Una mezcla de sales biliares inhiben a una gran parte de la flora acompañante. Las placas con medio de cultivo son claras y de color azul-verdoso. Endo-C Agar Medio selectivo para la demostración y aislamiento de E. Coli fecal y coliformes. El sulfito sódico y la fucsina inhiben a las bacterias grampositivas. E. Coli y coliformes consumen lactosa formando aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloración roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reacción es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la fucsina cristalizada). Las placas con medio de cultivo son claras y casi incoloras. Si una placa con medio de cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso, puede eliminarse dicho exceso de rojo añadiendo algunas gotas de una solución recién preparada al 10% de sulfito sódico anhidro. Por la acción del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por lo tanto, inservible. Incluso conservando en la oscuridad y a la temperatura de nevera, solo es utilizable durante pocos días. BIBLIOGRAFIA http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html MARTINEZ SILVA, Jorge y coautores. Microbiología General. Ed. Pueblo y educación. Playa ciudad de la Habana. 1989 Manual de medios de cultivos Merck. MURRAY y otros. Bioquímica de Harper. ED. Manual moderno S.A. MéxicoBogota. 1993 CONCLUSIÓN Las pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. A partir de las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana, mediante estándares establecidos, podemos conocer que bacteria tenemos en una muestra problema basándonos en sus reacciones metabólicas las cuales son características de cada microorganismo. Son funciones especificas del metabolismo: o o o o Obtención de energía para los procesos celulares. Conversión de los compuestos nutritivos en precursores de los componentes celulares. Organización de esas macromoléculas en polímeros. Formación y degradación de las biomoléculas necesarias para las funciones especializadas de la célula.
Report "PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA - 26 pp"