UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAESCUELA DE POST GRADO MAESTRIA EN TECNOLOGIA DE ALIMENTOS PROYECTO DE TESIS: “CARACTERIZACION TOXICOLOGICA Y DE LA PRESENCIA DE ALERGENOS EN TORTA DE MORINGA (Moringa oleífera)” EJECUTOR: Lady Nathaly Comettant Cruzado ASESOR: Marcial I. Silva Jaimes La Molina, 2014 I. INTRODUCCION Moringa oleifera, árbol perteneciente a la familia Moringaceae, es nativo de las estribaciones meridionales del Himalaya y en la actualidad se cultiva prácticamente en todas las regiones tropicales, subtropicales y semiáridas del mundo. Puede crecer en condiciones de escasez de agua, pero su cultivo intensivo, con irrigación y fertilización, aumenta los rendimientos de biomasa hasta superar las 100 toneladas por hectárea (Foidl, Makkar y Becker, 2001). Se conoce por diferentes nombres vernáculos, tales como: marango, moringa, resedá, árbol de rábano, árbol de la baqueta, ángela, árbol de los espárragos, árbol de las perlas, árbol "ben", árbol de la vida y árbol de los milagros (Fuglie, 2001). Este último nombre es una medida de la importancia de esta planta para solucionar problemas de salud que, de otra manera, podrían considerarse incurables. Desde hace milenios, prácticamente todas las partes de M. oleifera han sido utilizadas por el hombre. Las hojas, las flores, los frutos y las raíces son apreciados por su valor nutritivo y pueden ser usados tanto en la alimentación humana como en la animal. Las hojas son excepcionalmente ricas en vitaminas y diferentes aminoácidos, por lo que se recomiendan para tratar problemas de malnutrición en niños (Fuglie, 2001). También se emplean como forraje, biopesticida y para la producción de biogás (Fahey, 2005). Las semillas se utilizan en la alimentación, la medicina, el tratamiento de aguas y como fertilizantes (Foidl et al., 2001). El aceite se usa en la industria de perfumería y la de cosméticos como lubricante, en la alimentación humana y en la producción de biodiesel (Rashid, Anwar, Moser, y Knothe, 2008). Las cascarillas de las semillas sirven de materia prima para la producción de carbón activado y de intercambiadores aniónicos. La planta también se emplea como cerca viva o cortina rompevientos, mientras que la biomasa lignocelulósica del tronco y de las ramas puede ser utilizada como material de construcción y para producir pulpa celulósica y etanol (Fahey, 2005). II. PROBLEMA DE LA INVESTIGACION 2.1 Problema Principal 2.2 Problemas específicos III. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION 3.1 Objetivo principal Determinar las características fisicoquímicas de la torta de Moringa oleifera. 3.2 Objetivo Específico. Determinar la toxicidad de la torta del Moringa oleifera. Evaluar las características fisicoquímicas del mejor tratamiento para la obtención de la torta de Moringa oleifera. IV. JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION El término "desnutrición (malnutrición) proteico-energética" es relativamente nuevo, esta condición era anteriormente conocida como "deficiencia proteico- energética o calórica", este término incluye una variedad de condiciones que varía de una situación leve o moderada a una situación severa (marasmo o kwashiorkor). La desnutrición proteico-energética es uno de los problemas nutricionales más importante en los niños en países en desarrollo. Este problema se encuentra también en la mayoría de los países de América Latina y el Caribe, se presenta en los niños que consumen una cantidad insuficiente de alimentos para satisfacer sus necesidades de energía y nutrientes. La deficiencia de energía es la causa principal. La primera manifestación importante de este problema nutricional es una detención del crecimiento (los niños son más pequeños en estatura y tienen un menor peso que otros niños de la misma edad). Este proceso se encuentra frecuentemente agravado por la presencia de infecciones. Los niños que presentan desnutrición proteico-energética tienen menos energía para realizar sus actividades diarias, aprenden con dificultad y presentan baja resistencia a las infecciones. La desnutrición proteico-energética (DPE) se presenta con una mayor frecuencia y gravedad en los países que tienen elevados índices de pobreza y de inseguridad alimentaria. Los niños que presentan desnutrición proteico-energética provienen generalmente de familias pobres de las zonas rurales y urbanas, en algunos países existen regiones o comunidades donde la pobreza está muy extendida y este problema puede alcanzar una gran proporción de la población infantil y pre-escolar. Las familias que no disponen de suficientes alimentos durante todo el año para el consumo familiar, ya sea por una insuficiente producción de alimentos (áreas rurales) o por tener muy bajos ingresos (áreas urbanas) son las más susceptibles a la DPE. Otra causa importante, cuando no hay una limitación de recursos en la familia, puede ser el desconocimiento de las bases de una alimentación adecuada y sobre todo de las necesidades particulares de energía y nutrientes que tienen los niños. Los niños (lactantes y preescolares) son los grupos más vulnerables a la malnutrición. Las mujeres embarazadas y en período de lactancia constituyen otro grupo de riesgo, juntamente con las personas de la tercera edad y aquéllas que están en período de recuperación de algunas enfermedades. La DPE afecta con mayor intensidad a los niños pequeños, sobre todo a partir de los cuatro o seis meses, período en que la leche materna, hasta ese momento alimento exclusivo del niño, es complementada con otros alimentos. El problema puede ser mayor cuando el niño no recibe leche materna o cuando ésta es insuficiente, ya que dependerá mucho del suplemento de la leche que se proveerá al niño, además de las condiciones de higiene y la cantidad. Se debe tener un cuidado especial con los alimentos que se utilicen para el destete (cuando se suspende la lactancia materna), ya que éstos deben proporcionar toda la energía y los nutrientes que se necesitan para el desarrollo y crecimiento normal del niño. V. MARCO TEORICO 5.1 Moringa. Moringa oleifera Lam., conocido comúnmente como Marango, resedá, árbol de rábano (horseradish tree), árbol de baqueta (drumstick tree), ángela, árbol de los espárragos, árbol de las perlas, árbol "ben", Bean oil tree y por varios otros nombres, es un árbol miembro de la familia Moringaceae que crece en el trópico y es originaria del sur del Himalaya, noreste de India, Pakistán, Bangladesh y Afganistán (Makkar y Becker, 1997). La Moringa es un árbol siempreverde o deciduo de tamaño pequeño y crecimiento acelerado que usualmente alcanza de 10 a 12 m de alto. Tiene una copa abierta y esparcida de ramas inclinadas y frágiles, un follaje plumoso de hojas pinadas en tres, y una corteza gruesa, blanquecina y de aspecto corchoso. Se valora principalmente por sus frutas, hojas, flores, raíces, todas comestibles, y por el aceite (también comestible) obtenido de las semillas. Se usa extensamente en la medicina tradicional en las áreas en donde es nativo y en donde ha sido introducido (John A. Parrota). Las hojas de la Moringa fueron recientemente identificadas por el World Vegetable Center (Taiwan) como el vegetal con el más alto valor nutricional entre 120 tipos de especies alimenticias estudiadas. Fácil de cultivar y resistente a las sequías, este árbol produce gran cantidad de hojas con alto concentrado en proteínas, vitaminas y minerales: 100 gramos de hoja fresca de Moringa proveen la misma cantidad de proteína que un huevo, tanto hierro como un bistec, tanta Vitamina C como una naranja y tanto calcio como un vaso de leche. La moringa se está revelando como un recurso de primer orden y bajo coste de producción para prevenir la desnutrición y múltiples patologías, como la ceguera infantil, asociadas a carencias de vitaminas y elementos esenciales en la dieta. Esta planta tiene un futuro prometedor en la industria dietética y como alimento proteico para deportistas especialmente atendiendo a su carácter de alimento natural. Otras ventajas añadidas son su carácter ornamental, su gran velocidad de crecimiento, su facilidad de cultivo, su capacidad de aceptar grandes podas y su gran rusticidad. Además tiene otros múltiples usos que detallamos más adelante. Los antiguos escritores Sánscritos la conocían como una planta medicinal. Escritos Hindúes antiguos que datan de años anteriores a 150 AC se refieren a la planta Moringa y a sus usos. Los primeros Romanos, Griegos y Egipcios apreciaban la Moringa por sus propiedades terapéuticas, y también la utilizaban para proteger la piel, hacer perfumes y purificar el agua para beber. La misma Biblia en el libro del Éxodos 15:22-27 se refiere a la planta como purificadora del agua del Mar Rojo. En el siglo 19, plantaciones de Moringa en el Caribe exportaron el aceite de la planta hacia Europa para perfumes y lubricantes para maquinaria. La Moringa ha estado dando pasos agigantados en varias sociedades por miles de años. Sus remedios han pasado de generación en generación en medicina casera. La Moringa es ciertamente uno de los descubrimientos más recientes de la ciencia moderna. En América Latina y Centroamérica la Moringa o Marango se introdujo y naturalizó en 1920 como un árbol ornamental y fue utilizado como cerca viva y cortinas rompe vientos. Moringa oleífera es un excelente floculante natural para purificación de aguas, energético, fuente de materia prima de celulosa y de hormonas reguladoras de crecimiento vegetal; usos en los cuales existen investigaciones en marcha. Las partes más útiles de Moringa son las hojas y vainas. Las hojas, un vegetal popular, ricas en vitaminas y minerales también pueden tomarse como en té. Los médicos las recomiendan especialmente a las madres lactantes. La semilla de Moringa contiene un 35 % de aceite. Es un aceite de muy alta calidad, poco viscoso y dulce, con un 73 % de ácido oleico, de calidad por tanto similar al aceite de oliva. Empleado en cocina, no se vuelve rancio, muy bueno para aliño de ensaladas. También puede tener interesantes aplicaciones en lubricación de mecanismos y fabricación de jabón y cosméticos. Este aceite arde sin producir humo, es apto por tanto como combustible para lámparas. Los subproductos derivados del procesado de la semilla forman una torta muy indicada como fertilizante natural con un alto contenido en nitrógeno. Las hojas de Moringa constituyen uno de los forrajes más completos que se puedan imaginar. Muy ricas en proteína, vitaminas y minerales y con una palatabilidad excelente las hojas son ávidamente consumida por todo tipo de animales: rumiantes, camellos, cerdos, aves, incluso carpas, tilapias y otros peces herbívoros. Tabla 1. Clasificación taxonómica de la Moringa TAXONOMIA Familia Moringceas. Origen Capparidales. Clase Magnoleopesida. Genero Moringa Especies arborea concanensis drocanensis drouhardii hildebrandtii pygmeae peregrina ovalaifolia rospoliana stenopetala rivae oleifera borziana Se la conoce con diferentes nombres triviales como: Behenbaum (alemán); West Indian ben (inglés); Benzolive (francés); Sándalo cerúleo (italiano); Moringuiera (Portugal); Cedra (Brasil); Árbol del ben, Morango, Moringa (español); Dandalonbin (Burma); Ángela (Colombia); Marango (Costa Rica); Palo Jeringa, Palo de Tambor (Cuba); Palo de abejas (República Dominicana); Tebebrinto ( El Salvador); Sajina (Fiji); Perlas, Paraíso blanco (Guatemala); Saijhan (Guyana); Benzolive, Benzolivier, Ben oleifere (Haiti); Maranga calalu (Honduras); Sahijna, Sarinjna (Hindú); Kalor, Kelor (Indonesia); Névrédé (Malí); Marengo (Nicaragua); Jacinto (Panamá); Malunkai (Filipinas); Resada, Ben, Jasmín francés (Puerto Rico); Nébéday, Sap-Sap (Senegal); Dangap (Somalia); Murunga (Sri Lanka); Ruwag, Alim (Sudán); Kelor (Surinam); La mu (Taiwán); Mlonge (Tanzania); Mupulanga, Zakalanda (Zimbabwe). VI. METODOLOGIA 6.1 Tipo de investigación.- Descriptivo transversal 6.2 Formulación de la hipótesis.- No hay hipótesis 6.3 Identificación de variables.- Variable independiente: Variable dependiente: 6.4 Definiciones operacionales 6.4.1 Materia Prima.- Como materia prima se utilizo harina de moringa desgrasada. 6.4.2 Determinación de humedad, ceniza y grasa. Se determinara de acuerdo de los métodos estándar de la A.O.A.C. (1980). 6.4.3 Determinación de contenido de fibras.- El contenido en fibra total se determinó mediante el método enzimático-gravimétrico (Lee et al., 1992). Las muestras (1 g) se homogeneizaron en 40 ml de Mes 50 mM, Tris 50 mM, pH 8.2 y sucesivamente se digirieron con 50 |µl de una solución de a-amilasa termoestable (15 min a 95° C), 100 µl de una solución de proteasa, 50 mg/ml (30 min a 60° C) y 300 µl de una solución de amiloglucosidasa (30 min a 60° C).Tras la digestión, las muestras se filtraron por filtros con tamaño de poro de 40-60 µm y el residuo insoluble se pesó y secó determinándose el contenido proteico y de cenizas. El porcentaje en fibra total se calculó con la siguiente formula: Fibra total (%)= [residuo insoluble (g) – proteína (g) – cenizas(g)] muestra (g) x 100 6.4.4. Determinación de lípidos libres Para la determinación de lípidos libres, la harina o el aislado se extrajo con hexano durante 6 horas a temperatura ambiente con una relación harina: disolvente 1:10 (p/v) 6.4.5 Determinación de lípidos asociados.- Los lípidos asociados se extrajeron siguiendo el método de Nash et al. (1967). Para ello, el aislado proteico fue extraído con etanol del 86% en proporción 1:25 (p:v) a T ambiente durante 36 horas. 6.4.6 Determinación de azucares solubles.- La cantidad de azúcares solubles fue determinada mediante el método de Dubois et al. (1956). Para ello, 5 g de la harina desengrasada fueron extraídos con 200 mi de etanol del 95% mediante agitación durante dos horas a temperatura ambiente. Tras centrifugar a 4000 X g durante 15 min, el sobrenadante fue filtrado a través de papel Whatman n.-1. Los azúcares solubles se estimaron colorimétricamente usando una curva estándar de glucosa. 6.4.7. Determinación de polifenoles.- Se realizó a partir de un extracto etanólico obtenido de forma similar al utilizado para la determinación de los azúcares solubles. El volumen de etanol se redujo a 25 mi mediante concentración en vacío. La muestra se filtró por papel Whatman n°1, utilizándose alícuotas para medir la absorbancia a 324 nm. La cantidad de compuestos fenólicos se determinó como equivalentes de ácido clorogénico (Moeres et al., 1948) 6.4.8 Determinación de sólidos disueltos.- Los sólidos disueltos se determinaron por gravimetría llevando a sequedad un extracto etanólico del 95%. 6.4.9 Absorción del agua Se determinó de acuerdo con Sosuiski (1962). Para ello las muestras (3 g) se mezclaron con 25 mi de agua y se agitaron 6 veces durante 1 min a intervalos de 10 min. La mezcla se centrifugó a lOOOxg durante 25 min, el sobrenadante se desechó y el residuo se calentó en un horno a 50° C durante 25 min para eliminar el resto del agua no absorbida. A continuación el residuo se pesó y la absorción de agua se expresó como gramos de agua absorbida por 100 gramos de muestra. 6.4.10 Absorción de aceite Se siguió el método de Lin et al. (1974). Para ello, muestras de 0.5 g se mezclaron con 6 mi de aceite de moringa y se dejaron en reposo durante 30 min. La mezcla se centrifugó a 1600xg durante 25 min y se midió el volumen del sobrenadante. Los resultados se expresaron como gramos de grasa absorbida por 100 g de muestra. 6.4.11 Contenido en nitrógeno no proteico.- La determinación del nitrógeno no proteico se realizó mediante el método de Bhatty et al. (1973). Para ello la harina fue extraída con etanol del 70% en una proporción 1:40 (p:v). Se agitó durante una hora a temperatura ambiente y se centrifugó a 4000xg durante 10 min. En el sobrenadante se determinó el contenido en nitrógeno por el método de Kjeldahl (AOAC 1975). 6.4.12 Contenido en nitrógeno proteico.- La determinación de nitrógeno total se realizó según el método de Kjeldahl (AOAC 1975). El contenido en nitrógeno proteico se obtuvo por la diferencia con el no proteico. Se utilizó el factor 6.25 para obtener las cantidades proteicas correspondientes. 6.4.13 Digestibilidad proteica in Vitro Se evaluó de acuerdo al método de Hsu et al. (1997). Las soluciones proteicas (6.25 mg/ml en agua destilada) se ajustaron a pH 8 con NaOH 0.1 N agitándose durante dos horas a 37° C en un baño. La mezcla de proteasas (1.6 mg tripsina, 3.1 mg quimiotripsina y 1.3 mg peptidasa/ml) se mantuvo en hielo y se ajustó también a pH 8 con 0.1 N NaOH. La solución de enzimas se añadió a la de proteínas en una relación 1:10 (v:v), registrándose la disminución de pH tras un período de 10 min. El porcentaje de digestibilidad proteica (Y) se calculó a partir de la ecuación Y=210.47- 18. 1X, donde X representa el valor de pH tras 10 min (Hsu et al., 1977). 6.4.14.- Análisis de aminoácidos Las muestras (10 mg) se hidrolizaron con 4 mi de HCI 6N. Las soluciones se incubaron en atmósfera de nitrógeno durante 24h a 100° C. Los aminoácidos se determinaron mediante hidrólisis acida, tras derivatización con dietil etoximetilenemalonato, mediante HPLC de acuerdo con el método de Alaiz et al. (1992), usando el ácido D,L-a-aminobutírico como estándar interno. Las pérdidas de aminoácidos sensibles a la hidrólisis acida se consideraron para una cuantificación precisa. El equipo de HPLC consistió en un multisistema Model 600E con un detector 484 UV-Vis (Waters, Milford, MA). La separación se realizó con una columna de fase reversa 300 x 3.9 mm I.D. (Novapack Ci8, 4|j, Waters) utilizando un sistema de gradiente binario. Los solventes usados fueron (A) 25 mM acetato de sodio con 0.02% azida sódica (pH 6) y (B) acetonitrilo. Los solventes se inyectaron en la columna con un flujo de 0.9 ml/min de la siguiente forma: tiempo 0-3, min, gradiente linear de A:B (91:9) a A:B (86:14); 3-13 min, elución con A:B (86:14); 13-30 min, gradiente linear de A:B (86:14) a A:B (69:31); 30-35 min, elución con A:B (69:31). La columna se mantuvo a 18° C con un controlador de temperatura (Julabo F1O). 6.4.15 Determinación del punto isoeléctrico La harina desengrasada de colza se extrajo tres veces con NaOH 0.2% en una relación 1:10 (p:v). Los extractos se centrifugaron a 4000xg durante 20 min. Se reunieron los sobrenadantes y se determinó el nitrógeno total. A continuación se tomaron alícuotas que se llevaron a diferentes pHs desde 2.5 hasta 6.5 a intervalos de 0.5 unidades de pH. Se centrifugaron estas alícuotas a 4000xg durante 20 min. y se recuperaron los sobrenadantes en los que se determinó el nitrógeno. Con estos valores, referidos al extracto alcalino de partida, se determinó el punto isoeléctrico. 6.5 Diseño de la investigación En la figura 1 se muestra el sistema de obtención de aislado de proteínas de moringa. La HCD recibe primero un pretratamiento con el objeto de reducir los contenidos de compuestos no deseables en el producto final tales como fibras, azúcares reductores, polifenoles, sales o lípidos. Dicho tratamiento consiste en cuatro lavados con agua, seguido de un proceso de flotación-sedimentación. A continuación se realizan dos lavados con etanol al 20%, para disminuir los contenidos en polifenoles. El concentrado proteico así obtenido es extraído en medio básico usando NaOH al 0.2% o H2SO3 al 0.25%. Con estas soluciones se extraen aproximadamente el 60% de las proteínas (Tabla I). En general, el rendimiento obtenido con los distintos sistemas probados es inferior al obtenido con otros productos, que ronda el 75%. Probablemente, el tratamiento previo para la extracción del aceite desnaturaliza parcialmente las proteínas, provocando un descenso de su solubilidad debido a la aparición en la superficie de grupos hidrófobos y a la agregación de moléculas desplegadas Cuando se extraen las proteínas con NaOH en una relación 1:10, el rendimiento de la primera extracciónes menor que usando la relación 1:20, debido probablemente a su alta viscosidad. Aunque el rendimiento del proceso es menor con H2SO3 mejora el proceso de extracción desde un punto de vista de la calidad del aislado obtenido. Impidiendo la formación de puentes disulfuro. Además, éste se oxida en lugar de los polifenoles previniendo la formación de quinonas y el oscurecimiento del aislado proteico. A continuación, las proteínas solubles así extraídas se precipitan llevando la solución al punto isoeléctrico de éstas (pH 5). El rendimiento de esta precipitación se aproxima al 60% debido a que la colza presenta proteínas con un amplio rango de pl, obteniéndose a pH 5 una cantidad elevada de compuestos proteicos en solución. El precipitado obtenido es lavado sucesivamente con agua, etanol y acetona para eliminar los restos de compuestos solubles no proteicos que pudieran quedar en el mismo, obteniéndose un aislado de proteínas que es filtrado y secado, pudiendo ser utilizado directamente en la producción de hidrolizados proteicos. Lavados con agua y etanol al 20% Centrifugación Extracción básica x 3 Centrifugación Precipitación proteica a pH5 Centrifugación Secado Figura 1 Proceso de obtención de un aislado proteico de moringa HARINA DE MORINGA DESENGRASADA Compuestos solubles (sobrenadante) Concentrado Proteico Proteinas Solubles (Sobrenadante) Compuestos no solubles Aislado de Proteinas Sobrenadante Aislado de proteinas seco VII. CRONOGRAMA VIII. PRESUPUESTO IX. COLABORADORES X. REFERENCIAS BIBLOGRAFICAS Braddock, R. J. (1999). Handbook of citrus by-products and processing technology. New York: John Wiley & Sons. pp. 53–83. Chambi. 2009. Actividad antirradical de taninos hidrolizados de tara (Caesalpinia spinosa) y su eficacia antioxidante en aceite de soya. Tesis - Facultad De Ingeniería De Procesos. Universidad Nacional De San Agustín De Arequipa. Clifford, M.; Stoupi, S y Kuhnert, N. 2007. Profiling and Characterization by LC-MSn of the Galloylquinic Acids of Green Tea, Tara Tannin, and Tannic Acid. J. 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