Proyecto de investigación 4 de Abril ULTIMAACTUALIZACION

Universidad Autónoma Metropolitana-XochimilcoCiencias Biológicas y de la Salud Departamento de Sistemas Biológicos Carrera: Químico Farmacéutico Biólogo Módulo V: Obtención de materias primas para la producción de medicamentos Proyecto de investigación “Aislamiento y extracción del aceite esencial de Citrus sinensis y determinación de la citotoxicidad en el modelo de Artemia salina” Equipo No. 1 García Bautista Natalia García Luis Claudia Hernández Altamirano Gerardo Peña Rodríguez Zuri Saraí 2112032856 2112031644 2113059557 2112032730 Profesor: M. en C. Israel Velázquez Martínez Fecha de entrega: 1/03/2013 Introducción La mayoría de los aceites esenciales tienen muy baja toxicidad para el hombre, un ejemplo de ellos es el aceite esencial que se obtiene de la piel fresca de la naranja Citrus sinensis, el cual tiene un 90% de d- limoneno, citral, decilaldehído, antranilato de metilo, linalool y terpineol. El aceite es utilizado como repelente de perros y gatos y algunos insectos, y como insecticida, en ornamentales y basureros. Comochampú para perros y gatos y el el hombre como repelente de insectos. El D-limoneno es uno de los monoterpenos más comunes de la naturaleza. Posee un centro quiral, un carbono asimétrico, por lo que existen dos isómeros ópticos: el D-limoneno y el L-limoneno. Sin embargo, el D-limoneno prevalece en el aceite esencial de la naranja dulce Citrus sinensis, por lo que su extracción se realizó a través de este. Los dobles enlaces que contienen los monoterpenos tienen una reactividad similar a la química de alquenos, por lo cual, se le aplicaron pruebas de identificación típicas de estos, entre las más comunes se encuentran: bromo en tetracloruro de carbono y permanganato de potasio en frio siendo pruebas cualitativas que se determinan mediante cambios de color; así mismo se realizó una cromatoplaca con un revelador de vainillina/ácido sulfúrico para la determinación de monoterpenos Otra finalidad de este trabajo es la determinación de la DL50 del D-limoneno mediante el modelo de Artemia salina con un tiempo de exposición de 24 horas. La dosis letal 50 fue calculada mediante el modelo estadístico de Reed-Muench pak'aaal (maya). Clasificación taxonómica Nombre científico: Citrus sinensis L.1 Botánica y ecología. naranjo dulce. con los tallos verdes y espinosos. Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Rosidae Sapindales Rutaceae Citrus Citrus sinensis . Puebla: laxus (totonaco). son blancas y aromáticas. naranja injertada. ch'uhukpa.Antecedentes. flor de azahar. El árbol mide hasta 7 metros de altura. naranja de cucho. Las flores pueden estar solitarias o agrupadas. Reino: División: Clase: Subclase: Orden: Familia: Género: Especie: Cuadro No. cuando se encuentran maduros son redondos de color amarillo a anaranjado y jugosos. naranja portuguesa. pomfo (otomí). La naranja es una fruta cítrica no climatérica comestible obtenida del naranjo dulce Citrus sinensis que se da en regiones de clima templado y húmedo entres sus nombres comunes se encuentra: naranja de la china. palo naranjo. chujulpakal. naranja dulce. Quintana Roo: aal. San Luis Potosí: lanash (tenek)1. Oaxaca: tzon tende. Los frutos son grandes. con apariencia de cuero. xocot clavo (nahua). naranja común. tienen el soporte que las une al tallo con pequeñas alas angostas. naranjo. Las hojas tienen forma ovada. lisas por ambas caras. De igual forma se usa contra el insomnio. semicálido. de sidra (Citrus medica). la parte aérea del toronjil blanco y las ramas con hojas de hinojo. preparadas en infusión y administradas por vía oral. se calienta y se toma tibio tres veces al día. nuez moscada. de lima ( Citrus limetta). para asentar el estómago después de la purga. dolor de estómago. La cocción se debe hacer cada vez que se va a ingerir. flores de esta planta. mexicana). Para preparar el remedio se ocupa un frasco con refino al que se le agrega jerez. En las Huasteca potosina y veracruzana se utiliza en ceremonias especiales. con agua o miel de abeja. síntoma que se presenta cuando a alguien se le pasa la hora de comer (el paciente tiene el estómago duro. se toma tres veces al día durante ocho días. con o sin hojas. Se coloca en la mesa de la ofrenda y es portada por los participantes oficiales. el enfermo se atonta y se cae. como la de año nuevo. En este último caso se ingiere la fruta o jugo. bilis. se toma en ayunas un cocimiento de las hojas con canela (Cinnamomum zeylanicum). es una enfermedad frecuente que los nahuas reconocen por los siguientes síntomas: se cierran los oídos. pero también con frecuencia. con vegetación circundante de bosque tropical caducifolio o perennifolio y bosque mesófilo de montaña. que ocurre cuando se sube la presión a la cabeza repentinamente. semiseco y templado. irritación estomacal y falta de hambre. Se aconseja aplicar el zumo contra la caspa y tomar el jugo tibio del fruto para la tos. en desórdenes digestivos. raíz de pionía (Juncuseffusus). de limón (Citrus aurantifolia). Etnobotánica y antropología. siguiendo el pulso de la circulación). Colocándolo en una cucharita. y hinojo . empacho. que habita en sitios con clima cálido. se hace una cocción con las flores solas o combinadas con flor de tila y de manita. Se ocupa principalmente para bajar la calentura (Puebla y Tlaxcala). Son las flores. Para las alteraciones del sistema nervioso. se le agrega miel. ramas de toronjil (Agastache mexicana) y de estafiate (Artemisia ludoviciana ssp. Contra reumatismo fuerte y el acecido se recomienda el zumo. Debe endulzarse con miel de abeja. de sempiterna (Gomphrenanitida). yema de huevo y alcohol de caña. se le siente como una bola dura por encima del ombligo. Comúnmente cultivada en huertos familiares. hay convulsiones. la forma de preparación y tratamiento más comúnmente empleada. En caso de latido. de anís y de manita. El ataque o minique (nahua). de rosa de Castilla (Rosa centifolia).Es una especie originaria de China al sureste de Asia. duele la cabeza. (Foeniculumvulgare). valenceno y sus epóxidos2. Se deja reposar por tres días y posteriormente se toma tres veces al día un "topo" o una copita chica antes de cada alimento. A mediados del siglo XVIII. Alcaloides de isoquinolinasinefrina y nmetil-tiramina. Química. Cáscara Jugo . naributín. en el siglo XX. recaídas. se bebe para curar los dolores cólicos y las hojas estrujadas se usan entre el agua de baño de las mujeres paridas. Carotenoide beta-apo-8'-carotinol Flavonoides: heptametoxi-flavona. naringín. cólicos. El aceite esencial de la cáscara del fruto de Citrus Sinensis contiene un 90% del monoterpeno D-limoneno. narinjín y su glucósido. Monoterpenos 3-metil-butanol. notkatona. linalool y terpineol y en un menor porcentaje los sesquiterpenos cariofileno. Ricardo Ossado en el Libro del Judío comenta: "El cogollo de sus hojas hecho en infusión. hesperidín y su glucósido. En el siguiente cuadro se resume los metabolitos que se pueden encontrar en las diferentes partes del fruto. citral. naributín. Posteriormente. El enfermo debe consumir tres frascos del preparado. limoneno y linalol. catarro con tos. Narciso Souza indica que la infusión de sus hojas es empleada como astringente. neoesperidín. beta-elemeno. decilaldehído. su fruto comido con sal es muy bueno para las flemosidades". Parte de la naranja Citrus sinensis Metabolitos encontrados Flavonoides esperidium. nobiletín. sin embargo también se han identificado los deltacadineno. neoesperidín-hidrochalcona. tetrametilescutelareín. Otros padecimientos en que se menciona su uso medicinal son: alferecía de niños. alfa-copaeno. rutín y la 6-dimetoxi-cumarina. Historia. antranilato de metilo. sinensetín y langeretín. sofocamiento y asombro. Monoterpenos: limoneno. sesetín. mirceno. ostol.ácido valéncico Flavonoide: ciflavanona Triterpenos: limonín. beta-citraurín y mutatoxantín. Cumarinas braylín. y escoparona. terpeno de naranja) Formula molecular Punto de inflamabilidad Punto de ebullición Punto de fusión Masa molecular C10H16 50 °C 176 °C -75. Alcaloide cafeína Flavonoide rutín El D-limoneno posee un centro quiral.24 g/mol . lindol. nomilín. xantoxiletín y xanfiletín Bencenoides: estragol. pero se emplean con más frecuencia los prefijos D y L o alfa y beta. Propiedades físicas y químicas de limoneno (D-Limoneno. Por lo tanto existen dos isómeros ópticos: el D-limoneno y el L-limoneno. Corteza Flores Hojas Cuadro 22. oxigeranil-piranocumaril. Sesquiterpeno valenceno Flavonoide ramnósido del 4-metil -éterdihidro-camferol. Carotenoides mono y diepoxi-caroteno. Sesquiterpeno valenceno. La nomenclatura IUPAC correcta es R-limoneno y S-limoneno. di-hidro-caroteno.Pulpa Raíz Semillas.2 °C 136. suberosín. alfa-pineno y sabineno. concretamente un carbono asimétrico. deacetilnomilín y obacunona Cumarinadimetoxi-cumarina. American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH) o la National Toxicology Program (NTP) ya que no se ha demostrado que produzca cambios genéticos en pruebas bacterianas o células animales ni contiene toxinas conocidas de reproducción o desarrollo. mycoides. La relatividad tóxica del limoneno es de 0. La exposición prolongada o repetida puede causar sequedad o dermatitis de la piel. Candida albicans. Staphaylococcus aureus. Se ha demostrado que tiene baja toxicidad oral (LD50> 5g/kg) y baja toxicidad dérmica (LD50> 5g/kg) cuando se probó en conejos. garganta y tracto respiratorio. Este compuesto no está clasificado como carcinógeno por la Occupational Safety and Health Administration (OSHA). La inhalación puede causar irritación en la nariz. Escherichia coli. También mostró una baja toxicidad por inhalación (RD50> 1g/kg) cuando se probó en ratones.Densidad del limoneno Solubilidad en agua Solubilidad en metanol Cuadro 33.34 y la DL 50 es de 1470ppm en un tiempo de exposición de 6 hrs en el modelo de Artemia salina.84 g/cm3 insoluble Soluble El aceite esencial obtenido de la cáscara del fruto ejerce una actividad antibiótica contra las bacterias Bacillussubtilis. B. Se ha demostrado que el jugo del fruto ejerce actividad contra el Polivirus I. Farmacología. B. B. International Agency for Research on Cancer (IARC). También presentó un efecto carminativo al medir in vitro la actividad de reducción de la espuma. pumilus. Salmonella paratyphi.3 . anthracis. los principios amargos son responsables de su acción aperitiva y eupéptica. Vibrio cholera y Pseudomona aeruginosa y el hongo Candida albicans. 0. 2 El pericaripio y también las hojas tienen una actividad venotónica y vasoprotectora. La capacidad de irritación cutánea del D-limoneno en cobayas y conejos se considera moderada y baja respectivamente. El almacenamiento y la manipulación inadecuada pueden conducir a la sensibilización de la piel.1 Toxicidad. Biosíntesis Los monoterpenos y en general todos los compuestos terpenoides naturales se biosintetizan por la ruta del acetilCoenzima A a través de un intermedio común que es el ácido mevalónico. Mevalonato H3C OPOP CH3 CH3 CH3 CH2 + H3C C CH3 H3C CH3 H3C + H H3C CH2 Geranil difosfato Limoneno Figura 1 Síntesis química . Una forma de sintetizar D-limoneno es mediante la reacción de Diels-Alder. Reacción general H3C CH2 CH2 + CH2 O CH3  H3C H3C (Ph)3PCH2 CH3 O H2C CH3 Mecanismo de reacción H3C CH2 CH2 H3C CH3 O + CH2  O CH3 H2C - P + CH3 H3C CH3 O CH2 - H3C CH3 O - H2C CH3 P + P + + O P Figura 2. Elucidación estructural (química degradativa o métodos espectroscópicos) Debido a la diversidad de grupos funcionales que pueden estar presentes en los componentes mono y sesquiterpénicos de un aceite esencial no existe una prueba . El limoneno se reconoce en las placas de TLC porque absorbe luz UV a 254 nm. su absorción de luz UV y Rf en cromatografía en capa fina. Agregar 1 ml de la solución de bromo en tetracloruro de carbono.específica para su reconocimiento. o vainillina-ácido sulfúrico5 dando la presencia de zonas rojas-violetas. También se utiliza el reactivo de Liebermann-Buchard dando UV-365 nm con presencia de zonas gris-café y en luz visible (VIS) zonas café oscuro o gris indicando prueba positiva Objetivo(s) . Agitar el contenido del tubo. Observar y registrar los resultados . Una prueba que indica la presencia de insaturaciones es aquella en la cual el color del bromo desaparece sin que se desprenda bromuro de hidrogeno (HBr).Ensayo de bromo en tetracloruro de carbono (Br2)/CCl4) Los compuestos que presentan dobles y /o triples enlaces pueden adicionar bromo. Procedimiento: En un tubo de ensayo se coloca 1ml del compuesto a ensayar y se agrega 1ml de la solución de Baeyer. por la coloración con diferentes reactivos. cafés-rojas. pueden dar una ligera coloración. otra forma de identificarlo la presencia de terpenos es realizando pruebas típicas para alquenos: -Ensayo de Baeyer4 (oxidación con solución diluida de KMnO4): Los compuestos que tienen enlaces etilénicos o acetilénicos reaccionan con solución diluida de KMnO4 en frio. Sin embargo. Sin embargo existen procedimientos experimentales que permiten reconocerlos. debe advertirse que muchos compuestos orgánicos debido a la presencia de impurezas. El color purpura del ion permanganato se reemplaza por un precipitado marrón de dióxido de manganeso. Esta aclaración es válida para explicar que el desprendimiento de HBr indica que tuvo lugar una reacción de sustitución y no de adición. Procedimiento: Colocar 1 ml del compuesto a ensayar en un tubo de ensayo limpio y seco. Agitar el contenido del tubo. Otro método para identificar monoterpenos y sesquiterpenos es por cromatografía en capa fina utilizando reactivos reveladores como el anisaldehído-ácido sulfúrico. Observar y registrar los resultados. azules-verdes para una prueba positiva. Aislar D-Limoneno a partir del aceite esencial de la cascara de naranja dulce. -Diclorometano -Acetona -Hexano y acetato de etilo -Sulfato magnésico anhidro -Etanol Modelo Artemia Salina -Vaso de precipitado de 500 mL -Pipetas pasteur -2 Microespatulas . por medio de la destilación por arrastre con vapor. Destilación por arrastre con vapor -Refrigerante con mangueras -Matraz Erlemeyer -Tubos de vidrio. Determinar la DL50 en el modelo de Artemia salina Material y Equipo de laboratorio.   Realizar la extracción del aceite esencial de la cascara de naranja dulce (Citrus sinensis). tapones -3 Pinzas de 3 dedos con nuez -3 Soporte universal .Parrilla de calentamiento -Probeta -2 Matraz bola de 500 mL -2 Reostato -2 canastillas de calentamiento -Perlas de ebullición Extracción -Embudo de vidrio -Embudo de separación -Soporte universal -Anillo metálico -Matraz redondo Reactivos. Aislamiento La destilación por arrastre con vapor es una técnica muy utilizada para extraer compuestos de fuentes naturales (como los aceites esenciales) o para remover productos de mezclas de reacción complejas. a otro matraz que contiene la mezcla que se desea destilar que va ensamblado a un refrigerante y un colector. conectado por medio de un adaptador. Las condiciones de almacenamiento que retienen esta humedad o calor pueden producir cambios negativos en las frutas. Cuando no es tan sencilla la separación. Colocar en el matraz la mezcla que se va a destilar. producto de la mezcla de ambos constituyentes inmiscibles. . Por medio de un embudo de separación es posible separar los componentes. tal como mohos o podredumbre. se hace una extracción con un disolvente.-Agua -Cloruro de sodio Método de recolección. Eliminar el embudo de adición. secado. Método indirecto 1. purificación del metabolito secundario. Dado que la naranja es un cítrico no climatérico no debe recolectarse previo a la maduración del fruto. El destilado será un líquido turbio. Se utiliza un matraz generador de vapor (equipado con un tubo de seguridad para evitar proyecciones). 2. Conectar un matraz generador de vapor al mismo equipo. debido a que el fruto es de consumo común por lo se tiene la facilidad de adquirirlo en el comercio. En este proyecto no se llevó a cabo la recolección por este método. Recolección Todas las frutas son material vivo que liberan humedad y calor. después de un tiempo de reposo se separarán en dos fases. extracción. Recibir el destilado en un matraz. -Agitación de la mezcla: Se cierra el embudo.html [F. quedan restos de agua. Con el propósito de eliminar estos restos de agua se utiliza el desecante sulfato de sodio anhidro (NaSO4) que se hidrata según la reacción: . Sobre ésta se añade el disolvente orgánico (diclorometano). consulta 20130224] -Preparación del material: Para la extracción se monta un equipo donde se coloca el embudo de decantación (que tener su correspondiente tapón y llave funcionales) en un aro metálico sujeto a un soporte universal sujetado mediante una pinza. Se recoge la fase orgánica. la fase acuosa y la fase orgánica.blogspot.3. 4. Así se pueden reconocer dos fases. después se vierten 10 ml de diclorometano y se repite este proceso hasta tres veces. 5. Este proceso se realiza en un matraz redondo previamente tarado. y se coloca una mano sobre la llave y la otra sobre el tapón. -Secado de la fase orgánica: Al juntar las tres fases orgánicas. se agita la mezcla mediante movimientos circulares.mx/2012/02/obtencion-de-un-productonatural.6 Extracción:http://biotec93. -Adición de fases: Se vierte la disolución con ayuda de un embudo redondo en el embudo de decantación. -Separación de fases: Se coloca el embudo de decantación sobre el aro metálico con el tapón abierto y se espera hasta que las dos fases se separen. Introducir dentro de la mezcla a separar el inyector de vapor que debe llegar hasta el fondo del matraz. ya que el limoneno se disuelve mejor. para eliminar el aumento de presión que se ha producido se abre la llave. Calentar con mantilla el matraz que contiene la mezcla. si se observa que hay condensación. . Se realizó una filtración rápida para separar el sulfato de sodio de la fase orgánica la que se llevó al rotavapor para destilar el diclorometano y obtener el producto. (Ver imagen 3) 5. Para eliminar el disolvente orgánico se utiliza el rotavapor de la siguiente manera: Primero se une el matraz a la boquilla. 2.. del pericarpio. 3. Se pesaron 500 g. Se realizó la extracción de la fase orgánica a la que posteriormente se le añadió sulfato de sodio anhidro para secarla. recién cortado. se espera a que se termine de destilar. En un embudo de separación se añadió el aceite con agua con 25 mL de diclorometano y se agitó vigorosamente para permitir que las fases interactuarán de tal manera que los solutos presentes se distribuyeran entre ambas. Pruebas de identificación del metabolitos secundarios. Como el diclometano (1. Se pesó y se colocó en un frasco ámbar previamente tarado. Se colocaron a destilación por arrastre con vapor que se llevó por 3 horas obteniéndose 420 mL de aceite con agua (Ver imagen 1). Se repitió el procedimiento 3 veces añadiendo 15 mL de cloruro de metileno cada vez. se habrá hecho el vacío y el matraz quedará sujeto. Después se baja la palanca para que el matraz quede en contacto con el agua. se desactiva el vacío y finalmente se pesa el limoneno Fase experimental práctica La extracción del limoneno se realizó a partir del aceite esencial obtenido del pericarpio de la cascara de naranja (Citrus sinensis) mediante la técnica de arrastre con vapor de tipo indirecta que se realizo de la siguiente manera: 1.33 g/cm³) es más denso que el agua la fase orgánica se fue a la fase inferior del embudo y la fase acuosa se presentó en la parte superior.-Filtrado y eliminación del disolvente: El agente desecante se elimina mediante filtración empleando un círculo de papel provisto de varios pliegues y dispuesto sobre el embudo redondo. se activa la conexión al vacío y cuando deje de hacer ruido. (Ver imagen 2) 4. 496 ppm. una con 9 mL de etanol y pocos cristales de vainillina y la segunda con 1 mL de acido sulfúrico concentrado en 9 mL de etanol Después de correr la cromatoplaca se roció con la solución de la vainillina y posteriormente con la solución de acido sulfúrico colocándola a calentamiento directo en la parrilla. 3100 ppm.Se realizaron pruebas destructivas para determinar la presencia del limoneno utilizando las mismas que se realizan para determinar alcanos ya que la estructura contiene dobles enlaces. 1 mL de etanol y aforando a 10 mL con solución salina 2. 256 ppm. Posteriormente se realizaron 3 stock: 1. . posteriormente se monto la prueba realizando un blanco diluyendo 1 mL de etanol (disolvente para el limoneno) en 9 mL de solución salina aforada a 10 mL . También se llevó a cabo una cromatoplaca en una cámara con mezcla de disolventes de 6 mL de hexano y 4 mL de acetato de etilo utilizando un revelador de vainillina que se preparo de la siguiente forma: -Se prepararon 2 diluciones. 4000 ppm: agregando 40 mg de aceite. 1600 ppm. de NaCl en 500 mL de agua. 3100ppm: agregando 31 mg de aceite. 1240 ppm. Procedimiento: Se preparó una solución salina diluyendo 12 g. 326 ppm. 1 mL de etanol y aforando a 10 mL con solución salina Por lo que se prepararon soluciones con concentraciones de 5100 ppm. Evaluación de la toxicidad en el modelo de Artemia salina (determinar la DL50). 816 ppm. 640 ppm. 5100 ppm. 2040 ppm. agregando 51 mg de aceite. 4000 ppm. 198 ppm colocando en cada concentración 12 artemias que no fueron recién eclosionadas Las pruebas se realizaron por triplicado Observaciones. con bromo en cloroformo y permanganato de potasio diluido. 1 mL de etanol y aforando a 10 mL con solución salina 3. Se obtuvieron 1. amarilla y un aroma dulce.00% . observando un cambio de color de morado a café (Ver imagen 5) Positiva.72 mL teniendo una densidad de 0. Resultados y discusión de resultados.85 g/cm3 (reporte de la norma NMX-F-063-1978). Cuadro #. después del calentamiento se observo un ligero color morado en la misma zona donde corrió el aceite esencial (Ver imagen 4) Positiva. Para las pruebas de identificación se realizaron las siguientes.La destilación por arrastre por vapor se realizo en 2 partes ya que el matraz Erlemeyer no podía contener tanta materia prima. -Al culminar el rotavapor el compuesto adquirió una consistencia aceitosa..94 g/cm3 que es una densidad cercana a la reportada en literatura 0.64 g. Prueba Revelado vainillina/H2SO4 Resultado Positiva. 3. observando un cambio de color de rojo a incoloro (Ver imagen 6) KMnO4 diluido y frio Br2/CCl4 Determinacion de la citotoxicidad en el modelo Artemia salina Los resultados obtenidos son los presentados a continuación: Concentración (ppm) 5100 log Conc. -Las artemias utilizadas no fueron recien eclosionadas. Peso del limoneno obtenido 1.71 Muertas 12 Vivas 0 Acumuladas Acumuladas Muertas Vivas 108 0 Radio TOTAL Muertes 108/108 Mortalidad 100.64 g de limoneno con un volumen de 1. 81 2.00 3.00% 94.00% Mortalidad 100.00% 100.20 3.00% 5.00% 100.00% 80.00 .70% 81.10% 20.00% 20.00% 29.50 2.00 0.00% 0.00 1.00 2.30 12 12 12 12 12 10 8 11 1 4 2 0 0 0 0 0 2 4 1 10 7 10 96 84 72 60 48 36 26 18 7 6 2 0 0 0 0 0 2 6 7 17 24 34 96/96 84/84 72/72 60/60 48/48 36/38 26/32 18/25 7/24 6/30 2/36 100.4000 3100 2040 1600 1240 816 640 496 326 256 198 3.51 2.60 3.00% 100.00% Mortalidad 40.00% 60.49 3.70 2.00% 100.41 2.50 4.91 2.50 3. 120.50 1.31 3.55% Tabla 1.25% 72.00% 0.09 2. 50 4.50 2.00 3.Grafico 1.00 Número de Acumulados Log.00 0. 120 100 80 Y Acumuladas Muertas Y Acumuladas Vivas 60 40 20 0 0. de la dosis .00 1.00 2.50 1.50 3. Ed.pdf [F. 1.co/~ff/esencias2001b. Agrotécnicas S. Tamizaje fitoquímico de la especie vegetal guatemalteca Quararibea yunckeri Standley Subsp..wordpress.php?l=3&t=Naranja [Fecha de consulta: 2013/02/02] 3. tenshinoakuma.mx/monografia. pág. Alejandro. L.94 5. Esmeralda orantes morales.mx/pdfs/OTROS/D-LIMONENO. 3a edición. 93. Agosto 2008 6. Editorial Encuentro. Bibliografía.unam. Conclusiones. España. Farmacología Vegetal. Guatemala. 7-8 2. @muiscas. Encuentro Grupo editor.com/2008/10/09/terpenos-aceites-esenciales . Facultad Química Farmacéutica. -Las artemias que sobrevivieron se les agrego formaldehido y se tiraron junto con las muertas en la tarja. Carlos de Liñán Vicente. “Fundamentos teoricos practicos de quimica organica” 1° edición. Alverson ex Véliz (Bombacaceae)” [Tesis].udea.S. 2003. 2008. consulta 20130213] 5.pdf 4.edu. medicinatradicionalmexicana. -El disolvente destilado (diclorometano) se colocó en los desechos no clorados.Grafico # Las 2 curvasseomtersectam a la dosis letal para el 50% de la población animal Disposición de Residuos.udea.com. Hoja de seguridad quimicompuestos. Pp. -Los fase acuosa generada se arrojo a la tarja ya que solo era agua.. Lamarque A. Cordoba. izabalensis W. Maestri D. Profesor Martínez M.edu.co 2003. Medellínamart farmacia. mx/2012/02/obtencion-de-un-producto-natural. Soria Arteche Olivia.html [F. biotec93. consulta 20130224] . Fundamentos de Química Orgánica experimental Universidad Autónoma Metropolitana.[Fecha deconsulta 2013/02/02] 6. 2009. pág. Unidad Xochimilco. México. 203-204 y 207 7.blogspot. ANEXOS Arrastre por vapor . Extracción . sulfurico .Rotavapor Pruebas de identificación: Cromatografia en capa fina Relevador con vainillina/ac. Prueba de KMnO4 frio Prueba con bromo . Prueba de Artemia Salina .