INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CHETUMALLICENCIATURA EN BIOLOGÍA PROTOZOOLOGÍA MANUAL DE TÉCNICAS DE COLECTA DE EXTRACCIÓN, FIJACIÓN, TINCIÓN II MONTAJE DE PROTOZOARIOS DE VIDA LIBRE II SIMBIOSIS INTEGRANTES: y SANDRA DE LA CRUZ VILLEGAS y JANELLE TUN CHÉ y KRYSTEL CRUZ BAAC GRUPO ZB TURNO VESPERTINO Introducción Se ha demostrado que varias especies de protozoos tienen hábitats característicos y que muchas de las formas libres están distribuidas simplemente en masas de agua dulce, salobre y salada. Mientras que las formas se encuentran confinadas a huéspedes animales específicos. En este concepto encajan grupos muy diversos y sin especial relación de parentesco, que se encuadran en muchos filos distintos, principalmente del reino protistas. Las bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos. El término microorganismos no tiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensiones microscópicas (< 0.1mm) aunque presenten grandes diferencias entre sí. Así por ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariota (hongos, protozoarios, algas) y virus. También difieren notablemente en el tamaño aunque sean todos microscópicos; en una escala comparativa tenemos: Protozoarios ± levadura ± bacterias - virus Características de los protozoarios. Es un grupo muy heterogéneo, con estructura unicelular, aunque algunos grupos forman colonias con un número variable de individuos. Existen colonias con células sin ningún tipo de especialización, pero también hay especies coloniales en las que se diferencian células vegetativas y células reproductoras. Por otro lado, numerosos ejemplares presentan características de los seres vegetales, como la presencia de pigmentos sensibles a la luz y la capacidad para realizar la fotosíntesis (Gama 2004). La estructura celular que presentan los protozoos son las características de la célula eucariota y En algunos grupos de protozoos, por la parte exterior de la membrana, se puede presentar un glicocáliz, compuesto de mucopolisacáridos. aunque existen casos de células de gran tamaño que contienen muchos núcleos. Se pueden distinguir el hialoplasma y los orgánulos rodeados de membrana En el hialoplasma es habitual diferenciar una parte fluida y homogénea y otra más viscosa. en el citoplasma se encuentran inclusiones formadas por materiales de reserva. como polisacáridos y lípidos. aunque pueden tener extensión variable según las características del individuo y el estado fisiológico de la célula. Aparte de su tamaño. Son comunes a todos los grupos tanto el aparato de Golgi como el retículo endoplasmático. Algunas especies tienen dos núcleos: un macro núcleo grande y un micro núcleo pequeño. Varía en cuanto a forma y número según los distintos grupos. estos núcleos presentan diferencias estructurales y funcionales: . algunos aportan materia orgánica en ambientes acuáticos y otros actúan como depredadores de organismos o como degradadores de materia. Se presentan en las especies que se desplazan activamente. En numerosos casos. penetra en el interior de la célula. En general. Respecto a los orgánulos. Núcleo. y materiales de excreción diversos. por fenómenos de ósmosis. podemos encontrar los componentes característicos de cualquier célula eucariota animal con sus funciones habituales. 2007). Aparte de los orgánulos.y y y y y y y y y y y Citoplasma. es decir. una bicapa lipídica con proteínas incluidas. La mayoría de los protozoos que viven libres en las aguas dulces presenta vacuola contráctil. . Importancia de los protozoarios Los protozoos forman parte importante en la ecología. Este orgánulo permite evacuar al exterior el agua que. La célula está rodeada por una membrana plasmática típica. de aspecto granular y con abundantes inclusiones. los protozoos presentan células uninucleadas.El micro núcleo es diploide y no produce ARN. los protozoos poseen elementos esqueléticos que defienden al organismo de agentes exteriores perjudiciales y contribuyen a mantener su forma. Cilios y flagelos. Son importantes en el agua y en el suelo contaminado (Olivas. Membrana plasmática.El macro núcleo es poliploide y produce el ARN necesario para la síntesis de proteínas de la célula. . minerales y extracto de levaduras. proteínas. Cuidados previos para los métodos de cultivo de protozoarios.Los protozoarios de vida libre son fáciles de cultivar en el laboratorio con infusiones de vegetales y bacteria. Cultivo y y y y Los protozoarios necesitan luz moderada. el caso es que se encuentre oxigenada. éste puede contener arroz. Si se utiliza un medio artificial. Para aislamiento de protozoarios saprofitos son buenas las muestras de agua dulce que tengan fragmentos de algas filamentosas y lodo con abundante materia orgánica. leche descremada y lechuga. granos de trigo. Lo más fácil para nosotros es buscar alguna charca de este tipo. Algunos necesitan microorganismos como alimentos. Si es un medio específico. Los parásitos generalmente no son cultivables teniendo que recurrir a animales de laboratorio (Olivas. Se recomienda usar en los medios la misma agua de las muestras. porque ese será el factor determinante para la proliferación de protozoarios correspondientes a ese tipo de hábitat. o dulce. Por otro lado. ³Cultivo de Paramecium´ Recolección: El paramecio habita principalmente las aguas estancadas o semi estancadas. igual conforme en base a sus características y estructuras distintivas. 2007). los parásitos se cultivan en preparaciones de cultivo de tejido. o agua de mar. También son buenos los suelos con abundante materia orgánica en descomposición: para la incubación es buena una alta humedad. contiene glucosa. Características de Cultivo: las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo y las condiciones físicas de unos medios que lo favorezcan. temperatura de 15 a 21 grados C y un pH de neutral a un poco alcalino. Colecta Se extrae una pequeña muestra ya sea de agua estancada. Para aislar parásitos intestinales se usan muestras de heces (Olivas 2007). y . hasta que mejoran las condiciones del medio. Los protozoos se concentran en las partes descubiertas (la parte superior del tubo de ensayo o la tubería en los tapones porque la mayoría de los protozoos poseen un fototropismo positivo o un geotropismo negativo. y cubra el frasco con papel carbón. El proceso es mucho más lento. y mondas de plátano. lo que da como resultado un número reducido de especímenes incluidos en una gota de fluido para un portaobjeto provisional. formando quistes que le mantienen casi durante tiempo indefinido en estado de letargo. es decir. el cultivo puede estar demasiado diluido. Usando un gotero medicinal. Insértelo en un tapón de un solo agujero en un frasco lleno de cultivo.mejor todavía si lo recolectamos de alguna charca que sirva de abrevadero de animales. Los estudiantes pueden aumentar el número de organismos vertiendo el cultivo en un frasco largo o en un tubo de ensayo. pero ya se obtienen animalillos en una semana más o menos. excepto el cuarto superior del tubo. con papel carbón. paja seca. Preparaciones Tipos de preparaciones Preparaciones en fresco: . El paramecio comienza a rodearse de una capa protectora contra la desecación. como vacas. Si no podemos recolectarlos del medio natural podemos originar su cultivo a base de hojas de lechuga. etc. pero es pasajero hasta que se consigue esta cepa inicial). Se sacan del frasco (este no es ya necesario y se tira) y se pasan al acuario de cultivo. Zonas de la charca con detritus o similar. Algunas veces. Basta con recoger agua situada alrededor de cualquier materia en descomposición tanto de origen animal como vegetal. es posible colocar un gran número de organismos en un portaobjeto en una gota de medio (Olivas 2007). y cubriendo todo. y se echa en un frasco. solo hay unos cuantos organismos en el cultivo. Esto es posible porque cuando las condiciones del medio son adversas. dentro de un frasco con algo de agua (es un poco asqueroso. como en los meses estivales cuando se empiezan a secar las charcas. flagelos y otros organismos móviles. Concentración de los organismos en un cultivo Muchos estudiantes querrán examinar protozoos. o preparando un pedazo corto de tubería de vidrio. ovejas. o se reúnen donde la concentración de oxigeno es mayor en la superficie). así como gránulos retráctiles. rojo neutro.La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una preparación en fresco. frecuentemente hacen difícil la observación. sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavación central que queda adherido gracias a la vaselina. por otra parte. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y observar: la movilidad. una preparación en fresco simple que consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. que aumentan el contraste de las células sin afectar su viabilidad. con un microscopio óptico de campo claro. su uso. Por tanto. el movimiento continuo de los microorganismos. esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensión bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo con vaselina (actúa como sellador) o parafina. La ventaja de esta última técnica. A este tipo de preparaciones se pueden agregar colorantes muy diluidos como el cristal violeta. es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo. Sin embargo. Técnica de cultivo para protozoarios MATERIALES y 3 frascos de boca ancha y SUSTANCIAS azul de metileno y y 1 paquete de gasas 1 gotero y muestras de agua estancada . verde Janus. Se invierte la preparación y se observa colocándola en la platina del microscopio. Una preparación en gota pendiente. el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación por la escasa diferencia entre los índices de refracción del medio y de los microorganismos. esporas sin teñir y cloroplastos dentro de las células vivas. así como el causado por las corrientes de fluido. el tamaño y la forma de agrupación de los microorganismos en su estado natural y sin alteraciones. Existen dos técnicas. está bastante limitado. ) Tapar la boca de cada frasco con una gasa doble sujetándola con una liga (para evitar contaminación ) Dejar reposar los cultivos una semana antes de proceder a observarlos.y Microscopio y 5 ligas y Paja y Arroz PROCEDIMIENTO y Hervir aproximadamente un litro de agua con un puñado de paja conocido como infusión y lo dejar enfriar. estanques. Verter el contenido en varios frascos y poner una pequeña muestra de agua estancada en cada uno de ellos. etc. de panteón. Preparados fijos y teñidos Para observar las características morfológicas de las bacterias. procurar que las muestras en cada frasco sean tomadas de diferentes lugares (charcos. a) Las células son visibles más claramente después de teñidas y y y y y . aguas de floreros. las preparaciones fijas y teñidas son las que se usan con mayor frecuencia. Normalmente. pero ni las estructuras internas de la célula. para inactivarlos y convertirlos en insolubles e inmóviles. Bouin. durante la fijación se mata a los microorganismos y se fija firmemente al portaobjetos. Sin embargo. Los pasos esenciales en la preparación de un fijo y teñido son: a) Hacer el frotis o película b) La fijación y c) La aplicación de una o más soluciones colorantes. para proteger la subestructura fina y la morfología de microorganismo delicado de mayor tamaño hay que utilizar la fijación química. Colorantes microbiológicas Los numerosos tipos de colorantes empleados para teñir microorganismos poseen dos características en común: .b) En las preparaciones teñidas las diferencias entre células de especie diferentes y dentro de la misma especie se demuestra mediante soluciones colorantes apropiadas (tinción diferencial o selectiva). Las células teñidas que se observan con un microscopio deben parecerse la más posible a las células vivas. La fijación es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las estructuras internas y externas de las células de los microorganismos. etc. normalmente proteínas y lípidos. Fijación Son generalmente sustancias químicas que coagulan o precipitan los prótidos celulares. de manera que no cambian durante la tinción ni la observación. Los bacteriólogos fijan con calor frotis bacterianos calentando suavemente a la llama una película de bacterias secada previamente al aire. 2. Fundamentalmente. ALFAC. existen dos clases de fijación diferencial: 1. Inactiva enzimas que podrían alterar la morfología celular y endurece las estructuras celulares. Ejemplos: Formalina. Este método conserva adecuadamente la morfología general. endurecen los tejidos y facilitan el tratamiento posterior al que serán sometidos. Los fijadores químicos penetran en las células y reaccionan con componentes celulares. eosina. estos colorantes se emplean a menudo en bacteriología. Los colorantes ácidos. en que las proteínas y muchas otras moléculas poseen una carga positiva. rosa de bengala y fucsina acida.Todos poseen grupos cromóforos. debido a su celulares cargadas positivamente. Para realizar los exámenes microscópicos (biopsia) es necesario someter el material en estudio a procedimientos especiales cuyo conjunto constituye la denominada: Técnica Histológica. Pueden unirse a las células mediante enlace iónico. Por ejemplo. se unen a estructuras El pH puede modificar eficazmente la tinción. Los colorantes básicos se unen a moléculas cargadas negativamente. Los colorantes ácidos. . Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases generales. tomando como base la naturaleza de su grupo cargado. Como las superficies de las células bacterianas están cargadas negativamente. carga negativa. un colorante cargado positivamente se une a estructuras cargadas negativamente de la célula. Los colorantes aniónicos tiñen mejor en condiciones acidas. como ácidos nucleicos y muchas proteínas.son aniónicos o poseen grupos cargados negativamente. pues la naturaleza y el grado de la carga del componente celular cambian con el mismo. covalentes o hidrófobo. grupos con dobles enlaces conjugados que dan el color al colorante. los colorantes básicos son más eficaces a valores de pH más elevados. Los fijadores son sustancias que ingresan dentro del organismo y lo matan (en su mayoría son antisépticos) razón por la cual estos quedan inactivos.azul de metileno. Tipos de fijadores Físicos Congelación: .Inmediato (in vivo) Métodos de examen Mediato (post mortem) Fijación Inclusión Microtomía Tinción Montaje Los colorantes básicos. cristal violeta. fijados o hasta coloreados para facilitar la visualización del material celular. fucsina básica. safranina. verde malaquita.son cationicos o tiene grupos cargados positivamente y se comercializan generalmente como Técnicas de Fijación Agentes fijadores Capacidad fijadora (evitan autolisis) Capacidad conservante (evitan putrefacción) Los tejidos deben ser colocados en fijadores por dos razones. Primero. porque las células deben ser matadas rápida y uniformemente para que el contenido de las mismas se conserve y se parezca mucho al de la célula viva. La segunda razón es que el fijador endurece el tejido de manera que pueda ser cortado en secciones delgadas y transparentes. 3. Efecto microbicida. Tipos de fijadores quimicos Fijadores por deshidratación tisular (disuelven las grasas): alcohol etílico. Alcohol metílico 95% para fijar frotis. 2. Schaudim . Calor húmedo. Evitar los cambios de textura y composición tisular. Efecto mordiente. * Fijadores Químicos 1. metanol.N2 líquido (-121ºC) Isopentano (-50ºC) Criodesecación o liofilización (desecación por sublimación) Criosustitución (alcohol etílico. Formalina o formol 10% 3. acetona Fijadores por cambio en el estado coloidal de las proteínas (disminución de PH por debajo del PI): ácido acético. acetona o polietilenglicol) Químicos: desnaturalización o precipitación de proteínas Bloqueo de la autolisis. 2. Desecación. Evitar los efectos osmóticos. ácido tricloroacético y ácido crómico Fijadores que actúan formando sales en los tejidos Fijadores que actúan por reticularización de las proteínas Mezclas fijadoras * Fijadores Físicos 1. Calor seco. 4. y y y Formaldehido 0.0mL Solución salina (NaCl 0. de ácido pícrico acuoso saturado. Fijadores conocidos para protozoarios FORMALDEHÍDO Utilización: Para preservar esporas de microsporidia. Schauffer Fijadores 1. Si la muestra de heces contiene quistes y huevos se recomienda usar el fijador al 10%. de alcohol de 95%. de agua a 70 ml. luego se lavan en alcohol de 70% hasta que no ocurra más cambio de color.5% 5. Alcohol puro: Caliente cristales de sulfato cúprico hasta que sólo quede un polvo blanco. Filtre el alcohol rápidamente y almacene en botellas para almacenaje secas. 3. quistes y oquistes de protozoarios se utiliza el formaldehido al 5. Es difícil de eliminar de los tejidos que se quieren teñir. de ácido acético puro y 25 ml. Luego se transfiere el tejido a alcohol fresco de 70% hasta que vaya a ser usado. Haga esto hasta que el sulfato cúprico que se añade no se vuelva azul en el alcohol. Luego se elimina toda el agua. Fijador de Bouin: Este es un buen fijador para uso general con tejido animal y vegetal. Frío. luego lave en alcohol de 70% hasta que el color haya sido removido. Se colocan pedazos pequeños de fijador en él por 24 horas. Mezcle 5 ml. 4. Deje el tejido en el fijador de 24 a 48 horas. de aldehído fórmico al 40% con 75 ml. Su mayor ventaja es que los especímenes pueden ser almacenados en el por largo tiempo. Se prepara añadiendo 25 ml. Añada esta forma anhidra a alcohol etílico de 95%. Fluido de Allen: Este es un fijador de uso general. 2.0mL . Solución de alcohol etílico al 70%: Este es un preservativo común para formas pequeñas y especímenes de tejidos.0% y para huevos y larvas de helmintos al 10%. 4.85%) 95. A 100mL del fijador se le adiciona 0. los huevos de helmintos de pared gruesa pueden seguir su desarrollo. Esta solución concentrada puede durar varios meses. Cuando se utiliza el fijador a temperatura ambiente. Se utilizan para diferenciar fácilmente la morfología y estructura de los organismos en observación.0mL y Etanol 95% y 100. se homogeniza y se almacena en frascos ámbar a temperatura ambiente. para asegurar que los huevos no sigan su desarrollo se recomienda usar el fijador a 60º C SCHAUDINN Utilización: Este fijador facilita la preservación de quistes.0mL y Ácido acético glacial y 3. Solución concentrada y Cloruro de mercurio y 11. Los colorantes modifican el índice de refracción de las sustancias que colorean. Métodos de coloración.0mL Método: Se mezcla el cloruro de mercurio y el agua destilada con agitación constante.10g de fosfato de sodio monobásico y se almacena en un frasco herméticamente cerrado). huevos y larvas.08g de una mezcla de sales y se homogeniza (sales: se mezclan 6.Método: El formaldehido se diluye con solución salina. La solución de trabajo se prepara en el momento en que se va a preservar la muestra con las estructuras parasitarias. . después se añade el etanol.0mL Solución de trabajo Solución concentrada y 47. Para mantener la morfología de los parásitos en condiciones óptimas se recomienda el fijador amortiguado. trofozoitos.40g y Agua destilada y 200. Estas diferencias pueden ayudar al diagnóstico certero de varias enfermedades infecciosas de la sangre. Su fundamento está en la disociación controlada de las sales de eosinato. Resultaos e interpretación: Los eritrocitos se tiñen de rosa. Las preparaciones en fresco son utilizadas principalmente para la identificación de Tripanosomas y microfilarias. mientras que la eosina para coloración citoplasmática. La tinción de Giemsa al igual que la tinción de Wrightsirven para la identificación de parásitos tales como el Paludismo en los cuales es conveniente un tiempo de 30minutos hasta una hora para Giemsa y de tres a cinco minutos para Wright aunque se podrían obtener mejores resultados si se le deja a éste ultimo hasta por 15minutos. mientras que la gota gruesa es utilizada cuando escasean los . estas sustancias están disueltas en alcohol metílico. Por esto se dice que la coloración de Giemsa es una coloración compuesta o diferencial (ya que emplea más de un colorante). se cubre con la solución de Giemsa. Los eritrocitos en color gris claro. una mezcla de tiácinicos catódicos. El método de Wright brinda buenos resultados y requiere de muy poco tiempo. Los núcleos de los leucocitos de violeta. Las plaquetas de violeta. que colorean el núcleo. La cromatina nuclear adopta la tinción azul violácea algo distinta a la habitual para los colorantes tiacínicos y que recibe la denominación de efecto Giemsa. el citoplasma en color azul claro. como el azur A. El citoplasma de los leucocitos es rosa.Observación: Los núcleos de células y protozoarios se observan en color. Nota: El colorante de Giemsa es un colorante compuesto ya que es una mezcla de varios colorantes. La tinción de Giemsa emplea como colorante fundamental. se lava con agua y se observa. levaduras y hongos(Chlamydia).B y azul de metileno. Se deja secar. Se ponen en evidencia la morfología y estructura de los microbios. El fijador (metanol o etanol) se usa cuando se cuentan con muestras de tejidos. pero se obtiene detalles más precisos con la tinción de Giemsa. El método de Wright solo se puede aplicar a frotis delgados mientras que en Giemsa se pueden usar frotis delgados y frotis de gota gruesa omitiendo el paso de fijación con alcohol metílico.Fundamento: se basa en la distinta afinidad que demuestran las células y sus componentes a los distintos colorantes incluidos en el colorante de Giemsa. Técnica: se realiza el extendido de la gota de sangre (gota gruesa del pulpejo del dedo gordo). Resultados erróneos: se deben principalmente a errores durante el extendido sanguíneo o durante la aplicación del fijador. no debe usarse con extendidos de sangre. que ocurre por la mezcla de Giemsa con agua destilada. espiroquetas. los frotis teñidos (delgados) sirven para identificar diferencias morfológicas de protozoarios en células sanguíneas.y COLORACIÓN DE GIEMSA : se emplea en Hematología para observar los elementos sanguíneos normales y en Microbiología para identificar parásitos (protozoarios de la sangre y los tejidos). Utilidad: se emplea principalmente en frotis sanguíneos para observar a los agentes patógenos junto a las células sanguíneas y mostrar las diferencias entre ambos. Utilice una mancha de sangre secada al aire y fije la película al portaobjeto colocándola en alcohol metílico de 70% de tres a cinco minutos. gránulos azul oscuro. Linfocitos: cromatina púrpura oscuro. Neutrófilos: cromatina púrpura oscuro. Observaciones Una tinción satisfactoria debe dar los siguientes resultados: Glóbulos Rojos: rojo amarillento. Otras estructuras se tiñen por una combinación de ambos y se denominan neutrófilos. Los agrupamientos de ácidos nucleicos. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutros fálicos y de color rosado a los eritrocitos. fijan el azul B. Exceso de buffer. Monocitos: cromatina púrpura medio.parásitos o cuando en frotis delgados los resultados son negativos. citoplasma azul pálido y gránulos rojo brillante. Una parte de la solución base concentrada se deberá diluir en diez partes de agua destilada. colorante básico La eosina Y. es así como los ácidos nucleicos se tiñen con azul B que es el básico y la hemoglobina con la eosina Y que es ácida. Eosinófilos: cromatina púrpura oscuro. Empleo de colorante excesivamente ácido. ya que puede obtenerse una cantidad abundante de información a partir del examen de un frotis de sangre periférica bien teñido. hialómero azul claro. así como eosina Y o eosina B. estos también se utilizan para la identificación de Tripanosomas. Causas de error en la tinción del frotis sanguíneo. citoplasma azul grisáceo y gránulos lila Plaquetas: centrómero violeta o púrpura. Solución colorante de Giemsa La solución colorante de Giemsa se usa tanto para manchas de sangre como para manchas de bacterias. Basófilos: cromatina púrpura oscuro. . Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Tiempo tinción excesivamente prolongado.Extensión delgada. Empleo de colorante excesivamente alcalino Una coloración excesivamente rosada (acidófila). citoplasma rosa pálido y gránulos lila. Extensión gruesa. citoplasma azul cielo. microfilarias. La naturaleza ácida o básica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante policromático de Wright. Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación. plasmodios y leishmanias. colorante ácido. pero es muy difícil la identificación estructural de estos. Uno de los inconvenientes del uso de canastillas durante las tinciones es la cantidad de colorante que se requiere. Una extensión excesivamente azul (basófilo). y TINCIÓN DE WRIGHTFUNDAMENTO La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematología este tipo de tinción. las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo. se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas. Lavado insuficiente. Las dos especies más importantes desde el punto de vista clínico son: (infecta los vasos linfáticos y región inguinal) y Técnicas para la coloración de protozoos. Los cubreobjetos no son necesarios a menos que quiera volver sus portaobjetos en permanentes. Se deberá aplicar la solución colorante de uno a dos minutos.Seque el portaobjeto al aire. Muchas soluciones colorantes (generalmente aquellas que son tintes básicos de anilina. Se deberá diluir la solución colorante. como la fucsina básica. largos y delgados. le transmite las larvas. . lavando luego y. el violeta cristal. y MÉTODO DE KLEIN MODIFICADO (Impregnación de plata para tricodínidos)Preparar frotis delgados tanto de piel como de las branquias en un portaobjeto bien limpio. le transfiere las microfilarias y en su interior desarrolla el ciclo infeccioso de las larvas. FILARIAS Son un tipo de gusanos de aspecto filamentoso. añada una gota de bálsamo cuando el portaobjeto esté seco y luego añada un cubre objeto. La hembra puede tener distintas localizaciones en el organismo y es la que produce los micros filarias que alcanzan el torrente circulatorio. vierta una parte de la solución base concentrada en diez partes de agua. Finalmente lave el portaobjeto en agua destilada y séquelo. Se deja secar al ambiente. que suelen aparecer en el tejido linfático enrollados unos a otros. el azul de metileno y la safranina) puede ser usadas para colorear la bacteria. Luego coloque el portaobjeto en un plato o frasco (en el frasco de Coplin. La detección se lleva a cabo en sangre periférica y será necesario realizar varias tomas ya que la presencia en sangre es variable. secando con papel secante. si se cuenta con uno) que contenga solución colorante de Giemsa de 15 a 30minutos. En tal caso. Cuando el individuo es picado por un mosquito. por último. Cuando este mosquito vuelve a pica a otra persona. Puede verse al microscopio a los 5minutos. Montar con bálsamo de Canadá. Preparaciones fijas y teñidas: Aunque los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con unos microorganismos ópticos. El ³extendido´ o ³frote´ se puede hacer de varias maneras: Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequeña gota de agua mediante el asa y distribuyéndolo en el portaobjetos. 20 ml de alcohol al 95% y 15 ml de agua. Técnicas de tinción para bacterias Un colorante. se recomienda el empleo de las siguientes técnicas para la fijación y coloración demetazoos pertenecientes a diferentes clases. se agregan 5 ml de ácido acético glacial a la solución fijadora. Aclarar brevemente con agua. Como regla general los metazoos parasitarios pueden ser preservados para su posterior identificación en una solución fijadora que contenga 10 ml de formol. Chequear las muestras al microscopio. proporciona contraste para observar mejor un organismo completo. Se tiñe con un colorante básico (azul de metileno. cristal violeta. Para tricodínidos marinos o estuarios se recomienda utilizar la solución a una temperatura de 4°C. acentuar las características morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro.Lavar con agua destilada o con agua de lluvia. Exponer el portaobjeto al sol entre 10 ± 30 minutos según el espesor del frotis. Colocar la lámina en alcohol absoluto y después llevarlo axilol. a menudo hay que fijarnos y teñirlos para aumentar la resolución. No obstante. o fucsina básica) durante unos 5 minutos. La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Se tiñen casi todas las .Cubrir el portaobjeto con una solución acuosa al 2% de nitrato de plata durante 7 minutos. Técnicas para la fijación y coloración de helmintos. Esta preparación debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a través de ella. inmediatamente antes de usarse. Se deja secar. Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. la mayoría de los tejidos no se tiñe. Se tiñe con safranina (contraste). Según grupos cromóforos: Colorantes básicos: colorean estructuras ácidas Colorantes ácidos: colorean estructuras básicas Colorantes neutros: colorean estructuras diversas Colorantes indiferentes: colorean por impregnación física Colorantes metacromáticos: tiñen de color diferente al del colorante Según criterios de especificidad General: Específica: colorean estructuras concretas Tinciones diferenciales Tinción de Gram. Las células Gram positivas permanecen tenidas. Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. El color violeta de las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa. distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con una solución de iodo (mordiente). Todas las bacterias se tiñen de rojo. Dos o más colorantes. Las bacterias resistentes permanecen teñidas de rojo. Se decolora con acetona al 95%. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl.bacterias. Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen) Dos colorantes. pero las negativas pierden el colorante. . distingue entre las micro bacterias (ácido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias. se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe . que se observa como una región clara alrededor de la célula. Las endosporas retienen el color verde.todas las demás se decoloran. 1) Tinciones simples En las tinciones simples se usa un único colorante. Por tanto.alcohol resistentes continúan tenidas de rojo. se le añade una mezcla de ácido tánico (mordiente) y del colorante rosanilina. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Las partículas de colorante no pueden penetrar en la cápsula. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. que siempre es de tipo básico como safranina. Tinción negativa Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparación en fresco del espécimen. 2) Tinciones diferenciales Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. el resto de la célula toma el color rosa. hay que añadirlo justo antes del colorante. la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se utilizan solamente para incrementar el contraste. las otras se tiñen de azul. Tinciones selectivas Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin Tiñe selectivamente las endosporas Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se fija el espécimen. se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba. Si se utiliza un mordiente. azul de metileno o cristal violeta. Las bacterias ácido. Tinción de flagelos de Leifson Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas. A continuación. Este paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram. el frotis se tiñe de nuevo con un colorante básico de diferente color al cristal violeta.(y por tanto. Finalmente. En el primer paso de esta tinción. la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia. el colorante primario. mientras que las Gram negativas lo pierden y aparecen incoloras. las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta. se tiñe con el colorante básico cristal violeta (violeta de genciana). ambas aplicadas a bacterias. revela) las células no teñidas por el primer colorante. Por ejemplo. La tinción de acido. dejando a las Gram positivas de color violeta. La safranina es el colorante de contraste más común y tiñen las bacterias Gram negativas de rosa o rojo. Esto es. el yodo aumenta la interacción entre la célula y el colorante. Luego se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona.alcohol resistencia . Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. se trata con una solución yodada que actúa como mordiente. de forma que aquella se tiñe más intensamente. . pueden ser esféricas a elípticas. Esto se debe al elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células. Esta estructura se denomina endosporas pues se desarrolla dentro de la célula. Esta propiedad es la base de la mayoría de los métodos de Tinción de endosporas. excepcionalmente resistentes durante periodos largos de tiempo. Las endosporas no se tiñen bien con la mayoría de los colorantes. las células acido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con una solución acidoalcohólica. Una vez que la fucsina básica ha penetrado en la cella con la ayuda del calor y el fenol. los responsables de la propiedad de ácidoalcohol resistencia. particularmente Mycobacterium no se unen fácilmente a colorantes simples y hay que teñirlas con un tratamiento más fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y fenol. permaneciendo de color rojo. en partículas. agente patógenos responsables de la tuberculosis y la lepra. las bacterias aparecen como cuerpos más claros en medio de un fondo azul oscuro. los ácidos micólicos. Unas pocas especies. resisten intensamente la decoloración. pero una vez teñidos. Apenas se produce modificación de la forma bacteriana y la célula se puede teñir posteriormente para conseguir una mejor visibilidad. por lo que se tiñen de azul con azul de metileno (tinción de contraste). Se mezcla las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden en una capa fina sobre el portaobjetos. técnica que revela la presencia de cápsulas difusa alrededor de muchas bacterias. Este método se emplea para identificar Mycobacterium tuberculosis y M. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium forman una estructura de supervivencia en condiciones ambientales desfavorables. Se puede observar con el microscopio de contraste de fases o mediante tinción negativa. porque la tinta y las partículas de colorantes no pueden penetrar ni la célula bacteriana ni su cápsula. Las endosporas no se tiñen bien o mediante tinción negativa.Leprae. . La extensión de la región de luz está determinada por el tamaño de la cápsula y por la propia célula. Después de secarlo al aire. Las bacterias no ácido-alcohol resistentes se decoloran con la solución acido alcohólico.Es otro método importante de tinción diferencial. con un diámetro menor o superior al de la bacteria madre. La morfología y la localización de las endosporas varían con la especie y son a menudo de un gran valor para la identificación bacteriana. Tinción de estructuras especificas Uno de los más sencillos es la tinción negativa. Con el método de Schaeffer-Fulton. Tinción simple Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente mediante Tinción Simple. esto es. óptico. la preparación con agua para eliminar el resto de colorante y se contratiñe con safranina. Esta técnica revela endosporas de color rosa a rojo tinción de flagelos Los flagelos son estructuras de locomoción en forma de hilo. utilizando solo un colorante. Para observarlos con el M. y tiñéndolos con pararosanilina o fucsina básica. se aumenta su grosor cubriéndolos con mordientes. tan delgados que sólo se pueden observar directamente con el microscopio electrónico. como ácido tánico y alumbre de potasio. las endosporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita. . El valor de esta clase de tinción radica en su simplicidad y facilidad de empleo. Los métodos de tinción de flagelos ofrecen una información taxonómica importante acerca de su presencia y el modelo de su distribución. ni demasiado delgado. Coloca en uno de los bordes del cubreobjetos una gota de rojo neutro y absorbe por el otro extremo con papel de filtro. se cubre con un colorante durante el tiempo adecuado.Lavar con buffer 7. durante 5 o 6 segundos 4.El frotis. previamente fijado.2 y dejar secar 7. Tápala con el cubreobjetos y observa la preparación detenidamente. TÉCNICA 2 y y Formar un círculo de meticelulosa en un portaobjetos. se lava el exceso de colorante con agua y se seca el portaobjetos. Técnicas de Montaje de protozoarios TÉCNICA 1 y Toma una muestra de la infusión y deposita una gota de la misma sobre el portaobjetos..Fijar el frotis con alcohol metílico y dejar secar 3..Observar al microscopio.Lavar con Buffer 7. azul de metileno y carbolfucsina se emplea con frecuencia para determinar el tamaño. . El colorante es básico como cristal violeta. ni que llegue al extremo del portaobjetos 2. Procedimiento: 1. la forma y la organización de las bacterias...Hacer un frotis sanguíneo..Sumergir por 6-8 segundos en el hemoclorante 2 6.2 y sacudir para eliminar exceso 5.. Podrás comprobar cómo los protozoos que observaste se van tiñendo de rojo y siguen moviéndose..Sumergir el portaobjetos en el hemoclorante 1. TÉCNICA 4 y Luego coloque el cubreobjetos. añadimos una gota de azul de metileno y cubrimos la preparación con un cubreobjetos limpio. Sostenga el cubreobjetos a un ángulo de aproximadamente 45° en relación al portaobjeto y hágalo descender lenta y suavemente con alfiler hasta que cubra el agua. Es posible eliminar las burbujas golpeando levemente el cubreobjetos con el extremo romo de un lápiz. Otro método para preparar un portaobjeto mojado provisional (los cultivos de protozoos y algas no pueden ser teñidos utilizando este método) es colocando una gota de solución colorante en uno de los extremos de un cubreobjetos y luego conducir la solución colorante bajo el cubreobjetos absorbiendo el agua con un pedazo de papel filtro desde el lado opuesto del cobre objeto. Montar la preparación con un cubreobjetos. TÉCNICA 3 y y tomamos una gota del cultivo con un gotero y los colocamos en un porta objetos limpio. La solución colorante se esparcirá en el material. Adicione una gota de rojo neutro sobre la muestra. Las vacuolas acidas se teñirán de rojo y las alcalinas de amarillo. y . Observe a 10 x y a 40 x.y y y Con una pipeta Pasteur coloque una gota de cultivo de protozoarios en el centro del anillo. México. LIMUSA. Técnicas biológicas selectas de laboratorio ii de campo.II Gama. 2007. Figueroa Tapia Héctor Hugo.mx/files/MANUAL_PROTISTAS_2011. Argentina. ISBN: 968-18-4988-4.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Gaviño de la torre Gonzalo. 2005. (novena edición) . Tortora.biologia. http:// bios. 2007. biología 1: un enfoque constructivista. editorial médica panamericana.pdf http://es. Juárez López Carlos. 162 p.scribt. Introducción a la microbiología. 343 p.com/doc/29873050/2752-tecnicas-de-colecta-ii-tinción-de-parásitosmicrobiologia.umich. A. pearson educación.