MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIAAna Mendes Ferreira, António Inês, Maria José Saavedra, Arlete Mendes Faia Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro 2009 Manual de aulas práticas de Microbiologia 1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas práticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratório de Microbiologia. Nessas aulas serão utilizados vários grupos de microrganismos, bactérias e fungos, alguns dos quais poderão ser patogénicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras de modo a evitar qualquer tipo de contaminações. 1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ; 2- Não fumar nem comer no laboratório. Não levar à boca qualquer objecto nomeadamente lápis, canetas, etc. Não humedecer etiquetas com a boca; 3 - Manter a superfície da bancada livre de todo o material que não for utilizar durante a experiência; 4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao terminá-lo lavar e desinfectar as mãos; 5 - Desinfectar a superfície da bancada que irá utilizar com álcool a 70%, antes e após a execução do trabalho; 6 - Evitar que objectos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama; 7 - Todo o material usado (pipetas, lâminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri serão colocadas dentro do balde para posterior inactivação; 8 - O estudante com cabelos longos deve apanhá-los, sobretudo quando o trabalho exige a utilização do bico de Bunsen, de forma a não os queimar. 9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspirações indevidas ; 10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do género corte, queimadura, etc. 11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte. 12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilização; 13 - O microscópio deve ser manuseado com cuidado : a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a colocá-la no final; b) As lâminas já observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que está em cima da bancada para o efeito; c) Só deverá remover a lâmina da platina, depois deslocação da objectiva; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 2 Manual de aulas práticas de Microbiologia d) Nunca deixar a lente de imersão suja de óleo, limpando-a com o lenço de papel seco, depois com o lenço embebido em xilol e novamente com o lenço seco. 14 - Não misturar material conspurcado com o material esterilizado. 15 - Durante os trabalhos práticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente. 16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa. 2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA Microscópio- amplifica e ilumina objectos tal como bactérias e outros microrganismos que de outro modo seriam invisíveis; Autoclave - equipamento destinado à esterilização de materiais e meios de cultura utilizados em Microbiologia, por vapor de água sob pressão; Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas máximas até 180-200°C; para incubações, 5°C acima da temperatura ambiente, com temperaturas máximas de 70-100°C; Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50°C) para cultivo de microrganismos; Jarra de anaerobiose- câmara que permite remover o oxigénio do ar, substituindo-o por outro gás, para crescimento de microrganismos anaeróbios; Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura sólidos (Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos; Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios líquidos e sólidos; Tubos Durham- tubos de vidro de dimensões reduzidas utilizados para o aprisionamento do gás produzido pelos microrganismos, em meios líquidos; Pipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, etc. Devem ter um tampão de algodão na extremidade superior; Micropipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, quando se pretendem volumes muito reduzidos; Lâminas e lamelas- para observações ao microscópio; Câmaras de contagem- lâminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem de microrganismos totais numa suspensão; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 3 Manual de aulas práticas de Microbiologia Ansas e agulhas – instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizável à chama antes e após utilização, usado para transferir culturas de microrganismos; Para além deste material, há outro tipo de equipamento que é necessário ter num laboratório de Microbiologia nomeadamente – frigorífico, balança, aparelho de destilação e desionização de água, banho-maria, centrífuga, agitadores magnéticos, filtros de esterilização. 3- LIMPEZA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL Num laboratório de Microbiologia devem ser mantidas condições de higiene apropriadas na medida em que se trabalha com uma grande variedade de microrganismos, alguns dos quais poderão ser patogénicos. O chão deve ser lavado e desinfectado diariamente; As bancadas e todas as superfícies devem ser convenientemente desinfectadas com álcool a 70%; As placas de Petri com culturas devem ser previamente esterilizadas (121°C durante 20-25 min.) para inactivação das culturas. Após a esterilização o meio de cultura é escorrido e as caixas são lavadas com água e detergente e posteriormente mantidas algumas horas nesta solução. Depois são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água destilada. As caixas são embrulhadas em papel e esterilizadas a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur; Os tubos com culturas são submetidos ao procedimento descrito anteriormente. São esterilizados a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur. Quando contêm meios de cultura são esterilizados em autoclave a 121°C durante 15 min. As pipetas são lavadas com água corrente e posteriormente mantidas algumas horas numa solução com detergente. Depois são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água destilada. Depois de secas, coloca-se um tampão de algodão na parte superior. São colocadas em caixas apropriadas ou embrulhadas em papel antes da esterilização a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur; As lâminas e lamelas utilizadas nas observações ao microscópio são colocadas numa solução com detergente. Depois de lavadas devem ser colocadas numa mistura cromo-sulfúrica durante a noite e posteriormente lavadas. Notas importantes: Flamejar as ansas antes e depois do contacto com as culturas. Deixar arrefecer a ansa antes de tocar na colónia da cultura; Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 4 Manual de aulas práticas de Microbiologia Flamejar as aberturas dos tubos de ensaio, após a abertura e antes da colocação da tampa. Manter a tampa na mão por pressão do dedo mínimo; A abertura da tampa da placa de Petri deve ser cuidadosa, devendo ser manuseada junto à chama. 4 - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA O crescimento microbiano está dependente da presença de água e de nutrientes indispensáveis à biossíntese de material celular e à obtenção de energia. As exigências nutritivas e as condições ambientais que asseguram o crescimento são dependentes do tipo de microrganismo. No cultivo de microrganismos são utilizadas soluções de substâncias que funcionam como nutrientes necessários ao seu crescimento e multiplicação celular. Estas soluções designadas por meios de cultura têm uma composição variável com as exigências nutricionais de cada espécie. Os meios de cultura podem ser líquidos (caldo), semi-sólidos ou sólidos (1,5 a 2% de agar). O agar é um agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extraído de algas marinhas, que se liquefaz a 100°C e solidifica a 40°C. Quanto à composição química, são designados por meios sintéticos – quando quimicamente definidos; e complexos - com composição química desconhecida (com extracto de levedura, extracto de carne, extracto de malte, peptona, ou triptona, por exemplo). Quanto à função, os meios de cultura podem ser: meios de enriquecimento – formulados para permitirem o crescimento de microrganismos mais exigentes; meios selectivos – formulados para o crescimento de uns em detrimento de outros; e meios diferenciais – formulados para distinguir microrganismos que possuam determinada característica bioquímica. Material necessário: Erlenmeyer; Balança; Água destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos de ensaio Preparação de agar nutritivo (Como exemplo) 1- Pesar individualmente 5 g de peptona e 3 g de extracto de carne (usar espátulas bem limpas e limpar entre pesagens). Não voltar a introduzir o excesso no frasco. 2- Adicionar os ingredientes a 500 ml de água destilada colocada num Erlenmeyer de 2000 ml. 3- Homogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura até que se verifique a dissolução completa dos ingredientes. 4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar. 5- Adicionar água destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml. 6- Acertar a pH 7.0 com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico 1N, a uma temperatura de 60 °C. Lavar rapidamente os eléctrodos do potenciómetro. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 5 Composição do agar nutritivo: • Extracto de carne ......Manual de aulas práticas de Microbiologia 7...............Isolamento de colónias em meio sólido Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 6 ..................8-7. Para isso é necessário obter em primeiro lugar uma cultura pura do isolado (colónia obtida a partir de uma única célula)....... Há um conjunto de técnicas básicas de repicagens e sementeiras de modo a preservar o organismo.. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos Notas importantes: A adição do agar aos meios deve ser sempre feita no final.... depois de todos os ingredientes estarem dissolvidos.......... A principal fonte de contaminação externa é a atmosfera por isso a manipulação dos organismos terá que ser efectuada em condições de assepsia....... O meio de cultura deve ser esterilizado logo após a sua preparação..................... previamente esterilizados.Repartir o meio por 3 balões de 500 ml........... Os frascos não devem ter as rolhas completamente apertadas durante a esterilização... 3g 5g 15 g 1000 ml Acertar a pH 6............ Rolhar e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.............TÉCNICAS UTILIZADAS NA CULTURA DE MICRORGANISMOS O estudo de microrganismos no laboratório envolve o seu crescimento e manutenção em meios de cultura.......0........ Material necessário -Culturas de microrganismos -Placas de Petri com agar nutritivo -Tubos com caldo nutritivo -Tubos com agar nutritivo inclinado -Tubos com agar nutritivo -Ansas e agulhas -Pipetas -Estufa Procedimento 1.. • Peptona .. 5 .......... Os fracos não devem conter mais de metade do seu volume......... • Agar ..... • H2O destilada ......... Sementeira por esgotamento (streak plate) – isolamento e obtenção de cultura pura Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida.Manual de aulas práticas de Microbiologia Por espalhamento. Espalhar uniformemente com auxílio de um semeador (vareta de vidro dobrada) ou com pérolas de vidro esterilizadas de modo a que as células fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colónias individualizadas. Para agar em tubo. Incubar os tubos à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.Repicagem de colónias Para agar inclinado. retire uma porção de colónia que pretende isolar e espalhe à superfície da placa de Petri de modo a que as células fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colónias individualizadas. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.1 ml de uma cultura líquida para a superfície da placa de Petri. retire uma porção de colónia que pretende guardar e ou fazer crescer e espalhe à superfície do agar inclinado. retire uma porção de colónia que pretende guardar e/ou fazer crescer e introduza por picada dentro do agar.Retirar 0.Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 7 . Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar as placas à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. Incubar as placas à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.Com auxílio de uma agulha previamente aquecida ao rubro e arrefecida. Identificar a placa com o nome do operador e a data. 2. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 8 .Sementeira à superfície da gelose inclinada Nota: Após a obtenção de uma cultura pura de um isolado.Manual de aulas práticas de Microbiologia Figura 1. Podem ser refrigeradas a 4°C ou congeladas (-18°C) por períodos curtos ou por períodos mais longos a -70°C ou liofilizadas. a cultura deve ser mantida em laboratório de modo a que as células permaneçam viáveis e sem contaminações. Passar o cotonete sobre a superfície do meio de cultura. Espalhar a solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador. 2. Incubar as placas a 37°C durante 3 dias. 3.Pesquisa de microrganismos de outros ambientes Passar um cotonete estéril entre os dedos. na água e principalmente no solo.Pesquisa de microrganismos do ar Retirar a tampa de várias placas de Petri com agar nutritivo e manter abertas durante 5. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Identificar a placa com o nome do operador e a data. 4. Desenvolvem-se logo que as condições ambientais (nutrientes. Identificar a placa com o nome do operador e a data.Pesquisa de microrganismos do solo Pipetar 100ul da solução de solo e colocar numa placa de Petri com o meio de cultura.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 1 Diversidade e ubiquidade dos microrganismos Os microrganismos existem no ar. pode crescer e do qual pode ser isolado. 10 e 15 minutos. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. antes e após a lavagem das mãos. humidade e temperatura) sejam favoráveis ao seu crescimento. Cada organismo aparece pelo menos num habitat natural específico no qual pode ser normalmente encontrado. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfície do meio de cultura. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 9 . Do solo podem ser arrastados pelo vento através das partículas de poeira. Objectivos: Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos Material necessário -Placas de Petri com meio de agar nutritivo -Pipetas -Estufa -Zaragatoas Procedimento 1.Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas Passar um cotonete estéril sobre uma superfície da bancada antes e após a sua desinfecção com álcool a 70%. -Descrever o tipo de colónias com base na descrição apresentada na Fig. Quadro – Caracterização das colónias observadas Características das colónias Dimensão (mm) Cor Forma Elevação Margem Representação Escolher 2 ou 3 colónias que considere mais interessantes. Desenhe cada uma das suas observações no Quadro: Observação das células retiradas da colónia 1 Observação das células retiradas da colónia 2 Observação das células retiradas da Colónia 3 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 10 . Resultados: -Examinar as placas e contar o número de colónias totais e o número de colónias diferentes em cada placa. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. Observar ao microscópio. Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar) numa lâmina e cobrir com uma lamela.Manual de aulas práticas de Microbiologia Identificar a placa com o nome do operador e a data. -Registar os resultados.1. Manual de aulas práticas de Microbiologia Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 11 . Descrição de vários tipos de colónias Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 12 .Manual de aulas práticas de Microbiologia FORMA Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Pevide ELEVAÇÃO Plana Elevada Convexa Em abóbada Mamilonada MARGEM Inteira Ondulada Lobada Irregularmente crenada Filamentosa Frisada Figura 2. sarcinas (agrupamentos de oito cocos em cubo). forma-se um septo que vai gradualmente progredindo até à formação de duas células. Reproduzem-se por cisão binária. cilíndricas (bacilos) e espirais (espirilos e espiroquetas). distinguir microrganismos por coloração do meio envolvente e distinguir microrganismos Gram positivo e Gram negativo. Material necessário -Culturas de microrganismos Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 13 . Figura 3. Os bacilos também podem aparecer isolados. As preparações coradas permitem observar características morfológicas e evidenciar diferenças entre espécies (Bactérias Gram positivo e Gram negativo). Staphylococcus (cocos em cacho). forma e arranjos bacterianos Objectivos: Observar células vivas e mobilidade. Após o alongamento da célula. aos pares e em cadeia. Com base no número e no plano de divisão celular. Estas podem separar-se ou não umas das outras. O exame das bactérias pode ser feito directamente da suspensão. através de preparações a fresco em gota pendente. tétradas (agrupamentos de quatro cocos). as células podem apresentar-se sob as seguintes formas: Diplococcos (cocos aos pares). Streptococcus (cocos em cadeia). O tamanho das células é variável.Morfologia: Tamanho.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 2 Morfologia bacteriana e métodos de coloração As bactérias são organismos unicelulares que podem apresentar formas esféricas (cocos). Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lâmina. Limpar com papel absorvente. colocando-a verticalmente à chama de um bico de Bunsen até ficar ao rubro. Coloração simples. Cobrir com uma lâmina de modo a que a gota fique no centro da zona escavada. -Corar pelo método escolhido.Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Deixar arrefecer. -Esterilizar a ansa. -Colocar uma gota de água na secção delimitada.Deixar secar ao ar. Observação de mobilidade (preparação de gota pendente) .Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lamela. Observar ao microscópio. adicionar uma gota de azul-de-metileno e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. .Manual de aulas práticas de Microbiologia -Microscópio -Ansas -Lâminas e lamelas -Azul de metileno -Tinta da China -Reagentes para a coloração de Gram Procedimento Retirar as lâminas limpas do contentor que se encontra em cima da bancada. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 14 . Manipular tocando apenas nos bordos das lâminas. Identificar a lâmina numa extremidade. Observação a fresco. Deixar arrefecer. Observar ao microscópio. Colocar nos cantos da lamela um bocado de vaselina. -Retirar com a ansa uma porção da colónia e misturar com a água colocada na lâmina. -Fixar passando a face inferior da lâmina 3 vezes através da chama. Preparação dos esfregaços -Marcar na parte inferior da lâmina uma pequena área onde se irá fazer a preparação. -Lavar cuidadosamente e deixar secar ao ar Coloração negativa. lavada e seca antes de se adicionar a nigrosina. Deixar actuar durante 1 minuto. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 15 . Cobrir com safranina. Passar por água. espalhar muito bem uma gota de nigrosina (10%) sobre a preparação. Deixar actuar durante 30 segundos. Colocar algumas gotas de verde malaquite (solução aquosa a 5%). Deixar actuar durante 1 minuto.Após fixar. Esta coloração poderá ser usada na observação de cápsulas. Cobrir o esfregaço com um quadrado de papel de filtro.Passar por água e secar. Cobrir com safranina.Manual de aulas práticas de Microbiologia Coloração simples com fixação. -Cristal de violeta (1 minuto) -Azul de metileno de Loeffler (5 minutos) -Fucsina (30 segundos). Lavar com água e secar com papel absorvente. Deixar secar o corante e observar com a lente de imersão. Neste caso a preparação é previamente corada com fucsina. Colocar algumas gotas de Lugol (mordente que aumenta a reacção entre o cristal de violeta e as células). Coloração diferencial de Gram Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas na tina de lavagem. Colocar algumas gotas de cristal de violeta. Passar por água e secar com papel de filtro. Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão. Retirar o excesso do corante e passar por água. Lavar com água e secar com papel absorvente. Coloração de esporos Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas sobre o contentor com água em ebulição. Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão.Após fixar. Descorar com álcool a 95% durante 10 a 20 segundos. deixar arrefecer e adicionar uma das soluções apresentadas de seguida. Deixar actuar durante 5 minutos. Deixar actuar durante 30 segundos. deixando actuar durante o tempo referido para cada uma delas. micélio. Estas hifas penetram no substrato. 1. apresentando uma estrutura micelial ou unicelular dependendo das condições do meio. Cada filamento (hifa) assemelha-se a um longo tubo cilíndrico em que as células se distinguem umas das outras devido à existência de septos (hifa septada) ou sem separação das células (hifas cenocíticas). As hifas fertéis exibem normalmente as estruturas de reprodução que permitem classificar e identificar os fungos. Reproduzem-se por esporos que podem ser formados sexuada ou assexuadamente.Fungos filamentosos Os fungos são constituídos por uma massa de filamentos muito finos (micélio). Alguns fungos podem ser dimórficos.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 3 Morfologia e estrutura dos fungos Os fungos são organismos não-fotossintéticos que podem apresentar uma forma filamentosa (fungos filamentosos) ou unicelular (leveduras). Os fungos são constituídos por hifas vegetativas designadas por talo. Objectivos: Observação das estruturas de vários fungos – hifas. Figura 4. tendo algumas funções semelhantes às raízes das plantas (rizoides). células e estruturas de reprodução.Morfologia e estrutura de alguns fungos filamentosos Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 16 . Outras. Material necessário -Culturas de leveduras. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 17 .Leveduras As leveduras são fungos unicelulares que se reproduzem assexuadamente por gemulação ou cisão. Por vezes. Preparar lâminas com e sem adição de lactofenol.Manual de aulas práticas de Microbiologia Material necessário -Culturas de fungos -Microscópio -Ansas -Lâminas e lamelas -Lupa Procedimento Comparar macroscopicamente as colónias de diversas culturas de fungos que lhe são fornecidos. -ansas. cilíndricas. A morfologia das leveduras é bastante variada. as gémulas não se separam da célula mãe formando longas cadeias de células que se designa por pseudomicélio. adicionar uma porção de colónia e cobrir com uma lamela. triangular e até em forma de garrafa. Descrever as estruturas reprodutivas dos vários fungos (fazer um desenho). -Microscópio. adicionar uma porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. em forma de limão. quando cultivadas em determinadas condições formam verdadeiro micélio (dimorfismo). -Lâminas e lamelas. ovais elípticas. 2. Procedimento Examinar macroscopicamente as colónias de diversas leveduras. Resultados Descrever as características das colónias observadas. Observar ao microscópio. etc. hifas. Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina. Apresentam células esféricas. Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina. Manual de aulas práticas de Microbiologia MORFOLOGIA DAS LEVEDURAS OVOIDE Dekkera bruxellensis ESFÉRICA Saccharomyces cerevisiae CILÍNDRICA Pichia membranaefaciens GARRAFA APICULADA Kloeckera apiculata Pitysporum ovale TRIANGULAR Trigonopsis variable Figura 5.Morfologia das leveduras Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 18 . Em determinadas circunstâncias um profago pode ser activado. XX Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 19 . corresponde à forma inerte do vírus. e deste 1 Os bacteriófagos (fago: do grego phagein: comer) “comedores de bactérias” foram descobertos por Frederick Twort e Felix d’Herelle na 2ª década do sec. Estas placas são zonas transparentes sobre uma camada de células hospedeiras. ou simplesmente fagos. aquando do processo de libertação das partículas virais. O tamanho das placas é dependente dos tempos de replicação quer dos vírus quer das bactérias hospedeiras. sendo transmitido à descendência bacteriana como parte integrante do seu genoma. A replicação dos fagos está ainda restrita a certas espécies/estirpes bacterianas. replicar-se e induzir o ciclo lítico dando origem à libertação de novos fagos. podem ainda ser revestidos por um invólucro (envelope) constituído por proteínas e fosfolípidos. Existe uma enorme especificidade entre os vírus e as suas células hospedeiras compatíveis. (2) injecção do genoma do fago para o interior da bactéria. Alguns. Este processo de multiplicação é designado por ciclo lítico e os bacteriófagos são designados por fagos líticos.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático nº4 Titulação de uma suspensão de bacteriófagos líticos por contagem de placas fágicas Os vírus são entidades biológicas acelulares constituídos apenas por um ácido nucleico (DNA ou RNA) designado por nucleóide. Este processo é designado por ciclo lisogénico e os bacteriófagos são designados por fagos temperados. O estado extracelular. Por isso podem ser detectados por diluição e espalhamento em superfícies de agar inoculadas com células hospedeiras para a formação de placas fágicas. Todos os vírus podem apresentar dois estados: extracelular ou intracelular. outros em fungos. As bactérias que transportam no seu cromossoma um genoma viral (profago) são designadas por lisogénicas. O conjunto da cápside e nucleóide designa-se por nucleocápside. Como resultado de ciclos líticos subsequentes. (3) replicação do genoma viral. envolvido por uma cápsula proteica. (4) maturação em que após a formação de todos os componentes virais e consequente montagem dá origem à formação de novos fagos. adquiridos da membrana da célula hospedeira. Deste modo. (5) libertação dos novos fagos com ruptura da célula infectada. as células hospedeiras nessas zonas são destruídas. Os bacteriófagos1. designada por cápside. são vírus que se replicam apenas no interior de bactérias. designado por partícula viral ou virião. O ciclo de multiplicação dos fagos envolve as seguintes fases: (1) adsorção a receptores específicos da superfície. outros em algas e outros em protozoários. os vírus são considerados parasitas intracelulares obrigatórios uma vez que o processo de multiplicação viral é estritamente dependente da maquinaria da célula hospedeira. e representam o ponto sobre o qual uma partícula viral infecciosa foi depositada. No estado intracelular ocorre a replicação do ácido nucleico viral e a produção de novas partículas virais. Assim existem vírus que se replicam apenas no interior de células animais. sob a qual é transmitido entre células hospedeiras. A contagem de placas fágicas é por isso análoga à contagem de colónias bacterianas em caixa de Petri. Por vezes o genoma do fago não se replica mas integra-se no cromossoma bacteriano. outros em células vegetais. Os vírus líticos provocam a lise da célula bacteriana hospedeira aquando da sua libertação. 0) a cada um dos tubos anteriores. Misturar os conteúdos dos tubos por agitação suave (evitar a formação de bolhas) e em seguida derramar e espalhar uniformemente sobre a superfície da camada de LBs das caixas 2 O fago T7 é um dos vários colifagos que infecta estirpes de Escherichia coli. i. Preparar diluições seriadas (10-1 até 10-8) da suspensão fágica. adicionando (0. a contagem de placas fágicas pode ser usada para determinar o título.Manual de aulas práticas de Microbiologia modo. na suspensão inicial. cauda curta. 3. Objectivos: Contagem de placas fágicas Material necessário Por grupo: 8 eppendorfs com 0. não contráctil e pertence à família Podoviridae (Para mais informações consultar http://www. Identificar as caixas de petri previamente preparadas com as diluições efectuadas (10-1 até 108 ).1 ml de cada diluição e colocar nos respectivos tubos.nih. Identificar os tubos vazios esterilizados com as diluições realizadas.1 ml da cultura bacteriana hospedeira (DO600nm≈1. distribuir o meio de cultura LBs (sólido) pelas caixas de Petri formando uma camada fina no fundo. Adicionar a cada um dos tubos (ponto 3.) 5 ml do meio LBss contido nos tubos mantidos em banho a 50 ºC. Possui uma molécula linear de DNA em cadeia dupla. (Consulte o fluxograma em anexo como um auxiliar durante o procedimento experimental) 1. Apresenta cabeça.htm) Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 20 . 2. a concentração de partículas fágicas. Adicionar 0. Fundir o meio LBss (semi-sólido) e manter os tubos em banho a 50 ºC.nlm. 5.gov/ICTVdb/ICTVdB/54010001.e.1 ml) da suspensão inicial ao meio líquido estéril LB (0. Retirar 0.9 ml/eppendorf). Deixar solidificar.ncbi. 4.9 ml de meio LB 8 tubos com 5 ml de meio LBss (mantidos em banho a 50 ºC) 8 tubos vazios esterilizados 1 erlenmeyer com 100 ml de meio LBs (mantido em banho a 50 ºC) 8 caixas de Petri esterilizadas 1 micropipeta 1 caixa com pontas amarelas esterilizadas 1 tubo com a cultura de células hospedeiras (Escherichia coli 5911) 1 eppendorf com a suspensão do fago T72 Procedimento No ínicio da aula. 1 ml da cultura de células hospedeiras isoladamente como controlo. coli Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 21 .0 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição x 10 placa fágica “camada” de E. 7. Deixar que o agar solidifique e incubar as caixas a 37 ºC durante 24 horas.Manual de aulas práticas de Microbiologia de petri correspondentes. Resultados Observar as caixas e determinar o nº de placas fágicas (“plaque-forming units”-pfu). Inocular 0. por ml da suspensão original.1 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição Como apenas foram plaqueados 0. Apenas as caixas contendo 30-300 placas fágicas devem ser consideradas. partículas fágicas infecciosas. pfu/0. (Nota: deve preparar 1 tubo de cada vez para evitar que o meio solidifique). 6.1 ml deve multiplicar-se por 10 para obter pfu/ml pfu/1. Manual de aulas práticas de Microbiologia Procedimento experimental Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 22 . Curva que representa o crescimento microbiano em sistema fechado. um volume conhecido de uma suspensão microbiana é espalhado uniformemente à superfície do meio de cultura (técnica de espalhamento) ou misturado com o meio ainda liquefeito (método de incorporação). Para distinguir células viáveis (com capacidade para se multiplicar) de não viáveis é necessário cultivar as células num meio de cultura adequado ao crescimento da espécie em causa. as colónias são contadas (30 a 300) e os resultados são expressos em unidades formadoras de colónias (ufc). recorrendo às Tabelas de MacGrady. O cálculo do número mais provável de microrganismos será efectuado com base no número de tubos positivos. em batch (sistema descontínuo) Objectivos: Comparação de métodos de avaliação do crescimento microbiano Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 23 . Nas diluições mais elevadas não haverá crescimento em todos os tubos.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 5 Avaliação do crescimento microbiano O perfil de crescimento de uma população microbiana pode ser avaliado através da determinação periódica do número de indivíduos. da massa celular ou através da actividade celular. O processo mais usual é o de contagem directa ao microscópio. Para o efeito. O número de células viáveis pode ser também estimado através de diluições sucessivas da suspensão em análise (3 a 5 tubos para cada diluição). Após alguns dias à temperatura adequada. A massa celular pode ser determinada directamente através do peso seco ou indirectamente por turbidimetria. Figura 6. utilizando câmaras de contagem que permitem determinar o número total de células. 0025 mm2.Procedimento para avaliação quantitativa de uma população microbiana . o número de microrganismos/ml será igual ao valor médio por quadrado x 4 x 106. Para que o valor seja mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e determinar a média. cada um com uma área de 1/400 mm2).Contagem de células em câmara Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 24 . Cobrir com a lamela. profundidadexáreadoquadrado N= valor médio de microrganismos por quadrado Numa câmara em que a profundidade seja de 0. Figura 7.Avaliação quantitativa de uma população microbiana .1 mm e a área do quadrado de 1/400 = 0.Contagem em câmara Material necessário -Culturas de microrganismos -Microscópio -Câmara de contagem Procedimento Colocar na câmara uma gota da suspensão de microrganismos. Resultados O número de microrganismos/ml = Nx 1 x1000 .Manual de aulas práticas de Microbiologia 1. Contar o número de células por quadrado (Na zona central estão gravadas duas grelhas que são constituídas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados. Homogeneizar muito bem num agitador Fazer isto sucessivamente até obter a diluição desejada que permita contar as ufc.Determinação do número de células viáveis .Determinação do número de células viáveis – contagem em placa Procedimento Pipetar 1 ml da suspensão da cultura para um tubo com 9 ml de água estéril (diluição de 1:10).Contagem em placas Material necessário -Culturas de microrganismos -Tubos de ensaio com 9 ml de água estéril (solução salina) -Placas de Petri com meio apropriado à cultura -Agitador de tubos -Pipetas esterilizadas de 1 ml Figura 8 . Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. Homogeneizar muito bem num agitador. Transferir 1ml do tubo da diluição 1 para um segundo tubo 2 com 9 ml de água estéril (diluição de 1:100). data e nome do operador).1 ml de cada uma das diluições (Identificar cada uma das placas com a diluição respectiva. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 25 . Espalhar uniformemente em placas de Petri 0.Manual de aulas práticas de Microbiologia 2. Determinar o valor médio de colónias por placa e multiplicar pelo factor de diluição. Transferir para a cuvete caldo não inoculado e acertar a absorvância a zero. por contagem em placa e por turbidimetria. Proceder à leitura da absorvância (DO). para a mesma suspensão de células. 3.Manual de aulas práticas de Microbiologia Resultados Escolher o número de placas que contenham 30 a 300 colónias e efectuar a contagem. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 26 . Figura 8 – Avaliação do número de células por turbidimetria Resultados Relacionar os valores obtidos por contagem directa ao microscópio. O resultado será expresso em ufc/ml.Avaliação do crescimento por turbidimetria Material necessário -Culturas de microrganismos -Tubos de ensaio com água estéril (solução salina) -Agitador de tubos -Pipetas esterilizadas de 1 ml -Espectrofotómetro Procedimento Ligar o espectrofotómetro e acertar o comprimento de onda a 640 nm. Transferir as suspensões bacterianas para cuvetes do espectrofotómetro (pode ser necessário diluir as amostras). 4 1.2 0.6 0.5 tubos por diluição Nº Caract.1 0.5 4.0 1.5 4.4 1.5 3.0 17. 7.5 3.6 0.0 3.Manual de aulas práticas de Microbiologia Tabelas de MacGrady para determinação do NMP de microrganismos .4 0.5 6.5 8.5 4.2 0.0 11.0 6.6 0.9 1.1 1.4 1.0 14.7 2.5 16.0 20.0 140.0 0. 203 210 211 212 220 221 222 230 231 240 300 301 302 310 311 312 313 320 321 322 330 331 340 341 350 Nº Microrg. 400 401 402 403 410 411 412 420 421 422 430 431 432 440 441 450 451 500 501 502 503 504 510 511 512 Nº Microrg.5 5.5 20. 120 121 130 200 201 202 210 211 212 220 Nº Microrg.2 1.5 3.5 2.4 1. 1.0 3.3 tubos por diluição Nº Caract.3 0.9 1.0 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 27 .0 17.0 4.4 0. 0.1 0.5 1.8 1.5 0.0 2. 1.0 3.4 2.7 0.0 35. 221 222 223 230 231 232 300 301 302 310 Nº Microrg. 513 520 521 522 523 524 525 530 531 532 533 534 535 540 541 542 543 544 545 550 551 552 553 554 555 Nº Microrg.6 0.0 5.0 60.0 2.0 30.0 9.0 2.0 9.4 0. 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 Nº Microrg.6 0.0 3.2 1.5 4.6 0.5 15.0 2.0 30.6 0.7 2.0 2.4 0.9 Nº Caract.0 Nº Caract.0 .8 0.1 Nº Caract.0 13.1 1.0 25.4 0.5 4.5 11.0 4.0 7. 1.0 0.6 0.3 1.6 0.8 1.0 2.0 0. 8.5 3.5 Nº Caract. 000 001 002 010 011 012 020 021 030 100 101 102 103 110 111 112 120 121 122 130 131 140 200 201 202 Nº Microrg.7 1.0 2.0 7.8 1.3 0.0 25.0 110. 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 Nº Microrg.5 2.5 4.8 0.4 0.0 3.4 1.5 12. 3.0 25.0 35.0 17.0 2.0 2.2 0.0 1.5 1. 0.0 Nº Caract.2 0.1 1.0 6.0 90.0 45.9 1.7 0.5 Nº Caract.0 1.0 1.2 0.7 2.7 1.0 180.7 2.7 2.0 15.4 0.0 45.0 4.0 25.0 160.5 2. Figura 9 – Classificação dos microrganismos com base na temperatura óptima Objectivos: Avaliar o efeito dos factores físicos (temperatura e pH) no crescimento microbiano. 5. mesófilos e termófilos e hipertermófilos. é caracterizada por três temperaturas cardeais – temperatura mínima. máxima e óptima de crescimento. Estes valores permitem agrupar os microrganismos em psicrófilos. aerotolerantes e micro-aerofílicos. o pH. 7. em condições experimentais bem definidas. a pressão osmótica e o potencial de oxidação/redução do meio. existindo microrganismos aeróbios e anaeróbios estritos. aeróbios facultativos. Material necessário -Culturas de microrganismos -Placas com meio de cultura -Tubos com meio de cultura com diferentes valores de pH – 3. O comportamento dos microrganismos relativamente ao oxigénio disponível é heterogéneo. A temperatura é um dos factores que mais afecta o crescimento e a sobrevivência dos microrganismos.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 6 Avaliação do efeito de alguns factores físicos no crescimento microbiano O crescimento de um microrganismo é afectado pela disponibilidade de nutrientes e por um conjunto de factores físicos como a temperatura. Cada espécie. 9 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 28 . Incubar a 5.Efeito do pH Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura a diferentes valores de pH. 25 e 55°C durante 3 a 7 dias. Figura 10 – Classificação dos microrganismos com base nos valores de pH óptimo de crescimento Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 29 . 2.Efeito da temperatura Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. Comparar o crescimento observado em cada tubo.Manual de aulas práticas de Microbiologia Procedimento 1. Resultados Verificar os efeitos do pH e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos. para o mesmo microrganismo. para o mesmo microrganismo. Comparar o crescimento observado em cada tubo. Efeito da temperatura Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura. a filtração e as radiações. isto é. A esterilização pode ser atingida por processos físicos e químicos. 10 e 15 minutos. semear 0. Incubar as placas 30°C durante 3 dias. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 30 . Retirar as tampas e colocar as placas sobre uma lâmpada UV. Resultados Verificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos microrganismos. Comparar o crescimento em cada placa.Efeito das radiações UV Semear 3 placas com o mesmo microrganismo. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. 20 e 30 minutos. Farmacêutica e Alimentar.Tubos com meio de cultura líquido Procedimento 1. protegida com cartolina. Entre os processos físicos pode utilizar-se o calor. 2. Retirar uma placa ao fim de 10.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 7 Controlo do crescimento e morte dos microrganismos por métodos físicos A morte de microrganismos.temperatura e radiações UV. Observar o crescimento do microrganismo nas três condições. Verificar o efeito das radiações no crescimento de cada um dos microrganismos.1 ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas diferentes para uma placa. Objectivos: Avaliar o efeito letal de alguns agentes físicos . Introduzir os tubos num banho-maria a 70 °C durante 5. Material necessário -Culturas de microrganismos -Placas com meio de cultura . Após o tempo referido. é um aspecto fundamental no controlo de microrganismos no laboratório e na Indústria. a perda irreversível da viabilidade. Estes catalisadores permitem o transporte e utilização de nutrientes indispensáveis à síntese de material celular e à obtenção de energia.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 8 Actividade enzimática dos microrganismos As enzimas são proteínas promotoras de reacções químicas específicas na célula. como por exemplo o amido. Objectivos: Avaliação de actividades enzimáticas em alguns microrganismos. utilizando os seus componentes (glucose e maltose) nos diversos processos metabólicos.Hidrólise de polímeros Amilases Proteases 2. pela análise dos metabolitos finais produzidos ou pela pesquisa de determinada enzima. A utilização de um determinado substracto pode ser característica de uma dada espécie. álcoois e gás como produtos finais.Reacções respiratórias Catalase Citocromo oxidase 4. associada à observação morfológica das células microbianas e às suas características culturais em meios de cultura sólidos e/ou líquidos. não há reacção com o iodo. são alguns indicadores utilizados em Microbiologia na identificação de microrganismos. Apresentação de alguns testes bioquímicos usados na detecção e ou identificação de alguns microrganismos 1. A capacidade de utilização de substratos específicos. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 31 . Ao juntar-se uma solução de iodo a um meio de cultura com amido forma-se um complexo com cor azul se não tiver sido hidrolizado. permitindo a sua identificação. Caso contrário.Outras reacções Urease 1.Reacções de fermentação Fermentação de açúcares Produção de sulfetos Reacções ImVic 3.Pesquisa de amilase Alguns microrganismos hidrolizam moléculas orgânicas de elevado peso molecular. produzindo ácidos. Outros utilizam moléculas mais complexas como a celulose e o amido. Algumas bactérias fermentam hidratos de carbono simples. -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e sacarose (Com tubos Durham). Identificar as secções. Identificar cada um dos tubos com a espécie inoculada e com açúcar adicionado. Incubar as placas a 37ºC durante 24 horas. 2. Incubar as placas a 37ºC durante 24 a 48 horas. Semear uma das secções com E.Fermentação de açúcares simples Os principais critérios fisiológicos de identificação de microrganismos assentam na fermentação e na assimilação de fontes de carbono. Para verificar a produção de gás é introduzido (antes da esterilização). Resultados: Após o aparecimento das colónias. colocar algumas gotas de solução de iodo e verificar o aparecimento ou não da cor azul. -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e lactose (Com tubos Durham). aos quais se adiciona o açúcar a testar. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 32 . Procedimento Inocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios. um tubo Durham invertido. Coli e a outra com Bacillus subtilis. A fermentação de açúcares simples é avaliada em tubos com meio de cultura líquido. A produção de ácidos é confirmada pela alteração da cor do indicador. -Tubos de Caldo com vermelho de fenol e glucose (Com tubos Durham).Manual de aulas práticas de Microbiologia Material necessário -Culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis -Solução de iodo -Placas de Petri com meio de agar de amido Procedimento Inverter uma placa de Petri e dividi-la em duas secções com um marcador. Material necessário -Culturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris. A detecção desta enzima é particularmente útil para fazer a distinção entre algumas espécies Gram negativo. -Água oxigenada (3%). Tomar nota dos resultados obtidos em cada uma das espécies. Material necessário -Lâminas. Resultados: Verificar se há ou não desprendimento gasoso. -Culturas de Lactobacillus sp. B. por exemplo.produção de gás N.sem modificação de cor do indicador Espécie Glucose Modo de utilização dos açúcares Lactose Sacarose 3.produção de ácido. Adicionar uma gota de água oxigenada a 3%.. A maioria dos seres vivos possui catalase.alcalinização do meio G. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 33 . Pesquisa do Citocromo oxidase A citocromo oxidase é uma enzima que transfere electrões para o O2 no final da cadeia de transporte de electrões. enzima que destrói o peróxido de hidrogénio.Reacções respiratórias Pesquisa de Catalase Este teste bioquímico é utilizado para comprovar a presença de catalase. -Culturas de Bacillus sp.Manual de aulas práticas de Microbiologia Resultados: Tomar nota das reacções obtidas no quadro com base nos seguintes símbolos: A. Pseudomonas aeruginosa de Escherichia coli. Procedimento: Colocar numa lâmina uma porção de cultura. originando H2O e O2. Resultados: Verificar a alteração da cor.Pesquisa de outras enzimas Pesquisa de Urease Alguns microrganismos utilizam a ureia como fonte de azoto.2 tem cor violácea). Procedimento Inocular um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli . Procedimento Misturar a cultura em estudo com uma solução de tetrametil-parafenildiamina. Incubar a 37 ˚C durante 24 horas. Resultados: Verificar a alteração da cor do meio e preencher o quadro: Espécie Cor inicial do meio Cor final do meio Urease Considera-se reacção positiva o aparecimento de uma cor rosa forte.4 tem cor amarela e a pH 8. -Tubos com Agar de ureia. Material necessário -Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli. A enzima é detectada pela modificação da cor do indicador provocada pelo aumento de pH (vermelho de fenol. a pH 6. A sua hidrólise origina duas moléculas de amónia e a libertação de uma molécula de CO2.HCl numa folha de papel de filtro.Manual de aulas práticas de Microbiologia A presença de citocromo oxidase é detectada pela oxidação de um receptor artificial de electrões (p-fenilenodiamina). Este indicador é incolor na forma reduzida e adquire uma cor púrpura na forma oxidada (resultado positivo) 4. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 34 .HCl (1% W/V em água). Material necessário -Cultura microbiana a testar -Papel de filtro -Tetrametil-parafenildiamina. Objectivos: Pesquisa de coliformes em águas e determinação do NMP de coliformes Pesquisa de Escherichia coli Material necessário: -Tubos com caldo de lactose -Placas com Agar Endo -Tubos com caldo MR-VP -Tubos com água peptonada -Tubos com Agar de Citrato-Simmons -Filtros de 0. aneróbios facultativos que fermentam a lactose com produção de gás. Gram negativo. Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos nãoesporulados.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 9 Avaliação da contaminação fecal de águas A pesquisa periódica de microrganismos fecais numa rede de abastecimento de águas é essencial para se verificar a pureza da água. é hospedeiro habitual do intestino e não aparece normalmente na água. com tubo Durham invertido. Escherichia coli é um bom indicador da contaminação fecal – é fácil de identificar.1 Teste presuntivo: pesquisa de fermentadores de lactose Procedimento Pipetar 1 ml da amostra de água para cada um dos tubos com caldo de lactose. Neste caso fazer a determinação do NMP de coliformes por 100 ml de água com base nas tabelas de MacGrady. Incubar a 35 ºC durante 24 a 48 horas.45 1. A presença de gás em pelo menos 1/4 do tubo Durham é indicativa da presença de coliformes. Resultados: Observação dos tubos ao fim de 24 a 48 horas. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 35 .Pesquisa de Coliformes: 1. Procedimento Pipetar 0. Resultados: O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de Escherichia coli. o M de Methyl-red.Testes IMViC A distinção entre as duas espécies. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 36 . que tem reacção positiva. Espécies Indol + - Methyl-red + - Voges-proskauer + Citrato + Escherichia coli E. 2.1.Manual de aulas práticas de Microbiologia 1.1 ml dos tubos positivos para placas com Agar Endo. 1 ml da amostra de água para um tubo com água peptonada. Resultados: O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de coliformes não ficando estabelecido contudo que seja Escherichia coli. Incubar a 35 ºC durante 24 horas. de Enterobacter que tem reacção negativa. 3. Este teste permite distinguir Escherichia coli.Pesquisa da formação de indol a partir do triptofano Num meio de cultura contendo triptofano. Escherichia coli e Enterobacter aerogenes pode ser feita efectuando um conjunto de testes designados por IMViC: o I de Indol. aerogenes 3.Teste de confirmação de fermentadores de lactose Procedimento Semear 0. algumas bactérias com triptofanase produzem indol.2 Pesquisa de Escherichia coli (membrana filtrante) Procedimento Filtrar 100 ml da amostra de água para placas de Agar Endo. Deverão ser efectuados os testes IMViC. Poderá ser Enterobacter aerogenes. o V de Voges-Proskauer e o C de Citrato. Incubar a 44 ºC durante 24 a 48 horas. O indol é detectado pelo reagente de Kovacks. algumas gotas de vermelho de metilo. a adição de α-naftol e hidróxido de potássio. a adição de α-naftol e hidróxido de potássio (10%).Formação de ácidos por fermentação da glucose Num meio de cultura contendo glucose. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 37 . Resultados: Confirmar o crescimento no meio de cultura. ácido acético. Incubar a 37ºC durante 5 dias. Se existir acetoína no meio. Resultados: A reacção é positiva quando aparece um anel vermelho à superfície resultante da reacção do p-dimetil-aminobenzaldeído (reagente de Kovacs) com o indol.1 ml da amostra de água para um tubo com caldo MR-VP Incubar a 37 ºC durante 5 dias.Fermentação da glucose e produção de acetoína a partir do piruvato (Teste Voges Proskauer) No mesmo meio de cultura contendo glucose. outros metabolitos como a acetoína.teste Voges Proskauer (VP) positivo. fórmico. Se existir acetoína no meio. láctico e etanol (fermentação ácido-mista). a reacção é negativa quando após a adição do reagente o anel se mantém amarelo/alaranjado. as Enterobacteriaceae produzem ácidos a partir do piruvato. 3.4.2. algumas espécies de Enterobacteriaceae produzem a partir do piruvato.2 amarelo. Procedimento Pipetar 0. Resultados: Confirmar o crescimento no meio. Misturar bem.3. Procedimento Pipetar 0. Se houver produção de ácidos. a pH 4.4 fica vermelho e a pH 6. Quando se adiciona o indicador de pH (vermelho de metilo).Manual de aulas práticas de Microbiologia Incubar a 30 ºC durante 48 horas. A fermentação da glucose com produção de ácidos provoca a redução de pH e a alteração da cor do indicador de vermelho de metilo (MR . Adicionar ao meio. para além dos ácidos referidos anteriormente.1 ml de amostra de água para um tubo com caldo MR-VP. o que vai provocar uma acidificação do meio. Adicionar ao meio inoculado. há um abaixamento de pH para valores inferiores a 4. tornam o meio avermelhado .Methyl red). 3. α-naftol a 6% e hidróxido de potássio (40%). Procedimento Repicar a amostra para placa com Agar de Citrato-Simmons. reagindo com os catiôes Na+ existentes no meio.4. através de um programa informático. Salmonella . Nas Enterobacteriaeceae o desprendimento de CO2.reacção negativa. obtém-se um número com 7 a 9 dígitos a partir do qual. Incubar a 37 ºC durante 5 dias. Para se obter anaerobiose colocam-se algumas gotas de óleo mineral em cada um dos tubos. vai provocar um aumento do pH visível pela modificação da cor do indicador. Resultados: A utilização de citrato provoca uma alcalinização do meio que é detectada pela modificação da cor do indicador (azul de bromotimol). Se o meio de cultura mantiver a cor original a reacção é negativa. Escherichia coli . Este sistema utiliza uma estrutura plástica com 20 compartimentos separados que consistem em micro tubos contendo meios desidratados. Enterobacter. 3.Utilização do citrato como fonte de carbono e energia O meio de Citrato-Simmons contém citrato e azul de bromotimol como indicador de pH. A inoculação é efectuada por introdução da suspensão do organismo nos microtubos com uma pipeta de Pasteur. se determina o nome do microrganismo em causa.Manual de aulas práticas de Microbiologia tornam o meio avermelhado (reacção positiva). Verificar se houve ou não modificação da cor do meio (verde para azul).reacção positiva Notas: A identificação de Enterobacteriaceae pode ser efectuada através de galerias API 20E que é uma versão miniaturizada dos testes convencionais. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 38 . Após 18 a 24 horas registam-se os resultados positivos. matando as bactérias (efeito bactericida) ou inibindo a sua multiplicação (efeito bacteriostático). .Gram-negativo e Enterococcus faecalis . portanto. durante 24 horas. Semear placas de agar Mueller-Hinton.Soro fisiológico .Para testar a eficácia aos antibióticos serão utilizadas três espécies bacterianas (E.Pinças estéreis . provocando a lise das células e. os antibióticos usados na terapêutica devem explorar as diferenças bioquímicas entre as células bacterianas e as células hospedeiras. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 39 .Discos de antibióticos (Oxoid) .Meio de Cultura (Muller-Hinton agar) . Pseudomonas spp. Aplicar os discos dos antibióticos a testar (utilizar o “dispenser” como se representa na Figura) sobre a superfície do meio de cultura. Incubar a 37 °C. Uma vez que a célula bacteriana é uma célula procariota.Ansas .Régua . a partir de 3 – 4 colónias em soro fisiológico estéril (A suspensão deve ter uma turvação equivalente a 0. Procedimento Técnica de Kirby-Bauer Preparar uma suspensão bacteriana de cada uma das espécies em estudo.5 da escala de MacFarland) Mergulhar uma zaragatoa na suspensão bacteriana retirando o excesso.Gram-positivo). coli.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 10 Avaliação da eficácia a antibacterianos: antibióticos Os antibióticos são compostos químicos que podem ser administrados em doses sub-terapêuticas ou de forma terapêutica em Medicina Humana e Animal. após a secagem do inóculo.Zaragatoas . Objectivos: Determinar o fenótipo a diferentes grupos de antibióticos Analisar o perfil de susceptibilidade segundo as normas do CLSI Material necessário: . Os antimicrobianos são um grupo bastante heterogéneo. existindo antibióticos que actuam na parede celular e outros durante a síntese proteica. onde a bactéria é classificada. Resultados obtidos após crescimento bacteriano (à direita). nas categorias de sensível (S). Assim. a medida do halo de inibição será comparada com os valores da tabela. intermédia (I) ou resistente (R). Classificar de acordo com as normas do CLSI.Manual de aulas práticas de Microbiologia Resultados: Com uma régua ou craveira medir os diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. Figura 11 – Representação da aplicação de discos de antibióticos num meio de cultivo inoculado com uma estirpe em análise (à esquerda). Avaliação da susceptibilidade a antibióticos Amostra A (Gram -)_________________________________________________________ Antibiótico Diâmetro do halo Classificação Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 40 . 2006 (ex: NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards). Manual de aulas práticas de Microbiologia Amostra B (Gram -)_________________________________________________________ Antibiótico Diâmetro do halo Classificação Amostra (Gram +)____________________________________________________________ Antibiótico Diâmetro do halo Classificação Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 41 . A associação Rhizobium x leguminosa é o mais eficiente sistema de fixação de azoto atmosférico. apesar da atmosfera ser constituída por 80% de azoto. As espécies do género Rhizobium apresentam a forma de bacilos curtos. Mecanismo de infecção e formação do nódulo Legohemoglobina no nódulo Figura 12 – Mecanismo de formação do nódulo nas leguminosas Objectivos: Observação da nodulação em diferentes leguminosas. isolados ou aos pares. As espécies do género Rhizobium são bactérias do solo capazes de provocarem o aparecimento de órgãos especializados nas raízes das plantas. Material necessário -Microscópio -Lâminas e lamelas -Caixas de Petri esterilizadas -Ansa. Pinça e tesoura -Álcool a 70% Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 42 . apresentando grânulos de poli-β-hidroxibutirato nas culturas mais envelhecidas. os nódulos. Gram negativo. A molécula de azoto é quimicamente muito estável e apenas alguns procariotas têm capacidade de a reduzir a uma forma biologicamente assimilável. nos quais ocorre a redução do azoto (Figura 12). No interior do nódulo as células apresentam formas diversificadas designando-se por bacteróides. Isolamento de Rhizobium a partir dos nódulos.Manual de aulas práticas de Microbiologia Trabalho prático 11 Simbiose de microrganismos com plantas A disponibilidade de azoto no solo é o maior factor limitante na Agricultura. Observação dos bacteróides. móveis por flagelos polares ou peritriquiais. não esporulados. Resultados: Tomar nota e desenhar as formas das células observadas ao microscópio directamente do nódulo. Transferir um dos nódulos para uma caixa de Petri estéril e esmagar com uma vareta de vidro. Observar e tomar nota: Plantas Forma dos Nódulos Disposição ao longo do sistema radicular Constituição interna Observações 2.Observação dos bacteróides Cortar com uma tesoura várias secções da raiz de 1cm que contenham nódulos saudáveis (rosa). durante 15 min. Observar o suco extraído ao microscópio. Repetir as lavagens com água estéril pelo menos 3 vezes. Retirar as secções da solução e mergulhar em 20 ml de etanol a 70% durante 1 min..vermelho do Congo e azul de Bromotimol.. Lavar o sistema radicular em água corrente.Observação da nodulação em diferentes leguminosas Identificar as plantas. Colocar sobre uma folha de papel.Manual de aulas práticas de Microbiologia -Água esterilizada distribuída em tubos com 20ml -Solução de lixívia a 1% -Placas com Agar de Manitol-levedura 1. Mergulhar as secções dentro de uma caixa de Petri com lixívia a 1%.. Semear por riscado à superfície de uma placa de Petri com meio de Manitol levedura. Cortar a parte aérea da planta. Retirar uma porção de uma colónia para uma lâmina e misturar com uma gota de água estéril. Retirar as secções do etanol e mergulhar em 20 ml de água estéril durante 1 min. Registar as características das colónias formadas no meio de manitol levedura simples e com adição dos indicadores . Incubar as placa de Petri a 25˚C durante 3 a 5 dias. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 43 . Brock Biology of microorganisms.Manual de aulas práticas de Microbiologia Fazer o esfregaço e proceder à coloração de Gram. WCB Publishers. New Jersey. Vol 1. Madigan. Wheelis 1979. BIBLIOGRAFIA Benson.. New Jersey.C. Cambridge University Press. Martinko. Adelberg. 7th ed.J. 1993. Microbiological applications. H. 6th ed. W. Canas-Ferreira. de Sousa. Lisboa. Registar a morfologia celular e a reacção à coloração. 11th edition.F. Wheelis. Ingraham e M. microbiologia. e W. IA 52001. E.. General Microbiology. 1998. Introduction to the microbial world – Laboratory manual. M. PrenticeHall Inc.Segel 1979. 2006. M. 1994.. Lidel Editora. Cambridge Stanier. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 44 . Schelegel.. J. Observar as preparações ao microscópio. e J. New Jersey. Dubuque. Prentice-Hall Inc. H. R. Prentice-Hall Inc. Introduction to the microbial world. ...................... Y Malte Agar • Extracto de malte ....... 3g 10 g Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 45 ............................................ 3g 5g 1000 ml Acertar a pH final 6....................................................... • Extracto de levedura ............. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos Caldo nutritivo: • Extracto de carne .......................................... • Agar .......................................... Distribuir em tubos........ Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos..........8-7.............Manual de aulas práticas de Microbiologia ANEXO 1 ............. • Água destilada ...................... Esterilizar a 121°C durante 15 minutos Agar de dextrose Sabouraud • Peptona .......Meios de cultura Meio de agar nutritivo: • Extracto de carne .............. • Glucose . • Amido solúvel .............................. • Água destilada .............................................0.............. • Água destilada ..... • Dextrose .. • Glucose .............................................. 3g 3g 5g 10 g 20 g 1000 ml Acertar a pH 5............................ 3g 3g 5g 10 g 1000 ml Acertar a pH 5........ • Água destilada .......................................... Y Malte Caldo • Extracto de malte ...........................8-7....................0.............................6.............................. • Água destilada ................. Distribuir em tubos......0........................ Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos............................... • Peptona ....................................................................... • Agar ........... Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos................................................................................................................. • Extracto de levedura ...................... 10 g 40 g 15 g 1000 ml Acertar a pH 5... Agar de amido • Extracto de carne ............ • Agar .......................0. 3g 5g 15 g 1000 ml Acertar a pH 6.......................................... • Peptona ..................................... • Peptona ......... • Peptona ................... .......................... lactose ou sacarose.....................................................8............018 g 1000 ml Acertar a pH 7....... Água peptonada • Peptona .............................Manual de aulas práticas de Microbiologia • Agar ... Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos........................................................ Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos........ Nota: para avaliar a fermentação de açúcares adicionar............. separadamente. • Água destilada .... Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos................. • Extracto de carne . Agar Endo • Peptona . • Cloreto de sódio ........................ 10 g 1g 5g 0............. 15 g 1000 ml Acertar a pH 7........... Caldo de lactose • Extracto de carne .................................................. • Água destilada ..................... • Ureia ........... • Vermelho de fenol .................. 10 g 5g 1000 ml Acertar a pH 7........... • Vermelho de fenol ....012 g 100 ml Acertar a pH 6...... 10 g Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 46 ...............................................................0.. 3g 5g 5g 1000 ml Acertar a pH 6..... • Peptona .........2...... • Dextrose ......................... • Cloreto de sódio ................ Caldo com vermelho de fenol – meio base • Peptona ................... Distribuir em tubos.. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.................. Distribuir em tubos................. Agar de ureia • Peptona ............8 ml de vermelho de fenol...................................................................... • Água destilada .2............... • D-lactose ............................... Esterilizar a mistura de 15 g de agar com 900 ml de água a 121˚C durante 15 minutos (B)..... 1g 1g 5g 2g 20g 0.............. Esterilizar a mistura por filtração (A).................. Deixar arrefecer B e adicionar os 100 ml de ª Distribuir em tubos e inclinar................................ Distribuir em tubos................................ 5 g/l de glucose................................9.............. • Água destilada ..... Nota: Para pesquisar a fermentação de açúcares adicionar 1....... • Água destilada ............................. • Cloreto de sódio ................................................................................. • Fosfato de potássio .... ................................................5......................... • Fosfato de potássio .......................................... • Fosfato de potássio ........................................................ • Fosfato de amónio ..............5 g 0.. • Manitol .....0....................... • Sulfito de sódio .. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.. • Sulfato de magnésio .......... • Fosfato de potássio ............................................ • Extracto de levedura ....... • Água destilada ..................... os seguintes corantes: Vermelho do Congo (1%) ou Azul de Bromotimol (0............. Agar de Citrato................................5 g 3. • Água destilada ................................8-7. • Cloreto de sódio .........................................Simmons • Sulfato de magnésio .. • Agar ...... • Fucsina básica ................................ • Água destilada ................................................... 0....................... • Cloreto de sódio ....1 g 10 g 0............. • Citrato de sódio ...... Meio de LB (Luria-Bertani Medium) • Triptona • Extracto de levedura • NaCl • Água destilada 10 g 5g 10 g 1000 ml Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 47 ......................4 g 15 g 1000 ml Acertar a pH 6...................................... • Agar ............. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos.....................0.............. Distribuir em tubos........5 g 15 g 0................ Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos...................... Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 10 g 2............................. • Água destilada .............. • Agar ....................... Agar de Manitol-levedura • Fosfato de potássio ....................2 g 5g 1g 1g 2g 15 g 1000 ml Acertar a pH 6.......................... Caldo MR-VP • Peptona ..............8-7.................................5 g 1000 ml Acertar a pH 7.................... 7g 5g 5g 1000 ml Acertar a pH 6.....2 g 0........................... Nota: Poderão ser adicionados..5%).......................................................Manual de aulas práticas de Microbiologia • D-lactose ...... • Dextrose .8-7... 0................ separadamente...........................0... 2ml).5% Agar 10 g 5g 10 g 15 g 1000 ml Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 48 .0 com 5N NaOH (~0.7% Agar Meio de LBs (Luria-Bertani sólido) • Triptona • Extracto de levedura • NaCl • Agar • Água destilada LBs = LB + 1.Manual de aulas práticas de Microbiologia Agitar até à completa dissolução. Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Meio de LBss (Luria-Bertani semi-sólido) • Triptona 10 g • Extracto de levedura 5g • NaCl 10 g • Agar 7g • Água destilada 1000 ml LBss = LB + 0. Ajustar o pH a 7. ........ 1g 10 ml 100 ml Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos........05 g Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 49 .................................. 2.......... • Água destilada ..... Solução de Nigrosina • Nigrosina ....................................................... • Cloreto de cálcio ... • Hidróxido de potássio 1% .... Solução de verde malaquite • Verde malaquite .... perfazer a 100 ml Filtrar.... 10 g • Água destilada ............12 g 0.. 5g • Água destilada .............................. • Cloreto de potássio .......... • Álcool etílico a 95 % .0 g 300 ml Solução de Safranina • Safranina .................................................................................................................................................0 g 2............................ 2........................ • Água destilada ......3 30 ml 1 ml Solução de Cristal de violeta • Cristal de violeta ........................... • Fenol 5% (solução aquosa) .................. • Bicarbonato de sódio .. • Iodeto de potássio ...25 g 0......................Manual de aulas práticas de Microbiologia ANEXO 2 – Corantes e soluções Solução de azul de metileno • azul de metileno ......................................................................................... • Álcool etílico a 95% .....5 g perfazer a 100 ml Soluto de Lugol • Cristais de iodo ...... Solução de iodo • Cloreto de sódio .................................................. 1............................ 0................ Solução de Fucsina • Fucsina básica ..................................... • Etanol ............................... 0......5 g 10 ml Dissolver a safranina em etanol... perfazer a 100 ml Filtrar........................................................ Perfazer a 100ml em água destilada....105 g 0... ....05 g perfazer a 1 L Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos................................................... Adicionar depois o ácido láctico e o glicerol......................................1 g até 10 ml Solução de vermelho de metilo • Vermelho de metilo .............Manual de aulas práticas de Microbiologia • Água destilada ......... • Água destilada ............ 0.... 100 ml 100 g 100 ml 100 ml Dissolver o fenol em água.... • Água destilada ........ azul de algodão • sol.....................dimetil-aminobenzaldeído .................12 g 0.......................................................... • fenol .. 2....................................25 g 0....................... • etanol ..............................105 g 0. 5 ml • Álcool etílico a 95% ........................ 150 ml 10 g 50 ml Dissolver o aldeído no álcool......... • Água destilada ............................................................ • p...................... perfazer a 1 L Solução de tetrametil-parafenildiamina........................................ 0................................. a 60 C..HCl • Tetrametil-parafenildiamina.................... • Água destilada ......... • Cloreto de cálcio .................................... • Água destilada ................ 10 ml 10 ml 80 ml Misturar em partes iguais o lactofenol e o azul de algodão......................HCl .......... perfazer a 100 ml Solução salina de Ringer • Cloreto de sódio . Solução de lactofenol-azul de algodão lactofenol • Ácido láctico ..............................................................1 g 300 ml 200ml Reagente de Kovacs • Álcool amílico ............................ Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 50 .. Solução de α-Naftol • α-Naftol .......... • Bicarbonato de sódio ............................... Guardar no frigorífico............... Saturada de azul de algodão ............... • glicerol ................................. • Ácido clorídrico ... • Cloreto de potássio ..................... • glicerol ........... sem aquecer......................... deixar arrefecer e adicionar o ácido gota a gota................. .... 25 ml • Água destilada ................................................................ 100 ml Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 51 .......................5% de safranina em álcool ...................Solução de iodo • Iodo ................... 2 g • Etanol .............. 1 g • Iodeto de potássio .................................................. 100 ml C ........................................................ 4g • Etanol ................. 5 ml • Etanol ......................................................................... 95 ml D ..Manual de aulas práticas de Microbiologia Corantes (Coloração de Gram variante de Chan) A ...................................... 100 ml • Água destilada ............................Solução de cristal de violeta • Cristal de violeta ............Safranina 2.................................................... 400 ml B ........................ 10 ml Água destilada ...............Álcool iodado • Solução de iodo ...................................................... 10 g • Oxalato de amónio .......... Manual de aulas práticas de Microbiologia Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro Página 52 .