Protocolos de CriogenizaciónS Criopreservación S Criopreservación: “conservación durante un período de tiempo corto/largo de células vivas o materiales tratados usando nitrógeno líquido como refrigerante”⑴ Estudios criobiológicos se enfocan en descubrir lo que ocurre al congelar las células vivas y cómo superar los fenómenos adversos de este proceso ⑵. Factores de daño celular⑶: S S S S S Formación de cristales: daño a la membrana determinado más por su cantidad intracelular que por su tamaño. Efecto de soluto: aumenta la concentración de electrolitos en agua residual aún no congelada, lo que desestabiliza la membrana. Aumento de la temperatura durante cambio de fase: uso de crioprogramadores. Importancia de las tasas de congelación en la viabilidad . A medida que aumenta la temperatura puede ocurrir la recristalización del agua y producirse shock osmótico. constante de permeabilidad al agua y coeficiente de temperatura. la cantidad de cristales formados alcance una cantidad letal. ocurren cambios de congelación pero en sentido opuesto.Descongelación S S Al descongelarse. S Probabilidad de formación de hielo intracelular depende de: S Tasa de enfriamiento/descongelamiento. (3) S S Descongelamiento lento: los cristales tienden a agregarse dada su alta energía de superficie. . Descongelamiento rápido: no habrá tiempo suficiente para que al alcanzar la temperatura de fusión del agua. (3) S Agentes crioprotectores más comunes: Dimetilsulfóxido (DMSO) y glicerol. razón superficie-volumen. mejor que las menos permeables. Resulta en una mayor cantidad de hielo intracelular. S Células más permeables pueden tolerar tasas de enfriamiento rápidas . S Recomendación: Tasa de enfriamiento de -1°C/minuto. S Lento: mayor pérdida de agua y por lo tanto menos formación de hielo internamente.Manual de Criopreservación de Nalgene S Enfriamiento: S Rápido: minimiza el efecto de concentración de soluto y se forma el hielo uniformemente. y para el descongelamiento. un baño maría a 37°C de manera inmediata. congelamiento ocurre externamente a la célula antes de que se forme el hielo intracelular = desbalance osmótico (efecto de soluto). Guardados separadamente .Sistema “Seed Lot” S Sistema “Seed Lot”: S S S Cultivo inicial intacto “Seed lot” o lote semilla: separado al material celular con el que se trabajará. un vial del lote semilla es retirado y usado para preparar un segundo lote de trabajo S Esto continúa hasta que todos los viales semilla excepto uno han sido utilizados. S . Pueden durar muchos años si los lotes son adecuadamente medidos. El último es entonces usado para preparar un segundo lote semilla. en caso de desastres o accidentes.asegura continuidad y longevidad de la colección. “Working lot” o lote de trabajo: cuando se acaba el primero. La viabilidad y la recuperación debe ser determinada antes y después del congelamiento. S Preparación de “seed lots” de bacterias y levaduras : S S Concentración: 107 células/ml. y debe ser protegido de la luz durante su almacenamiento.Agentes crioprotectores y preparación de células S Resistencia de Microorganismos es mayor cuando: S Son cosechados en con etapa log tardía o estacionaria temprana. OGMs: pueden ser preservados de una manera similar a la célula no-modificada. o conteo directo. Se puede estimar por dilución seriada. Agente crioprotector: glicerol 10% T mínima de almacenamiento: bacterias -60°C. conteos en placa. levaduras -150°C. y preparados en volúmenes de uso único. S S . S Cultivados en condiciones aireadas. El glicerol puede ser esterilizado autoclavando 15 minutos a 121 °C y 15 psig. S Los crioprotectores deben ser de grado de reactivo o mejor. Para la mayoría de las células ocurre por al menos 15 minutos. El tiempo de equilibrado óptimo debe ser determinado empíricamente para maximizar la recuperación posterior. . Debe llevarse a cabo a temperatura ambiente: permite adentrarse a las células. pero no más de 45-60. Este tiempo puede ser usado para pasar las suspensiones a viales y hacer las preparaciones y manipulaciones previas a la congelación.Equilibrado S S S S S Es el período de tiempo entre el mezclado del crioprotector con la suspensión de células y el comienzo del proceso de enfriamiento. También los viales de plástico con taparoscas son suceptibles a penetración pero minimizan el potencial de explosión. S Almacenamiento por inmersión en nitrógeno líquido no se recomienda… S S Microcanales de las ámpulas pueden ser penetrados por el nitrógeno líquido: cuando son regresados a temperatura ambiente.2 a 2 ml Generalmente 0. Viabilidad en células no fastidiosas no se ve afectada. Factores para selección de contenedor: criotolerancia.0 ml de la suspensión es colocada a cada contenedor. Tamaños: 1. Tasa de calentamiento afectada por el tipo de contenedor: S S Viales de plástico requieren mayor período de descongelamiento que las ámpulas de vidrio. Sin embargo. para viales de plástico en calentamiento. consideraciones de seguridad. líquido puede salir de la interfase tapa/vial y potencialmente esparcir sus contenidos .Ámpulas y Viales S S S S Variedades más comunes: Ámpulas de vidrio selladas con flama. o viales de plástico con tapa roscas. tipos de células a ser almacenadas. la conversión a vapor hace que la ámpula explote. condiciones de almacenamiento.5-1. se puede inducir artificialmente la formación de hielo: S S S S introducir hielos a la suspensión u otro agente nucleante. S No repetibilidad en sistemas de enfriamiento caseros. El cambio de estado de líquido a cristalino resulta en la liberación de energía en forma de calor latente de fusión. Para minimizar este efecto. la mayoría del agua presente se congelará aproximadamente de -2°C a -5°C. .Enfriamiento S A pesar de el control al enfriar las células. o bajando la temperatura del ambiente externo rápidamente. El calentamiento ocurre hasta que se alcanza el punto de equilibrio de congelación (T a la cual el hielo se forma). Manejo inapropiado afecta viabilidad (exposiciones al ambiente hasta por pequeños instantes). También existen congeladores mecánicos de hasta -150°C . Para maximizar el espacio de los congeladores de nitrógeno líquido. se utilizan pequeñas cajas de aluminio. Para seguridad óptima: células deben ser almacenadas a temperatura de nitrógeno líquido. Unidades de nitrógeno líquido: ideal mientras la temperatura en la apertura permanezca bajo 130°C. S S S Estabilidad no garantizada a temperaturas mayores de -130°C. mayor el período de tiempo de almacenamiento viable. Importancia de sistemas de congelamiento que minimicen exposición (material y personal). S S .Almacenamiento S Después de que se ha congelado 48 horas. un vial debe ser descongelado para determinar si las células son viables: sobreviven el procedimiento de congelado. Para esto. se debe ajustar para que la temperatura justamente arriba del material almacenado sea de -150°C. y la exposición durante el manejo. La temperatura de almacenamiento afecta al tiempo de recuperación: S S A menor temperatura. Descongelamiento S Baño maría a 37°C. S Agitación regular del vial durante el calentamiento puede acelerar el proceso de descongelamiento. . remover el sobrenadante. Puede ser necesaria una mayor dilución para algunas líneas celulares. resuspensión en medio fresco. Se recomienda: centrifugación a 100xg por 10 minutos después de la dilución inicial. S S S S Riesgo de contaminación al reconstituir: para minimizarlo se debe desinfectar la superficie externa con alcohol. Inmediatamente se pasan los contenidos a medio fresco para minimizar la exposición al agente crioprotector. dilución seriada y conteos de placas son efectivos para cuantificar la población de células recuperadas. el número de células generalmente es el mismo en todos los viales. S Aunque existe variación de vial a vial en un S Variación de vial a vial puede indicar . lote. problemas que ocurren durante el almacenamiento y manejo de los viales. en condiciones de almacenamiento constantes.Determinación de Recuperación S Para microorganismos. 1 año) S 500X B (. Calentar y disolver completamente. Filtrar. 1 año) S 100X H (0.histidina en 100 mL de agua.02% Biotina) S S Disolver 20 mg de biotina en 100 mL de agua y esterilizar por filtrado. (Vida útil aprox. 1 año) S 10X D (20% Dextrosa) S S Disolver 200 g de D-glucosa en 1L de agua. Esterilizar por filtrado y guardar a 4°C.4% Histidina) S S Disolver 400 mg de L.Soluciones Stock para Pichia pastoris S 10X YNB (13. (Vida útil aprox. Calentar la solución. 1 año) . (Vida útil aprox. no más de 50°C para disolver. si es necesario. (Vida útil aprox. Autoclavar por 15 minutos y esterilizar por filtrado.4% base de nitrógeno de levadura con sulfato de amonio sin aminoácidos) S S Disolver 134 g de YNB con sulfato de amonio y sin amino ácidos en 1L de agua. esterilizar y guardar a 4°C. Guardar a 4°C. . 868 mL de 1M KH2PO4 y confirmar pH= 6. y L.) S 1M buffer de fosfato de potasio. (Vida útil: más de un año) S 100X AA (0. L-metionina.1 (si necesita ser ajustado. esterilizar y almacenar a 4°C.Soluciones Stock para Pichia pastoris S 10X M (5% Metanol) S S 1) Mezclar 5 mL de metanol con 95 mL de agua.isoleucina en 100 mL de agua.0 +. Filtrar esterilizar y guardar a 4°C. 2) Filtrar. (Vida útil: 2 meses). L-leucina. 2) Esterilizar por filtrado o autoclavado. Almacenar a temperatura ambiente. (Vida útil: más de un año). L-lisina.5% de cada Amino Acido) S S Disolver 500 mg de: ácido L-glutámico. utilizar acido fosfórico o KOH) Esterilizar por autoclavado y guardar a temperatura ambiente.0 S S Combinar 132 mL de 1M K2HPO4. (Vida media: 1 año aprox. pH 6. S 10X GY (10% Glicerol) S S 1) Mezclar 100 mL de glicerol con 900 mL de agua. 2% dextrosa (glucosa) 1) 2) 3) Disolver 10g de extracto de levadura y 20 g de peptona en 900 mL de agua. 2% peptona. . Almacenar las placas a 4°C.Preparación de Medios S YPD (1L) S 1% extracto de levadura. (Nota: 20 g de agar si es para crecimiento en placas). Autoclavar por 20 minutos Añadir 100 mL de 10X D 4) Almacenar el medio líquido a temperatura ambiente. Vaciar a placas y guardar a 4°C.Preparación de Medios S LB broth S Bacto tryptona 10 g/L S Extracto Bacto-levadura 5 g/L S NaCl 5 g/L S Ajustar pH a 7. Añadir agar (18 g/L). Añadir ampicilina a 50 μg/ml. enfirar a 50°C. autoclavar.0 con 5N NaOH. Autoclavar. . Almacenar a 22°C S LB/amp agar plates S Preparar LB broth. determinar la densidad celular. • Calcular el total de células en el cultivo. (Las células a ser resuspendidas en el medio de congelamiento deben estar a 107/ml) .Protocolo Pre-congelamiento 1 2 3 • Cuando las células han llegado a una etapa tardía log. • Determinar la cantidad de medio de congelamiento necesario. (aprox.Protocolo Congelamiento 1 • Cosechar las células por centrifugación. • Añadir la solución crioprotectora al pellet celular y mezclar. Cerrarlos bien. 2 • Preparar la solución de Glicerol pre-estirilizada a la concentración de 10% con respecto al medio de cultivo. Etiquetar viales con fecha. •Enfriamiento semi-controlado: utilizar un congelador (Mr.20 min) • Congelar: 6 •Enfriamiento no-controlado: colocar crioviales al fondo del congelador a -60°C por 90 minutos. tipo celular. (-60°C para bacteria. -150°C para levadura) . 7 • Remover las células de la unidad de enfriamiento y colocarlas a la temperatura de almacenamiento apropiada. 5 • Dejar pasar el tiempo de equilibrado. •Enfriamiento controlado: usar unidad programable para enfriar las células a 1°C/min a -40°C. 3 4 • Pasar con cuidado 1 ml del stock a congelar a los crioviales. y las iniciales del usuario. Frosty ) en un congelador a -70°C. 15. transferir los contenidos a un medio de cultivo fresco. • Cuando esté completamente descongelado. • Rápidamente colocar en un baño maría a 37°C.Protocolo Descongelamiento 1 2 3 • Sacar con cuidado del lugar de almacenamiento. .