Hibridación fluorescente in situ (FISH) Introducción Hibridación in situ es una técnica que detecta secuencias de ácidos nucleicos en células, cromosomas o tejidos preservados. La detección in situ provee una visualización directa de la localización espacial de secuencias específicas que es crucial para dilucidar la organización y función génica, por lo que el método de hibridación in situ se ha convertido en una técnica importante en diversos campos, incluyendo diagnóstico de rearreglos cromosomales, detección de infecciones virales y análisis de la función génica durante el desarrollo embrionario. La hibridación in situ toma como fundamento la complementaridad de los ácidos nucléicos, la cual puede ser DNA y/o RNA, a través de puentes de hidrógeno formados entre las bases: adenina–timina (DNA) o uracilo (RNA) y citosina -guanina (DNA y RNA). Este apareamiento da lugar a una doble cadena en la cual una cadena, tiene la orientación opuesta a la otra con respecto al esqueleto azúcar-fosfato. La secuencia es leída de 5' a 3'. Secuencia DNA 5'… TGATCCGTTA…3' RNA 5'…UGAUCCGUUA…3' 3'… ACTAGGCAAT…5' Transcripción Figura 1. Principios de la hibridación in situ. La relación entre la doble cadena de DNA y su transcrito a RNA. El DNA genómico consiste de dos cadenas complementarias, A aparea con T y G con C en orientación opuesta (5' a 3' y 3' a 5'). La transcripción usa la cadena líder como templado y genera una secuencia idéntica de RNA. Pasos y consideraciones para la hibridación in situ. La técnica involucra: a) Generación de ácidos nucleicos marcados para una detección subsecuente. b) Fijación de tejidos (seccionados), preparación de cromosomas. c) Preparación del tejido para incrementar el acceso del ácido nucleico marcado. d) Hibridación de la sonda marcada en cromosomas o tejidos. e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan. f) Detección de la sonda marcada, revelando la localización celular de los ácidos nucleicos. Preparación de la sonda. Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripción, involucra generar mRNA del gen endógeno. Cuando se diseñan los oligos marcados, es importante recordar que la secuencia antisentido es la hebra complementaria reversa de la cadena líder y debe ser leída de 5’ a 3’. En general es preferible usar sondas específicas, ya que esto garantiza una buena hibridación. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a cabo, por ejemplo, si los genes todavía no están clonados de las especies usadas para la hibridación o si la secuenica génica es muy similar entre especies. Esto puede favorecer una hibridación entrecruzada. Para evitar ésto, se requiere una alta selectividad que reduzca la presencia de bases mal apareadas, aumentando de esta a) El diseño de sondas se resume en los siguientes puntos: i) La hibridación entrecruzada utiliza sondas largas (>100 pb) usadas bajo condiciones selectivas especialmente después de la digestión con nucleasas. La fluoresceína dUTP/UTP/ddUTP pueden ser incorporados enzimáticamente a los ácidos nucleicos de acuerdo a técnicas standard. La hibridación entrecruzada provee información preliminar muy valiosa. iii) Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U). Pre-hibridación Reactivos y soluciones: - Pepsina (Sigma) - Formaldehido 1% - Etanol al 70%. Otros nucleótidos marcados con fluorocromos. 1991). Alternativamente. Si los modelos de expresión son los mismos. 1991. A continuación se describen los pasos realizados sobre los cortes de parafina de las matrices de tejido de 3μm de grosor. Wiegant et al. al transcribirse a cDNA se evita que la sonda no incluya esta cola. En general las desventajas de los métodos directos es que son menos sensibles que los métodos indirectos descritos anteriormente. Algunos métodos alternativos están disponibles para la síntesis de la sonda.. ya que una sonda además de homóloga.. Los análogos de nucleótidos marcados con fluoresceína pueden ser usados como sistemas directos e indirectos de la hibridación (Dirk et al. etanol al 80% y etanol al 100% (Merck) - Solución de Pretratamiento Dako - Xilol . aunque no prueba la especificidad. MARCAJE Marcaje Fluorescente de ácidos nucleicos Los nucleótidos marcados con fluoresceína (Figura 5) son una alternativa de los marcajes radioactivos. como se pueden ver con una sonda homóloga. ricas en GC dan una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre estas bases. porque secuencias largas. Alternativamente se puede hacer un screening y éste puede ser realizado por búsqueda de secuencias en bases de datos. como tetrametil-rodamina-5-dUTP que emite en rojo están disponibles actualmente. debe ser lo suficientemente amplia para llevar a cabo la hibridación. Ésto puede ser probado por un Northern o un Southern-blot. Se necesitan dos elecciones más para la preparación de la sonda: el tipo de ácidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda. Procedimiento FISH El protocolo de esta técnica se puede subdividir en 3 apartados: pre-hibridación. ii) Para sondas pequeñas (oligonucleótidos de 20-30 pb) es muy probable que algún gen distinto al de interés tenga una secuencia idéntica. los nucleótidos marcados con fluoresceína pueden ser detectados con un anticuerpo conjugado anti-fluoresceína o con un anticuerpo no conjugado o con un anticuerpo secundario contra fluoresceína. El marcaje con fluoresceína es un marcaje directo que no requiere detección inmunocitoquímica por lo que es necesario que haya un mínimo ruido de fondo. es un experimento alentador.manera la especificidad. hibridación y post-hibridación. DETECCIÓN La localización de sondas marcadas con haptenos pueden ser visualizadas por . 6. Mantener las preparaciones a 4°C y protegidas de la luz. Lavar los portaobjetos con 2xSSC. Introducir los portaobjetos en una jarra couplin con formaldehído al 1% durante10 minutos a temperatura ambiente. 12. 14. Desparafinar los portaobjetos en Xilol 3 veces x 10 minutos.1mg/ml 0. Incubar los portaobjetos en una solución de pepsina al 0. 16 horas a 37°C. 9. Precalentar la solución de formamida al 50% en un baño a 46°C. Colocar los portaobjetos en un recipiente con la solución de pretratamiento durante 10 minutos.Procedimiento 1.fenilindol) - “Vectashield” (Laboratorios Vector) Procedimiento 1. incubándolos 5 minutos en cada recipiente y posteriormente dejarlos secar a temperatura ambiente. Lavar los portaobjetos con 2xSSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Post-hibridación Reactivos y Soluciones - Formamida al 50% / 2XSSC pH 7. 4. Realizar un lavado de 2 minutos en la solución de 2XSSC Mantener en DAPI durante 2 minutos y añadir “Vectashield”®. 13. 8. 2. y de la hibridación. 3. Agregar 10μl de la sonda sobre el portaobjetos. Lavar con abundante H2O destilada. 75°C durante 6 minutos. Lavar con etanol al 100%. 80% y 100%.6 – diamidino – 2. introducirlas en el recipiente que contiene la solución de formamida 50% a 46°C durante 5 minutos. 10. Cubrir con un cubreobjetos y sellar con pegamento. 2. Eliminar suavemente el pegamento con unas pinzas e igualmente los cubreobjetos de las preparaciones. Lavar los portaobjetos con 2xSSC durante 5 minutos a temperatura ambiente. 5. Colocar las preparaciones en la estufa a 65°C por 24 horas. Solución de pepsina: precalentar en un baño a 37°C. Hibridación Introducir las preparaciones en la estación de hibridación HYbrite (Vysis) para la realización de la desnaturalización de la sonda. 15. Solución de pretratamiento: precalentar en un baño a 99°C.0 - Solución de contratinción: DAPI (4. Deshidratar los portaobjetos en etanol al 70%. durante 10 minutos en un baño a 37C en agitación. 7. 3. 80% y 70% durante 5 minutos.01 N de HCl. 11. que se asociará al DNA de la muestra en el sitio diana. La señal emitida por la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y así la muestra de DNA se puede clasificar según la presencia o ausencia de la señal. La sensibilidad de estos ensayos es en todos los casos mejor que la de la citogenética de rutina. Además. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés. pero depende del síndrome en concreto. proceso que separa las hebras complementarias de la estructura en doble hélice del DNA. la FISH de metafase puede detectar algunos de los reordenamientos específicos que se observan en ciertos tipos de cáncer. Puede también ser de ayuda en casos donde es difícil determinar mediante la citogenética de rutina si un cromosoma tiene una deleción simple o si está implicado en una reorganización sutil o compleja. marcada con un fluoróforo. pero estos son menos sensibles que NTB/BCIP. así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son características de ciertos tipos de cáncer. si la sonda es marcada con un fluoróforo o indirectamente con un anticuerpo conjugado. Síndromes de microdeleción actualmente diagnosticables mediante FISH Síndrome del maullido (cri-duchat) Síndrome de Kallman Síndrome de Miller-Dieker Síndrome de Williams Síndrome de Smith-Magenis Síndrome de Wolf-Hirschhorn Deficiencia de esteroide-sulfatasa Síndrome de PraderWilli/Angelman Síndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen FISH de interfase La FISH se puede usar sobre células en interfase para determinar el número de copias de uno o varios cromosomas. donde el 96% de los pacientes con diagnóstico confirmado poseen una deleción en el gen de la elastina. deteniendo productos coloridos: rojo. En otros síndromes como el de PraderWilli/Angelman. Una variedad de otros sustratos están disponibles. la sonda es específica para el gen defectuoso. En algunos. El número de síndromes de microdeleción diagnosticados por FISH está aumentando con rapidez. verde fluorescente. La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rápidamente . la etiología es heterogénea y las microdeleciones sólo existen en una parte de los casos (60%). FISH de metafase La FISH puede usarse sobre células en metafase para detectar microdeleciones específicas más allá de la capacidad de resolución de la citogenética de rutina. como en el Síndrome de Williams. magenta. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES La FISH es una tecnología reciente que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluoróforo para detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá de la capacidad de resolución de la citogenética de rutina. En primer lugar. Estas técnicas funcionan muy bien para hibridación in situ cromosomal y ofrecen un gran flexibilidad para detecciones simultáneas de secuencias múltiples. Un método más sensibles es amplificar la señal usando una enzima acoplada a un anticuerpo o una proteína por la cual el sustrato cromogénico esté disponible para generar un producto insoluble colorido.microscopía de fluorescencia. en el proceso denominado hibridación. pero sólo son suficientemetene sensibles para la detección de mRNAs abundantes. donde se vuelve a formar una doble hélice. o para identificar material extra de origen desconocido. la muestra de DNA (cromosomas metafásicos o núcleos en interfase) se desnaturaliza. Se desnaturalizan los núcleos de la muestra. que se realiza sobre células del fluido amniótico cuando hay una fuerte indicación clínica de una de las trisomías más comunes. 18. porque no requiere crecimiento de las células. X e Y.si es preciso. 21. se hibridan con sondas específicas para los cromosomas 13. RESULTADOS FISH en metafase 2 sondas para 2 loci del cromosoma 22 FISH en metafase Sonda para la parte terminal del cromosoma 4q. se confirma que en uno de los cromosomas 4 falta material del extremo terminal del brazo . Puesto que sólo hay una señal verde. Un buen ejemplo es el ensayo de aneuploidía. normalmente en 24 horas. y habitualmente en 24 horas se dispone de los resultados. La prueba de aneuploidía suele incluir también una citogenética de rutina para confirmar los resultados o detectar cualquier anomalía no detectada por la FISH de interfase. FISH en interfase Sonda verde: para cromosoma 13 Sonda roja: para cromosoma 21 ¿Interpret ación? Tres señales rojas: trisomía 21 (síndrome de Down) Sonda azul claro: para cromosoma 18 Sonda verde: para cromosoma X Sonda roja: para cromosoma Y ¿Interpretac ión? Dos señales verdes y ninguna roja: el feto es una niña . Puesto que ambos cromosomas 22 tienen la señal roja.FISH de metafase Éste es un ejemplo de una célula en metafase que se ha hibridado con la sonda diseñada para detectar el síndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen. causado por una microdeleción en el cromosoma 22. en esta célula no hay microdeleción en la región DiGeorge y este paciente no tendría el síndrome DiGeorge. Esta otra metafase se ha hibridado con una sonda "de pintado" para el cromosoma 4. La señal verde es un control interno que hibrida en 22q13. Uno de los cromosomas 4 de este paciente era anormal. La señal roja está situada en la región DiGeorge. esto sugiere que la anomalía es una deleción terminal pequeña. que hace que el cromosoma completo emita fluorescencia. Puesto que ambos cromosomas 4 son fluorescentes en toda su longitud y no hay material fluorescente en ningún otro cromosoma. La metafase siguiente es del mismo paciente y confirma este diagnóstico. Permite identificar rápidamente los dos cromosomas 22. En este caso particular. en 22q11. pero era difícil determinar con la citogenética de rutina si tenía una pequeña deleción terminal en 4q o si era el resultado de una reordenación más compleja.2. . se emplea una mezcla bicolor de dos sondas distintas para el cromosoma 22. Puesto que hay dos cromosomas X y sólo uno tiene la señal del gen de la esteroide-sulfatasa.3. Puesto que sólo hay una señal verde. que permite la identificación rápida del (o los) cromosoma(s) X.3" de la sonda está localizada en la región de la esteroide-sulfatasa. FISH de interfase . En este caso particular. ambas con color rojo. Éste es un ejemplo de una célula en metafase que se ha hibridado con una sonda para la deficiencia de esteroide-sulfatasa. Este caso es un buen ejemplo de cómo la citogenética de rutina y la FISH pueden usarse conjuntamente para diagnosticar con exactitud anomalías cromosómicas sutiles. La señal "Xp22.Esta metafase del mismo paciente anterior se ha hibridado con una sonda diseñada para la parte terminal del cromosoma 4q. en Xp22. causada por una microdeleción en el cromosoma X. se confirma que en uno de los cromosomas 4 falta material del extremo terminal del brazo q. La señal"X cen" de la sonda es un control interno localizado en el centrómero de X. se emplea una mezcla de dos sondas independientes para el cromosoma X. este individuo es una mujer portadora de la deficiencia genética de esteroide-sulfatasa. Bibliografía GOSDEN. USA. Oxford University press. X (verde) e Y (rojo). D. 224 p. In situ hibridization. El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los cromosomas 18 (azul claro). El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas diseñadas para los cromosomas 18 (azul claro). y tiene claramente tres señales rojas. donde se han combinado núcleos en interfase procedentes de células de fluido amniótico con sondas de DNA diseñadas para los cromosomas 13. es femenino. este feto es un varón.R. 1997. X e Y. 165p. X (verde) e Y (rojo). USA. 2nd edition. y una sola señal de cromosomas X e Y. WILKINSON. normal con respecto a la prueba de aneuploidía. J. PRINS and in situ PCR protocols. 18.Éste es un ejemplo de la prueba de aneuploidía. 18 y 21. 21. El núcleo de la izquierda se ha hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo). Esta otra prueba de aneuploidía muestra un feto femenino con trisomía 21.G. . Human Press. a practical approach. New Jersey. Puesto que hay dos señales correspondientes a las sondas de 13. Puesto que muestra dos señales verdes y ninguna roja.1999. Colección métodos en biología molecular. El núcleo de la izquierda se ha hibridado con sondas diseñadas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo).