PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANASCONTENIDO: 1. SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTÍNUO 2. CINÉTICA DE CULTIVO 3. CINÉTICA DE FORMACIÓN DE PRODUCTOS MICROBIANOS CÁLCULO DE RENDIMIENTO Y PODUCTIVIDAD 4. TRASNDERENCIA DE OXIGENO EN FERMENTAIONES. http://biorincon.blogspot.pe/2012/06/blog-post.html http://biorincon.blogspot.pe/2012/06/biorreactor.html MICROORGANISMOS COMO FACTORÍAS DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS Las enzimas se pueden obtener de tres fuentes, tanto de origen animal, vegetal como microbiano (levaduras, hongo y bacterias): la elección de una u otra fuente depende de varias factores como son la estabilidad, especificidad de sustrato, temperatura y pH óptimo, coste, inocuidad, abundancias… Sin embargo la producción de enzimas a partir de microorganismos presenta ciertas ventajas económicas y técnicas, ya que permite su producción a gran escala con un rendimiento predecible, hay una disponibilidad continua y no hace falta diseccionar animales, por no olvidar que como hay gran versatilidad de microorganismos se puede obtener un gran número de enzimas diferentes [1,2]. Además hoy en día gracias a la ingeniería genética se pueden desarrollar mutaciones en el metabolismo de los microorganismos para que estos produzcan más cantidad de enzima. El primer paso para la producción de enzimas es la elección del microorganismo adecuado, lo cual dependerá de las características de la enzima a producir. Una vez elegido el microorganismo, se le deja crecer en condiciones adecuadas de pH, temperatura y aireación. A continuación se debe extraer la enzima, lo cual depende de si la enzima es extracelular, intracelular o periplasmática (ver figura). De manera que si es extracelular no hay que romper ninguna membrana, pero si es intracelular hay que romper tanto la membrana externa como la interna, y si es periplasmática sólo la membrana externa. Para estos dos últimos casos existen diferentes métodos de rotura celular tanto químicos (con disolventes orgánicos, detergente, choque osmótico) como físicos (sonicación, cizalla líquida o sólida, congelación y descongelación) [1,3]. Una vez extraída la enzima, esta se aísla, es decir se eliminan todos los ácidos nucleicos que han sido liberados al medio tras la rotura celular, y partículas sólidas como fragmentos de membrana y células parcialmente rotas. Después se concentra y enriquece y por último se purifica. La producción de enzimas microbianas a nivel industrial se lleva a cabo por 2 métodos: a) Fermentación en superficie (método Koji): solo para obtener enzimas extracelulares b) Cultivo sumergido: se lleva a cabo en grandes fermentadores o biorreactores que controlan perfectamente las condiciones de cultivo [1,4]. En la actualidad se producen gran cantidad de enzimas microbianas utilizadas en múltiples áreas: industria alimentaria, textil, farmacéutica y papelera. Referencias [1] J. D. Bu’lock; B. Kristiansen (1991) “Biotecnología básica”. Editorial Acriba, S.A. [2] M. García, R. Quintero, A. López-Munguía (2002) “Biotecnología alimentaria”. Editorial Limusa. Pp. 577-582. [3] S.M. Robert; N.J. Turner; A.J. Willetts; M.K. Turner (1995) “Introduction to Biocatalysis using enzymes and microorganisms”. Cambridge University Press. [4] K. Aunstrup, O. Andresen, E.O. Falch, T.K. Nilsen (1979) “Production of microbial enzymes in Microbial Tecnology”.Vol.1. Eds. Peppler, H.J., Pelman D. Academic Press, Nueva York. . . mutantes y recombinantes. cuando el metal se encuentra recubierto de una película de sulfuros insolubles.html https://w3. levaduras y hongos filamentosos. Para ello se emplean principalmente células microbianas como bacterias. que pueden ser cepas nativas como de colección. Esta tecnología. a través del diseño de estrategias optimizadas de cultivo. Nuestra Escuela a partir de 1974 ha desarrollado diversos proyectos de investigación en aspectos relacionados con la fisiología y cinética de los microorganismos lixiviantes.1. Sin embargo. Sudáfrica. tomando en cuenta tanto los factores fisiológicos como los de ingeniería y operación. elección de la modalidad de cultivo (cultivo por lote. Ghana y Brasil. En esta área se estudia la interrelación entre las condiciones de cultivo y la respuesta fisiológica de la célula. http://www.es/~jfernand/ProcMicro70801207/tema-1--- generalidades/1-5-modos-de-cultivo. el efecto de la concentración de mineral en la pulpa. de relaves y de concentrados de flotación y el uso de biorreactores con agitación mecánica y neumática. permite una mejor recuperación del oro por el proceso de cianuración. la biolixiviación de minerales de baja ley. la aireación y la agitación. basadas en la mejora del medio. su cultivo requiere de condiciones ambientales y nutricionales muy definidas.pucv.html . También se estudia la operación continua y la configuración de reactores más adecuada. implementada a gran escala en Australia.ual. cultivo por lote alimentado. para expresar plenamente sus potencialidades.cl/uuaa/postgrados-ingenieria-bioquimica/cultivos- celulares/2016-04-08/100920. la velocidad de transferencia de oxígeno. cultivo continuo) y disposición de las células (libres o inmovilizadas). proteínas y metabolitos. para la producción de enzimas. Se ha cuantificado el efecto de la adición de CO2. tanto primarios como secundarios. En los últimos años se han incorporado cultivos de células animales recombinantes para la producción de biofármacos. SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTÍNUO Cultivos celulares Las células constituyen sistemas de producción muy versátiles y altamente especializados. En la actualidad se trabaja en la biooxidación de minerales y concentrados refractarios de oro en reactores. tanto en la calidad de la suspensión como en la velocidad de biooxidación. siendo la EIB pionera a nivel nacional en la investigación en este campo. google.pe/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA582&lpg=P A582&dq=CIN%C3%89TICA+DE+CULTIVO+en+ENZIMAS+MICROBIANAS&s ource=bl&ots=_rx51eyxye&sig=bQaVRm9q7NlYz- 1uLTF01pPO0AQ&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiQwNKgg4bYAhVMxCYKHcK HDYoQ6AEIZzAO#v=onepage&q&f=false .https://books.com. . ya que las técnicas actuales no permiten el estudio de células individuales Procesos implicados en el crecimiento 1. 5. cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación. 4. Muchos productos de los cultivos microbianos de interés comercial se producen después que el crecimiento ha cesado. Ingreso de los nutrientes básicos a la célula. 3. CINÉTICA DE CULTIVO Definición de crecimiento Incremento en el número de células microbianas en una población. Replicación del material genético. Actividad de células en reposo. Incremento en tamaño y masa de la célula. es decir: Actividad de células en crecimiento. Es importante conocer la cinética de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo. cada una conteniendo una copia del genoma y otros componentesvitales CINÉTICA DE CULTIVO Describe el crecimiento y la formación de productos. 2. División de la célula en dos células hija.2. Patrones de crecimiento de diferentes tipos de microorganismos 1. PATRÓN DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS Las bacterias se dividen por fisión binaria . Transformación de estos compuestos en energía. Reproducción por fisión binaria de bacterias El tiempo que le lleva a una nueva célula dividirse se llama “tiempo de generación” (Tiempo de duplicación). Curva de crecimiento. . Cinética de crecimiento de cultivo en lote (batch): Cultivo realizado en un sistema cerrado: volumen fijo de nutrientes cuya composición se ve alterada en forma continua como resultado del consumo de estos a causa del crecimiento microbiano y la producción de metabolitos. Cada especie bacteriana tiene un tiempo de generación determinado genéticamente. pH. se realiza entre 15 y 60 min. solamente: o Oxígeno. etc. el cual se añade en forma de aire o Antiespumantes o Ácidos o bases para controlar el pH Después de la inoculación de la solución nutritiva estéril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases típicas de crecimiento. temperatura. Figura 1. (medio. así se le llamará también al tiempo que tarda en dividirse la población bajo condiciones dadas de crecimiento.). A lo largo del cultivo no se añaden nutrientes. (Etanol. amilasas. Es cuando las células se transfieren de un medio a otro y no existe inicialmente aumento en el número de células. Biomasa (Transformaciones de metabolitos intermedios). Fase lag. cítrico). etc.). Ácidos orgánicos (acético. Proteínas (fosfatasa. se realiza la reacción en cadena de duplicación de las células. de latencia o inducción. . Es un período de ajuste al nuevo ambiente. Es la fase en la que se producen los metabolitos primarios. Puede ser larga o corta dependiendo de muchos factores: Inoculo o Estado fisiológico o Fase de crecimiento o Tamaño o Tipo de microorganismos Composición del medio en el que se inocula o Condiciones fisicoquímicas del medio a) Fase Lag aparente: Es la que se observa con inóculos pequeño Cinética de la fase lag (dX/dt) = 0 X = Concentración de células (biomasa) t = Tiempo X = X0 X0 = Biomasa inicial b) Fase exponencial. proteínas recombinantes-insulina. aunque la masa microbiana puede cambiar. proteasas. Trofos= que se alimenta. logarítmica o trofofase. Fase en la que las células se han adaptado. El crecimiento puede ser descrito cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de tiempo. Velocidad específica de consumo de sustrato (de formación de producto) .Descripción matemática basica de la trofofase. Otras velocidades usadas para describir el patrón de crecimiento microbiano: Velocidad volumétrica (de crecimiento. de consumo de sustrato y de formación de producto). hongos y virus En este caso lo que se considera es la duplicación de la biomasa o del material genético por unidad de tiempo. Los tiempos de duplicación oscilan entre 15 a 20 o incluso hasta 60 min para bacterias y de 45 a 90 o hasta 120 minutos para levaduras. Las ecuaciones anteriores describen perfectamente la duplicación del número de células de bacterias y levaduras que presentan crecimiento por división celular. Patrón de crecimiento de actinomicetos. 2. . la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular. Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energía tanto en calidad como en cantidad. Si estudiamos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la temperatura de cultivo. . 1. La constante especifica de la velocidad de crecimiento microbiano (μ) se utiliza para caracterizar el comportamiento de una población microbiana..Aplicabilidad del modelo matemático del crecimiento microbiano y constante específica de crecimiento explicados: Es aplicable a la trofofase. a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el microorganismo. Por encima de esta temperatura óptima. fase exponencial o logarítmica de la curva de crecimiento. podemos observar una temperatura mínima por debajo de la que no hay crecimiento.Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. FACTORES FÍSICOS Y QUÍMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO. 2. En términos generales. La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. sin embargo. psicrótrofos y termófilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias. Sin embargo. se les puede considerar como psicrófilos facultativos.. aunque no tienen porqué morir.8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 . . el metabolismo celular se enlentece y las células paran de crecer. son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 . Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesófilos y algunos psicrótrofos ya que sus temperaturas óptimas de crecimiento coinciden con las corporales. se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento por la reducción de la velocidad de reacción y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). cuando la temperatura es superior a la óptima.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR). El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura.5 y 2. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. tanto mesófilos como psicrófilos.35 ºC). Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos. Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima. la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1. Por tanto. máxima y óptima. 0 a 7. distintos. Así. la actividad de agua es mucho menor que en el primero.80. En función de su tolerancia a ambientes con baja aw. la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. levaduras aw>0. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.. En el caso de las esporas. su crecimiento se detiene. los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son. el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo.90. salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. 3. como consecuencia del metabolismo. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio. la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. los siguientes: bacterias aw >0. disminuye su actividad de agua. halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas. también. El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo. Por otra parte. El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6. los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo. hongos filamentosos aw >0. La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja. De hecho. la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada. sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo.85.pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. a título orientativo. en muchos casos.0. las bacterias lácticas que producen .0 y otros alcalófilos que toleran pH=10. los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes. respectivamente. La utilización de almíbares. Como puede verse. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son.0 Hay que considerar que. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que. En este último caso. por ejemplo. El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos. es la concentración de oxígeno [O2]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer. o como Saccharomyces cerevisiae. sin embargo. 4. aunque viven en presencia de oxígeno. no son capaces de . Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que.5). El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento.Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones. los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. La bajada del pH se puede deber a varios factores. De esta forma. por ejemplo). En general. cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4. Por ejemplo. las bacterias que "respiran" nitratos (NO3 -). Hay microorganismos que. sulfatos (SO4 2-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración anaerobia). acético. En este sentido. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox. hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. aunque no el único. uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico. esto es: sus características oxidantes o reductoras. láctico) por ciertas bacterias. Esto es. De esta forma. la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches. o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). por ejemplo) y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables.. llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que actúa como oxidante ambiental. las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante. mientras que otros necesitan ambientes reductores. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia. etc. La detección de estas enzimas tiene valor taxonómico. En el curso de ciertas reacciones metabólicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación: . fermentativo. En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se añade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nutrientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante. Las células se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa. Este tipo de cultivo es también importante en los estudios de fisiología y de ecología microbiana. CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO. Por otra parte. membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lácticas que son anaerobias aerotolerantes. En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo. QUIMIOSTATO El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estén creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente productos de interés (biomasa. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. formas superóxido) que pueden dañar las proteínas. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. metabolitos secundarios. hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. por ejemplo).). En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales. A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (μ) baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks). velocidad de dilución D se iguala a la tasa de crecimiento μ. A valores de D> μmax. pequeños incrementos de la velocidad de dilución producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (μ) según lo indicado en la ecuación de Monod (ecuación 13). La velocidad de crecimiento aumenta (μ aumenta y τ disminuye) cuando la energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento de los microorganismos del cultivo. En una situación de equilibrio (steady state). Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo. el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente . de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f) permite regular la tasa de crecimiento y. las dimensiones de D son [h-1]. Por consiguiente. A velocidades de D muy bajas.donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D. A valores más altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el efluente aumenta. la situación fisiológica del orga nismo. de esa forma. . Habida cuenta de que en el estado estacionario D = μ. En el steady-state. se obtiene la ecuación siguiente: que permite calcular cómo varía la concentración del nutriente limitante en el efluente en función de la tasa de dilución D. considerando que el substrato consumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado estacionario (Ñ) con un rendimiento Ys. si μ > D hay un incremento positivo de la población en el quimiostato. La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente: Por consiguiente. μ = D como se había explicado anteriormente.como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y. Si llamamos SR a la concentración de nutriente limitante que entra en el fermentador y Sr la concentración de este nutriente en el efluente. como (dN/dt) = 0. la ecuación de Monod puede reformularse en los siguientes términos donde Sr es la concentración de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo. Despejando de la ecuación 16 el valor de Sr en función de los demás. cuando μ = D el tamaño de la población se mantendrá estable (equilibrio) y si μ < D la población disminuirá como consecuencia de la dilución de las bacterias. por consiguiente S alcanza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (μ) dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). podemos calcular la producción de biomasa en el fermentador con las siguiente ecuaciones Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad de substrato consumido regulando la tasa de dilución del fermentador. . . . PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE FERMENTACION PARA LA PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS La ingeniería y diseño de los procesos de fermentación ha sido ampliamente estudiada y existen diversos textos donde estos aspectos pueden ser consultados. . . . . CINÉTICA DE PRODUCCION DE ENZIMAS OPERACIONES DE RECUPERACIÓN . . . . . . . A continuación. Existen diversas enzimas involucradas en su transformación y constituyen probablemente el sector de mayor desarrollo en los últimos 15 años en lo que a tecnología enzimática para el sector alimentario se refiere. Hidroliza al azar los enlaces α1 4 del almidón gelatinizado. licheniformis es actualmente la más empleada por su alta termoestabilidad. El genero Bacillus es la fuente bacteriana de mayor importancia destacando por su importancia comercial dos de ellos: B. Son producidas principalmente por bacterias y hongos y pueden ser clasificadas por su actividad: licuefacción o sacarificación. aryzae. En el segundo caso se llegan a producir cantidades importantes de azúcares (glucosa. es después de la celulosa el polisacárido más abundante en la naturaleza y materia prima para una gran diversidad de productos de la industria alimentaria. al menos un átomo por molécula de enzima y hasta 10 en el caso de la enzima de A. La mayor parte de las α-amilasas son metaloenzimas que requieren calcio. formando maltohexosa como producto más pequeño. provocando una drástica disminución de viscosidad (licuefacción) y generando una distribución de productos de bajo peso molecular. se describen las principales características de las amilasas de origen microbiano. las α-amilasas bacterianas son de mayor resistencia a la temperatura que las fungales. Produce igualemente las α-dextrinas. En general. amyloliquefaciens y B. la producción durante durante la fermentación es lenta en la fase logarítmica pero la secreción de enzima se acelera antes de llegar a la fase . La enzima del primero fue la primera en aparecer en el mercado. endo-amilasa o α1 4 D-glucan 4 glucano hidrolasa. ALGUNOS EJEMPLOS DE PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS MIBROBIANAS AMILASAS El almidón. disminuyendo rápidamente la viscosidad. maltosa y maltitriosa). α-amilasa La α-amilasa. mientras que la α-amilasa de B. En el caso de las enzimas bacterianas. polímero de glucosa. licheniformis. mientras que en el primero se desdobla el almidón. considerando que no puede hidrolizar los enlaces α1 6 de la amilopectina. PECTINASAS Por pectinasas se denomina a un complejo de enzimas que se clasifican de acuerdo con el sustrato (pectina o ácido péctico). Dado que no tiene actividad hacia enlaces α1 6. Un medio adecuado de producción. continuando cuando el microorganismo ha dejado de crecer y al inicio de la esporulación.28% nitrato de sodio.05% peptona y 0. pues produce altas cantidades de maltosa.1% MgSO4. incluyéndose además a la pectina esterasa. 0. 0. 0. tambien se obtienen como producto dextrinas.05%Mg(H2PO4)2. ampliamente distribuida en vegetales (granos malteados). del tipo de reacción (hidólisis o transeliminación) y del mecanismo (endo o exo). 0. aryzae es de importancia comercial. trazas de zinc y 2% extracto de malta. Aunque se encuentra. 0. 0.08% Mg(NO3)2. En ambos casos parecer ser que el pH de fermentación juega un papel de suma importancia.1% K2HPO4. habiéndose obtenido mutantes 250 veces más potentes que la cepa silvestre después de 5 pasos de mutación. 0. Por otro lado. 7H2O. Un medio adecuado de producción podría ser 5% de almidón. al igual que la β-amilasa. Β-amilasa La α-amilasa es una exoenzima que libera maltosa a partir del extremo no reductor de amilosa y amilopectina.05% KCl. Esto permite una mayor efectividad en la . 0. 0.01% CaCl2. 2H2O. la temperatura de fermentación depende de la cepa empleada.2% extracto de levadura. es que el mayor número de éstas produce: una endo y una exo poligalacturonasa. 1.2% NaNO3. La producción de amilasas parece ser regulada por varios genes. Los productos comerciales provienen generalmente de Aspergillus niger. 0. podría ser: 8% almidón.13% KH2PO4. La α-amilasa A. dado que de la gran variedad de microorganismos que producen enzimas pécticas. La fermentación dura de 2 a 3 días. La fermentación dura menos de dos días.003% FeSO4.56% NH4NO3. 0.05%MgSO4. Un cambio hacia el lado alcalino durante el cultivo debe producirse. pues pertenece a las enzimas de sacarificación: es maltogénica. además de una endo polimetilgalacturonasa y una endo pectin liasa. 0.estacionaria. etc. La levadura se crece en melazas (la sacarosa es inductor) y sulfato o fosfato de amonio. Se han propuesto otros microorganismos . El proceso de recuperación debe eliminar las actividades pectinolíticas que resultarían nocivas en el tratamiento del jugo. requiriendo de dextranas como inductor. DEXTRANASAS Las dextranasas son producidas fundamentalmente para ingenios azucareros. La sacarosa es adicionada gradualmente durante la fermentación con el fin de reducir la represión catabólica. ay que las enzimas comerciales sólo presentan alta actividad hacia enlaces α1 6. en los que la contaminación con dextranas producidas por Leuconostoc mesenteroides requiere de un tratamiento enzimático. Solo las invertasas de S.degradación de pectina. Se obtienen de cepas de Penicillum funicilosum. La fermentación se lleva en sustratos (salvado. siendo empleada en el tratamiento de jugos de toronja para eliminar el sabor amargo asociado con la presencia de naringina. Algunos productores japoneses emplean igualmente cepas de Sclerotina libertiana y Coniothyrium diplodiella. pero existen dextranas con alto contenido de enlaces α1 3 y/o α1 2. Existe una gran variedad de enzimas reportadas en la literatura con actividad hacia diversos tipos de dextrana. La enzima es inducible por pectina. lo que se logra con tratamientos con urea. principalmente en Japón. P. y las condiciones de aireación juegan un papel importante en la proporción de enzimas producidas al final del proceso. Dado que la enzima se encuentra asociada a la pared celular. lilaceum y Chaetomium gracilae. cerevisiae y S. OTRAS ENZIMAS MICROBIANAS Naringinasa La naringinasa es una enzima comercial producida de Aspergillus niger. al ser liberada de la pared mediante un proceso de autolisis en presencia de cloroformo o tolueno. carlsbergensis (sinónimo: S. INVERTASA Las invertasas pueden ser β-fructofuranosidasas o α-glucosidasas. pastorianus y S.) a los que se adiciona cáscara del cítrico. uvarum) (β- fructofuranosidas) son producidas industrialmente. soya. existen dos tipos de productos: aquellos que consisten de preparaciones trituradas de levadura y productos en los cuales la enzima es soluble. Actualmente la isomaltulosa ha adquirido un mercado por sí misma. parece ser una sola enzima la responsable de la síntesis. macerans en B. Aunque existen tres tipos de ciclodextrinas (G6. stearothermophilus y 80% B. Protaminobacter rubrum o Erwinia rhapontici. Por ingeniería genética se ha clonado el gene de B. responsable del sabor de la mantequilla. .3 butilen glicol. Ciclodextrina glucosil transferasa Estas enzimas permiten obtener ciclodextrinas. macerans. Se puede emplear para producir esta enzima Aerobacter aerogenes. dada su gran similitud tecnológica con la sacarosa. 57% de α con B. Diacetil reductasa Esta enzima permite transformar el diacetilo (2.con muy baja actividad pectinolítica: A. 73% de β con B. beta y gama. producidas por las empresas que manufacturan ciclodextrinas. Este es otro caso de enzimas microbianas no comerciales. tambien conocidas como dextrinas Shardinger. Es producida industrialmente por Aspergillus niger. Las cepas de Bacillus empleadas en la producción de la enzima permiten obtener: 74% de β con B. Isomaltulosa sintetasa Esta enzima se ha empleado en la producción de isomaltulosa como intermediario en la síntesis del edulcorante conocido como palatinita. megaterium. donde se produce como subproducto de la fermentación alcohólica. es indeseable en la cerveza. respectivamente. Cochliobolus miyabeanus y Rhizoctonia solanii. a partir de hidrolizados de almidón (8-12 DE). La isomaltulosa es posteriormente hidrogenada con catalizadores de níquel. circulans. El diacetilo. G7 Y G8) conocidas como alfa.3-butanodiona) en 2. con un poder edulcorante netamente inferior. Acil tanino hidrolasa Esta enzima se conoce como tanasa y se emplea para la producción de té instantáneo. empleando células completas de Serratia plymuthica. saitoi. subtiilis. La estaquiosa es un tetrasacárido responsable de problemas de flatulencia en algunas semillas oleaginosas como la soja. y posteriormente para hidrolizar la rafinosa en galactosa y sacarosa. . mientras que la rafinosa es importante en la producción de azúcar de remolacha. ya que afecta negativamente al proceso de cristalización de la sacarosa. α-galactosidasa Esta enzima se puede emplear para hidrolizar la estaquiosa y obtener así rafinosa y galactosa. Esta enzima se produce de forma industrial a partir del microorganismo Mortierella vinacea.