Produção experimental de inoculantes a base de Azospirillum para FBN

LUANA RISSI SILVA Produção experimental de inoculantes agrícolas á base de Azospirillum spp.para Fixação Biológica de Nitrogênio em gramíneas e Forrageiras Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/I.BUTANTAN para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Área de concentração Biotecnologia Orientador Dr. José Geraldo da Cruz Pradella São Paulo 2006 AGRADECIMENTOS Ao professor Doutor José Geraldo da Cruz Pradella pela orientação, aprendizado e amizade ao longo destes anos. Á memória do Professor Luiz Carlos Urenha, pelo estímulo e críticas. Aos pesquisadores do Centro de Biotecnologia Industrial pela assitência e amizade. Aos funcionários do Laboratório de Fermentação Industrial (LFI) pelo auxílio e colaboração, em especial, ao Régis Norberto de Carvalho e Walter de Oliveira. Á mestre Marilda pelas sugestões e críticas que muito me influenciaram. A professora Doutora Vera Lúcia Baldani pelo fornecimento das cepas de Azospirillum e o insentivo para realização dos ensaios. A ajuda paciente da minha mãe que agüentou folhas de rascunho espalhadas pela casa, arengas sobre canetas que tinham sumido, e as numerosas vezes que me apossei do computador. Ao Bruno pelo carinho, amor e paciência nos momentos difíceis. Em especial a Cristina, Vinícius, Marcelo, Cecília, Fernanda Matias e as colegas da salinha, Tatiana Strelec, Sra, Caulkins e Cristiane Ottoni. pela amizade, carinho e imprescindível colaboração para o desenvolvimento deste trabalho. Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT), pelo suporte técnico e físico. À Secretaria de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/I.BUTANTAN pelo auxílio prestado no decorrer do mestrado. Ao Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo auxílio concedido. A Todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste trabalho. 5.4 Fixação Biológica de Nitrogênio 2.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas 2.3 Resposta da planta à inoculação de Azospirillum spp 2.1 Bactérias associadas às plantas 2.5.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio 3 Produção de Inoculantes para a FBN à base de Azospirillum 37 28 34 3.2 Fontes de Nitrogênio 4 Objetivos 42 .3 A Revolução Verde 2.1 Endofíticos facultativos 2.5.5 Diazotrofos associativos 2.2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas 2.1 Fontes de Carbono 3.SUMÁRIO Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Abstract 1 Introdução 1 2 Revisão Bibliográfica 4 4 6 9 11 14 15 16 18 23 2. 7 Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios .2.4.5. Sacarose. processo descontínuo 5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas 5.6 Determinações efetuadas 5.1 Microrganismo 5.5 Determinações efetuadas 5.2.5.6 Avaliação da concentração de Fósforo 5.2.5.4 Ensaios em fermentador.4 Meios de cultura sólidos para preparo do inóculo 5.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo 5.3.4. Glicerol e Lactato (S) 5.2 Concentração Celular Mássica (X) 5.3.4.3.3 Inoculação do fermentador 5.2.3 Preparo do inóculo 5. Etanol.4 Amostragens 5.4 Inoculação dos frascos 5.1 Equipamento 5.6 Cálculo dos Parâmetros Cinéticos 5.2 Meios de cultura 5.5 Métodos de análises 5.4 Concentração de Frutose.4.2 Preparo do Pré-inóculo 5.3.5.2.4.1 Soluções-estoque 5.3.5 Meios de cultura líquido 5.5 Materiais e métodos 43 43 43 43 44 45 46 46 47 47 48 48 48 48 49 49 49 50 50 50 50 51 51 52 52 52 54 55 57 58 5.5 Inoculação e amostras 5.1 Determinação de Absorbância (A) 5.3.5.2 Solução salina 5.5.3 Ensaios em incubador rotativo 5.2 Preparo do inóculo 5.5 Avaliação da concentração de Nitrogênio Amoniacal 5.1 Equipamento 5. 5 Ensaios em biorreator 6.3.4 Observações gerais 6.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A.3. brasilense 7 8 Conclusões Referências Bibliográficas 100 104 .3.4 Etanol 6.7.5.6 Resultados e discussão 60 60 60 61 62 63 63 64 65 71 74 76 79 81 83 85 89 91 95 6.2 Frutose 6.1 Glicerol 6.6 Comparação entre os ensaios (biorreator) 6.5 Etanol 6. lipoferum 6.7.3.5.2 Fontes de nitrogênio 6.5.2 Glicerol 6.5.3 Sacarose 6.3 Ensaios em incubador rotativo 6.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC) 6.1 Frutose 6.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A.1 Meios sólidos 6.3.4 Lactato 6.3 Sacarose 6. 3 Evolução das concentrações de Biomassa.1 51 Figura 6.2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e projeções do Banco Mumdial e da FAO (modificado de Mann. em agitador rotativo 66 Figura 6.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson & Cox. 1997) 10 Figura 2. Frutose. Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)). Sacarose.1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy. Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)). em agitador rotativo 67 Figura 6.LISTA DE FIGURAS Figura 2. 2004) 7 Figura 2.1 Figura 5. Glicerol. em agitador rotativo 68 .2 Evolução das concentrações de Biomassa. 13 33 Figura 3. 2000) Metabolismo central do carbono em Azospirillum Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das ams Evolução das concentrações de Biomassa.1 Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)). 10 Figura 6. Glicerol (◊). Absorbância ( ). Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em 78 fermentador Figura 6. etanol (◊). Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em 82 fermentador Evolução das concentrações de frutose. frutose (◊).Figura 6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□). Lactato.4 Evolução das concentrações de Biomassa. Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)). sacarose (◊). Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em 80 fermentador Figura 6. em agitador rotativo 69 Figura 6. Absorbância ( ). Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)). Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em 84 fermentador . Absorbância ( ).5 Evolução das concentrações de Biomassa. Absorbância ( ).6 Evolução das concentrações de biomassa (□). glicose e sacarose em Azlp01 82 Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os ensaios com Glicerol 79 Figura 6. em agitadorrotativo 70 Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□). Etanol.11 Evolução das concentrações de biomassa (□). Figura 6. ensaio Azlp02 92 Figura 6.15 Crescimento de A.14 Resultados do protocolo a ADC para A lipoferum Br 17 94 Figura 6. ensaio Azbr05 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7 96 Figura 6.13 Crescimento de A. brasilense em batelada. lipoferum BR 17 em batelada.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e absorbância para os ensaios em fermentador 87 Figura 6.16 98 . brasilense Sp7 e A.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países 24 Tabela 2.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A.4 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio 26 Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp 29 Tabela 3.2 Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes fontes de N 35 Tabela 5.1 Concentração de glicerol em g/L na amostras 53 Tabelas 5.3 Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de cultivo) 61 Tabela 6. lipoferum Br 17 em incubador rotativo (200 rpm. 30ºC) 73 Tabela 6.LISTA DE TABELAS Tabela 2. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada experimento 59 Tabela 6.4 Etapas preliminares dos ensaios em fermentador 75 .1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados 60 Tabela 6.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp – experimentos desenvolvidos em diversos países 20 Tabela 2. 7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase descontínua-alimentada à vazão constante do protocolo de ADC para cultivo de A.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em biorreator em relação ao custo do substrato 88 Tabela 6.Tabela 6.5 Tempo de crescimento. Sf). Nitrogênio (No.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum BR 17 95 Tabela 6. Substrato (So.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp 7 99 . em função da composição do meio de cultura 85 Tabela 6. Nf) para os diferentes ensaios. Xf). lipoferum BR 17 e A. concentrações iniciais e finais de células (Xo. brasilense Sp 7 91 Tabela 6. 2. 2.8) durante 5 dias. YX/N = 7.09 h-1. lipoferum BR17 foram escolhidas as fontes de C sacarose e glicerol obtendose.62 g/g. YX/N = 4. respectivamente. Os ensaios foram realizados em incubador rotativo (200 rpm. A.RESUMO Este trabalho objetiva o estudo do cultivo de bactérias do gênero Azospirillum spp. YX/S = 0. lipoferum: sacarose (µm=0. A. Foi efetuado screening de fontes de carbono e nitrogênio.17 g/L. brasilense Sp7 foram escolhidas as fontes de C frutose. YX/N = 1. pois os constituintes ácido málico e vitaminas encareceriam demasiadamente o custo de produção. glicerol (µm= 0.h).28 h-1 .h). Baseados nos resultados.06 g/g e PX = 0.35 h-1 . glicerol.08 h-1. pH 6.07 g/L.41 g/g.20 h-1. etanol. YX/S = 0.1 e 1.h) e etanol (µm= 0.h) e glicerol (µm=0.69 g/g. Mn. brasilense: frutose (µm= 0. para o estabelecimento da produção de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em gramíneas e forrageiras. A. B. cedidas pela EMBRAPA-CNPAB.35 g/g e PX = 0. (NH4)2HPO4 foi a fonte de N escolhida para estas linhagens. de baixo custo. capazes de garantir altas concentrações celulares e de propiciar formulação de meio de cultura reprodutível. brasilense Sp7 e A.0 g/L). um protocolo a alta densidade celular através do processo descontínuo-alimentado.21 g/L. glicerol e etanol obtendo-se. 2. A cinética do processo foi estudada em biorreator (pH = 6. e 1. YX/N = 12. . lipoferum BR 17.24 g/L.4 g/L ao final do ensaio. pO2>20%) obtendo-se os parâmetros descritos a seguir. YX/S = 0. Cu. Para A.8 g/L de biomassa ao final do ensaio.81 g/g e PX = 0.8 e 30oC.07 g/L. obteve cerca de 25g/L para ambas as linhagens.h).8. variando-se as fontes de carbono frutose.49 g/g e PX = 0. respectivamente. Alternativas ao meio NFb usado em laboratório são necessárias para processamento industrial.48 g/g.61 g/g e PX = 0. YX/N = 9. YX/S = 0. 2. sacarose e lactato (5g/L) e as fonte de Nitrogênio NH4Cl e (NH4)2HPO4 suplementado com K2HPO4. Para A. foram cultivadas em um meio básico composto de micronutrientes (Mo.60 g/g. YX/S = 0. 30ºC. Zn) e extrato de levedura (1. fructose. varying the Carbon (fructose. Author: Silva. lactate. lipoferum BR 17 were cultivated in a medium containing micronutrients.6 g/L. A screening of low cost carbon and nitrogen sources.a. yeast extract. A.The experiments took place at 30oC and pH 6. respectively. 4. 25 g/L for both strains. Luana Rissi Abstract The subject of the present work was to study the growth of Azospirillum spp.0 and 3.0 and 2. brasiliense Sp7. high cell density protocol using a fed-batch procedure was developed attained c. glycerin and ethanol were the best carbon sources attained.0 g/L of biomass in bioreactor experiments. ethanol) and Nitrogen sources (NH4Cl and (NH4)2HPO4).8. lipoferum BR17. capable of producing high cell concentration with a reproducible culture medium was performed. 2. (NH4)2 HPO4 was the best nitrogen source. and K2HPO4.Title: Experimental production of Azospirillum spp. For A.8. Inoculant for Biological Nitrogen Fixation in non-leguminous crops. Based on these results. . For A. sucrose. sucrose and glycerin carbon sources were chosen and the results were. aiming the production of inoculants for Biological Nitrogen Fixation in non-leguminous crops. respectively. glycerin. 2. brasiliense Sp7 and A. Além disso. São muitos os processos envolvidos na ciclagem desse elemento: desnitrificação. possuem o complexo enzimático chamado nitrogenase. causando graves limitações à produção de alimentos. o N dos solos agrícolas é exportado para as cidades. a maioria dos solos das regiões tropicais é deficiente em N. é freqüentemente limitante da produção agrícola. O nitrogênio é pouco reativo e somente um grupo seleto de seres vivos. em regiões tropicais. conduzindo à perda do N nos ecossistemas. Estima-se que os fertilizantes nitrogenados representem 40% do custo total da produção da . INTRODUÇÃO As bactérias diazotróficas utilizam como fonte de nitrogênio para seu metabolismo o enorme reservatório de nitrogênio gasoso (N2) da atmosfera (>79%). O N é um nutriente essencial para a vida e. através da comercialização dos produtos. volatilização da amônia e queimadas (processos que retornam o N à forma gasosa) e lixiviação de nitratos para as camadas profundas do solo. bactérias e actinomicetos. necessário para transformá-lo em amônia que é subseqüentemente assimilada em aminoácidos e proteínas.1 Introdução 1 1. Somente os fertilizantes nitrogenados ou a FBN podem retornar o N perdido aos solos agrícolas. algumas espécies de microrganismos procarióticos. Como conseqüência. Esse processo é chamado de fixação biológica de nitrogênio (FBN). um inoculante contendo bactérias diazotróficas que pode ser utilizado para gramíneas. A associação entre as bactérias do gênero Azospirillum e estas plantas já foi demonstrada nas décadas de 70 e 80. como a soja. forrageiras e grãos. 1991). para obtenção de nitrogênio. Uma grande variedade de genótipos de plantas de importância agrícola.1 Introdução 2 cultura. que comercializa cerca de 14 milhões de doses destes inoculantes no Brasil (IBGE. e capazes de se associar com microrganismos diazotróficos existentes no solo ou na rizosfera. Com o avanço do conhecimento na seleção de estirpes e dos . 2005). Deste processo de melhoramento obteve-se variedades selecionadas com maior habilidade de produção em solos pobres. Entretanto os resultados de inoculação obtidos até hoje mostraram-se muito variáveis.5 milhões/ano no país. no caso o rizóbio. Além disso. Já a fixação biológica de nitrogênio é um importante fator de competitividade do setor agrícola brasileiro. os fertilizantes nitrogenados são a maior fonte de poluição ambiental dos sistemas agrícolas (Machado & Magnavaca. O mercado de inoculantes agrícolas produzidos com bactérias fixadoras de nitrogênio para plantas leguminosas movimenta cerca de US$ 8. Existe um mercado promissor através da geração de um novo produto. o que se tornou uma barreira para o lançamento no mercado brasileiro de inoculantes agrícolas obtidos a partir desta bactéria. foi melhorada para que fosse possível uma diminuição no uso deste tipo de fertilizante. Cinco empresas brasileiras e algumas argentinas e uruguaias suprem este mercado. 1 Introdução 3 genótipos das plantas. novos experimentos de inoculação tornam-se necessários. Bem como o estudo sistematizado para que se estabeleça uma tecnologia de produção deste tipo de inoculante em larga escala. . Andrews & Harris. 1995. 2000) e de bactérias epíficas. dependendo das condições do ambiente e do próprio estado fisiológico do hospedeiro. forma de penetração. 1991. 1997b. Sturz et al. 1991. Azevedo et al. 2000). habitando. a emergência de raízes secundárias laterais sempre é . visto que existem algumas populações bacterianas que podem ficar entre a colonização endofítica e epífica (Hallmann et al. Reinhold-Hurek & Hurek. Andrews & Harris. Jacques & Morris.. como folhas. não existindo um claro limite entre grupos e sim um gradiente entre eles. 1998a. A origem.... podendo apresentar relações neutras. Azevedo. 1997b). Hallman et al. de modo geral. 1998). Sua penetração pode ocorrer pelas aberturas naturais e feridas. 2000). Elas podem ser provenientes de sementes. Este aspecto pode ser melhor entendido com o trabalho de Whitesides & Spotts (1991) que compararam características fenotípicas de isolados endofíticos e epíficos de bactéria Pseudomonas syringae e relataram a capacidade de um mesmo isolado de se estabelecer dentro e fora do hospedeiro. essas distinções têm finalidades apenas didáticas. 1998a. um endófito pode ser considerado um patógeno latente (Azevedo. caules e raízes. Hallmann et al. simbióticas e de patogenia com a planta hospedeira.2 Revisão Bibliográfica 4 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Bactérias associadas às plantas Bactérias são habitantes comuns da superfície e do interior dos vegetais. havendo sobreposição entre esses grupos de microrganismos. 1998b. da rizosfera e de material propagado vegetativamente (Mclnroy & Klopper. que vivem na superfície dos órgãos e tecidos vegetais (Rizoplano) (Petrini. Assim. sem causar aparentemente nenhum dano a seus hospedeiros (Petrini. Evidentemente. 1997b. As bactérias associadas às plantas são chamadas de bactérias endofíticas quando vivem no interior das plantas. suas partes aéreas. 2000b. Reinhold-Hurek & Hurek.. Uma das portas de entrada mais utilizadas pelos endófitos são as raízes. colonização e transmissão de bactérias endofíticas ainda são muito discutidas. 1995a. .. 2000). Hirano & Hupper. arroz (Stolzfus et al. Eles podem também ser encontrados dentro de estruturas fúngicas. como estômatos e hidatódios. 2000). Araújo et al. o Glomus clarum. penetrando no solo. 1997).2 Revisão Bibliográfica 5 acompanhada por uma “ferida”. incluindo muitas de interesse agrícola. tais como cana-de-açúcar (Cavalcanti & Döbereiner. podem ser causadas feridas como as que fatalmente ocorrem. O próprio crescimento das raízes. folhas e frutos em uma extensa variedade de plantas. sendo este um possível mecanismo de penetração (Di Fiore & Dell Gallo.. 1997a). aberturas causadas por insetos e até por estruturas de fungos patogênicos. gera abrasões que facilitam a entrada de germes que podem produzir enzimas hidrolíticas capazes de degradar a parede celular dos vegetais. 2001. 1999.. Shishido et al. Especialmente em plantas perenes. tomate (Pillay & Nowak. 1997a. Marcon. 2002). 1995). algodão (Quadt-Hallmann et al.. no qual diversos fatores podem influenciar a estrutura e composição da comunidade bacteriana associada ao vegetal. entre outras. trigo e sorgo (Zinniel et al. . (1991). caule. Desta forma. 1996. 1988). 1992. batata (Reiter et al. contendo a bactéria endofítica Acetobacter diazotrophicus no seu interior. nematóides parasitas e por características próprias de seu hospedeiro (Lindow & Anderson. Esse é o caso constatado por Paula et al. o habitat associado à planta é um ambiente dinâmico. como os apressórios. milho (Fisher et al. nódulos. citros (Araújo et al.. que identificaram um fungo micorrízico. 1995.. E adentram também pelas entradas naturais. que serve de entrada para os microrganismos. 1997b. As bactérias endofíticas têm sido isoladas de raiz. na época da colheita de frutos. Quadt-Hallmann et al. 2000). Mclnroy & Kloepper... 1995b. A colonização e distribuição de bactérias endofíticas e epíficas no hospedeiro pode ser influencia da por interações com outros microrganismos associados à planta.. por exemplo. 2002). Andrews & Harris. videira (Bell et al. 2002). Quadt-Hallmann et al. 1997).. Elas constituem pontos de penetração de endófitos. outros microrganismos patogênicos e inclusive contra herbívoros (Azevedo et al. Lodewyckx et al.. antibióticos e outros fármacos. fixando N2 ou por outros mecanismos (Sturz et al. 2002). mas foi Bary (1866) quem primeiro delineou uma possível distinção entre eles e patógenos de plantas. 2000).. Downing et al. Peixoto Neto et al. 2000a. iii) endófitos podem ser utilizados como vetores para a expressão de genes heterólogos nas planta hospedeira (Murray et al. produzindo fitohormônios. 2000b. . 2000).2 Revisão Bibliográfica 6 Os microrganismos endofíticos foram mencionados pela primeira vez no início do século XIX. 2001). fatores de crescimento e muitos produtos de interesse biotecnológico (Azevedo et al. contudo.. 2002).1)... foi verificado que estas bactérias possuíam propriedades de interesse. Sturz et al. sabe-se que endófitos podem produzir toxinas.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas O ciclo do nitrogênio (N) na natureza é um dos que mais afeta as variadas formas de vida na Terra (Figura 2. 2. efeitos benéficos ou prejudiciais aos seus hospedeiros.. Na biosfera e na litosfera o nitrogênio é essencial para a nutrição de plantas e animais. quando. permaneceram praticamente esquecidos até o final dos anos 70. por uma série de motivos. 2000). ii) podem também ser utilizados como promotores de crescimento vegetal. 2001. sua excessiva concentração em solos e águas pode acarretar problemas de eutrofização e intoxicação de organismos (Van Lonn & Duffy. 1992.. Definidos como assintomáticos. portanto. Marcon. 2002. como por exemplo: i) conferir proteção contra insetos-pragas.. e foi citado por Azevedo (1998a) e Peixoto-Neto (2002). O nitrogênio é um importante constituinte das chuvas. iv) atualmente. afeta o clima global e influencia as reações de síntese e o balanço de decomposição do ozônio na estratosfera. iv) endófitos podem ser combinados em processo de fitorremediação de contaminantes orgânicos e metais pesados (Siciliano et al. não produzindo. 2001). Entre os gases que formam nossa atmosfera. 1998).. só é observado seu carreamento para o solo pelo arraste através da chuva dos óxidos de nitrogênio produzidos por descargas elétricas (Fernandes. Entretanto.2 Revisão Bibliográfica 7 Esse nutriente é essencial para a manutenção e acumulação de proteínas em plantas. a assimilação de nitrogênio somente ocorre na forma reduzida.77% da matéria seca de parte aérea de arroz aos 19 dias após o plantio (Breseguello & Stone. Devido à grande estabilidade dessa molécula. N2 apresenta uma posição privilegiada no que diz respeito à quantidade: 78%. Sua absorção por parte dos vegetais superiores pode ser tanto na forma nítrica (NO3-) quanto na amoniacal (NH4+) (Britto et al. Figura 2. 1978). 2004).1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy. . em virtude de seu baixo potencial de ionização e alta energia de dissociação. alcançando até 4. podendo ser a única fonte de nitrogênio mineral para as plantas em certos solos (Britto et al. Já a forma nítrica é facilmente lixiviada do solo. quando o NH3 atmosférico estiver abaixo do ponto de compensação de amônio da planta (Trivelin et al. Indiscutivelmente. pH baixo ou no uso de inibidores de nitrificação (Fernandes. Dessa forma. as perdas da forma amoniacal baseia-se na acentuada volatilização. NH4+ pode ser acumulado onde houver inibição da nitrificação. O N é indispensável para a vida e principalmente para a produtividade de culturas agrícolas. mesmo após absorvida pelos vegetais. alcançando cerca de 1. alcançando uma relação de 56 de NH4+ para 1 de NO3-. principalmente em regiões de alta precipitação e temperaturas de solo elevadas. como econômico. o nitrogênio é quantitativamente o mais importante elemento requerido por plantas e animais para o crescimento tanto na água como na terra. em muitas áreas agricultáveis este cátion aparece em níveis milimolares na solução do solo. O NH4+ é oxidado a NO3 -. 1990). volatilização e desnitrificação.2 Revisão Bibliográfica 8 O amônio tem sido subestimado como fonte de nitrogênio para as plantas. bem como. mas se perde do solo facilmente por lixiviação. Ainda hoje novas metodologias para sua utilização são intensamente estudadas. 2002). A busca da maior eficiência no uso de N (EUN). no entanto. de . se fazendo-se necessário o uso adequado da adubação tanto do ponto de vista agronômico e ecológico. oxigênio e hidrogênio. Entretanto.. Devido seu uso indiscriminado trouxe consigo problemas ambientais (Bouchard et al. 1992). 2001). em pequeno grau na faixa de pH normalmente encontrada nos solos (Britto et al..5% do peso seco de inúmeras culturas agrícolas (Van Loon & Duffy. 2001)... este foi um dos nutrientes que mais contribuiu para a chamada Revolução Verde. através do reconhecimento das vias bioquímicas e moleculares de absorção e assimilação em plantas. O NH4+ do solo surge da protonação da amônia oriunda das desaminações da matéria orgânica em decomposição no solo (amonificação). De maneira diferente. depois de carbono. como é o caso do Trópico Úmido. 2001). como nos solos com excesso de Al. Com isso o balanço energético da produção mostrava-se bastante desfavorável e levaria.2 x 106 Kcal de milho no meio-oeste americano.. o aumento da irrigação e do uso de agentes químicos agrícolas. Para a produção de 8. Alguns ganhos obtidos nas décadas que se seguiram à Revolução Verde foram perdidos juntamente com milhares de hectares de terras. a produção mundial de grãos cresceu 2. O problema tornou-se tão flagrante que no início dos anos . 1975). são propostas para permitir o uso sustentável deste elemento sem a perda da produção (Traore & Maranville. Além disso. 2002). 2.3 A Revolução Verde Entre os anos de 1950 e 1984. alcançando 80% na China e 130% na Europa Ocidental (Corson. os problemas não demoraram a aparecer. necessitavam-se 2. Estas três décadas de crescimento são devidas a vários fatores. o uso indiscriminado de energia na produção agrícola trazia preocupações. destaca-se a expansão de terras cultivadas. Assim. o cultivo simultâneo de várias culturas e as melhorias nas técnicas de produção (Corson. 1999. ao extermínio de todas as reservas de petróleo conhecidas na época (Pimentel. A agricultura tecnológica desenvolvida na Europa Ocidental e nos Estados Unidos era totalmente inviável para os trópicos. como a fixação biológica do nitrogênio (FBN). A agricultura de alta tecnologia implantada com a Revolução Verde havia escolhido a proposta de aumentar a produção pelo aumento da oferta de nutrientes no solo. Dentre eles.9 x 106 Kcal de energia fóssil e mais 2. erodidos pela intensa aragem.6 vezes. Entretanto. 2002). Pradella et al.043 x 106 Kcal de energia solar.2 Revisão Bibliográfica 9 metodologias agroecológicas. Este fato incrementou a produção per capita em 40%. em apenas 13 anos. devido à irrigação excessiva e à salinização e contaminação dos corpos d’água e do solo promovida pelos insumos químicos utilizados agressivamente. notou-se o esgotamento do lençol freático. 2001). já em meados dos anos de 1970. .25. A produção per capita de grãos iniciou uma onda de quedas. como mostra a Figura 2. Várias são as explicações para o declínio da Revolução Verde. 2002). O índice de colheita. A partir de 1984 o milagre parecia ter chegado ao fim (Corson. alcançase 0. a fração da massa da planta recuperada em seus grãos.5 e acredita-se que se pode chegar no máximo a 0. Assim. publicou um relatório mostrando que o potencial do solo em produzir alimentos encontrava-se limitado em 117 países em desenvolvimento (Corson.2 Revisão Bibliográfica 10 de 1980 o órgão da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Agricultura (FAO). 1997). 2002). Figura 2. mantendo-se longe daquela projetada pela FAO e pelo Banco Mundial. 1997). Corson. 2002).2 (Mann. no início do século passado. seria o alcance dos limites físicos da planta. 1997. Outro fator importante apontado por cientistas.6 ou 0. variava em torno de 0. isto é. Talvez o problema esteja no fato de que a população não parou de crescer. 1997).2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e projeções do Banco mundial e da FAO (modificado de Mann.65 do peso em grãos. o paradigma da Revolução Verde: cultivar pequenas plantas com mais grãos por pé às custas de muito fertilizante não se torna sustentável (Mann. o aumento no consumo de carne levou ao direcionamento de grande quantidade de grãos para a alimentação animal (Mann. Hoje. além disso. Uma possibilidade para tornar o N atmosférico disponível para as culturas agrícolas é a fixação biológica (FBN). Com isso. torna-se possível realizar tal processo à temperatura biológica e a 0.2 Revisão Bibliográfica 11 É ponto factível que nos próximos 30 anos as necessidades globais de grãos irão crescer e. É constituinte essencial de aminoácidos. Apenas alguns organismos procariontes possuidores do complexo enzimático denominado nitrogenase são capazes de efetuar este processo. Além disso.simboliza elétron e Pi simboliza o fosfato inorgânico). 1994). entre outras moléculas (Kim & Rees.. bem como pela perda de terras aráveis para cidades. amônia. 2000). hormônios e clorofila. os vegetais são incapazes de assimilar o dinitrogênio. indústrias e recreação (Mann. 1997). 2. a solos ácidos ou capazes de utilizar mais eficientemente a nutrição e cada vez mais estimulado o uso de inoculantes agrícolas baseados na fixação biológica de nitrogênio (Mann. que a expansão da produção de cereais tornou-se limitada pelas necessidades de preservar os ecossistemas.5 KJ. . ainda.2001).8 atm de N2 (Kerbauy. Em virtude do sistema enzimático. ácidos nucléicos. Para que o N2 seja convertido em uma forma assimilável. mol -1 (Nelson & Cox. bases nitrogenadas. A forma molecular do nitrogênio acessa continuamente as plantas através dos processos de trocas gasosas. Pradella et al. tem-se selecionado novos tipos de plantas mais resistentes à doenças.+ 8H+ → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi (onde e. A equação geral da FBN é descrita a seguir: N2 + 16ATP + 8e. No entanto.4 Fixação Biológica de Nitrogênio O nitrogênio é o quarto elemento mais abundante nas plantas. 2004). proteínas. se faz necessário o gasto de 33. 1997. a Revolução Verde tem dado lugar a uma agricultura sustentável que leva em consideração métodos precisos para otimizar cada etapa da produção do plantio à colheita. quando já se conheciam as vias de metabolismo do carbono.3). Na verdade. Como o processo de fixação se baseia na redução do N2 a NH4+ se faz necessária uma cadeia de moléculas transportadoras de elétrons capazes de catalisar também a redução de outras moléculas como o acetileno e o etileno (Figura 2. não se conhecia praticamente nada acerca da via mediante a qual o N2 era convertido em aminoácido. Possivelmente devido à facilidade de cultivo de aeróbios.2 Revisão Bibliográfica 12 Ainda que a fixação biológica de nitrogênio seja conhecida há mais de um século.. A primeira bactéria fixadora de nitrogênio foi isolada por Sergei Winogradsky na última década do século XIX e foi o anaeróbio Clostridium pasteurianum. Esta última reação pode ser utilizada como estimativa da taxa de fixação (Nelson & Cox. Em 1901. Possui também dois sítios de ligação de ATP/ADP. Martinus Beijerinck isolou o Azotobacter chroococcum. a maioria do trabalho bioquímico foi efetuado em Azotobacter durante muitos anos. observa-se um centro redox de 4Fe-4S. 1984). Metade do Fe e do S está presente em dois pares de sítios 4Fe-4S. A incapacidade de preparar extratos ativos livres de células se devia com toda a segurança à extrema sensibilidade ao O2 da nitrogenase. A resolução do problema se obteve em 1960 quando um grupo na empresa E. O problema mais importante em qualquer intento de estudar a bioquímica de um processo é obter um sistema de enzimas ativas livres do resto da célula. A dinitrogenase redutase é formada por um dímero com subunidades idênticas (Fe-proteína). outro fixador de nitrogênio. Já a dinitrogenase é um tetrâmero com duas cópias de duas tetrâmero. Nesta proteína. mesmo de aeróbios como o Azotobacter. DuPont desenvolveu um sistema livre de células trabalhando com Clostridium pasteurianum. que pode ser oxidado e reduzido por 1e-. (Brock. apenas a partir da década de 60 do século XX foi possível ter uma compreensão aproximada do processo. I. Todos os intentos para obter este sistema livre de células que pudesse fixar nitrogênio não tiveram êxito e ainda muito tempo depois. . 2000). a enzima nitrogenase é formada por um complexo protéico altamente conservado constituído essencialmente por duas enzimas: dinitrogenase redutase e dinitrogenase. et al. de forma que a enzima se inativava ainda antes que se pudesse fazer alguma prova. Uma forma de Nitrogenase contém Vanádio (V) ao invés de Molibdênio (Mo). O restante dos metais faz parte de um cofator Fe-Mo. .2 Revisão Bibliográfica 13 chamados cluster P. 2000). Dessa forma. 2000). as bactérias que expressam esta enzima também expressam Fe-Mo. Figura 2.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson & Cox. Porém. a enzima V-Fe teria função em certas condições ambientais limitantes (Nelson & Cox. Klebisiella pneumoniae e Azotobacter vinelandi (Fixação Biológica.. 2. 1997. Oscillatoria.. 2004). Azotobacter. arroz. que são utilizados na redução de N2 a NH3. alguns organismos de vida livre também são capazes de fazer FBN. por sua vez. Além disso.2000). Rhodospirillum rubrum. é produzida uma molécula de H2. reduzindo a FeMo-proteína. Gloeothece. se oxida. Concomitantemente. Assim.. E. associando-se com leguminosas. São exemplos de microrganismos autotróficos: Thiobacillus ferrooxidans. Plectonema. associando-se às culturas de milho. Sinorhizobium e Rhizobium. ainda microrganismos heterotróficos como Clostridium pasteurianum. A dinitrogenase acumula 8e-. Mesorhizobium. o complexo Nitrogenase recebe o auxílio de uma ferredoxina no transporte de e-. os gêneros Azospirillum. restabelecendo ATP e H2O. que utiliza parte dos e-. Kerbauy. A eficiência da FBN é aumentada em certos organismos que possuem uma hidrogenase capaz de oxidar o H2.2 Revisão Bibliográfica 14 Durante a reação. A ferredoxina reduzida transfere um elétron para a enzima dinitrogenase redutase. trigo. Anabaena e Nostoc. Para cada elétron transferido. O NH3 fixado dá origem no meio aquoso do citoplasma bacterióide ao NH4 + que é direcionado para o citoplasma vegetal. Bradrhizobium. Entre as diversas espécies de bactérias diazotóficas pode-se destacar: os gêneros Azorhizobium. grama batatais e cana-de-açúcar (Vargas & Hungria. onde será assimilado pelas vias de redução até aminoácidos.5 Diazotrofos associativos Dentro deste grupo podemos dividir os diazotrofos em dois grupos de acordo com a proposição de Baldani et al. Beijirinckia. (1997a): endofíticos facultativos (podem . As pesquisas sobre FBN estão trazendo novas perspectivas a cada dia. 2003a. Herbaspirillum e Gluconacetobacter. são utilizados dois ATP. Bacillus. no balanço da reação são utilizados 16 ATP para cada N2 reduzido. Resende et al. Esta unidade. Estirpes têm sido encontradas em associação com plantas monocotiledôneas. Rennie. 1986. 1982). . a película formada vai se deslocando até a superfície do gradiente de oxigênio. 1980. 1979) e com as dicotiledôneas (Rao & Vankateswarlu.. Reinhold et al. 1982). 1976. Döbereiner & Pedrosa. sorgo. cana-de-açúcar. 2. análise do DNA:DNA e sequência 16S rRNA: A. 1987).. 1982).. O isolamento das espécies de Azospirillum como fixadores de nitrogênio se deveu a introdução de meios semi-sólidos sem N. gramíneas forrageiras como Digitaria e “Kallar grass” (Döbereiner et al. caracterizadas com base fenotípica. graças ao fenômeno de aerotaxia (Döbereiner et al. Endofíticos Facultativos Somente após a redescoberta do gênero Azospirillum por Döbereiner & Day (1975). Wong & Stemberg. A distribuição ecológica de Azospirillum spp. incluindo milho. O desenvolvimento do meio semi-sólido foi um fato muito importante para o isolamento de diazotrofos com carácter microaerofílico. em 1978 e hoje compreende seis espécies.2 Revisão Bibliográfica 15 colonizar tanto a rizosfera como o interior das raízes) e os endofíticos obrigatórios (colonizam o interior das raízes). Os microrganismos desse gênero colonizam tanto o interior quanto a superfície das raízes de várias gramíneas forrageiras e cereais.. posteriormente. arroz. é extremamente ampla podendo ser considerada uma bactéria universal encontrada colonizando plantas crescidas em diferentes habitats (Döbereiner et al. 1995). o crescimento dependente de fixação de N2 ocorre em regiões do meio de cultura onde a taxa de difusão de O2 está em equilíbrio com a taxa de respiração das bactérias e.1. 1981. O gênero foi definido por Tarrand et al. sendo então chamado de diazotrofo endofítico facultativo (Döbereiner & Baldani.5. os cientistas no mundo todo mostraram interesse na associação dos diazotrofos com as gramíneas (Döbereiner & Baldani. Haahtela et al. 1976.. No caso de Azospirillum e outros diazotrofos. 1987). países como o Brasil continuaram a apoiar pesquisas em fontes alternativas de nitrogênio.. Após análises fisiológica e filogenética.2 Revisão Bibliográfica 16 brasilense e A. Okon & Labandera-Gonzalez. ou seja. 1999). A. garantem aumentos de 5 a 30% na produção (Baldani et al. 2. A.. durante a chamada “revolução verde”. 1958). Estas colonizavam os espaços intercelulares das células da epiderme e do córtex radicular na zona de elongamento e formação de pêlos radiculares. A. principalmente com a descoberta de que bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. estes diazotrofos. ainda falta conhecimento sobre o mecanismo envolvido na interação bactéria-planta e como ele contribui para o nitrogênio acumulado nas plantas. Esses estudos avançaram bastante no Brasil na década dos setenta. 1989) e A. muitos destes isolados foram designados para o gênero Herbaspirillum. a parte interna das raízes. diminuir a sua dependência dos adubos nitrogenados. largimobile (Sly & Stackebrandt. lipoferum (Tarrand et al. 1983..5. uma vez que a crise energética havia elevado seus custos e que não eram subsidiados no Brasil..2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas Os estudos sobre o processo de fixação biológica de nitrogênio em gramíneas iniciaram-se na década dos cinqüenta (Döbereiner & Ruschel. amazonense (Magalhães et al. Apesar das diferentes formas de interação. quando estão em associação com gramíneas. (1997a). Segundo Baldani et al. constituindo assim uma nova espécie (Kirchhof et al. 1983). 1994). assim. os quais muitas . 1978). halopraeferens (Reinhold et al. buscando. a associação de bactérias fixadoras de nitrogênio com gramíneas ganhou uma importância enorme. Enquanto a maioria dos países industrializados procurava auto-suficiência de alimentos mediante o uso intensivo de fertilizantes na agricultura. Sua identificação e detecção foi através da hibridização fluorescente in situ (Eckert & Hartman. embora várias características ecológicas e fisiológicas estejam sendo desvendadas. denominado como Azospirillum dobereinense. Nesse contexto. 2001) e o gênero Azospirllum. 2001). irakense (Khammas et al.. brasilense e A. A espécie Spirillum lipoferum foi redescoberta no Brasil como bactéria diazotrófica associada à rizosfera e raízes de várias gramíneas (Döbereiner & Day. No primeiro caso. Assmus et al. em parte da capacidade de algumas estirpes em colonizarem o interior das raízes. diversos grupos mundiais de pesquisa se interessaram pela associação gramíneas/bactérias diazotróficas. fisiologia e genética. interna. concluíram que a utilização de estirpe homóloga (refere-se à estirpe isolada da espécie de planta à qual está sendo inoculada) Sp 245 colonizam o interior de raízes de trigo enquanto que a estirpe heteróloga (refere-se à oriunda de outras espécies) foi incapaz de colonizar o interior das mesmas raízes (Baldani et al. 1978. algumas vezes embebida no mucigel. ao nível de superfície. 1975. onde podem estar envolvidas estruturas fibrilares que realizam o ancoramento da bactéria á célula vegetal.. trabalhando em condições de campo com plantas de trigo inoculadas com diferentes estirpes de Azospirillum e utilizando técnicas diferentes. assim como sobre o processo de infecção e colonização de cereais. Contudo.. e raramente coloniza a superfície dos pêlos radiculares (Patriquin & Döbereiner. As dúvidas emergem.. Assim. a bactéria coloniza indinstintamente toda a superfície radicular.. lipoferum (Baldani et al. 1995). 1987. O modo de adesão do Azospirillum à planta se dá mediante ataque apolar (raramente polar). . Mas há no meio científico. foram gerados conhecimentos sobre ecologia. muita discussão quanto á classificação das bactérias do gênero Azospirillum como bactérias endofíticas facultativas ou rizosféricas. 1980). principalmente pelas espécies A. A partir desse conhecimento. Umali-Garcia et al. 1997a). estabelecendo deste modo a ligação entre células (Levanony et al. Schloter et al. o que culminou com a identificação de seis espécies de Azospirillum nos últimos vinte anos. formando pequenos agregados. 1989)..2 Revisão Bibliográfica 17 vezes não apresentam nenhum sinal de ruptura. indicando que sua interação com a planta poderia resultar em uma associação com maior potencial de exploração agrícola do que as associações de várias bactérias diazotróficas com a rizosfera dessa plantas (Döbereiner & Day. Estudos. dois tipos de associações radiculares têm sido descritas: uma. enquanto outras colonizam apenas a superfície delas. 1978).. Patriquin & Döbereiner. e outra. 1994. Conquistas como .. 1989).3 Resposta da planta á inoculação de Azospirillum spp O uso de várias técnicas para a quantificação do N em culturas. sorgo e de diversas outras gramíneas com a via fotossintética C4. 1994). 2003a). Pouco se sabe. 1980. o ‘kallargrass` (Leptochloa fusca).. Rocha et al. A introdução da FBN nesta cultura torna-se ainda mais importante quando se avalia o balanço energético da cultura.. aveia. uso do gás 15 N2 e redução de acetileno em raízes. porém sobre sobrevivência do Azospirillum no solo na ausência da planta hospedeira. 2.2 Revisão Bibliográfica 18 1976) e. que podem facilitar a sobrevivência em condições desfavoráveis (Del Gallo & Fendrik. planta nativa do Paquistão. 2003a). centeio e gramíneas com via C3 (Döbereiner & De-Polli.. halopraeferans é mais específica. Já a espécie A. 1982a). altamente tolerante a solos salinos (Reinhold et al.5. tem mostrado que 60% das necessidades de nitrogênio da cana-de-açúcar são equacionadas pela FBN (Resende et al. diluição isotópica de 15N. reclassificada como gênero novo Azospirillum (Tarrand et al. produção de melanina. 1978). 1987). O padrão de colonização das raízes das gramíneas pelas espécies de Azospirillum mostra uma tendência de especificidade entre grupos de plantas e as bactérias: A. tendo sido isolada apenas de uma espécie de gramínea. brasilense ocorre preferencialmente associado a trigo. logo depois. como: abundância natural de 15N. Dois terços desta cultura são utilizados para a produção de álcool combustível no Brasil (Resende et al. arroz. mas tem sido demonstrado que a bactéria apresenta vários mecanismos fisiológicos de proteção (formação de cistos. mas foi também observada em uma espécie ciperácea (Döbereiner. A. tem sido apenas isolada de raízes de arroz (Khalmmas et al. lipoferum ocorre preferencialmente no córtex de milho. de poli-β-hidroxibutirato e de polissacarídeos).. enquanto A. balanço de N total. irakense.. 1981). cevada. segundo Rao et al. com médias de 505 kg. Este grão corresponde entre 20 e 28% das proteínas ingeridas no Brasil. permitindo que o feijoeiro nodulado alcance produtividade de até 2500 kg. a produtividade ainda é muito baixa.ha-1 em solos pobres em N. existe o problema de transferência do N fixado para a planta que. compatível às plantas que recebem N mineral (Vargas & Hungria.1 enfatizam que a inoculação pôde ser otimizada através das condições ambientais favoráveis quando comparados os diversos países que utilizam a técnica de FBN.2 Revisão Bibliográfica 19 esta fizeram com que o Brasil se tornasse o menor usuário de adubos nitrogenados do mundo. tem-se perguntado muito sobre os benefícios da inoculação com as bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. Nesse processo. 1991) e cuja viabilidade foi demonstrada por Cristiansen-Weniger & Van Veen (1991). 1997).. A alternativa para melhorar a transferência do nitrogênio fixado para a planta seria o uso de mutantes excretores de NH4+ (Machado et al. Entretanto. 1997). A utilização de ciclos culturais longos. muito limitada pelo fornecimento de N e P. (1986). um exemplo de cultura que pode ser significativamente otimizada pela FBN é o feijoeiro (Vargas & Hungria. ocorre muito lentamente e apenas pequena parte se torna disponível para o vegetal. como mostra os resultados obtidos nos cultivos de milho e sorgo no Brasil e na França alcançaram 100% de resposta no aumento de N na planta. além de contribuir para a preservação da fertilidade do solo. o que pode ser otimizado com condições ambientais favoráveis. Apesar da vasta área plantada. Durante os últimos anos. O N necessário à cultura poderia ser fornecido via FBN. . ciclos culturais longos e uso de estirpes e cultivares selecionados. Entre as leguminosas. Esta tecnologia de baixo custo reverteria a queda na produtividade sem o uso de adubos nitrogenados. estimativas das taxas de FBN obtidas em campos experimentais na América Latina e África não ultrapassam 40% de N fixado no feijoeiro. Já a Tabela 2.ha-1. Enquanto países como a Índia ainda seguem os paradigmas da Revolução Verde (Döbereiner. porém. 1997). brasilense Cd Inoculante comercial Inoculante comercial A. 1990 Okon et al... lipoferum A. 1987). Kapulnik et al. tais como auxinas. Lin et al.63 53 78. 1987 Mirza et al. 1985. brasilense Sp 245+ 15kg de N. 1996 Baldani et al.. 1983. 1983. 1989 Por outro lado.. bactérias do gênero Azospirillum são conhecidas pela sua capacidade de produzir hormônios de crescimento... BrasilenseJA04 + 15kg de N.ha-1 A. 2000 Pereira et al... 1989 Pereira et al.20 20 . 1979 Rao. brasilense Cd A... 1994 Citado por Okon &Lanbadera. . Tal incremento resulta num aumento da absorção de água e nutrientes. 1986 Wani. 1994 Caballero-Mellado et al. elevando a capacidade da planta de produzir e suportar estresses ambientais. brasilense UAP-55 A. até mesmo de resistência a geadas (Baldani et al. lipoferum CRT-1 A. 1988 Okon et al. geberelinas e citoquininas “in vitro” (Hartmann & Zimmer. lipoferum S82 e S65 A. amazonense S 91 Aumento N total na planta (%) 11 . brasilense Az-5 Isolados locais A.24 19 20 .2 Referência Tien et al. brasilense Cd A.9 58..30 100 37 15 . de taxa de aparecimento de raízes secundárias e da superfície radicular quando as plantas são colonizadas por essas bactérias. Tem-se verificado que ocorre um aumento da densidade de pêlos radiculares.ha-1 A..30 15 . País EUA Índia Índia Israel Israel França Argentina Argentina México Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Duração dos experimentos (Semana) 3 1 1 7 7 6 3 7 2 3 5 6 5 6 Cultura Sorgo Sorgo Milheto e Sorgo Sorgo Milho Milho Milho Trigo Milho Trigo Trigo Arroz Sorgo Sorgo Inóculo A.9 17-60 90..1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp – experimentos desenvolvidos em diversos países (Baldani et al.... 1988). 1994 Barrios et al. 1994).2 Revisão Bibliográfica 20 Tabela 2.30 23 . A produção pela planta de substâncias de crescimento em resposta à colonização radicular também tem sido sugerida como uma possibilidade alternativa para os aumentos de massa seca observados em plantas inoculadas com Azospirillum (Fallik et al. 1992 Didonet et al. 1999). 1988 Fages. Summer. 1987.. Penot et al. sendo muito favorável.1. Fallik et al.. Bactérias do gênero Azospirillum são capazes de acumular poli-β-hidroxibutirato (PHB).. especialmente. Embora o termo especificidade hospedeira seja usado para caracterizar essas associações. quando se comparado aos resultados obtidos nos experimentos efetuados nos EUA. 1985). um material de reserva que lhes permite resistir a condições de estresse ambiental (Tal & Okon. tem-se demonstrado que existe certa afinidade entre estirpes e cultivares (Patriquin et al. Wani. 1980. lipoferum S82 E S85 no inóculo que conseguiu aumentar o acumulo de até 60% de N na planta. quando a população nativa está presente (Favilli et al. 1990). porém esse conceito não tem sido aplicado com muita freqüência nos trabalhos de inoculação de gramíneas em campo. 1992). 1990. O experimentos realizados com sorgo no Brasil utilizando A. E com a cultura de milho pode-se efetuar comparações semelhantes. índia e Israel. lipoferum CRT-1 como inóculo obtiveram aumento de 100% de acúmulo de Nitrogênio na planta. Estudos prévios de seleção de estirpes mostraram que o uso das homólogas pode promover aumentos de produção.. 1983. Alguns autores sugerem que estirpes isoladas do interior das raízes (após a esterilização superficial) são mais eficientes e que se devem utilizar estirpes homólogas. pois os resultados obtidos para os experimentos na França utilizando A. isoladas do mesmo tipo de planta que se deseja inocular.. 1987. Em relação ao estágio fisiológico.2 Revisão Bibliográfica 21 O uso de estirpes e genótipo da planta selecionadas podem influenciar os resultados de inoculação como mostra a Tabela 2. já que as células com maior acúmulo de PHB podem resistir por mais tempo a condições adversas. Vale ressaltar que a competitividade com outras estirpes ou mesmo outros componentes da microbiologia do solo pode prevenir a colonização radicular por bactérias do gênero Azospirillum (Döbereiner & Pedrosa. Wani et al. visando aumentar a sobrevivência da bactéria no inoculante. Boddey & Döbereiner. Fages (1992) relata estudos comparativos de inoculação de culturas jovens e daquelas mantidas sob crescimento por mais de dez dias. 1988b). . estudos foram feitos no sentido de multiplicar células de forma a melhorar a sobrevivência da bactéria nos inoculantes. 1988. isto é. 1985) ou entre a bactéria e espécies de plantas (Baldani & Döbereiner. Baldani et al. 2003b). O substrato sólido mais usado é a turfa estéril neutralizada. e ainda. No primeiro caso. A inoculação de Azospirillum na presença de pequenas doses de fertilizantes nitrogenados tem mostrado maior eficiência para o sistema planta-bactéria quando comparado com o uso isolado da bactéria (Tabela 2.. Este adubo é produzido por uma cultura que fixa nitrogênio anteriormente ou concomitante à cultura de interesse.1). tem-se feito uso de óleo mineral e de polímero como. Adubos verdes podem contribuir com até 150 kg de N. se devem a um melhor desenvolvimento do sistema radicular da planta devido aos fitohormônios produzidos. No caso dos inoculantes líquidos. O veículo de inoculação (sólido e líquido) é outro aspecto que se deve considerar nos experimentos em gramíneas. por . a cultura fixadora corretamente manejada.. Já Didonet et al. serve de base para o plantio da outra cultura que se beneficia com a mineralização do nitrogênio.ano-1 para as culturas (Resende et al. (1996) observaram que a produção de grãos de trigo inoculado com a estirpe JA04 de A. brasilense e suplementaram as plantas com 15 kg/ha de N (Tabela 2. (1987) obtiveram uma incremento de 28% na produção de grãos de trigo em relação à testemunha crescida com o equivalente a 100 kg/ha de N quando inocularam a estirpe Sp 245 de A. brasilense e complementada com 15 kg/ha de N.2 Revisão Bibliográfica 22 Outra possibilidade de uso da FBN é sua utilização indireta através de adubos verdes. pelo corte da parte aérea do adubo que irá se decompor concomitante à assimilação pela cultura de interesse. Fages (1994) relata que os aumentos observados na produção de grãos de sete experimentos de inoculação de milho na presença de pequenas doses de N.1). que recebeu adubação equivalente a 45 kg/ha e aumentou em até 53% de N em cobertura (Tabela 2. na forma de pó ou granulada e em mistura com argilas (vermiculita) ou carvão. Entretanto. dado o know how já adquirido com o inoculante desenvolvido para rizóbio e também o seu baixo custo.1). diferiu estatisticamente do tratamento-controle. Ela pode ser empregada pura. Já o consórcio possibilita a utilização direta pela excreção de compostos nitrogenados ou decomposição de nódulos radiculares.ha-1. em condições tropicais de alta temperatura e pluviosidade a mineralização é acelerada produzindo perdas significantes do adubo. Estudos de inoculação de cereais com bactérias diazotróficas têm mostrado que as endofíticas têm um maior potencial de contribuição da FBN e que o genótipo da planta influencia na associação da planta/bactéria. quando comparada com a de outros países. por exemplo. Já a pulverização pós-emergência das sementes teve um efeito negativo de 2% na produção de grãos. (1983) também obtiveram maior aumento na produção grãos de trigo usando turfa granulada (35%) em comparação com inoculante oleoso (19%). conseqüentemente. obtiveram um aumento de 15% na produção de grãos de milho quando fizeram uso da turfa granulada em comparação com a pulverização no sulco e semente peletizada. a necessidade de mão-de-obra especializada e. Baldani et al. Os avanços alcançados apontam para uma maior exploração e entendimento desta associação endofítica. 1982). assim. o alginato e a goma xantana que promovem o encapsulamento das células e só as liberam após a degradação do polímero e. previnem as células de estresses ambientais (Jung et al. Os programas de sequenciamento do genoma: RIOGENE e GENOPAR mostram a importância da FBN no Brasil e devem permitir que o país continue na fronteira do conhecimento em relação ao processo de FBN em gramíneas (Baldani et al.2 dá um quadro da quantidade de nitrogênio aplicada como fertilizante em diversos países: . o custo elevado. 2005). como desvantagem. 2. Fallik & Okon (1996).. Esse processo tem. que aumentaram 11 e 3% respectivamente. A Tabela 2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio A agricultura brasileira tradicionalmente usa menos nitrogênio mineral nas aplicações de fertilizantes.2 Revisão Bibliográfica 23 exemplo. Dentre todas as não leguminosas. a cana-de-açúcar é provavelmente a que recebe maior contribuição da fixação biológica de nitrogênio. Estas bactérias colonizam raízes. proveniente da ação bacteriana. esta economia poderia chegar a US$ 375 milhões com o uso de inoculação bacteriana e seleção de melhores genótipos. O baixo uso de N mineral faz a agricultura mais lucrativa e gera menor poluição dos lençóis freáticos. 1997) País Países da Europa China USA México Índia Brasil N (kg/ha) 172 87 58 36 27 10 O alto custo do fertilizante nitrogenado no Brasil leva a um processo de seleção de genótipos de plantas que fornecem altos rendimentos com baixo uso deste fertilizante.2 Revisão Bibliográfica 24 Tabela 2. Estima-se que a economia total pelo não uso de fertilizantes nitrogenados na soja é de cerca de US$ 3. Com um conteúdo médio de 6% de N. Hoje. . isto corresponde a cerca de 120 kg/ha de N. Burkholderia spp e Azospirillum spp. arroz e trigo. O rendimento médio desta cultura é maior que 2 ton/ha. No feijão. troncos e folhas de milho. Cerca de 150 kg N/ha são obtidos por fixação biológica na cana-de-açúcar (Döbereiner. 1997). praticamente vindo totalmente da fixação biológica. Na última década ficou demonstrado que parte do nitrogênio utilizado por cereais e forrageiras advém da associação destas plantas com bactérias diazotróficas como Herbaspirillum spp.2 bilhões. toda a soja plantada no país é feita sem aplicação de N mineral. A seleção de genótipos da soja plantada no país foi feita levando-se em consideração a não aplicação de N mineral.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países (Dobereiner. Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse Agrícola (RELARE). Relatório apresentado durante a XI-RELARE. ocorrida no Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo. . existe um mercado completamente desenvolvido para a produção e uso do inoculante para fixação biológica de nitrogênio em leguminosas. reunião da Rede de Laboratórios para Recomendação. o que permite estimar o mercado em cerca de US$ 8.2 Revisão Bibliográfica 25 2. entre 18 e 20 de junho de 2002.7 O Mercado Brasileiro de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio Apesar de ter sido largamente demonstrada a fixação biológica de nitrogênio pela associação entre Azospirillum spp. Em contraste. a US$ 0. como a Associação Nacional de Produtores e Importadores de Inoculantes (ANPII) e a Rede de Laboratórios para Recomendação.01 por dose de inoculante vendida. do Uruguai1. não existe ainda um produto comercial para tal fim. Destas.Laura Machado Ramos. à razão de R$ 0. em média. A associação entre produtores. em escala bem menor.5 milhões1. Os produtores estrangeiros são igualmente membros participantes da RELARE e os importadores. da ANPII. 1 . pesquisadores e agentes governamentais gerou uma bem sucedida comunidade. cerca de 10 milhões foram produzidas no país e o restante importado da Argentina e. fundamentalmente a soja. totalmente suprido por indústrias de pequeno e médio porte.60. Este mercado é regulado pelo Ministério da Agricultura e conta com associações de produtores e de pesquisadores. e gramíneas. que conta inclusive com um fundo de pesquisas financiado pelas empresas. A dose de inoculante é vendida. Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse Agrícola. foi de cerca de 14 milhões de doses em 2001. O mercado brasileiro de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em leguminosas. Tabela 2.000 20.280. A uma razão de aplicação de uma dose por hectare. a abertura de um mercado de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em não-leguminosas permitiria uma imensa ampliação de escala de produção.147.3 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio (IBGE.000 Os benefícios econômicos. (5) geração de empregos nas indústrias. cana-deaçúcar. sociais e ambientais da abertura deste mercado são evidentes: (1) menor uso de fertilizante nitrogenado mineral. a mesma que é recomendada para leguminosas.000 7. milho.000 151.000 5.000.000 42. o mercado poderia ser ainda maior. apenas o mercado potencial brasileiro total saltaria de 14 milhões para 42 milhões de doses.314. (4) economia da energia empregada na fabricação de N mineral.162 Argentina 10.000 12. arroz e trigo no país (IBGE.422 3.623. (3) menor poluição ambiental. A Tabela 2.000 2.2 Revisão Bibliográfica 26 Para as empresas. Com redirecionamento de parte dos investimentos de marketing das empresas para os países da América Latina.702. 2005). feijão. (2) maior lucratividade das culturas.009.698.162 3.745. 2005). CULTURA Soja Feijão Cana-de-açúcar Arroz Milho Trigo TOTAL ÁREA PLANTADA (ha) Brasil 16.3 mostra as áreas plantadas de soja.468.000 1.355.000 265. .000 257. pensava-se que havia somente bactérias diazotróficas na rizosfera. Baldani & Döbereiner. procurou-se a seguir efetuar um levantamento das fontes de carbono. se tornou um dos maiores desafios dos últimos 20 anos. nitrogênio e fósforo utilizáveis no processo de produção de A. Pensando-se em termos industriais. o meio NFB era suplementado com 0. devem-se procurar alternativas ao meio NFB. fornecer o nitrogênio de forma mais eficiente. 1980). assim. lipoferum para o cultivo não dependente da fixação de nitrogênio.3 Fontes de Carbono 27 3. foram isoladas de cana-de-açúcar e cereais como milho. Nos anos seguintes. .53g de NH4Cl (Baldani & Döbereiner. pois a sua principal fonte de carbono (ácido málico) é uma substância de difícil obtenção somente possível de utilização em trabalhos de laboratório. Inicialmente. brasilense e A. já que certas gramíneas como a grama batatais (Paspalum notatum) crescem bem em solos ácidos. lipoferum. Produção de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio à Base de Azospirillum A extensão da FBN para plantas não leguminosas. como também contêm certas estirpes que são capazes de infectar a planta. brasilense e A. arroz e sorgo três novas espécies de Azospirillum que não somente colonizam a rizosfera. Também a formulação incluindo micronutrientes e vitaminas talvez não seja adequada pelo alto custo e dificuldade de preparo. utilizaram o meio NFB líquido para o cultivo dependente da fixação de nitrogênio de A. entretanto. Assim. principalmente gramíneas e cereais. sem adubo nitrogenado. e. em 1980. . 1995). lipoferum como A. brasilense e A. amazonense. Tarrand et al. . 1978 e confirma o crescimento de Azospirillum utilizando açúcares ou ácidos orgânicos como fonte de carbono. Os genes para a biossíntese desse fitohormônio foram encontrados também em A. A partir da descoberta da presença desta via metabólica. O ótimo crescimento com relação à temperatura. CW-1 e CW-2 nos experimentos de crescimento em meio sólido. Utilizou-se A.3 Fontes de Carbono 28 3. A Tabela 3. 1997a). 1980.1 mostra que os resultados obtidos assemelham-se aos achados por Albrecht & Okon. O gênero Azospirillum também tem a habilidade para produzir fitohormônios como AIA (ácido indol acético) (Thuler et al. 2003). halopraeferens tem um crescimento ótimo a 41ºC e possui tolerância à condições salinas.1). entre a fixação de nitrogênio e a escolha correta da fonte de carbono e o suprimento de açúcar na natureza por hospedeiros em gramíneas (Westby and Vigil. Westby et al (1983) estudou o metabolismo do carbono em Azospirillum para checar a resposta ao crescimento deste organismo usando diversas fontes de carbono e energia.1). BR17 e de dois mutantes. brasilense utilizam malato como fonte de carbono. lipoferum. 1976. Tanto A.. Alguns compostos estimulam a atividade da nitrogenase (Okon and Burris. 1983). irakense hidrolisa pectina e também tolera altas concentrações de sais (Baldani et al. pôde-se traçar outras para a utilização de outras fontes de carbono. 1997).. mas somente a primeira consegue utilizar glicose (Baldani et al.1 Fontes de Carbono Existe uma importante relação em Azospirillum. (Tabela 3. A. irakense (Vandebroek & Vanderleyden. sendo que A. Os resultados indicaram que essa fixadora de nitrogênio utiliza a via EntnerDoudoroff para a dissimilação de gliconato (Figura 3. Okon et al. estirpes selvagens de Sp7. está entre 32 e 37ºC. mas não em A. 1976).. 3 Fontes de Carbono 29 Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp. Fontes de Carbono Sacarose D-gliconato Arabinose Frutose Etanol Glicerol Fumarato Glicose Malato Lactato Ceto-gliconato A. brasilense Sp7 --+++ ++ +++ ++ ++ ++/+++ --+++ +++ +++ A. lipoferum Br17 --+++ ++ +++ ++ ++ ++/+++ +++ +++ +++ +++ As fontes de carbono utilizadas estão presentes no meio sólido Dobereiner-Day-NH4Cl (DDN) em concentração de 5 g/L. Os ácidos estão incorporados nos sais de sódio ou potássio. As bactérias foram incubadas a 32ºC por 3 ou 4 dias, obtendo-se os seguintes resultados de crescimento em agar: + + +, Excelente crescimento; + +, bom crescimento; e ---, nenhum crescimento As fontes de carbono (Acetato, Galactose, glicose, glicerato, manitol, manose, ribose e xilose) permitiram pouco crescimento ou nenhum crescimento para Sp 7 (resultados não apresentados). A habilidade para utilizar sacarose é a principal característica de A. amazonense e A. irakense, embora somente a primeira espécie seja hábil para crescer em vários pHs, sendo que para as demais espécies é requerido um pH perto do neutro. Supõe-se que para utilização de sacarose, em Azospirillum lipoferum, necessita-se de uma enzima que hidrolisa as ligações α, β (1→2) da sacarose em glicose e frutose. Através da glicólise, a glicose é convertida em piruvato. O piruvato é transformado em acetil CoA que é totalmente oxidado no ciclo do ácido cítrico com a formação de duas moléculas de CO2. Os elétrons oriundos da reoxidação do NADH 3 Fontes de Carbono 30 em NAD+ em condições aeróbicas, são transferidos para o oxigênio molecular para a síntese de ATP pela fosforilação oxidativa. Já a frutose pode entrar na via “EMP anabólica”, pois a existência da via ED e a ausência da atividade de 6fosfofrutoquinase indica ausência da via EMP. Por outro lado, existe a frutosebisfosfato e o ciclo de Krebs que são responsáveis pela formação dos sete precursores biossintéticos, a saber: gliceraldeído-3-fosfato, ácido-3-fosfoglicérico, ácido fosfoenolpirúvico, ácido pirúvico, acetil-coenzima A, ácido oxaloacético, ácido α-cetoglutárico (Dawes, 1982; Hurek & Niemann, 1987; Stanier & Painter, 1986). Quatro precursores restantes são obtidos pela parte não oxidativa das vias das pentoses, a saber: eritrose 4P, ribose 5-P, frutose 6-P e glicose 6-P. No caso de A. brasilense, glicose-6-fosfato é produzida por isomeração da frutose-1-fosfato (Martinez-Drets & Burris, 1984). Dependendo da espécie bacteriana (e em muitos casos, das condições de cultivo também) pode-se obter um máximo de 26 moles de ATP por mol de frutose completamente oxidado a CO2 e H2O, contra por exemplo, 38 moles formados em levedura pela mesma oxidação (Gottschalk, 1979; Nagai, 1979; Stouthamer, 1977). Glicerol foi uma das fontes de carbono utilizadas por Tarrand et al (1978) para a caracterização do gênero Azospirillum com 100% de respostas positivas para o crescimento nesta substância, para todas as cepas de ambas as espécies, A. brasilense e A. lipoferum. O glicerol, em Azospirillum, é catabolizado através da segunda etapa da via glicolítica, após transformação em gliceraldeído-3-fosfato (GAP) a partir da desidrogenação e subsequente fosforilação ou invertendo a ordem com a fosforilação seguida pela desidrogenação com a subseqüente ativação do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (Weatby & Vigil, 1983). Pode-se afirmar com certeza, que a entrada da substância nas células acorre por difusão facilitada, pois esse é o mecanismo universal de transporte do glicerol por microrganismo (Hunter, 1985; Lin, 1976). 3 Fontes de Carbono 31 Na maior parte dos microrganismos, apenas uma das rotas de transformação de glicerol em gliceraldeído-3-fosfato atua de cada vez. Em Klebsiela pneumoniae, entretanto, determinou-se a existência da glicerol desidrogenase em conjunto com a gliceralquinase. Nesses microrganismos, verificou-se que a atividade da glicerol desidrogenase era fortemente influenciada pelo oxigênio dissolvido no meio de cultura: quanto maior a pressão parcial de O2, menor a atividade específica da enzima. Em função disso, e de outras indicações, foi postulado que a gliceralquinase opera principalmente para a dissimilação oxidativa do glicerol, enquanto a glicerol desidrogenase é mais importante no crescimento anaeróbio (Lin, 1976). Como salientado por esse último autor, a possibilidade da ocorrência simultânea das duas enzimas aumenta quando o cultivo, embora aeróbio, vai se tornando limitado em oxigênio, conforme aumenta a concentração celular, caso bastante comum em culturas em incubador rotativo. Para glicerol não há gasto de energia no transporte (difusão facilitada) (Hunter, 1985), mas a formação da di-hidroxiacetona-3-fosfato requer 1 mol de ATP, qualquer que seja o caminho (figura 3.1). Para a formação de frutose-6-fosfato são necessárias duas trioses fosforiladas (2 moles de ATP) e na posterior transformação a frutose-6-fosfato, um mol de ATP é regenerado, com um balanço total de 1 mol de ATP gasto por mol G6P formado. O crescimento de bactérias a partir do glicerol, (bem como a partir de outros compostos de 3 ou 4 carbonos, como ácidos láticos, pirúvico, málico e succinato) depende da produção de frutose-1-6-bisfosfato, e sua transformação em glicose-6fosfato (G6P) (Dawes, 1982; Stainer & Painter, 1986). Não existe descrição na literatura de uma via metabólica de assimilação de lactaoto para Azospirillum. Segundo Poole and Ingledew, (1987), para assimilação de lacato em E. coli há produção de quatro tipos de lactato desidrogenase, duas das quais não associadas ao NADH. Para esta bactéria, na dissimilação do lactato, tanto as formas D e L são convertidas em piruvato, e por sua vez oxidado a Acetil CoA. CoA sintetase em uma reação dependente de ATP. A produção de acetil CoA constitui a ligação entre a utilização do etanol como fonte de carbono e o matebolismo central (Figura 3. 2002).1) É importante destacar que não há nenhum estudo sistematizado com o objetivo de seleção destas fontes com a finalidade de se promover o cultivo em biorreator. . As PQQ-dependente aldolase quinoproteína e álcool desidrogenase são localizadas no periplasma (Kretzschmar and Gorish. O acetato é então convertido a acetil.3 Fontes de Carbono 32 Sabe-se que um número de bactérias gram-negativas sintetizam enzimas com pirroloquinolina quinona (PQQ) como cofator quando crescidas em glicose ou vários álcoois. A degradação do etanol começa na álcool desidrogenase transformando-o em acetaldeído que é oxidado mais adiante a acetato pela enzima aldeido desidrogenase. glicose desidrogenase. 17 – glicoquinase. 14 .glicose-6fosfato desidrogenase. (Baseado em Westby et al. 2 .fosfoglicerato mutase.fosfogluconato desidrogenase. As linhas pontilhadas correspondem às reações que não aparecem em A. 5 .fosfo-2-keto-3deoxigluconato aldolase. 1983). As enzimas estão enumeradas da seguinte manerira: 1 . 13 . 7 .gliconato 2desidrogenase. 18 . 22 – álcool desidrogenase.lactato desidrogenase. 9 . 11 – enolase. . 8 gliceraldeído-fosfato desidrogenase (NADP+).gliceraldeído-fosfato desidrogenase (NAD+). 21 . 3 – fosfogliconato desidratase. tornado-se inutilizáveis pela bactéria. 16 glicose-fosfato isomerase.6-fosfofrutoquinase.malato desidrogenase. 15 . 20 .fosfoglicerato quinase. 23 – acetaldeído desidrogenase.frutosebisfosfato aldolase.glicoquinase. 10 ..1 Metabolismo central do carbono em Azospirillum.3 Fontes de Carbono 33 Figura 3. brasilense ou não são importantes. 6 . 4 . 12 – piruvato quinase.frutose bifosfatase. 19 glicerolquinase. poder-se-ia empregar amônia. Lipoferum.5 a 7 h em condições de fixação de nitrogênio atmosférico (Okon & Burris. 1987). Para iniciar a discussão a respeito de quais fontes poderiam ser industrialmente viáveis. aminoácidos. principalmente os que se referem à velocidade da produção.2 Fontes de Nitrogênio A princípio. e de 5. e à facilidade de compatibilização da etapa de crescimento celular com as demais etapas do processo. deve-se levar em consideração os critérios já citados (Stanbury & Whitaker. 1984). . nitrato.3 Fontes de Nitrogênio 34 3. aminoácidos) são bem maiores do que para culturas que se desenvolvem às custas da fixação de nitrogênio (ver tabela 3. nitrato. e até mesmo nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano (Döbereiner & Pedrosa. aos fatores de conversão. Para A. Já foi demonstrado para muitas espécies bacterianas que os fatores de conversão e as velocidades de crescimento para culturas que utilizam nitrogênio combinado (amônia.2). 1977). foi determinado que os tempos de geração para cultivo em meio líquido eram de 1 a 2 horas com amônia. 2 72.2 69.0 30. (1977).20 70. aerogenes Azotobacter chroococcum Az chroococcum Az chroococcum Azotobacter vinelandii (3 g/L) Az vinelandii Crescimento anaeróbio Clostridium pasteurianum C.5 9.8 24.0 55.3 Fontes de Nitrogênio 35 Tabela 3.05 0. aerogenes A.4 43.1 sacarose (15g/L) 0.3 Fator de Conversão Molar segundo fonte de N2 (g/mol fonte de carbono) Amônia Nitrato N2 Fonte: Sthouthamer.39 0. em mistura. ou. (1983) Outro incoveniente para o uso do nitrogênio gasoso na produção de microrganismos seria a necessidade de obtenção da baixas pressões de oxigênio (Nelson & Knowles. 1978.3 3.14 0.39 0. Microrganismo Fonte de Carbono Velocidade específica de Crescimento (h-1) Crescimento aeróbio Aerobacter aerogenes A. Okon & Tal.3 60. Volpon & Döbereiner.9 5.2 29.0 0.05 0.67 0. à reciclagem dos gases efluentes do fermentador com ajuste da concentração através de sensores e controladores automáticos.10 0. Qualquer dos dois sistemas é bastante complexo (e caro) .3 32.25 48.2 . o que obrigaria a trabalhar com nitrogênio e oxigênio puros.6 11. pneumoniae sacarose sacarose lactato lactato glicose glicose 0.15 80.22 0.7 58. Post et al . desulfuricans Klebsiella pneumoniae K. 1981).0 22.7 39.15 150.2 9.5 52.2 45. 1987.0 glicose glicose glicose manitol manitol manitol sacarose 0.5 38. pasteurianum Desulfovibro desulfuricans D.Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes fontes de N.13 0.0 8.7 12. peptona e extrato de levedura. (NH4)2SO4 ou uréia. valina.3 Fontes de Nitrogênio 36 e pode. Essa maior velocidade no consumo de glutamina como fonte de nitrogênio está de acordo com o que se conhece acerca da assimilação de NH4+ e de aminoácidos por Azospirillum. As outras fontes de nitrogênio orgânico (ácidos casaminados. em cultivo aeróbio. particularmente quando usou-se frutose (de 1. a velocidade de crescimento aumentou com o aumento da concentração do aminoácido entre 2 e 8 mM (que foi a faixa estudada).5 a 18 g/L) como fonte de carbono. Diferentes comportamentos foram obtidos no tocante ao estímulo e repressão da nitrogenase e ao crescimento de A. 1982): aminoácidos. lipoferum. brasilense e A. peptona e extrato de levedura. testados em concentrações entre 0. alanina. ácido aspartico. 1982 demonstraram que A. Nesse mesmo caso verificou-se que NH4Cl e glutamato também levaram a formulação de flocos. histidina). ácido aspártico e ácido glutâmico. ser evitado no caso de se utilizar nitrogênio combinado. lisina. Para diversos aminoácidos (glutamina. quando frutose era usada a 1. Fontes de nitrogênio orgânico também foram estudadas (Das & Mishra. alanina. Algumas fontes de nitrogênio foram estudadas para o crescimento de Azospirillum. ácido glutâmico. asparagina. cuja tecnologia é conhecida e barata. entretanto. causaram efeitos inibitórios ao crescimento na concentração de 8 mM. leucina. mas com a utilização de nitrato para as cepas A. seguido por asparagina lisina. treonina.glicina e cistina. Das e Mishra. mas com intensidades bem menor que a obtida com os nitratos. lipoferum sp 59 b houve aparecimento de intensa floculação. glutamina foi o aminoácido individualmente consumido com maior rapidez. Dos nitratos testados KNO3 foi o que induziu maior floculação. (1990). brasilense pôde desenvolver-se adequadamente com NH4Cl. e está de acordo também com os resultados apresentados por Shawky.5 g/L. prolina. brasilense sp7 e A. em ambas as cepas. evidentemente. tirosina.05 e 5 g/L) estimularam o . serina. como será visto no item seguinte. Para facilitar alguns aspectos da discussão dos resultados. uma vez que essa substância conduz os maiores fatores de conversão e velocidades específicas de crescimento.1987. repressível e dependente de energia (Hartmann & Kleiner.3 Fontes de Nitrogênio 37 crescimento. devendo-se salientar também que concentrações dessas fontes entre 0. 1983). Tibelius & Knowles. a amônia entra no metabolismo bacteriano através de três reações. A primeira etapa de assimilação de amônia (e de aminoácidos) é o seu transporte ativo através da membrana celular. sem entretanto se determinar as concentrações internas ou dos gradientes máximos. Ambas as vias levam a incorporação do N fixado no grupo amida do aminoácido glutamato. Gordon & Moore. 1982). com o envolvimento das seguintes rotas de assimilação de NH4+: a) GDH – glutamato desidrogenase. Embora não se conheçam exatamente os mecanismos e gasto energéticos desse transporte sabe-se que a concentração interna de amônia quando ela mesma é usada como única fonte de nitrogênio varia. Também já foi demonstrada a existência de um sistema ativo de transporte de amônia. 1981. para diferentes microrganismos.05 e 0. de 1. 1980. A via GDH . 1982).1986. pode-se concluir que para o processo de produção de Azospirillum deve-se preferir amônio (evitando o nitrato) como fonte de nitrogênio.8 nM (Cordts & Gibson . Schreier & Bernlohr.4 a 10. 1982). principalmente no tocante aos efeitos do nitrogênio presentes no extrato de levedura sobre o crescimento Azospirillum spp é importante descrever as formas de assimilação de amônia e aminoácidos em bactérias (Brown. para formar glutamato e glutamina. Com as informações expostas. b) GS-GOGAT – Glutamina sintase e glutamina-cetoglutarato amino transferase. Após o transporte.50 g/L não reprimiram a atividade da nitrogenase (Das & Mishra. Stanier & Painter. 5 mM. pois a via GDH opera com o gasto de 1 NADPH2.3 Fontes de Nitrogênio 38 opera quando a concentração de NH4+ está acima de 1.Esquema de assimilação de amonia em bactérias. mais onerosa para a célula. Figura 3.2 .2 abaixo. Uma possível explicação se fundamenta na energia gasta para esta assimilação. dessa maneira. sendo.5 mM e a via GS-GOGAT é ativada quando esta concentração é mais baixa de 1. Enzimas envolvidas 1 – GLUTAMATO DESIDROGENASE (GDH) 2 – GLUTAMINA SINTETASE (GS) 3 – GLUTAMATO SINTASE (GOGAT) 4 – TRANSAMINASES . As reações principais de assimilação estão ilustradas na figura 3. enquanto a via GS opera com gasto de 1NADH + 2 ATP/ mol glutamato formado. 1978).1 g cel por mol de ATP (Stouthamer. 2004) ou por reações de transaminação.3 Fontes de Nitrogênio 39 Não se conhece ainda exatamente qual sistema enzimático (GDH ou GSGOGAT) seria o predominante em Azospirillum para a produção do glutamato. 28. Quando os aminoácidos são usados não só como fonte de nitrogênio.2. Castillo and Mora. quer pela degradação direta do aminoácido através das rotas bioquímicas já conhecidas (Lehninger. Os aminoácidos que são usados diretamente dispensam a ativação dos sistemas enzimáticos específicos e isto. 1978. 2000) e isto pode atrasar o anabolismo. enquanto outros entrarão nas reações de transaminação para formação de glutamato (e glutamina). afirmam que a via pode ser determinado de acordo com a concentração de amônia disponível. introduzindo “lags” no crescimento celular. além de acelerar o metabolismo. no máximo. alguns deles poderão ser usados diretamente pelo anabolismo. ou seja. Deve-se mencionar ainda que no caso de ocorrer suprimento de misturas de aminoácidos. numa reação exatamente inversa à de nº 4 da figura 3. Em relação à produção de aminoácido a partir amônia como fonte de nitrogênio. pela adição de grupo amino ao ácido α . há necessidade de formação ou ativação de sistemas enzimáticos específicos que nem sempre estão presentes quando as fontes de carbono e energia são açúcares ou ácidos orgânicos (Tyler. mas Westby & Meeks.cetoglutarato. passaria a predominar a catálise pela GDH. ainda .8 g cel/mol de ATP gerado pela fonte de carbono e quando GS-GOGAT é o sistema atuante há um gasto de 1 mol de ATP por mol de NH4+ incorporado e o valor máximo de YATP que se pode esperar é de 23. as etapas iniciais são melhor conhecidas: o metabolismo passa pela formação de glutamato . pois quando GDH atua não há gasto de ATP e pode-se obter. E essa questão é relevente do ponto de vista bioenergético e de processo. 1987. mas também como fonte de carbono e energia. quando baixa (como na fixação de nitrogênio) o sistema principal em atuação seria o GS-GOGAT e quanto mais elevada. o que torna potencialmente interessante a utilização de extrato de levedura e outros suplementos protéicos.3 Fontes de Nitrogênio 40 aumenta o aproveitamento dos compostos e da energia disponível. . 3 Cultivo descontínuo alimentado 41 3. inicia-se a suplementação destes substratos (previamente preparados e esterilizados) ao meio. podem-se atingir concentrações celulares elevadas. O processo consiste em começar o cultivo no fermentador como se fosse um processo descontínuo comum. A partir do momento em que um ou mais substratos atinjam concentrações que limitem o crescimento celular (ou produção de um metabólito). Através deste processo. que não provoque limitação. . necessário ao bom desempenho microbiano (Yamane & Shimizu. que podem ter vazão constante ou. Neste processo. A alimentação é feita através de uma ou mais bombas. a concentração dos subtratos limitantes no fermentador deve ser mantida sempre num valor baixo. preferencialmente. ou antes. 1984). É a adição contínua que vai garantir o suprimento constante de substrato. impossíveis de ser obtidas nos cultivos descontínuos comuns.3 Cultivo descontínuo alimentado Os cultivos descontínuo-alimentado são empregados quando se pretende obter determinadas concentrações celulares (ou de algum metabólito) que demandam quantidades de substratos que provocariam inibição do crescimento num cultivo descontínuo comum (“batch”). 2001). se o resultado esperado foi alcançado (Schimidel et al. O processo é interrompido quando se atinge a capacidade volumétrica máxima do fermentador. vazão variável que acompanhe a velocidade de demanda dos substratos pelo microrganismo. lipoferum no sentido de se contribuir para o estabelecimento das bases tecnológicas para a produção industrial de inoculantes. através da escolha das fontes de carbono e nitrogênio mais promissoras do ponto de vista industrial e fornecer subsídios para o estabelecimento de protocolos de produção de biomassa destas bactérias a alta densidade celular. Objetivos Este trabalho tem por objetivo geral o estudo do cultivo de A.4 Objetivos 42 4. . brasilense e A. Materiais e métodos 5. RJ.5 Materiais e métodos 43 5. A solução de Fe EDTA foi preparada misturando-se 16.2.0 g de Na2 EDTA (sal di-sódico do ácido etileno diaminotetra-acético) com 11. As linhagens eram mantidas na coleção de microrganismos do IPT por liofilização e/ou criopreservação em freezer a -80ºC e em meio sólido NFB que continha L-malato e NH4Cl como fontes de carbono e nitrogênio. respectivamente. da Embrapa.64%. V – solução de micronutrientes VI – solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%. IV – solução de Fe EDTA a 1.7H2O e 950 .1 Soluções-estoque Para o preparo de diferentes meios de cultura eram utilizadas as soluçõesestoque relacionadas a seguir (todas as porcentagens são em massa/volume): I – solução de MgSO4.7H2O a 10%.5% em 0. II – solução de NaCl a 10%. (solução 0.1 Microrganismo Foram utilizadas as linhagens de Azospirillum brasilense Sp7 e Azospirillum lipoferum Br 17 gentilmente cedidas pela Dra. em Seropédica. Vera Lúcia Baldani do Centro Nacional de Pesquisas em Agrobiologia.2 Meios de Cultura 5. 5.2N KOH) VII – solução de vitaminas.2H2O a 1%.95 g de FeSO4. III – solução de CaCl2. 1. 4.5 Materiais e métodos 44 mL de água. A . completando-se o volume até 1.7H2O. 2. 1.64%). após resfriamento.0 litro.5 g KOH O pH desta solução foi ajustado para 7. 1995) 10 mg biotina 20 mg piridoxol-HCl A solução era dissolvida em banho-maria e completada o volume para 100 mL com água destilada. 1995): 0. por litro: (Döbereiner. aquecendo-se até dissolução e. 2.04 g CuSO4. em seguida era filtrada e mantida a solução em geladeira.00 g Na2MoO4.2 Solução salina Para diluição do inóculo foi utilizada solução salina com a seguinte composição.2H2O a 1%.A solução de micronutrientes continha.H2O. por litro: (Döbereiner.0 com KOH. .2.5H2O. 5.40 g H3BO3.0 mL da solução de NaCl a 10%. 4.0 mL da solução de MgSO4. 1995) 3. B – A solução de vitaminas continha: (Döbereiner.0 mL Fe EDTA (solução 1.2H2O 1. 1. 1.7H2O a 10%.175 g MnSO4.0 mL da solução de CaCl2.0 mL da solução de micronutrientes.20 g ZnSO4. 2.4 g KH2PO4. 0. . 2. 4. 1.0 mL de solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%. 2.64%.8 utilizando-se solução de NaOH e completava o volume para 1000 mL com água destilada.2. No preparo do meio adicionavam-se as substâncias na ordem indicada e ajustava o pH para 6. A cultura foi transferida a erlenmeyer contendo o meio citado. Após o cultivo foi preparada uma solução a 50% de glicerol (p/v) para ser adicionada à cultura crescida. A composição do meio é a seguinte: 5 g de ácido málico.0 mL de solução de micronutrientes.0 mL de solução de Fe EDTA a 1.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo A partir dos liófilos armazenados foram preparados tubos com meio de cultura NFb sólido e incubação em estufa a 30ºC.7H2O a 10%.0 mL da solução de NaCl a 10%.0 g de Extrato de Levedura.5 g de K2HPO4.5 Materiais e métodos 45 5. 4. 2. com exceção do agar.0 mL de solução de vitaminas.0 mL da solução de MgSO4. Posteriormente.5 g de KOH.2H2O a 1%.5 mL da solução de glicerol 50% e 0. 1. 0. 2. 1.5 mL do meio NFb foram dispostos em tubos Eppendorfs estéreis e levados ao freezer à -80ºC.0 mL da solução de CaCl2. 15 g de agar-agar. em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC por 72 horas. 5 Materiais e métodos 5.32g (NH4)2HPO4/NH4Cl.64 g K2HPO4. sacarose. 1.7H2O a 10%. 5. Agar Potato Dextrose (PDA) e NFb (já descrito no item anterior) para averiguação da adaptação e crescimento por 5 dias em estufa a 30ºC. 5. Inóculo: Baseado nos resultados da etapa anterior selecionou-se entre os meios sólidos testados suas respectivas formulações líquidas para preparação dos inóculos.0 mL da solução de CaCl2. A composição básica de todos os meios. 1.0 mL da solução de NaCl a 10%.0 mL da solução de MgSO4. lactato e etanol)..0g Extrato de Levedura.5 Meios de cultura líquidos Foram utilizados meios de cultura nos ensaios em incubador rotativo e reator com as fontes de carbono e nitrogênio selecionadas. Agar de Soja-Triptona (TSA). glicerol. Luria Bertani (LB). 1988). 1. 2. água filtrada . era composto de: (Dias. 4. 2.0 mL da solução solução de Fe EDTA a 1.0 Fonte de C selecionadas (frutose..2. qsp 1000 mL .2H2O a 1%.4 Meios de cultura sólido para preparo do inóculo 46 Pré-inóculo: Um tubo Eppendorf contendo as cepas de Azospirillum spp foram crescidas em meios sólido que consistiram de Agar nutriente (AN). 2.64%. que será identificado como meio F.2. 2 g MgSO4.5 Materiais e métodos 47 Todos os meios de cultura tiveram seu pH ajustado para 6. 0.1 Equipamento Foram utilizados incubadores rotativos. 9. 6. Averiguação do crescimento aeróbio de Azospirillum brasilense e Azospirilum lipoferum em meio mínimo que continha respectivamente por litro (Martinez & Burris. com controle de temperatura por circulação de ar aquecido e freqüência de agitação ajustável.0 g KH2PO4. 1983): 4.3. 0. .8 e foram esterilizados a 121ºC por 30 minutos.026 g CaCl2.3 Ensaios em incubador rotativo 5. o glicerol e o lactato foram esterilizados em separado. a sacarose.72 g sacarose (pH 6.2H2O. A frutose.01 g FeCl3. 0.1 g NaCl. o etanol foi devidamente filtrado com filtro estéril e posteriormente adicionadas ao meio no momento da inoculação.7H2O.002 g Na2MoO4.2H2O.0 g K2HPO4.8) 5.001 g biotina.0 g NH4Cl. 0. 0. 0. 1. 5.5 Materiais e métodos 48 5.5 Incubação e amostragem Os frascos eram incubados à temperatura constante de 30ºC. lipoferum. um frasco de erlenmeyer do incubador. brasilense.4 Inoculação dos frascos Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos com frascos erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura (meioF).3.3 Preparo do inóculo Em seguida. .3.3. A inoculação de cada um dos frascos era feita com 10% da suspensão bacteriana preparada e padronizada como anteriormente descrito. 18 horas.2 Preparo do Pré-inóculo Foi retirado da cultura estoque mantida em freezer à -80ºC. com velocidades de 200 rpm. A. Em alguns experimentos em biorreator a segunda passagem foi realizada com meio de cultura com a mesma composição do meio utilizado no ensaio. 5. 5. de tempos em tempos. cerca de 10% da suspensão foi transferida para Caldo Nutriente e incubadas novamente por 24 horas.3. 40 horas. com os seguintes tempos de incubação: A. inoculado em meio CN (3g Extrato de carne e 5g de Peptona bacteriológica por litro) em frascos erlenmeyer de 125 mL e colocado em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC. A amostragem era feita retirando-se. 4 Ensaios em fermentador. lactato e glicerol). A esterilização do meio de cultura.1 Equipamento Foram utilizados biorreatores New Brunswick Scientific de 5 L de volume para os ensaios em batelada e o Biostat Braun ED de 10 L de volume útil. 5. que permitia o controle da freqüência de agitação.5 Materiais e métodos 49 5. consumo de fósforo.6 Determinações efetuadas Em cada amostra dos ensaios de incubador rotativo foram determinados. sacarose. processo descontínuo 5. consumo da fonte de carbono (frutose. . etanol.3.4. e dos filtros de ar e frasco com anti-espumante e soluções controladoras de pH era efetuada por autoclavação a 121ºC por 40 minutos. temperatura e oxigênio dissolvido e monitorava automaticamente o pH por adição de solução de HCl ou NaOH 2N. a concentração celular (massa seca e em termos de número de unidades f ormadoras de colônias em placas/mL). pH. absorbância celular. consumo do nitrogênio inorgânico. Para o cultivo em alta densidade celular foi utilizado biorreator. do fermentador. de vazão de ar. em periodicidade e volumes previamente definidos. O volume de inoculo era cerca de 10% do volume total no fermentador.5 Determinações efetuadas Durante o cultivo são retiradas.4.3. 5. 5. 5.2 Preparo do inóculo O inoculo de um ensaio descontínuo constituía-se de microrganismos cultivados em incubador rotativo.4. foram utilizados tubos de ensaios estéreis e auxílio do bico de Bunsen.3. brasilense e de 18 horas para A. As assépticas destinamse à avaliação da concentração de unidades formadoras de colônias e a amostra não asséptica para outras determinações representado na Figura 5.4.4 Amostragem Para possibilitar a coleta de amostras de forma asséptica. .4.2 e 5.1.3 Inoculação do Fermentador A inoculação do fermentador era feita com de 24 horas para A.3. amostras assépticas e não-assépticas. segundo a seqüência descrita no item 5. utilizando-se erlenmeyers de 2 litros com 500 mL de meio utilizado no fermentador.5 Materiais e métodos 50 5. lipoferum. dilui-se a amostra o número de vezes necessárias. utilizou-se água destilada.5.1 Determinação da Absorbância (A) Foi determinada diretamente no caldo fermentado dos cultivos em incubador rotativo e em fermentador. 5. A leitura foi feita em espectrofotômetro Thermoelectric cell Holder (U2001) modelo 131-0307 no comprimento de onda de 540nm. Químicas e Microbiológicas 5. A leitura foi realizada na faixa de 0.5 Materiais e métodos 51 Figura 5. .Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das amostras. Quando superior.5 Métodos de Análises Físicas.01 a 0.1 . Como “branco”.7 de absorbância. Etanol. 5.4 Concentração de Frutose.5. E para a determinação de etanol. foi utilizado Cromatógrafo a gás (HP 5840-A) equipado com detector de ionização por chama de . sacarose.45 ųm).5 Materiais e métodos 52 5. obteve-se a média da contagem de 9 gotas para cada ponto obtido. previamente pesada. exprimindo-se os resultados em UFC/mL de amostra.5. O resíduo em conjunto com o filtro era colocado em estufa a 105ºC por 4 horas (tempo sulficiente para obter peso constante). ressuspendia-se o centrifugado em pequeno volume de água destilada e filtrava-se a suspensão através da membrana Millipore (diâmetro de poro de 0.5. quando frio (após aproximadamente 15 minutos). Um volume de µL do sobrenadante da amostra era injetado no equipamento. lactato foram determinadas por cromatografia de fase líquida (HPLC – Waters 510) equipado com uma coluna para determinação de açúcares. 5. As amostras foram convenientemente diluídas e gotas de 25 µL cada foram semeadas em meio AN (Agar nutriente). transferia-se o conjunto para um dessecador e. Sacarose. em estufa a 30ºC. Separava-se o sobrenadante. Após incubação por 48 horas. Glicerol e Lactato (S) As concentrações de frutose.2 Concentração Celular Mássica (X) Para efetuar a determinação da concentração celular centrifugava-se a 4ºC um volume adequado do caldo a 9800 xg durante 10 minutos. procedia-se a pesagem. Decorrido esse período.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas (UFC) A contagem de unidades formadoras de colônias em placas foi realizada segundo o método de Miles & Misra (1938). lavando-se algumas vezes com água destilada o recipiente usado para a pesagem da amostra. Identificados os picos de etanol. a . Para o preparo da curva de calibração foram preparadas soluções padrões contendo diferentes concentrações (% em massa) utilizando o nbutanol como solvente. .2: Tabela 5. c – Diluia-se a amostra a 50 mL. de acordo com o cromatograma padrão anexo.5 Materiais e métodos 53 hidrogênio.2N até que o pH se tornasse iguala 3.0. As soluções preparadas devem estar numa faixa de concentrações que normalmente são encontradas nas amostras. determinação de glicerol por oxidação de periodato de sódio.Pesava-se uma alíquota (filtrada da determinação da massa seca ou sobrenadante da centrifugação) em pés-filtro ou béquer pequeno. obteve-se as respectivas áreas. foi realizado conforme o método IPT/DQEQ (1982).2 Concentração de glicerol em g/L na amostras. Para determinação da concentração de glicerol. injetor tipo split/splitless e forno com capacidade de realizar de programação de temperatura. no eixo das ordenadas os valores de concentração dos respectivos componentes nas soluções. colocando no eixo das abscissas os valores das relações de área e. d – Adicionava-se H2SO4 0. Criou-se uma curva de calibração. segundo a tabela 5. Concentração esperada de Glicerol na amostra (g/L) 8 – 10 5– 8 2– 5 <2 Peso da alíquota (g) 5 10 15 20 b – Transferia a amostra a um béquer de 300 mL. 2095 m onde: Va = volume de NaOH gasto na titulação da amostra (mL).5 Materiais e métodos 54 e – Em seguida.1 para a amostra.1 ± 0.5. no escuro.1 (no final. . agitava-se o conteúdo para homogenizar. Model 95-12) através da conversão de amônio a amônia. até pH 6. colocava-se 1 gota ou fração de gota de cada vez. Perto do ponto final.1 N e diluído a 1 L). a temperatura inferior a 35ºC. g – Adicionava-se 10 mL de solução de periodato de sódio (obtida dissolvendo-se 60 g de NaIO4 em água destilada contendo 120 N de H2SO4 0. j – Cálculo: % glicerol = (Va − Vb) * N * 9. cobria com vidro de relógio e deixava em repouso por 30 minutos. usando medidor de pH. N = normalidade do NaOH. i – Diluia a a proximadamente 100 mL e titulava com NaOH aproximadamente 0. f – Preparava-se um branco contendo 50 mL de água destilada e procedia ao mesmo ajuste de pH.125 N (normalidade perfeitamente conhecida). m = massa da alíquota da amostra (g) 5. h – Adicionava 2 mL de solução de etilenoglicol 50% e deixava por 20 minutos.05 N até que o pH atingisse o valor 8.1 ± 0.005 N para facilitar este acerto). usava NaOH 0.5 para branco e Ph 8. adicionava-se NaOH 0.5 Avaliação da concentração de nitrogênio amoniacal O método permite a determinação de nitrogênio na forma de amônio via eletrodo específico (Orion ammonia gas-sensing electrod. Vb = volume de NaOH gasto na titulação do branco (mL). 5. Com esse procedimento o amônio presente na solução passa a forma de amônia. amostra e outra e colocado em uma solução de descanso (solução-padrão 10 ppm). a cada 30 segundos. sendo então determinado. no momento da leitura. até que a corrente se estabilize. Procedimento analítico: (1) Adiciona-se 0. com as soluções-padrão. em O eletrodo deve ser lavado com água destilada entre as medidas de uma A concentração de amônio é calculada segundo a curva de calibração obtida milivolt. (2) (3) (4) (5) Amostras e padrões são agitados com agitador magnético. 5.6 Avaliação da concentração de fósforo O método do ácido ascórbico determina o in fosfato (PO4) contido na amostra por análise colorimétrica (Franson.0 mL de amostra (sobrenadante do centrifugado) ou solução-padrão. Preparo das amostras: Devem ser preparadas curvas de calibração com solução-padrão de sulfato de amônio em diferentes concentrações a cada lote de amostras a serem analisadas. . 1998). Amostras e soluções-padrão devem ser analisadas sempre à mesma temperatura. A amônia dissolvida na amostra difunde-se através da membrana até que as pressões parciais do lado interno e externo à membrana se igualem. A pressão parcial de amônia será proporcional á concentração presente na amostra.5 Materiais e métodos 55 Esse eletrodo é constituído por uma membrana hidrofóbica gás-permeável que separa a solução de amostra da sua solução interna.2 mL de NaOH de solução 10 N em 2. As leituras são realizadas no condutivímetro (Procyon Model AS 720). 2. H2SO4 5 N – Diluir 70 mL de ácido sulfúrico concentrado em 500 mL de Tartarato de antimônio e potássio – Dissolver 1.30 mg/L de P) deverá dissolver 219. 1:4. (Esta mistura é estável por um período de 4 horas). 5 mL do reagente 2. Adiciona-se 800 µL do reativo. Adiciona-se 4.5 mg de K2HPO4 anidro em 1000 mL de água destilada e assim prepara-se os padrões por diluição (1:0. Incuba-se por 10 minutos. 1:2. elevar o volume para 500 Ml.76 g de ácido ascórbico em 100 mL de água destilada. prepara-se o reativo utilizando as soluções descritas acima: Para obter 100 mL do reativo prepara-se: 50 mL do reagente 1. Ácido ascórbico 0. Acondicionar em frasco de vidro. água destilada. 15 mL do reagente 3.15 a 1. 1:8 e 1:10). 30 mL do reagente 4.5 Materiais e métodos 56 Para efetuar o procedimento do método do ácido ascórbico é necessário preparar os seguintes reagentes: 1. 1:6. (Acondicionar em frasco de vidro). Em seguida. (A solução fica estável por uma semana à 4ºC). água destilada.9 Ml de água destilada e deionizada no tubo contendo o item 1. 3. . Procedimento para análise colorimétrica: (1) (2) (3) (4) Prepara-se 200 µL de amostra ou padrão ou água destilada (branco). Deve-se preparar o reativo à temperatura ambiente. Na solução padrão (0.1 M – Dissolver 1. 4.3715 g do sal em 400 mL de Molibdato de amônio – Dissolver 20 g do sal em 500 mL de água destilada. YX/N e produtividade de biomassa Px foram calculados conforme Hiss. 5. Fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N) (2) onde: NO = concentração de nitrogênio amoniacal inicial (g/L).6 Cálculo dos parâmetros cinéticos Os parâmetros cinéticos µmax (velocidade específica máxima de crescimento) e os fatores de conversão substrato a células. Determinou-se um tempo “final” (tf) em que a concentração celular mássica era máxima ou que fonte de carbono estava esgotada. pela equações a seguir: Fator de conversão de substrato em células (YX/S) (1) onde: Xf = concentração celular final (g/L). nitrogênio a células. Calcular a concentração de Fósforo em mg/L segundo a curva de calibração obtida com as soluções-padrões. XO = concentração celular inicial (g/L). e em relação a esse tempo calcularam-se os fatores de conversão e produtividade. . So = concentração da fonte de carbono inicial (g/L). Nf = concentração de nitrogênio amoniacal final(g/L).5 Materiais e métodos 57 (5) (6) Efetua-se as leituras a 880 nm em durante. Sf = concentração da fonte de carbono final (g/L). (2001) e Carvalho e Sato. (2001). respectivamente YX/S. lipoferum. O nome de cada ensaio é composto por cinco letras e um número: as duas primeiras letras (Az) indicam a abreviação da palavra Azospirillum e as duas seguintes (br ou lp) o organismo que participa no ensaio e a última letra (S ou F) demonstra o processo/equipamento utilizado. (4) . A velocidade específica máxima de crescimento celular (µmax) Para determinar a fase de crescimento exponencial. notou-se que os pontos podia.7 – Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios Para estudar o crescimento de Azospirillum ssp em diversas fontes de carbono e nitrogênio. o número é seqüencial por tipo de ensaio (Tabela 5. em dois sistemas de cultivo. através de uma regressão linear (o coeficiente angular da correlação linear era o valor utlizado). t Xo 5. foram desenvolvidos 27 experimentos para A. segundo a equação (4): lnX = µmax .1). brasilense e 22 para A. Após traçadas as curvas. foram traçadas curvas de ln(X) (logaritmo neperiano da massa de célula) em função do tempo. ser correlacionados por uma reta e com isso foi possível obter o µmax (velocidade específica de crescimento).5 Materiais e métodos 58 Produtividade celular mássica (3) onde: tf = tempo para consumo da fonte de carbono (h). 0 120.0 12. 11.0 26. ponto de vista econômico. . lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada experimento.0 120.0 7.0 13.0 120. Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos em duplicata.0 18.0 37.0 13.5 Materiais e métodos 59 Tabelas 5. Experimento Ensaios Azbr01 (S) E1 Azbr02 (S) Azbr03 (S) E2 Azbr04 (S) Azbr05 (S) E3 Azbr06 (S) Azbr07 (S) E4 Azbr08 (S) Azbr09 (S) E5 Azbr10 (S) Azlp01 (S) E6 Azlp02 (S) Azlp03 (S) E7 Azlp04 (S) Azlp05 (S) E8 Azlp 06 (S) Azlp07 (S) E9 Azlp08 (S) Azlp09 (S) E10 E11 E12 Azlp10 (S) Azlp01 (F) Azlp02 (F) Azbr01(F) Azbr02 (F) E13 Azbr03 (F) Azbr04 (F) E14 Azbr05 (F) Azbr06 (F) E15 Azbr07 (F) Etanol (NH4) 2HPO4 Glicerol (NH4) 2HPO4 Frutose (NH4) 2HPO4 Etanol Sacarose Glicerol Lactato Sacarose Glicerol Frutose Etanol Lactato Sacarose Glicerol Frutose Fonte de Carbono Fonte de Nitrogênio (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 NH4Cl (NH4) 2HPO4 (NH4) 2HPO4 120.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A.0 Tempo de ensaio (h) Título Influência da concentração das fontes de Carbono e de C e N é melhor do ponto Determinar quais das fontes 15.0 120.0 120.0 de vista de processo e do Nitrogênio sobre o crescimento microbiano.5 120.0 120. brasilense Sp7 e A.0 120.0 120.0 (S) = shaker e (F) = Fermentador Obs:. Dos meios de cultura testados: Agar nutriente (AN).60 6 Resultados e Discussão 6. evitando a utilização de matéria-prima que tenha apenas um único fabricante ou fornecedor foi o Agar nutriente (AN). brasilense Sp7 +++ +++ + +++ ++ A. Luria Bertani (LB) e Agar de Soja-Triptona (TSA) demonstraram colônias bem caracterizadas quanto à cor. Tabela 6.2 Fonte de Nitrogênio A princípio. Agar Potato Dextrose (PDA) e Novo Fábio Pedrosa. consistência das colônias e excelente crescimento celular para ambas as linhagens. mas deve-se levar em consideração critérios que se referem à velocidade da produção. Agar nutriente (AN). + pouco crescimento. Meio de cultura NA LB PDA TSA NFb A. Luria Bertani (LB). Resultados e Discussão 6. lipoferum BR 17 +++ +++ +++ +++ ++ Símbolos: +++. em meio sólido a 30ºC estão resumidos na tabela 6. excelente crescimento. ++ bom crescimento.1 Meios sólidos Os resultados obtidos após incubação por cinco dias. o meio de cultura que atendeu tanto o critério de maior velocidade de crescimento e maior quantidade de células quanto aos critérios de disponibilidade e preço.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados.1. aminoácidos. Entretanto. diâmetro. Agar de Soja-Triptona (TSA). aos fatores de . proteínas e até mesmo nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano. poder-se-ia empregar amônia. (NFb) 6. 19 g/L 0. Tabela 6.38 g/L 2.1 a 6.76 gL 1.26 g/L 1. A tabela 6.3 o resumo de todos os resultados obtidos nos ensaios em incubador rotativo e nas figuras 6.04 g/L 2.2 apresenta os melhores resultados da seleção realizada nos ensaios em duplicata em incubador rotativo e suas respectivas biomassas. (1988).82 g/L 1.57 g/L 2.27 g/L 1. conforme citado por Döbereiner.3 Ensaios em incubador rotativo São apresentados na tabela 6.61 6 Resultados e Discussão conversão.06 g/L * fontes testadas nos ensaios em incubador rotativo 6. por facilidade de preparação já que (NH4)2HPO4 é fornecedor de P ao sistema.57 g/L A.5 as curvas dos resultados destes ensaios. todos realizados à temperatura de 30ºC e 200 rpm.89 g/L 0.58 g/L 1. . este foi o escolhido.73 g/L 1.62 g/L 2. NH4Cl.82 g/L 2. (1995) e (NH4)2HPO4 mencionada em Dias. lipoferum BR17 1. e à facilidade de compatibilização da etapa de crescimento celular com as demais etapas do processo.01 g/L 1.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de cultivo) Ensaios (NH4)2HPO 4/frutose NH4Cl/frutose (NH4)2HPO4/glicerol NH4Cl/glicerol (NH4)2HPO4/sacarose NH4Cl/sacarose (NH4)2HPO 4/lactato NH4Cl/lactato (NH4)2HPO4/etanol NH4Cl/etanol A.21 g/L 2. Os resultados mostram que elas são equivalentes em termos de crescimento e.20 g/L 2. Das duas fontes suplementadas ao meio de cultura.85 g/L 1. brasilense Sp7 2.19 g/L 1. as células iniciavam uma fase de aumento da concentração celular que era acompanhada pelo decréscimo da concentração de frutose e de nitrogênio. Azlp01 e Azlp02. há aumento do pH a partir de 100 horas de ensaio. brasilense Sp7 observou-se um pequeno decréscimo no pH até o final dos ensaios.62 6 Resultados e Discussão O principal objetivo destes ensaios foi avaliar a influência das fontes de carbono e nitrogênio no crescimento de Azospirilla e nos correspondentes fatores de conversão e produtividade. Azbr02. Esta fase de crescimento terminou quando a concentração de C limitante. . Já para o NH4Cl usando o mesmo organismo. que libera N protéico para o meio. em resposta à liberação de íons fosfato (a parte não foi utilizada pelas bactérias) pelo consumo de amônia e por conseqüência da lise celular. utilizando fontes de nitrogênio diferentes (NH4)2HPO4 e NH4Cl) pôde-se observar que antes de completar 24 horas de ensaio. Houve consumo de nitrogênio e frutose em ambas e não se percebe o crescimento subseqüente a partir de aproximadamente 30 horas de ensaio (Figuras 6.3. Deve-se salientar que foi observado a formação de flocos.1). sendo mais intensa quando maior o tempo do ensaio.1 Frutose O desenvolvimento das bactérias do gênero Azospirillum utilizando frutose como principal fonte de carbono. Nos ensaios utilizando (NH4)2HPO4 com A. apresentaram-se bem caracterizado. 6. Nos ensaios em duplicata em Azbr01. . lipoferum e concluíram que ambas as linhagens não crescem utilizando sacarose como fonte de carbono. Não se verificou o aparecimento de duas fases exponenciais de crescimento nos ensaios utilizando glicerol e extrato de levedura. o pH decresceu.4). (1983).3.2 Glicerol Uma primeira característica de todos os cultivos com glicerol foi um período de crescimento celular com baixo consumo de N presente no meio de cultura. por ser um meio pobre. foi acrescentado ao meio mínimo (MM).63 6 Resultados e Discussão 6. Foi observado o aparecimento de flocos (Figuras 6.075 g/L). Levando-se essas informações em consideração. extrato de levedura. sendo ele provavelmente um dos nutrientes essenciais que age em conjunto com os outros componentes para o desenvolvimento da bactéria. numa concentração prédeterminada (0. lipoferum BR17. cresceram aerobiamente A.3. não contêm os nutrientes necessários para a mesma desenvolver-se adequadamente. Os resultados confirmaram que Azospirillum realmente não cresce no meio mínimo proposto. descrito na página 46. lipoferum Br 17 (Tabela 6. há necessidade da adição de extrato de levedura ao meio de cultura. o meio de cultura (MM). Mas também houve o consumo de nitrogênio e glicerol sem o crescimento subseqüente.2). Esse período foi acompanhado por valores de pH constantes ou ligeiramente ascendentes. nas temperaturas de 30 ou 35ºC. Para o glicerol obtevese o dobro dos valores dos fatores de conversão e das produtividades de A. Quando se iniciou o consumo de nitrogênio inorgânico. Pois Martinez & Buris. brasilense Sp7 em relação a A. brasilense e A. 6. foi preparado e inoculado com as linhagens utilizadas neste trabalho.3 Sacarose Para averiguar o crescimento de Azospirillum utilizando sacarose como fonte de carbono. Observou-se que para o crescimento sem fixação de nitrogênio. Constatou-se que a introdução do estrato de levedura no meio propiciou o crescimento apenas de A. para A. Metabolicamente o lactato é convertido em piruvato e são utilizados como fonte de energia. Por ser um carboidrato.3 g/L) e em momento algum do ensaio as fontes de carbono e nitrogênio foram consumidas. foram obtidos resultados desfavoráveis para A.4). o lactato foi consumido mais rapidamente quando comparada a A. mudança de cor e formação de flocos. lipoferum Br 17. a tendência do pH foi aumentar em decorrência à liberação de íons de sódio que libera N protéico para o meio. obteve-se um excelente crescimento celular. Em A. o decréscimo do pH ao longo do cultivo pode ter ocorrido pela mesma razão verificada em frutose (Figura 6. Nos ensaios observou-se a formação de flocos.h). as linhagens crescidas em meio F. implicando. acompanhada pelo decréscimo da concentração das mesmas fontes. A concentração de sacarose. para A. Como demonstrado nos ensaios. .3).4 Lactato Na utilização de sais de ácidos orgânicos (lactato) como fonte de carbono. mostraram o consumo total deste substrato antes de atingir 24 horas de ensaio. Notou-se ainda. glicose e frutose determinada por cromatografia de fase líquida (HPLC) (resultados não apresentados). a concentração de sacarose permeneceu constante. conseqüentemente. o crescimento celular ou o consumo dos substratos (Figuras 6.64 6 Resultados e Discussão Para os ensaios com sacarose. acelerando o consumo do substrato nesta bactéria.0 não prejudicando. Entretanto. brasilense. brasilense Sp7.3. pois a concentração celular encontrada foi baixa (0. lipoferum. alterou-se o pH de 6. brasilense.8 para 9. aparentemente.006 g/L. Ao contrário. e a concentração de glicose e frutose não aparecem. 6. em uma baixa produtividade (0. dado apresentado na tabela 6. os ensaios suplementados com DAP (diamônio-fosfato). em todas as amostras analisadas.3. com agitação e temperatura definidas. maior será a degradação dos nutrientes contidos no meio.2 g/L. soluções de DAP.5 g/L de Nitrogênio inorgânico enquanto que a solução final tinha apenas 0. O fato dos ensaios durarem 120 horas. Sabe-se que quanto maior o valor do pH.5. o consumo de carbono associado ao crescimento celular quando utilizado DAP na composição do meio de cultura. sendo que ocorre limitação desta fonte a partir das 40 horas de ensaio. apresentou comportamento diferente. pode-se observar que houve diferenças significativas para fatores de conversão.6 e concentração celular consideravelmente baixa (1. Já A. produtividade e a diferença nos pHs apresentados na Tabela 6. assim. brasilense. sem que se tenha consumo pelas bactérias.5 Etanol É possível que as linhagens não tenham se adaptado ao meio de cultura que continha etanol como única fonte de carbono.0 g/L e pH 6. E após análises de nitrogênio amoniacal. brasilense Sp7 foi superior à outra linhagem. Pela análise da variação dos parâmetros obtidos. .65 6 Resultados e Discussão 6.0.030 g/L). O crescimento de A.4. nas mesmas condições foram utilizadas como teste para averiguar o grau de degradação de N num período de 5 dias. constatou-se que a solução inicial continha 0.3 para a interação entre os fatores linhagens e substrato. também é um fator que auxilia na degradação dos nutrientes. obteve concentração celular final de 2. e os devidos comportamentos durante os ensaios estão representados nas figuras 6. e nesses ensaios ocorre aumento do pH. E o consumo de nitrogênio não associado ao crescimento celular para ambas as linhagens. lipoferum BR 17. onde o pH final foi 7. Observou-se em A. 66 6 Resultados e Discussão (NH4)2HPO4 g/L 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) g/L 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) NH4Cl Biomassa g/L 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) g/L 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) Frutose g/L 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) g/L 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) Nitrogênio Amoniacal pH 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) pH 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 t empo ( h) Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E1 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E6 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo. 67 6 Resultados e Discussão (NH4)2HPO4 (g/L) 3,0 NH4Cl 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) g/L 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) Biomassa 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) g/L 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Glicerol 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) g/L 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) g/L 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) pH 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Nitrogênio Amoniacal pH 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo. 68 6 Resultados e Discussão (NH4)2HPO4 (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) NH4Cl Biomassa (g/L) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 (g/L) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Sacarose tem po (h) (g/L) 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) (g/L) 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Nitrogênio Amoniacal pH pH 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo. 69 6 Resultados e Discussão (NH4)2HPO4 (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) NH4Cl Biomassa (g/L) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) (g/L) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Lactato (g/L) 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) (g/L) 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 Nitrogênio Amoniacal 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) pH 10,0 pH 10,0 8,0 8,0 6,0 6,0 4,0 2,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) 4,0 2,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo. 70 6 Resultados e Discussão (NH4)2HPO4 (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tem po (h) NH4Cl (g/L) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Biomassa (g/L) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) (g/L) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Etanol (g/L) 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) (g/L) 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Nitrogênio Amoniacal (g/L) 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) pH 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 tempo (h) Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E2 (Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e E7 (Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo. principalmente acético. Goebel & Krieg. estes ácidos eram formados em quantidades reduzidas. Os flocos tornaram-se visíveis a partir das 6h de cultivo. UFC (unidade . X. não se observa coerência nos resultados. não era o nitrogênio inorgânico. Esses dois eventos (floculação e formação de carotenóides) foram observados para A. glioxálico. A formação de subprodutos durante o crescimento de Azospirillum não chega a preocupar. Pois quando ocorria o consumo total de substrato consequentemente ocorreu o aumento da concentração celular final. Deve-se ressaltar que a hipótese de produção de alguma substância extracelular poderia explicar a ocorrência de floculação. demonstraram que os produtos finais do cultivo deste microrganismo além de CO2 e H2O são apenas alguns ácidos orgânicos. a tabela 6. lático. 1981). denotando a formação de carotenóides. diversas grandezas. como pode ser visto nos resultados apresentados. Quase todos os ensaios com residual de substrato superior a 1 g/L indicavam que possivelmente outro componente do meio de cultura era o limitante. Nos ensaios em que houve floculação notou-se também que os meios de cultura e as células retidas nos filtros apresentavam-se rosadas. entretanto. málico. S.3 reúne os valores iniciais e finais de pH. 2-oxoglutárico e β-hidroxibutírico. que consequentemente decrescem o pH e não apresentavam efeito inibidor no metabolismo bacteriano. Esse limitante.4 Observações gerais Os flocos formados nestes ensaios eram aproximadamente esféricos e decantavam quando em repouso. (1984). Em relação aos valores obtidos nas análises de fósforo. quando não se observou crescimento celular satisfatório.71 6 Resultados e Discussão 6. Para facilitar as comparações entre os resultados obtidos com substratos diferentes. brasilense cd (Nur & Henis. devido à presença de carotenóides. devem ter sido utilizadas somente para manutenção celular. lactato e etanol. N. Nos ensaios em incubador rotativo. como por exemplo. os seguintes substratos: sacarose e glicerol. lipoferum Br 17. brasilense Sp7.21x109) e glicerol (1. lipoferum. pois com etanol as variações foram pequenas e suaves. para os ensaios em incubador rotativo com A. os valores de pH. foram avaliadas como melhores fontes de carbono em ordem decrescente. lipoferum Br 17. brasilense Sp7 e A. Alguns comportamentos foram semelhantes para as fontes de carbono estudadas. Provavelmente. brasilense utilizou-se frutose (3.72 6 Resultados e Discussão formadora de colônias).00x10 9) e para A. P. utilizou-se sacarose (3. pois os nutrientes (nitrogênio e substrato). glicerol (2.25x109) e etanol (2. mas com glicerol e frutose foram bem mais abruptas. Para A. e consequentemente o retardamento do crescimento celular. As concentrações celulares e as produtividades nos cultivos com frutose foram quase sempre superiores às obtidas com as demais fontes de carbono.02x10 9). Os fatores de conversão de substrato e de nitrogênio em células apresentaram comportamentos distintos para cada fonte de carbono. Para A. Já para A. Com sacarose. observou-se o não consumo do substrato. foram obtidas nas contagens de UFC valores acima de 10 9 para ambas as linhagens. o oxigênio atuou como fator limitante. os fatores de conversão e a produtividade. Considerando o mesmo tempo de ensaio para as linhagens. o consumo de nitrogênio e substrato sem efetuar o crescimento celular. glicerol. foram avaliadas como mais eficientes as seguintes fontes de carbono: frutose.22x10 9). As demais fontes de C conduziram os experimentos com resultados insatisfatórios. diferenciando-se segundo as fontes de carbono utilizadas. que são consumidos após a velocidade específica de crescimento terem tendido a zero. como pode ser visto na tabela 6. de acordo com os valores numéricos da concentração celular e dos fatores YX/S. .3. ambas decresceram. apresentam comportamento diferenciado. 88E+08 6.25E+06 2.00 4.88 0.68 0.21 0.22 0.42 1.68 0.80 0. Sf).79 6.95 11.15 0.68 0.13 0.06 0.49 9.10 2.05 5.28 0. 30ºC).04 7.34 7.22E+06 7.90 4.16 Azlp09 (a)9 120 6.11 0.Etanol / (NH4)2HPO4. 6 .90 0.60E+07 2.02 0.99 0.11 0.C.78 7.16 0.01 0.99E+08 2.00E+09 2.00 0.C U.19 0.16 0.76 6.39 10.42 1.02 5.04 0.07 0.28 0.61 0.12 0.13 0. brasilense Sp7 e A.81 7.73 4.31 0.06 0.64 0.21 0.72 0. 10 .65E+07 1.93E+07 1.59 4.12 0.72 0.00 4.54 0.22 Azbr10 (a)10 72 6.27 0.02 0.79 0.80 0.16 0.08 0.31 12.10 0.75 0.14 2.21E+09 1.25 0.003 0.90 1.05 0.06 6.03 1.74 0.12 0.53E+06 8.31 0.00 4.82 2.12 0.48E+06 4.81 6.95 7.00 4.75 0.09 0.12 0.04 0.37E+08 8.28E+08 6.20 0.72 5.56 1.29 0.95 4.75 0.47E+08 2.03 0.74 0.46 15.98 4.31 0.13 0.07 0. .21 6. Nf).10 0.22 0.30 0.00 0.13 1.74 0.21 0.15 0.77 5. Ensaio Tempo dos Xo pHo pHf (g/L) ensaios (h) Xf (g/L) So (g/L) Sf (g/L) U.72 4.Frutose / (NH4)2HPO4.01 0.18 0.43E+09 9.65 0. e Fatores de conversão do substrato (YX/S).93E+06 1.22 0.79 6.65 0.04 2.Sacarose / (NH4)2HPO4. Tempo de crescimento.26 0.69 0.85 0.21 0.74 0.21 0.35 0.36 0.19 0.60 2.00 0.78 6.21E+07 3.25 4.15 0.95 4.81 6.80E+08 6.71 0.F.14 0.62 2.76 0.53E+06 4.22 0.81 6.02 0.80 6.26 0.44E+07 1.68 1.88 6.18 0.23 5.29E+07 2.59E+07 1.19 0.3 .28 6.28 0.23 0.57 8.16 Azbr09 (b)9 117 6.26 0.20 0.00 5.22E+09 1.85 1.04 0.98 7.Glicerol /NH4Cl.50 0.00E+09 8.42 0.74 0.07 0.06 5.06E+09 1.60 0.98 5.45 17.59E+08 5.21 0.88 4.09 0.89 4.28 0.02 4.Sacarose / NH4Cl.33 0.34 0.07 0.05 0.00 4.56 0.72 0.56 0.21 9.20 0.485 11.00 0.00 0.45 0.20 5.11 0.F.20 0.82 6.77E+06 3.17 0.22 0.48E+08 3.00 4.80 0.F.23 0.38 9.41 19. 3 .96 5.02E+09 9.21 5.21 8.55 9.46 0.21 0.01 0.84 5.02E+07 4.43 0.64 0.05 3.07 8.23 2.02 0.11 0.10 1.10 5. 7 .99 5.85 0.21 0.02E+09 1.85 0.48 0.05 0.48 0.011 0.02 0.82E+06 2.25E+06 4.05 0.81 0.22 0.95 6.43 9.Dados experimentais obtidos nos ensaios com A.28 0.29 0.73 0.00 4.66 5.86E+08 3.16 0.20 1.48 0.88 9.12 0.F.68 0.62 0.59 0.99 0.Frutose / NH4Cl.14 0.82 1.32 0.32 5.19 0.13 Azbr10 (b)10 72 6.C/mL) (U.77 0.63 4.24 0.71 0.34 8.58 0.40 10.05E+08 1.66E+06 6.182 0.12 0.07 7.05 8.23 0.22 Azlp10 (b)10 72 6.32 10.10 4.99 1.03 0.09 0.28 0.80 6.02E+09 7.68 4.04 0.25 0.58 0.79E+06 5.45E+06 6.85 0.25E+09 1.12 0.20 0.07 2.30 5.12E+06 1.69E+08 1.55 0.007 0.33 0.75 0.14 Azlp09 (a)9 120 6.51 0.76 7.66 1.11E+09 1.88 5.12 0.66 0. Nitrogênio (No.02 0.25 0.74 0.27 2.55E+08 1.15 0.46 0.23 13.04 0.Lactato / (NH4)2HPO4.h) Azbr01 (a)1 Azbr01 (b)1 Azbr02 (a)2 Azbr02 (b)2 Azlp01 (a)1 Azlp01 (b)1 Azlp02 (a)2 Azlp02 (b)2 Azbr03 (a)3 Azbr03 (b)3 Azbr04 (a)4 Azbr04 (b)4 Azlp03 (a)3 Azlp03 (b)3 Azlp04 (a)4 Azlp04 (b)4 Azbr05 (a)5 Azbr05 (b)5 Azbr06 (a)6 Azbr06 (b)6 Azlp05 (a)5 Azlp05 (b)5 Azlp06 (a)6 Azlp06 (b)6 Azbr07 (a)7 Azbr07 (b)7 Azbr08 (a)8 Azbr08 (b)8 Azlp07 (a)7 Azlp07 (b)7 Azlp08 (a)8 Azlp08 (b)8 24 24 24 24 24 24 24 24 44 44 44 44 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 24 24 24 24 24 24 24 24 6.10 0.220 2.04 1.Etanol / NH4Cl.68 5.73 6 Resultados e Discussão Tabela 6.13 2.140 0.04 0.Glicerol / (NH4)2HPO4.14 0.16 0.98E+08 6.23 0.62 0.68E+07 1.46 0.02 0.88 6.00 5.36 0.23 0.007 0.23 0. lipoferum Br 17 em incubador rotativo (200 rpm.21E+09 3.59 0.51 9.25E+06 2.03 0.19 0.89E+08 0.62E+09 2. 9 .20 2.08 0.79 6.27 0.26 0.21E+08 2.94 21.21 4.33 4.03 0.06 0.11 0.26 6.C/mL) No (g/L) Nf (g/L) Po (g/L) Pf (g/L) Yx/s (g/g) YX/N Px (g/g) (g/L.55 0.10 0.23 5.04 0.00 4.39 2.30 5.09E+08 1.77 4.18 0.88E+06 8.88E+08 0.86 5.05 0.53 9.08 0.06 0.73 0.83 5.58E+06 9.25E+06 7. concentrações iniciais e finais de Células (Xo.04 0.31 6.42 9.11 0.01 6.32 8.81 7.02 5.41 11.21 Azbr09 (a)9 117 6.79 5.66E+06 6.04 0.87 0.76 0.31E+09 3.58 1.02 0.49 11.06 0.02 0.26 0.25 6.90 2.85 7.20 0.44 0.49 0. 5 .74 6.00 5.36 17.22E+09 2.24 0.15 0.63 16.06 0.28E+08 5.12 Azlp10 (a)10 72 6.02 0.66E+08 2.26 1.73 0.05E+07 1.01 0.63 0.82 6.60 0.01 0.72 0.81 7.21 0.81 6.40 9.07 0.75 5.52 0.70 0.67 0.22E+07 1.89E+08 0.25E+06 7.80 1.03 0.03 0.14 0.F.04 1.28E+08 7.25 0.14 0.11 0.22 0.23 5.19 0. Fósforo (Po.12 0. 4 .48E+08 1.57 1.03 0.32 0.78E+08 5.42 0.48 1.31 5.85 4.04 0.09 0.92 6.77 1.34 7.09 0.010 0.06 0.07 7.19 0.80 0.00 5.77 5.36 0.00 1.80 6.00 6.81 6.33E+07 1.85 5.44E+06 8.04 5.80 6.46 0.51E+06 3.74 1.74 0.77 9.11 0.86 4.58E+07 2.68 9.006 0.69 6.80 0. pH e U.13 1.26 0.19 2.013 1 .43 1.09 0.22 0.76 0.55 0. Pf).48 0.20 5.04 1.02 5.00 4.02 6.75 0. 2 .75 28.62 9. Substrato (So.73 5.13 0.33E+06 3.41 8.06E+09 0.21 0.00 5.09 0. 8 .31 0.22E+09 0.10 0.14 0.33 0.70 0.90 0.078 0.03 0.07 0.02 0.79 6.70 0.21 4.66 0.11 0.02 0.44 0.65 0.65 0.57 2.Lactato / NH4Cl.88 0.25E+09 1.19 0.03 0.72 0.26E+07 3.C final inicial (U.88 0.77 0.68 0. de nitrogênio (YX/N) em células e produtividade (P X) para todos os ensaios realizados.45 0.73 5.22E+07 4.35 9.68E+06 6.27 9.30 4.32 0.32 12. Xf).80 6.58E+08 0.81 7.24 1.29 0.02 0.41 0.64 1.00 0.03 0.18 0.60 0.43 0.82 6.19 5. Todos os ensaios foram realizados segundo a metodologia descrita no item 9. em fermentador. Concentrações iniciais de substrato inferiores a 5. Assim. e aumento da agitação conforme necessidade das bactérias durante o cultivo. em que houve crescimento exponencial para variações de pH bem pronunciadas. .74 6 Resultados e Discussão 6. brasilense Sp7 e A. Dias (1988). O controle de pH.2 < So < 11. no caso dos inoculantes.5 Ensaios em biorreator Os experimentos foram realizados com o intuito de se estabelecer melhores condições para a produção de A. Para o processo industrial deve-se utilizar a concentração inicial de nutrientes que proporcione os maiores fatores de conversão (que estão associados aos custos dos reagentes e matérias-primas) e produtividade (que é inversamente proporcional ao tamanho dos equipamentos e aos custos operacionais) e. não foi realizado. como pôde ser verificado nos cultivos em agitador rotativo.0 g/L de extrato de Levedura. estudou diferentes concentrações de substrato e concluiu que os meios de cultura com 1. Foi adotado esse procedimento levando-se em consideração que o crescimento bacteriano não é muito sensível à variação de pH.5 g/L não seriam vantajosas.2 g/L trariam acentuados decréscimos na concentração celular final e na produtividade.4. concentrações iniciais de substratos maiores que 11. pois não aumentariam os fatores de conversão nem a produtividade celular. a partir dos resultados já obtidos em incubador rotativo.0 L/min de O2 (oxigênio dissolvido). lipoferum Br 17 em processo descontínuo. pôde-se restringir a faixa de experimentação para 5.5 g/L para frutose.5 e 1. embora pudessem conduzir a fatores YX/S bastante elevados. para programar os ensaios em processo descontínuo. as maiores concentrações de células viáveis. à temperatura de 30ºC e a uma vazão de ar entre 0. Tendo em vista que a taxa de respiração para adequar ao fermentador seja suficiente para atender às necessidades do crescimento da cultura microbiana.4 . resume as condições preliminares dos ensaios realizados em fermentador. ou seja. faz-se necessário conhecer a concentração crítica de O2 dissolvido para Azospirilla em cultivo submerso. Tal & Okon. ser de grande utilidade no controle do processo descontínuo.4. ao longo dos ensaios a concentração de oxigênio tendia a decrescer de 10% até 40% de saturação e ao término da fonte de carbono.Etapas preliminares dos ensaios em fermentador. as bactérias não tinha o que oxidar e a mesma concentração subia de forma acentuada (dados não apresentados). Tabela 6. notou-se um mesmo padrão de comportamento. (1985) concluíram que as bactérias do gênero Azospirillum . Esse parâmetro poderá. indicando rapidamente o término do crescimento e evitando que o reator fique em operação com células em estado estacionário ou de declínio.75 6 Resultados e Discussão A tabela 6. Ensaios Azlp01 Azlp02 Azbr01 Azbr02 Azbr03 Azbr04 Azbr05 Azbr06 Azbr07 Pré-inóculo CN CN CN CN CN CN CN CN CN Fonte de Carbono (5 g/L) Sacarose Glicerol Frutose Frutose Frutose Glicerol Glicerol Etanol Etanol CN: Caldo nutriente Inóculo MEIO F MEIO F CN MEIO F MEIO F MEIO F CN CN MEIO F Meio F: Meio de fermentador Observando-se as variações de oxigênio dissolvido. então. o crescimento de Azospirillum lipoferum ficou restringido quando a OD era de 30 µM (cerca de 10% de saturação) (Tsagou and Aggelis. o aumento da absorbância em conseqüência do acúmulo da biomassa. o cultivo vindo de caldo nutriente carreou algum nutriente para o meio fermentador. Apesar de serem linhagens diferentes.1 Glicerol Provavelmente. com 9 horas de cultivo.9 g/L de NH4+ contida no meio de cultura. enquanto que para Azbr04.33 g/L. no ensaio Azbr05 obteve-se 2 g/L de biomassa. maior variação do pH e menor tamponamento das soluções. A. 2003). como a utilização total da fonte de carbono e nitrogênio. quando utilizou inóculo crescido em meio F. foi o aumento de NH4+ devido o consumo do extrato de levedura presente no meio de cultura. 6.5). No caso do A. lipoferum. no ensaio Azlp02.5. Mas em concentrações de 0. uma primeira característica muito interessante dos ensaios com A. aparentando uma pequena diferença na velocidade de crescimento entre um ensaio e outro. Verificou-se na figura 6. No ensaio Azbr04 o inóculo utilizado foi preparado com meio F e no ensaio Azbr05 utilizou-se CN (Tabela 6. pois ao alcançar 18 horas de cultivo.5 a 0.6 que em Azlp02.6). . e quando ocorre decréscimo do pH juntamente com a queda do Nitrogênio.76 6 Resultados e Discussão desenvolvem-se em uma ampla faixa de oxigênio dissolvido (OD). o valor obtido foi de 1. pode-se afirmar que em todos os ensaios com glicerol houve um período de crescimento celular (e de consumo de glicerol) sem que houvesse o decréscimo de N (Figura 6. Supõe-se que em Azbr05. lipoferum pára de crescer. as curvas mostram alguns comportamentos semelhantes. brasilense. Este autor concluiu que o aparecimento de duas fases de crescimento nos cultivos de A. brasilense Sp 245 em glicerol e extrato de levedura não era devido a diauxia.77 6 Resultados e Discussão Esses períodos foram acompanhados por valores de pH constantes. o microrganismo tenha utilizado nitrogênio orgânico presente no extrato de levedura através das reações da assimilação de aminoácidos e proteínas. embora tenha interferido nas leituras de absorbância (Tabela 6. . a floculação não afetou o crescimento celular. Na figura 6. pois os ensaios com maior densidade de flocos eram também os mais rosados. ou ligeiramente ascendentes e quando se iniciava o consumo de nitrogênio o pH decrescia. Entretanto. diferenciando do resultado observado por Dias. (1988). Mais uma vez a floculação pôde ser associada.7 foram calculadas as velocidades específicas máximas de crescimento celular e como se observa não foi obtida duas fases de crescimento exponencial. Uma observação final a respeito dos ensaios com glicerol é que as pequenas diferenças entre eles parecem provir do uso de inóculo com diferentes concentrações da composição do meio utilizado no preparo do mesmo.6). ainda que de forma qualitativa à formação de carotenóides. É provável que nesse período de concentração constante de nitrogênio inorgânico. devia-se ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato de levedura. pois há consumo simultâneo de ambas as fontes. 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0.5 N (g/L) 0.0 6.0 2.00 N (g/L) tempo (h) Variáveis 8.50 0.20 0.0 5.0 4.0 2.5 0.6 Evolução das concentrações de biomassa (□). Glicerol (◊).0 2.0 1.4 0.0 4.0 0. Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.0 6.35 0.15 0.45 0.40 0.0 5.0 20 5 10 tempo (h) 15 Azbr05 (inóculo = CN) Variáveis 8.0 0.15 0.2 0.20 0.0 7.3 0.4 0.0 0 Azlp02 (inóculo = Meio F) 0.0 4.25 0.0 0.0 0 Azbr04 (inóculo = Meio F) 0.10 0.0 3.0 6.35 0.30 0.0 5. Absorbância ( ).2 0.1 0.0 7.05 0.40 0. .0 1.30 0.10 0.05 0.0 7.0 1.1 0.0 3.3 0.25 0.50 N (g/L) 0.00 15 5 tempo (h) 10 FiGURA 6.78 6 Resultados e Discussão Variáveis 8.45 0.0 3. 7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os ensaios com Glicerol.00 0. utilizou-se caldo nutriente. Para o ensaio Azbr01.8). nota-se que há decréscimo no ensaio Azbr01 nos outros dois ensaios. pois os ensaios foram efetuados em condições semelhantes. Comparando-se os valores de pH. resultando a concentração celular final em 4.50 -2. o meio de cultura diferenciado no preparo do préinóculo pode ter sido um fator representativo para o crescimento da bactéria em fermentador.50 1. o pH permance praticamente constante (Figura 6. . diferenciando-se dos resultados obtidos em Azbr02 e 03 com concentrações finais de 0. 6.50 0 4 8 12 16 20 24 28 Azlp0 2 Azbr0 5 Azbr0 4 32 36 40 tem po (h) Figura 6.00 -2.01 g/L e consumo total do substrato.69 g/L.5.00 -1. brasilense.50 -1. em cultivo de 15 horas. houve decréscimo de N semelhante entre os três ensaios.50 LN(X) 0.2 Frutose Nos ensaios com A.79 6 Resultados e Discussão 1.6 g/L e 0.00 -0. 00 Variáveis 8.30 0.15 0.40 0.00 0 5 10 tempo (h) 15 20 0. frutose (◊).45 0.35 0.50 N (g/L) 0.25 0.15 0.0 0. Absorbância ( ).00 7.20 0.25 0.40 0.0 5.80 6 Resultados e Discussão Azbr01 – (inóculo = CN) Variáveis 8.45 0.0 1. .0 0 5 10 15 20 tempo (h) 25 30 0.0 5.00 5.0 3.05 0.05 0.00 15 5 tempo (h) 10 Azbr03 – (inóculo = Meio F) Variáveis 8.0 4.10 0.00 0.20 0.00 1.0 6.00 6.0 7.50 N (g/L) 0.40 0.10 0.10 0.0 3.0 2.0 6.0 1.30 0.25 0.00 4.0 4.00 3.00 2.0 7.0 0 Azbr02 – (inóculo = Meio F) 0. Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.15 0.35 0.45 0.20 0.35 0.00 Figura 6.30 0.50 N (g/L) 0.05 0.0 2.8 Evolução das concentrações de biomassa (□).0 0. lipoferum (Figura 6. no qual. (2003). Como ocorreu nos ensaios em shaker. devido a periodicidade das amostragens. atingindo-se um valor consideravelmente alto de velocidade específica máxima de crescimento (0. sacarose é hidrolisada a glicose e frutose e posteriormente oxidada (Figura 3. utilizou-se a fonte de carbono sacarose apenas com A. variações de pH podem causar: alterações nas funções das membranas. Da mesma maneira. uma vez que aparentemente toda sacarose transformada em glicose e frutose é consumida.9 e 6. De acordo também com a figura 6. o pH neste processo também decresceu.5 horas e obtendo-se um crescimento celular não muito satisfatório (1.10. utilizou-se o mesmo meio de cultura do fermentador na etapa do pré-inóculo. 1985).5. Esse caso especificamente. não havendo acúmulo destas fontes de carbono no meio. alterações na morfologia e estruturas celulares e na floculação e/ou adesão a superfícies (Forage & Pitt. 6.1). acompanhada pelo decréscimo da concentração do substrato e de nitrogênio.35 h-1). detectou-se concentrações de glicose e frutose. O tempo de crescimento para esta linhagem foi de 7. as concentrações de glicose e frutose caíram sem nenhum acúmulo no meio de cultura. . Nos ensaios em biorreator.81 6 Resultados e Discussão Não se conhece muito a respeito da influência do pH sobre os aspectos fisiológicos e bioquímicos em Azospirillum.92 g/L). De acordo com Jackson and Ricard. De uma maneira. a etapa principal da enzima da sacarose é sua hidrólise a glicose e frutose. pôde-se observar as variações mais detalhadamente. modificações no consumo de substrato e no perfil de produtos metabólicos.9). As curvas nas figuras 6.10 mostram o consumo total de sacarose e sua associação com a término de crescimento celular.3 Sacarose Como os ensaios foram determinados de acordo com os resultados em incubador rotativo. 0 0 2 4 tempo (h) 6 8 10 Figura 6.0 2.0 0. Pensou-se inicialmente em contaminação por outras .0 3.0 4.0 8. O outro tipo de floco apresentava tamanho maior.0 0.0 2. Absorbância ( ). Um dos tipos. Azlp01 – (inóculo = Meio F) g/L 5.0 4. Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador. com ramificações (“fiapos”) visíveis. densidade menor e aparência de “algodão”.0 1.0 0 2 4 6 8 10 tempo (h) Frutose Glicose Sacarose Figura 6.0 0. Foi observada dois tipos de floculação bacteriana caracterizados por sua densidade e aparência. sacarose (◊).0 2.10 Evolução das concentrações de frutose.0 1.0 3.0 4. glicose e sacarose em Azlp01.0 6.0 1. menor e mais compacto sedimentava com rapidez quando em repouso e era facilmente colocado em suspensão quando a agitação era reiniciada.0 5.0 3.9 Evolução das concentrações de biomassa (□).82 6 Resultados e Discussão Azlp01 – (inóculo = Meio F) Variáveis 5.0 N (g/L) 7. 6. pois para o mesmo crescido em meio fermentador o cultivo atingiu 12 h. . brasilense. pela adesão inicial das células em bolhas de ar depois permanecido ocluso.5. Os resultados comparativos nos ensaios com etanol.11.03 g/L).110 g/L. principalmente.h). mas observações microscópicas efetuadas não demonstraram a presença de outros microrganismos que não Azospirillum. baseando–se nos valores de concentração final (3. Este tipo de floco talvez tenha se formado. µmax (0. sem consumo do etanol.83 6 Resultados e Discussão bactérias ou fungos.4 Etanol Os ensaios com etanol também foram processados somente com A. Os acompanhamentos realizados durante os experimentos podem ser observados na figura 6. estão apresentados na tabela 6.6. inflando o floco. e observou-se que o tempo de crescimento e a formação de biomassa podem estar envolvidos com o fato de utilizar caldo nutriente no inóculo.103 h-1) e produtividade (0. e mostram resultados satisfatórios. 60 N (g/L) 0.0 2.00 0.0 5.0 6.50 Figura 6.0 0.0 2.0 7.0 4.50 0.0 3.40 0. Absorbância ( ).0 5.0 1.40 0.0 4.00 0 5 10 15 20 tempo (h) 25 30 7.0 0 5 tempo (h) 10 15 0.10 0.60 N (g/L) 0.84 6 Resultados e Discussão Azbr06 – (inóculo = CN) Variáveis 8. Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.0 6.0 0.20 0.0 0.30 0. etanol (◊).Evolução das concentrações de biomassa (□).0 3.30 0.10 0.0 1.20 0.0 Azbr07 – (inóculo = Meio F) Variáveis 8. .11 . 29 3.11 0.30 0.11 0.61 12. CN = caldo nutriente A tabela 6.69 5.48 µmax (h-1) 0.= acrescentado da fonte de carbono em estudo.31 9.24 Xf (g/L) 1.5 11 15 13 13 18 37 26 12 Xo (g/L) 0. Nitrogênio (No.18 0.5 e 11 h de cultivo.30 0.08 0.06 0. produtividade (PX).08 0. respectivamente.60 0.08 0. Foram obtidos altos valores de produtividade.05 4.10 0.35 4.62 YX/N (g/g) 1.69 1. 0. (h) 7.26 0.h.53 (N)f (g/L) 0.07 0.50 0.56 g/L. concentrações iniciais e finais de células (Xo.09 0.61 5.60 0. Sf).00 0. foram obtidos resultados expressivos.41 g/g).03 0.85 6 Resultados e Discussão 6.43 0.53 Sf (g/L) 0.69 0.07 0.11 0.24 0.06 8.h) 0.10 0.09 0.57 0.20 5.13 0.70 5.24 0.55 5.41 0.33 4.17 0.11 0. quando foi .83 7.5 demonstra que para A.24 0.46 0.24 2. Tabela 6. fatores de conversão de Substrato (YX/S) e de nitrogênio (Y X/N) em células. em função da composição do meio de cultura.67 So (g/L) 4. Substrato (So.35 0.05 0.02 0.62 0.56 2.03 0. ENSAIOS Pré-inóculo Fonte de Carbono (5g/L) Azlp01 Azlp02 Azbr01 Azbr02 Azbr03 Azbr04 Azbr05 Azbr06 Azbr07 CN CN CN CN CN CN CN CN CN Sacarose Glicerol Frutose Frutose Frutose Glicerol Glicerol Etanol Etanol MEIO F MEIO F CN MEIO F MEIO F MEIO F CN CN MEIO F Inóculo Tempo de cresc.04 3.67 0. Obs:. Para sacarose e glicerol como fonte de carbono foram obtidas.11 0.05 0. lipoferum.28 0.08 0.28 0.07 Velocidade específica máxima de crescimento (µx).21 0.04 4.17 0.24 0.81 PX (g/L.09 YX/S (g/g) 0. Xf). velocidade específica máxima de crescimento e fator de conversão em células (0.20 0.49 12.10 0.93 2. a utilização do próprio meio de cultura utilizado em fermentador igual ao do inóculo como forma de adaptação da bactéria.05 0.6 Comparação entre os ensaios A comparação entre os ensaios foi realizada levando-se em conta os fatores de conversão e produtividade no desenvolvimento do processo de produção de Azospirillum.24 g/L.69 0.26 5. bem como a tendência à formação de flocos e carotenóides.07 0. Nf) para os diferentes ensaios.28 0.20 0.80 3.5 – Tempo de crescimento.84 No (g/L) 1. após 7.06 5.5). As comparações entre as fontes de carbono foram efetuadas preponderantemente nos resultados obtidos em fermentador de 5L (Tabela 6.82 5.22 0.35 h -1 e 0.03 0. concentrações celulares finais de 1.93 e 2. Meio F. observou-se uma importante diferença em relação a influência das condições ambientais melhor controladas obtidas no biorreator relativa à agitação. na formação de subprodutos e de materiais de reserva e na eficiência energética. a velocidade específica máxima de crescimento. 37h e 26h. o tempo de ensaio para A. 15h. a adequação do binômio agitação-aeração é de fundamental importância devido aos efeitos diretos (falta de homogeneidade do sistema. ruptura de células por cisalhamento.6). brasilense no esgotamento total das fontes de C.) ou indiretos (limitação pelo oxigênio dissolvido) que influem no metabolismo celular.64 g/L). nas velocidades de crescimento e de respiração.h. Entretanto.3 h-1 usando frutose (10 g/L) como fonte de C DAP como fontes de nitrogênio e fósforo (2. etc. glicerol e etanol foram. que contribuíram positivamente para aumentar os parâmetros cinéticos do cultivo. Por outro lado. Taciro (1986) obteve para A.4 g/Lh. As concentrações celulares finais foram. A concentração celular final.86 6 Resultados e Discussão comparada sacarose ao segundo substrato escolhido. 0. glicerol (0. extrato de levedura (1g/L) e outros sais minerais.6). utilizando-se inoculo com CN.03 g/L. os fatores de conversão substrato e nitrogênio em células e produtividade foram altas (Tabela 6. aeração e nível de O2 dissolvido.22 g/L. não foram obtidos bons resultados quando o meio de crescimento do inoculo (CN) foi substituído pelo meio utilizado em fermentador (ensaios Azbr02. Os valores destes parâmetros para esta linhagem foram superiores aos encontrados no presente trabalho (Tabela 6. brasilense Sp 7 cultivada em biorreatore valor de produtividade de 0. 03. formação de espuma.28 h-1 e 0. brasilense.46 g/g).04 g/L e 3. respectivamente. devido provavelmente a diferenças fisiológicas entre as linhagens. Percebe-se que os ensaios em biorreator desenvolveram-se de forma semelhante aos ensaios em incubador rotativo. frutose. floculação. Nos ensaios com A.45 g/g e µmax = 0. Yx/s = 0. . 4. respectivamente de 2.67 g/L. Para o desenvolvimento de um processo aeróbio de produção de microrganismos. 04 e 07). 0 0. O correu uma correlação linear entre os pontos obtidos até 0. obtendo-se através de uma regressão linear a equação abaixo. determinações de absorbância e concentração celular mássica.5 3. Na Figura 6. após este valor. a absorbância acompanhou bem de perto a concentração celular ao longo dos ensaios.12 reuniram-se os valores de absorbância e concentração celular obtidos nos ensaios em fermentador. Já a correlação logarítmica.5 2.0 1.0 1.5 X (g/L) Azlp02 Azbr05 Azbr02 Azbr06 Azbr03 Azbr07 Figura 6.0 0. 3.5 1.0 0.0 2.5 Azlp01 Azbr04 0.0 3. foram efetuadas em paralelo.0 4.5 A 1.0 2.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e absorbância para os ensaios em fermentador. com o coeficiente de correlação de 0.87 6 Resultados e Discussão Em todas as amostras coletadas durante os cultivos.6 g/L.5 2. houve algumas diferenças entre as grandezas devido à floculação e à formação de carotenóides. .5 4.9799. 88 6 Resultados e Discussão Os ensaios realizados ainda permitiram a comparação do custo de produção da biomassa em biorreator relativo às fontes de carbono empregada (Tabela 6.99 Revista Química e derivados .21 0. Tabela 6. diminundo gasto de água de diluição e possibilitando maiores concentrações de biomassa.21 5. a produtividade conseguida com esta fonte de C é muito baixa (0.6).11 g/Lh).75 2. Para A.11 0.69 0.54 1.brasilense Yx/s (g/g) 0.41 0.11 Custo de substrato (R$/kg) 4. uma vez que o custo de produção da biomassa é o segundo mais baixo e a produtividade alcançada é a maior entre as fontes de C estudas.00 Custo produção (R$/kg) 7.80 1. e o fato das indústrias de inoculantes para FBN à base de rizóbio já utilizarem . brasilense A. lipoferum Br 17 a escolha recairia sobre sacarose uma vez que foram atingidas com esta fonte de C a maior produtividade e o menor custo de produção de biomass.lipoferum A.00 0.6.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em biorreator em relação ao custo do substrato.90 3.Jan 2006.17 0. glicerol seria a fonte de C de escolha. Entretanto. Esta tabela mostra os valores. lipoferum A. Entratanto. Custo de produção = Custo de substrato/Yx/s Para A. brasilense Sp 245.45 0.24 0.52 0. considerações de ordem prática como possibilidade de utilizar a fonte de C sem diluição da mesma em cultivo descontínuoalimentado. brasilense A. Esta conclusão é diversa da encontrada por Dias (1988) que propôs a frutose como a fonte de Carbono de escolha para produção industrial de A. seguido de glicerol.50 Px (g/Lh) 0.51 5.80 3. Este resultado corrobora a escolha da fonte de C feita segundo os dados da tabela 6. Fonte de carbono Frutose Sacarose Glicerol Glicerol Etanol Linhagem A. brasilense Sp 7 o menor custo de produção é alcançado com etanol. Azlp 02 e Azbr 05. 2001. Como já explicitado na revisão de literatura. O metabolismo dos Azozpirilla é desconhecido sob este aspecto. Basicamente os protocolos constituíram-se de uma batelada inicial igual ao ensaio em bataleda conduzido em biorreator.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC) Neste item foram desenvolvidos protocolos em ADC para as linhagens de Azospirilla utilizadas no presente trabalho. a facilidade de manipulação desta fonte de C. A fonte de carbono de escolha foi o glicerol. meio de cultura é disponibilizado aos microrganismos de forma parcelada. propõe-se o uso deste substrato também para o cultivo de A. produção de ácido orgânico... algum desvio metabólico não desejável. como é o caso em E. eventualmente. devido aos bons resultados atingidos nos ensaios realizados em batelada em biorreator. De acordo com este processo. 1984). coli (Yamane et al. usando glicerol como fonte de carbono. tende a ser minimizado. lipoferum. para as . Baseados nos experimentos em batelada realizados foram propostos protocolos descontínuo-alimentado para obtenção de ADC para as duas linhagens estudadas. como por exemplo. podendo ser alimentada ao biorreator sem diluição prévia. a obtenção de alta densidade celular pode ser alcançada com a condução do processo de forma descontínua alimentada (Schmidell. 6. grande disponibilidade e baixa custo. Yamane et al.89 6 Resultados e Discussão glicerol no meio de cultura. 1984). condição experimentada como modelo para confirmar a possibilidade de se obter cultivos a alta densidade celular para esta categoria de microrganismos. respectivamente. de tal forma que os efeitos de inibição pelo substrato ou. f) Pela hipótese (c). acrescido do coeficiente de morte. pretendia-se ao final dos ensaios. K2HPO4 e micronutrientes da solução de elementos traço já estavam em quantidade suficiente para sustentar o crescimento de 30 g/L.7H2O. NaCl. .Kd = µ max S S + Ks (5) b) Os valores paramétricos da equação foram estimados dos experimentos conduzidos em batelada. d) para o crescimento celular e que o substrato limitante S da equação 5 era o glicerol. quando necessário. dado pela equação 5: µ . lipoferum BR 17 e A. seguido de uma fase de alimentação a uma vazão constante. brasilense Sp 7. Para um volume útil de 10L. Levamos em consideração que as quantidades de Mg SO4. Fe (EDTA). esta concentração corresponde a cerca de 300 g de biomassa. Para o desenvolvimento deste protocolo em ADC assumimos as seguintes hipóteses: a) O crescimento microbiano se dava segundo a cinética de Monod (Schimidell. Assim. c) Considerou-se que o meio de cultura em ensaios em batelada estava balanceada. 2001). Kd. o meio de cultura concentrado foi obtido simplesmente pela multiplicação por 10 vezes das concentrações descritas do meio utilizado nos ensaios em batelada.90 6 Resultados e Discussão linhagens A. 30 g/L de biomassa. e) Como meta foi proposto a obtenção de concentração final de biomassa cerca de 10 vezes superior aos ensaios em batelada. 9. o meio de cultura para a fase do protocolo constituída pela operação descontínuo. Os valores de µmax e Yx/s foram retirados dos experimentos em batelada realizadas em biorreator da (Tabela 6. equação A. o tipo de condução do processo e suas condições iniciais. lipoferum BR 17 e A. lipoferum BR 17 Como se disse. brasilense Sp 7. foi composto segundo o descrito na tabela 6.7.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para linhagem A. Componente Glicerol (NH4)2 HPO4 Extrato de levedura CaCl2. Foi utilizado a cinética de Monod. foi utilizado o programa de computador ANABIO (Silva e Badino Jr.6). O valor de Ks foi estimado utilizando-se o programa ANABIO através de sua variação e visualização das curvas calculadas de X e G e sua comparação com os dados experimentais do ensaio . Tabela 6.91 6 Resultados e Discussão g) Assim.7.2H2O Água Massa (g) 500 132 100 2 2 litros 6. F. os valores dos parâmetros do modelo. dado um modelo matemático de crescimento celular.7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase descontínuaalimentada à vazão constante do protocolo de ADC para cultivo de A.alimentada que sucedeu à batelada inicial. o protocolo consistiu em conduzir o processo iniciando por uma batelada exatamente igual ao ensaios Azlp02 seguida de alimentação a vazão constante de meio de cultura concentrado composto por todos os nutrientes do meio descrito na tabela 6. Para estimar o valor da vazão de alimentação. 2003) que simula a cinética de crescimento microbiano. 0 0.0 1.0 2. como mostra a figura 6. X (g/L) 6.13.13 Crescimento de A.14: . para evitar possíveis efeitos inibitórios por substrato. O valor da vazão de alimentação F durante a fase descontínua-alimentada foi estimada levando-se em conta um perfil de concentração de glicerol que não excedesse 5 g/L.0 3.92 6 Resultados e Discussão Azlp02.0 0 X exp G exp 5 10 X simul G simul 15 tempo (h) Figura 6.0 5.0 4. ensaio Azlp02. lipoferum BR 17 em batelada. Os seguintes parâmetros foram utilizados na simulação do processo em ADC para A lipoferum e cujos resultados estão apresentados na figura 6. concentração inicial de biomassa na batelada: So: concentração inicial de glicerol na batelada: 0.13 g/L 5 g/L 0. .28 h-1 0.93 6 Resultados e Discussão Xo.48 g/L 30 h µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular Ks: constante de Monod Kd: coeficiente de morte celular: Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa T bat: tempo da batelada inicial: Se: concentração de glicerol na solução de alimentação Xe: concentração inicial do processo descontínuo alimentado T total: tempo total do ensaio: A vazão obtida pela simulação foi de 100 ml/h.0 h -1 0.5 g/L 0.47 g/g 13 h 250 e 300 g/L 2. 0 0 10 20 30 tempo (h) F (mL/h) 200.0 40 150.4 0.0 0.14 Resultados do protocolo a ADC para A lipoferum Br 17.5 0.1 0.2 0.3 0.0 20.0 1.0 0 10 20 X simul ( G=300 g/ L) 30 40 tempo (h) X exp X simul (G= 250 g/ L) G (g/L) 7.0 Fmédio = 102 mL/h 100.0 0 10 20 G simu (G=300 g/L) 30 40 tempo (h) G exp G simul (G=250 g/L) X (g/L) 0.0 15.0 2.0 5.0 0 10 20 30 40 50 tempo (h) Figura 6.6 0.0 0.94 6 Resultados e Discussão X (g/L) 30.0 6.0 4.0 3.0 10.0 5.0 0.0 25. .0 50. 95 6 Resultados e Discussão Tabela 6.7. Os valores de µmax e Yx/s foram retirados da tabela (valores de batch). para amostras em triplicata (Tabela 6. Tempo (h) 0 A.8 g/Lh. A concentração celular atingida em UFC também foi bastante elevada. O valor de Ks foi estimado utilizando-se o programa ANABIO através de sua variação e visualização das curvas simuladas de X e G e sua comparação com os dados experimentais do ensaio Azbr05. foi utilizado o modelo de Monod acrescido do coeficiente de morte celular. Desta forma.67x108 1.13x10 10 Nota-se que as curvas calculadas e experimentais mostraram tendência parecidas. estimou-se o valor inicial da vazão de alimentação utilizando-se o programa de computador ANABIO. 6.8). Kd. levando-nos a concluir que a metodologia usada para o proposição do protocolo em ADC foi adequada. . 300% superior ao obtido ao experimento em batelada. para a linhagem A brasilense Sp 7. superior a 1x 1010 UFC/mL. principalmente no que se refere ao glicerol.35x108 6. atingindo-se produtividade de cerca de 0. embora não conseguissem prever com exatidão os valores das concentrações experimentais. foi obtido cerca de 25 g/L em 30 h de fermentação.93x10 10 6.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum BR 17.01x10 10 1.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para linhagem A brasilense Sp 7 Da mesma maneira. lipoferum BR 17 0 0 28 28 28 UFC/mL 2. Neste caso.33x109 1. como mostra a figura C. Os seguintes parâmetros foram utilizados na simulação do processo a ADC para A brasilense e cujos resultados estão apresentados na figura 6.0 2.0 5.69 g/g 35 h 250 g/l 4 g/l 100 h µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular Ks: constante de Monod Kd: coeficiente de morte celular (quando a concentração de glicerol for ≤ 0.0 0 10 X simul 20 G exp 30 G simul 40 50 tempo (h) X exp Figura 6. embora .96 6 Resultados e Discussão X (g/L) 6.0001 g/L) Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa T bat: tempo da batelada inicial: Se: concentração de glicerol na solução de alimentação Xe: concentração inicial do processo descontínuo alimentado T total: tempo total do ensaio: A vazão obtida pela simulação foi de 50 ml/h.0 3. ensaio Azbr05.102 h-1 0. Da mesma forma como ocorrido anteriormente.15 Crescimento de A.0 1.16 h-1 0.16: Xo: concentração inicial de biomassa na batelada: So: concentração inicial de glicerol na batelada: 0.1 g/l 0.0 4.13 g/l 5 g/l 0.0 0. brasilense em batelada. a evolução da simulação e dos dados experimentais relativos às concentrações de biomassa e do substrato com o tempo. 97 6 Resultados e Discussão não tenham sido previstas com exatidão.9). A concentração celular atingida em UFC também foi bastante elevada. Pelo protocolo em ADC proposto foi obtido cerca de 25 g/L em 74 h de fermentação atingindo-se produtividade de cerca de 0.34 g/Lh. 200% superior ao obtido ao experimento em batelada. apresentaram tendências semelhantes. superior a 1x 1010 UFC/mL (Tabela 6. . 6 Fmédio = 69.7 mL/h 0.8 0.0 35.00 1.00 3.2 0.0 0.0 100.2 1.0 0 X exp 10 20 X simul 30 40 50 60 70 80 90 tempo (h) G (g/L) 6.00 0.0 25.00 2.00 5.4 0.0 60.0 20.0 80.00 4.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 tempo (h) Fmédio = 69.0 40.0 10.0 30.16 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7 .98 6 Resultados e Discussão X (g/L) 40.0 F (mL/h) 140.0 15.0 120.0 20.0 0.00 0 G exp 10 20 30 40 50 60 70 80 90 G simul tempo (h) N (g/L) 1.7 mL/h Figura 6.0 0 20 40 60 80 tempo (h) 100 160.0 5.0 0. 35x10 10 3.92x108 6.99 6 Resultados e Discussão Tabela 6. brasilense Sp 7 0 0 0 74 74 74 UFC/mL 2.00x108 3.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp 7. Tempo (h) A.33x108 8.29x109 1.27x10 10 . O fator de conversão de substrato em células (YX/S = 0.82 g/L). A. brasilense Sp7 com frutose como fonte de carbono foi mais rápido do que as demais. glicerol (2. lactato (2. observou-se crescimento celular significativo antes de completar 24 horas de ensaio. lipoferum BR17 foram: sacarose (2. 2) Para todas as fontes de carbono.20 h-1 quando utilizou-se caldo nutriente no crescimento do inóculo.19 g/L) e lactato (1..350 2) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. brasilense Sp7 1) O crescimento de A. glicerol (2. lipoferum foram sacarose e (NH4)2HPO4.54 g/g) e a produtividade (Px = 0. Conclusões Dos experimentos e análises realizadas neste trabalho.10 g/L).09 g/L) e etanol (1.7 Conclusões 142 7. obtendo-se µmax 0. as seguintes conclusões puderam ser obtidas: Ensaios em incubador rotativo A.82 g/L).h) nos cultivos com frutose foram superiores às obtidas com as demais. brasilense Sp 7 foram frutose (2. 3) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. .12 g/L.85 g/L). lipoferum Br 17 1) As fontes de carbono e nitrogênio que possibilitaram melhor desempenho no crescimento de A.21 g/L). as velocidades específicas máximas de crescimento em processo descontínuo foi 0. lipoferum BR17 2) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. YX/S = 0. A.03 g/L) e frutose (2. Px = 0. As produtividade foram respectivamente.67 g/L). Px = 0. etanol (3.04 g/L). brasilense Sp 7 foram glicerol (4. respectivamente. Px = 0.7 Conclusões 143 3) O consumo das fontes de nitrogênio e de carbono após a cessação do crescimento celular foi atribuido à manutenção celular 4) Houve associação entre a floculação e a formação de carotenóides para os cultivos.11 g/L. respectivamente. levando-se em consideração aspectos econômicos da aquisição das matérias-primas (custo e disponibilidade) bem como praticidade de preparação de meio de cultura visando .24 g/L.h . A.93 g/L). YX/S = 0.69 g/g. As produtividade foram respectivamente. Os fatores de conversão de substrato em células para estas fontes foram.57 g/g e YX/S = 0.60 g/g.60 g/g. brasilense Sp7 1) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. YX/S = 0. lipoferum BR 17 foram: glicerol (2.46 g/g. Ensaios de batelada em biorreator A.22 g/L. lipoferum BR17 1) Para uma definição com vista à utilização industrial.17 g/L. brasilense Sp7 e A.h.h e Px = 0. YX/S = 0.h e Px = 0. Os fatores de conversão de substrato em células para estas fontes foram.56 g/L) e sacarose (1.41 g/g e YX/S = 0.h.11 g/L. 2) Os valores dos parâmteros da equação de Monod foram os seguintes: A.0 provavelmente ocasionou limitação do crescimento celular. 2) A utilização do meio de cultura diferenciado no preparo do pré-inóculo foi um fator representativo para o crescimento dos microorganismos em biorreator e foram observadas variações para as bactérias e fontes de carbono testadas. para A.brasilense Sp 7. brasilens Sp 7. embora não tenha sido observado diauxia.1 g/l . a queda do pH abaixo de 5. acrescido do coefeiciente de morte Kd.6 g/L. µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular Ks: constante de Monod 0.9799) entre absorbância e biomassa 5) somente até concentração celular de 0. foi 3) atribuído ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato de levedura. 4) Nos cultivos em biorreator. a fonte de carbono glicerol pode ser uma alternativa para ambas as linhagens. O aumento da concentração de NH4+ no início dos cultivos em biorreator. após a qual floculação e produção de carotenóides produziram desvio desta relação.102 h-1 0. Ensaios em alta densidade celular (ADC) 1) Os resultados para ambas as linhagens foram modelados satisfaroriamente por uma cinética de crescimento segundo Monod . Houve uma correlação linear (r2 = 0.7 Conclusões 144 produção a alta densidade celular. 78g/L e em A.8 g/L. lipoferum BR 17 0. lipoferum foi de 23.0001 g/L) Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 0.28 h-1 0. atingindo-se valor muito próximo da concentração de biomassa pretendida que era de 30 g/L.87 g/L.. respectivamente.0 h-1 0. com produtividades.16 h-1 0.h e 0. a concentração final de biomassa atingida para A. 5) A metodologia usada para a proposição do protocolo em ADC foi adequada. de 0. brasilense foi de 24. . 6) Glicerol é uma fonte de carbono conveniente para o cultivo de Azospirilla em alta densidade celular.h Os valores de UFC foram superiores a 1x1010 /mL para ambas as linhagens.47 g/g µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular Ks: constante de Monod Kd: coeficiente de morte celular: Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 3) Nos experimentos em sistema descontínuo alimentado.5 g/L 0.34 g/L.7 Conclusões 145 Kd: coeficiente de morte celular (quando a concentração de glicerol for ≤ 0. 4) cerca de 10 vezes superiores aos ensaios em batelada conduzidos em incubador rotativo.69 g/g A. C. The ecology and biogeography of microorganisms on plant surfaces. H. J. H. Amann.117-137. 1013-1019.. L.57-93.. J. M. Saridakis.. Washington. Araújo. L. Escola superior de agricultura “Luiz de Queiroz” – Universidade de São Paulo – Tese de Doutorado. Lawrence. & Hartmann. J. cap. V.4. P. Jaguariúna: EMBRAPA-Meio ambiente.8 Referências Bibliográficas 104 8. Importância dosmicrorganismos endofíticos no controle de insetos. Barroso. Referências Bibliográficas Andrews. p. Azevedo. W. 131p. Azevedo . Jaguariúna: EMBRAPA-Meio Ambiente. Microrganismos endofíticos. J. I. L. L. I.47.. L. W. 2001.. O..145–180. G. F. R. In: Melo. Canadian Journal of Microbiology. 1995. Maccheroni Jr. Gerritsen. Araújo. p. R. Variability and interactions between endophytic bactéria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. 2000ª. S.. v. Applied and Environmental Microbiology. (Ed. Assmus. I. Hutzler. J.. L. P.) Controle Biológico. Barbour.) Ecologia Microbiana. & R.229-236. p. J. Azevedo. 38. 2000. Azevedo.. (Ed.. vol. W.. Harris. agente causal da clorose variegada dos citros (CVC). W. p. S. L. J. Maccheroni-Jr. Annual Review of Phytopathology. J.. B. In: Melo. rRNA-targed oligonucleotide probes andscanning confocallaser microscopy. v. A comunidade bacteriana endofítica de citros e sua interação com Xilella fastidiosa. Kirchhof. p. 1998a. Cap. Aguilar-Vildoso... A. 61. Azevedo. L. 2000.3. W. Araújo. A. “In situ” localization of Azospirillum brasilense in the rhizosphere of wheat with fluorescentily laballed. . T. D. O. Soil Biology and Biochemistry. Baldani. Berlin.. Ottawa. 4. J.. D. Caruso. R. R.8. I. D. Canadian Journal of Microbiology. Pereira. v. Baldani. W. p. Caruso. Recent advances in biological nitrogen fixation with non-legume plants. J. 1980. 6-9 november. 37-40. I. Maccheroni Jr. Goi. v.. 3. 1987. 316p.5/6. L. 1997a. D & Döbereiner. Baldani. Recent advances in BNF with non-legume plants. Flechten und Myxomyceten.. L.3. Barrios. p. J. L. Buenos Aires. 1996a. V. J. 1983. .. Eletronic Journal of Biotechnology.8 Referências Bibliográficas 105 Azevedo. Rodrigues.29. & Damilano. . Oxford. Döbereiner. Goi. Baldani.(no prelo). 1984. S.. 12. Baldani. v. 1866. Endophytic microrganisms: a review on insect control and recent advences on tropical plants. S.. v. I. in Brazil . D. In: Congreso Nacional De Maiz. L.. Soil Biology ang biochemistry. http://www. L. Host plant specificity in the infection of cereals with azospirillum spp. Proceedings. I. J.. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen in wheat. A. J.. W.. v. V. J. L. Bary. n. V. Araújo. L. E.. & Döbereiner.Caceres. Biology and Fertility of Soils.Baldani. L. Baldani. Baldani.ejb. V. J. A. n. Morphologie und physiologie der Pilze. 2000b. J. and Döbereiner. V. Soil Biology and Biochemistry. J.433-439. p. Baldani.. Leipzig: Engelamn.869-881. p. L. Döbereiner. Pergamino.org/content/vol3/issuel/full/3/4 (05/05/2000). J. S. 911-922. Inocukation of field-grown wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum ssp.29.. Respuesta del maiz a la inoculación com Azospirillum spp. 317-335. Nutr. B. Tecnologia para arros de terras altas. 890 p. J. 1992. Y. A.. K. and Robert. Surampalli. Willians. . W. R. An evaluation of recent proposals. 1998. D. p. Plant and Soil. D. R. J.. Dickie. 1984.8 Referências Bibliográficas 106 Bell. Martinko. p. Burris. J. K. Microbiologia. 125. Italy: A position paper.1-11. 13. BIOLOGICAL nitrogen fixation: the global challenge & future needs. T. Biological nitrogen fixation. Siddiqi. C. T. 83p. T. M. Parker.. Prentice-Hall International.. Madigan. D. México. F. Biological nitrogen fixation for sustainable agriculture: a perspective.. J. Y. Harvey. Bouchard.. J. M. Brock. Journal of the American Water Association.. L.A. 523-526. G.Stone. Smith. Plant Phisiology. W. 1994. H. Ladha. discussed at The Conference Centre.. v. M. p. Nitrate contamination of ground water: sources and potencial health effects. F. Inc. G. Rockefeller Foundation Bellagio Bohlool. D. Prentice Hall Hispanoamericana. Canadian Journal of Microbiology.46-53. Lake Como. L.. 1997.. Glass. Brock. D... 84.. p. 1992. D.. Rockville. F. Biology of Microorganisms. S.. Britto. Garrity. 2001. Kronzucker... T. v. M. T. W. 41. 141(1-2). 1993. Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arros e Feijão. M. Cytosolic concentration and transmembrane fluxes of NH4+/NH3. George. New York. Madigan.. Annu..B. D. P. Y. A.. P. v. 161p. 1995. Endophytic bacteria in grapevine.. Breseghello. R. G. Rev. M. T. 85-90. C. Chan.H. 909 p. Del Gallo. 57. 2001. Augustus. J. p. K. S.). New Delhi. M. São Paulo: Ed. C. (Ed.249-257.57-75. Canadian Journal of Microbiology. M.1994. Fermentação descontínua alimentada. Facciotti. p. A. Effect of Yeast Extract..8 Referências Bibliográficas 107 Caballero-Mellado. Field inoculation of wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum brassilense Ander temperature climat. p.A. A. M. Symbiosis. Y. R. Biotecnologia Industrial. jul/set. 3006-3012. Engenharia Bioquímica. Vol 2. and Van Veen. A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugar-cane. Plant and Soil. Applied and Environmental Microbiology. 1991. Dordrecht. A. Okon. v. v. & Schmidell.13. 1992. . p. Rehovot. The rhizospheres and Azospirillum. Das.. J.V. Editora Edgard. W. & Mishra. São Paulo.. p. v. 413p.1213-1217. A. 1982. C. M.108. n. C. A.. M. In: Schmidell et al. I. Sato. 243-253.1. J.1987. Azospirillum/ plant associations. Manual global de ecologia: O que vocÊ pode fazer a respeito da crise do meio ambiente. ed. p. 1983. Revista de Microbiologia. K. 2002. J. Casamino Acids. Das. 20(10).23-31.Excreting Azospirillum brasilense mutants enhance the nitrogen supply of a wheat host. Influência de micronutrientes e de extrato de levedura no crescimento de Azospirillum brasilense em incubador rotativo. Carcano-Montiel. J. Cavalcante. M. & Mishra.751-755. NH4+ .. Christiansen-Weniger. A. Döbereiner. Utilization of fructose by Azospirillum brasilense.. C. & Mascarua-Esparza. Peptone & various L-Aminoacids on Growth & Acetiline Reduction in Azospirillum brasilense. v. 1988. H. 29. v.18(3). Boca Raton:CRC Press. Corson. Fendrik. v. p. Dias. W. S. Indian Journal of Experimental Biology. Carvalho. uma bactéria fixadora de nitrogênio na rizosfera de Paspalum. J. P. 518-538. In: FENDRIK. (Ed. C. Nitrogen fixation. J. Ruschel. Applied Biochemical and Biotechnology (aceito para publicação). Döbereiner. 5761.. Diniz. J. M. Journal of Experimental agicultural. M... J.. Pradella. Rio de Janeiro.E. Revista de Biologia. . In: NEWTON. NYMAN. E. G. J. Day. Pesquisa Agropecuária Brasileira. v. p. Day.2. proceedings of the 1st International Symposium on Nitrogen Fixation.. S. Gomez.. 1988. Associative symbioses in tropical grasses: characterization of microorganisms and nitrogen-fixing sites. J. p.. S. ed. Azotobacter paspali sp. Döbereiner. S. p. E. A. Döbereiner.. 1994.. DEL GALLO. K. C. W.169187. I.261-272. Newton. Del Gallo. 1995. G. J. J. Uma nova espécie de Beijerinkia. J. Nyman. & Rodrigues-Caceres. C. ED. Taciro. Endophytic bacteria: their possible role in the host plants. M. Buenos Aires.. High-cell-density cultivation of Pseudomonas putida IPT-046 and medium-chain-length polyhydroxyalkanoate production from sugar cane carbohydrates.. DE ZAMAROCZY. Cultivo de Azospirillum brasilense sp 245 em frutose ou glicerol como fontes de carbono para produção de inoculantes agrícolas. C.. 2004. VANDERLEYDEN.) Azospirilum VI and related microrganisms. V. J. .. Response of Setaria itálica to inoculation with Azospirillum spp. Associative symbioses in tropical grasses: Cha of microorganisms and dinitrogen-fixing sites. W.8 Referências Bibliográficas 108 Dias. 357-365. 1966.1. C. p. 1958. Pullman: Washington State University. p. Döbereiner. Di Fiore. M.1. Berlin: Springer-Verlag.. J. DiCiocco. C. A. v. M. Escola Politécnica da USP – Tese de Doutorado. C.J. 1975. M. M. n. M. J. J. E.154. Bases científicas para uma agricultura biológica.. P. J. p. v.. Döbereiner.44..7. ed. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop plants..8 Referências Bibliográficas 109 Proceedings of the First International Symposium on Nitrogen Fixation. 155p. J... Ottawa. W. De. TRIPPER.-H. J. Pedrosa. O.22. Nitrogen-fixing bacteria in nonleguminous crop plants. O. eds. J. Emerging technology based on biological nitrogen fixation by associative N2 – fixing organisms.469-483. J. I. p.. A. I. Döbereiner. Diazotrophic rhizocoenoses. Madion: Science Tech Publishers. 1980.. Gallon..G. Biological nitrogen fixation technology for tropical agriculture. p. Döbereiner. In: BALOWS. 1991. R. New York: Springer-Verlag. P. DWORKIN. S. The prokaryotes. M. Pulmann: Washington State University Press.1464-1473.. ed. F. v. 1982.517-538. Marriel. 1976. 1992. Pedrosa. SCHLEIDER. Graham. .Polli. Ciência e Cultura. Baldani. Döbereiner. H. Nery. São Paulo.. p. J. London: Academic Press. 1987. HARDER. p. Stewart D. Ciência e Cultura.. Madison: Springer-Verlag. Cali: Centro Internacional de Agricultura tropical. Döbereiner. Recents changes in concepts of plant bactéria interactions: endophytic N2 fixing bacteria. Döbereiner.2236-2253. H. C. H. J. F. 310-313. J. 1982a. K. Harris.869-881. p.. Döbereiner.34.. p. Döbereiner.Nitrogen fixation. The Genus Azospirillum and Herbaspirillum. Ecological distribution of Spirillum lipoferum Beijerinck.. 2 ed. v.301-334. 1987.10. n. p. 1976. Canadian Journal of Microbiology. M. K. A. J.. v.. M. G.42. Soil Biol. & Safwar.2804-2810. O. A. Kluwer Academic Publishers. Evans. R. 17-26. Stoffels. K. Nitrogen fixation withnon-legumes. V. Boddey. R. B. Effect of Azosprillum inoculation on growth and N2 fixation of maize subjeced to different levelsof FYM using 15 N-dilution technique. 1998.8 Referências Bibliográficas 110 Döbereiner. H. In: Okon. 2000. Leslie. Urquiaga. & Khalid. J. Döbereiner. p. Eckert. v. ed. Biological Nitrogen Fixation. Applied and Environmental Microbiology.. M. p. Thomson. New York: Chapman and Hall. EVANS.. Biochem. Dordrecht. Y. A. El-Komy. 2001. Biological nitrogen fixation in the tropics: social and economic contributions. p. B.. T... G. 60p.. J. H. A. L. No.H. Baldani. In: STACEY.. A. eds. 87-109. D. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas.. I. Boca Raton.. J. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.J eds. M. Downing. Azospirillum/plant associations. J.1-42. A. . p.. nov. Itaguaí: Embrapa-CNPAB.. M.339-346.66. J.29. 49-59. Kirchhof. 1994. p. Alternatives for nitrogen of crops in tropical agriculture. Burris. a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus. Weber.. BURRIS. p.5/6. G.. p.771-774. M. CRC Press. S. v. Moharram. Hartmann.. Biocontrol of the sugarcane borer Eldana saccharina by expression of the Bacillus thuringiensis cry1Ac7 and Serratia marcescens chiA genes in sugarcane-associated bacteria. 51. H.. R. Mirza. Fertilizer Research. Baldani. J. M. v. Highlights in Biological Nitrogen Fixation during the last 50 years. Azospirillum inoculants and field experiments. 1995. Halbritter. 1992. Döbereiner. M. Fages. 1995. 1997. Azospirillum doebereinerae sp. H. S. A. J.. S. In: Malik. p. p. Forage. S. number of rhizosphere bacteria and timing of inoculation.usp. Y. Okon. Döbereiner. Fallik. Consultado em 27/06/2006. The distribution endophytes in maize (Zea mays L. Oxford. A. 155-163.251-280.. The response of maize (Zea mays) to Azospirillum inoculation in various types of soil in the field. M. R.. Absorção e metabolismo de nitrogênio em plantas. Effect of Environmental on Microbial Activity. M. Fernades. E.1. Oxford.1.8 Referências Bibliográficas 111 Fallik. E. and Fisher. v. P. 71-76. 122. Scott. P. H. Freitas. P.). 1992. 12. Fixação Biológica e assimilação de nitrogênio.. p. Disponível em: http://www. v. P. Fisher.. Petrini. E.ib. ed. p. F. Efeitos de fontes e níveis denitrogênio sobre a absorção e assimilação de N em arroz. L. World Journal of Microbiology. M. 50P. v. 1990. In MOO YOUNG. O..2. L.) Comprehensive Biotechnology. (UFRRJ. p. 511-515. M. G. Itaguaí: UFRRJ. Associative N2 fixation. strains in the metabolism of nitrogen in Sorghum vulgare. M. p. & Okon. J. J. RUCHEL.br. Pereira. Growth response of maize roots to Azospirillum inoculation: effect of soil organic matter content. Effect of organic matter and Azospirillum spp. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal. 299-305.45-49. Boca Raton: CRC Press. 1981. Soil Biology and Biochemistry. 1985. S. J. .1. D. M. 1988. 1996. v.1). A. Londrina. B. . & Pitt. NewPhytologist. In: VOSE. Y. Harrison.. A. n. (ed.. v.. D. 1978. J. Fernandes. Boletim Tácnico. v. Pergamon Press. 20. W. p. Canadian Journal of . Sundman. E.448. J. 1981. 20th ed. American Water Works Association. Washinngton. P. M. W.Water Environment Federation. v. and epiphyte.). W. S.) 1998. and Kloepper. Y. p. R. K. Lammers. Bacteriol. H. Microbiology and Molecular Biology Reviews.8 Referências Bibliográficas 112 Franson. 1984. J. Fructose catabolism in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum. W. v.41. Zimmer. Azospirillum/plant associations. 159. Gupta.485-490. Microbiology. p. .V. C. A. Dordrecht: Martinus Nijhoff. J.W. 1994. J.. Nitrogen fixation research progress. (ED. NEWTON. T.J. Quadt-Hallmann. 64... Root-associated N2 fixation (acetylene reduction) by Enterobacteriaceae and Azospirillum strains in cold climate spodosols. Applied and Environmental Microbiology.. and Krieg. v. (Ed... Hartmann. S. Haselkorn. Haahtela. 43:1997b. J. D.F. N. M. p.2000. Bactéria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae – a pathogen.1.. Mulligan. 86-92.J. and Ghosh. Boca Raton: CRC Press.. Physiology of Azospirillum.. p.. S. Waartiovaara.D. P. BOTTOMLEY. K. Journal of Bacteriology. J. Golden.203-206. Skujins. Organization of the genes for nitrogen fixation in the cyanobacterium Anabaena. Mahaffee. Identification of a phosphoenolpyruvate: fructose-1phosphotransferase systenm in Azospirillum brasilense. p. H. 624-653. E.. Bacterial endophytes in agricultural crops. 1998 Goebel. A. R. Hupper.E. Hallmann. M.15-39. 1984. n. ice nucleous. In: OKON. Standard methods for the examination of water and wastewater. In: EVANS. American Public Health Association. A. Hirano. 1985. 160:12041206.. cv. To appear in the Proceedings of the 1st International Workshop on Mobile Agents.. 84. P. M. Morris. a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil. Levantamento Sistemático da Produção Agrícola. E.. D. M. Y. E. P.. Flavone limitations to root nodulation and symbiotic nitrogen fixation in alfalfa. v.. p. Paris. Research Microbiology. Inoculation on root development and NO3uptake in wheat (Triticim aestivum.63. Azospirillum irakense sp.. Y. v. Kapulnik. A. B. 2001. A review of issues related to the quantification of bacteria from the phyllosphere... C. In: Schmidell et al.. Khammas.679-693. 2004. Vol 2. R. p. 627-631. 1–14. Grimont. 18: p. Berlin. M. Okon. 1985. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.140. Brasil. C. G.93 – 122.gov. v. P. Germany. Rockville. Plant Physiology. Kapulnik. Canadian Journal of Botany.) Fisiologia vegetal. Kaiser. & Phillips. 1987. Mobile agentsSmart messages. Área confronto das safras 2004 e das estimativas para 2005. 1989. Kerbauy. Jacques. Outubro 2005. 452 p. Ageron. Gafni. A. Miriam) in hydrofonic systems. Effect of Azospirillum spp. v.8 Referências Bibliográficas 113 Hiss. Hurst . Engenharia Bioquímica. Cunningham and F Somers. H.br. Y. http://www. Biotecnologia Industrial. FEMS Microbiology Ecology. (Org. A. April 1997. nov. Joseph. IBGE (2005). Editora Edgard Blücher Ltda. . L. Cinética de Processos Fermentativos. 1995.1193-1196. p.ibge. D. K. L. M. Kecskés. 1983. Plant Soil. A. C.). p. T.460161. Baldani J.. N... Splittstoesser. physiological and molecular analysis of endophytic diazotrophic bacteria in gramineous energy plants. I. Reis. Ed. 1997b. v. and Döbereiner. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes. 2004. Holt (ed.. G. p. The Williams & Wilkins Co. 1997.C.. S. Schloter M. Hortscience.. v. S. Kennedy..S. Soil Biol Bioch 29: 853–862. J. Samson Isou. J. G. Fort Collins. Rees D. vol..Baltimore. R. Non-symbiotic bacterial diazotrophs in crop-farming systems: can their potential for plant growth promotion de better exploited? Soil Biology & Biochemistry. M. Bergey's manual of systematic bacteriology. Sarvier. J. Baldani. A. São Paulo. B. and Hartmann.. & Hartmann..N. In N. I.M. 1. Nitrogenase and biological nitrogen fixation.8 Referências Bibliográficas 114 Kim J. B. 1994..E. Kirchof. Kirchhof G. 194:45-55. Drip irrigation and tomato yield under tropical conditions. I. 2001. R.. Choudhury. Princípios de Bioquímica.S. M. 33. Lehninger.. Occurrence. M. R. Biochemistry. V. 1997a.. Krieg and J. W... A. Eckert. 2002. p.18. Int J Syst Evol Microbiol 1:157-168. 1984. Reis V. 36: 1229-1244.389–397. a new nitrogen-fixing bacterial species that occurs in C4-fibre plants.. Herbaspirillum frisingense sp. Eckert. Hubbel. A. Krieg. Kirchhof. nov.. Döbereiner.94-104. Stoffels. M. A. Aßmus B and Hartmann A. J. . G. Genus Azospirillum. Lin. B. J. Science.365367.55. Magalhães. D. F. Döbereiner. E. 117. M.. v. Anais da Academia Brasileira de Ciências. C. Endophytic bacteria and their potential applications. p. 2002. Reseeding the green revolution.. 91p. Rio de Janeiro..39. Levanony. E. M. A. B.1038-1043. 277. Mezgeay. Ultrastructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and whitin wheat root by immunogold labelling. Vangronsveld. Souto. Taghavi. Estresse Ambiental: o milho em perspectiva. 2002.. Mann.. S... 1997. R. p. p. v... p... Döbereiner. Baldani. Vander Lelie. D. & Klein. 207-218. J. R. and G. Patriquin.. R. v. Madison. Lodewyckx. Influence of immigration in establishing epiphytic bacterial populations on navel orange. E. Romano. A new acid-tolerant Azospirillum species. I. v.8 Referências Bibliográficas 115 Lindow. F. Magalhães.417-430. 47p. 1996. Dordrecht. Rio de Janeiro. . Machado. 1991. F. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. p. 1979. 62. S. p. T. M.. Bashan. C.583-606. Applied Environmental Microbiology. H.. A. v. M.. S. J. M. J. 2978–2987. 1983. 1989.4.. Isolamento e caracterização genética de actinomicetos endofíticos de Citrus spp. Infection of field grown maize with Azospirillum spp. J.. Magnavaca. Plant soil. vol. n. Rio de Janeiro: AS-PTA. Revista Brasileira de Biologia. J. Y. e interação com Xylella fastidiosa. Moore. Andersen. Porteous. Critical Reviews in Plant Sciences. Kuykendall. São Paulo. Marcon.21. J. Latch. 1995b. S. H. and J. R. McInroy.. p. R. Lollium perenne.. 159:8085. D. 1248-1254. W. 1977. R. 98: 87-93. M. Molecular General Genetics.8 Referências Bibliográficas 116 Martinez-Drets. Scott. Nelson. Journal of Bacteriology. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn. and . J.. p. n. v. Y. M. Burpee. Albrech. 1152p. J Gen Microbiol.337–342. P. Ottawa. M. S. & Knpwles. H. Murray. G. v.. McInroy. Nelson. v. Houchins . H. Surrogate transformation of perennial ryegrass. W. A. A. R.. L. Albrecht. Okon. Cox. J. 1395-1403. Journal of Bacteriology. New York: Wrth Publishes.337-342. Catabolism of carbohydrates and organic acids by the azospirilla. R.24(11). Kloepper.L. M. Okon. and Burris.. p. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn. 2000.. 1984. . v. Dordrecht. B. Lehninger priciples of biochemistry.2. Plant and Soil. Canadian Journal of Microbiology. using genetically modified Acremonium endophyte. 1978. 173. 1992. 127.173. C. J. W. J. D. Kloepper. L. Effect of oxygen and nitrate on nitrogen fixation and denitrification by Azospirillum brasilense grown in continues culture.23.. 1976a. p.1-9. F.Burris. M. Y.. C. Burris. p. Growth of Spirillum lipoferum at constant partial pressures of oxygen and the properties of its nitrogenase in cell-free extracts. Delallo. Factors affecting growth and nitrogen fixation of Spirillum lipoferum. L. v. G. L.. Plant Soil.. 1995a. Reis. Rio de Janeiro. Paula. T. Stuttgard. E. Paredes-Cardona. Weinhard. p. N. & Döbereiner. v. p. v. J. 1994. 1989.. S. Light microscopy observations of tetrazoliumreducing bactéria in the endorhizosphere os maize and oyher grasses in Brazil. n.. Patriquin..24.. S.9.8 Referências Bibliográficas 117 Okon. Field inoculation of rice with in vitro selectedplant/growth promoting-rhizobacteria. Paris. J. Falik. Sarig. p.. .) and sweet sorghum (Sorghum vulgare). Berlin.. Omar.111-115. M. & Balandreau. 741-748. G. Agronomic application of Azospirillum: An evaluation of 20 years worldwide field incubation. v. V . J. E.. Agronomic. F. & Tal. Oxford. Morphology and Physiology of Roots Inoculated with Azospirillum. Interactions of Glomus clarum with Acetobacter diazotrophicus in infection of roots and tops of sweet potato (Ipomea batatas) sugar cane (Saccharum sp. & Newton. D. In: Bothe. Sarig.M.11.. M . Labandera-Gonzalez.. Carcano-Montiel. & Tal. Yahalom. 1988.. Y. In: International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. E. Avstract.. Ottawa.26. W. p. E. S. México. p.. P. M.84. Mascarua-Esparza. v. 1987. v. 351-355. p. Okon. Heulin. Revista latinoamericana de microbiologia. 30. Y. 803-808. E. R.. 1978. Plant growth promoting effects of Azospirillum.1591-1601. J. Debruijn.12. E. Gustav Fischer. Döbereiner. Respuesta del maiz ala inoculación com Azospirillum brasilense. C. Y. M. Biology and Fertility of Soils. 1991.. Nitrogen fixation: hundred years after.. 734-742. J. Soil Biology and Biochemistry... p. Hadas. N. Okon. S. aug. Alaa-el-din. 1988. Falik. H. eds. & CaballeroMellado. Yahalom.. Canadian Journal of Microbiology.A. N. Cambridge: Cambridge University Press. Dordrecht.354-361.29. S. Ouinguene. M.K.187.. T. Döbereiner. L. In: Andrews JH.. D. 62-76. Berges.. Azevedo.G.39.. J. 179-197. Postgate.29.1. v. Canadian Journal of Microbiology.43.8 Referências Bibliográficas 118 Patriquin.13-39. Nowak. Fungal endophytes of tree leaves. J.. Penot. Ottawa. Innoculum density. P. Craswell. p. Biological nitrogen fixation. . Madison. 1997. Pillay. Canadian Journal of Microbiology. p. 1983..) seedlings inoculated with a pseudomonas bacterium.141. C & Fages. expectations and actual contributions to agriculture. v. D. Pimental. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses. 1983. Jain. Canadian Journal of Microbiology. R. D. p. Biotecnologia e Desenvolvimento.900915.. B. E. p. W. Berlin. 2002. p. p. Araújo.1991. A. n. T. Characterization of Azospirillum associated with maize (Zea mays) in France. J. V.. 252 p. Science. The fundamental of nitrogen fixation. Petrini O. Germany: Springer Verlag. 561-1975.798-803. Microrganismos endofíticos: interação com plantas e potencial biotecnológico. Peixoto Neto. 1992. Peoples. L. p. Microbial ecology of leaves.. investments. eds. v. and genotypes colonization of tomato (Lycopersicon esculentum L. Food production and energy crisis: A comment. 1992. 1975. temperature. Hirano SS. K. v. using biochemical tests and plasmid profiles. Plant and Soil. J. v. v. J. K.43.). (Coord. J. Biotecnologia Industrial.577582. E. Rao.. V.W. n..43. I. Associative symbiosis of Azospirillum lipoferum with dicotyledonous succulent plants of the indian desert. Kersters. v.37. Aquarone. Baltimore.. São Paulo: Edgard Blücher. Fendrik. v. Andhra Pradesh.28. p. Close association of Azospirillum and diazotrofic rods with different root zone of Kallar grass.. Produção de inoculantes Agrícolas. Canadian Journal of Microbiology. Benhamou.520-526. 1986. Azospirillum halopraeferens sp. p. 1986. p. Hallmann.778-782.W. N. Hurek. Washington. Cereal nitrogen fixation. p.. n. B. Oliveira.. T. In: Lima. P.254-259. Quadt-Hallmann. 279-305. 1997b. 1987.. S. Kloepper. Canadian Journal of Microbiology. Fendrik. Urenha. Applied and Environmental Microbiology. Canadian Journal of Microbiology.. p. U. J. M. B. A... C.43-51. Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant. Vankateswarlu. M.8 Referências Bibliográficas 119 Pradella. 1997a. Kloeper. S. J. v. Pot. A... Schimidell. p. 2001. G.. n. 1982. v. Borzani.. P. Ed.. N. Proccedings of the working Group Meeting Held at ICRISAT. Thielemans.. S.. De Ley.3. Reinhold. W. J. In: WANI. International Journal of Systematic Bacteriology. Gillis. E. G. Quadt-Hallmann.7. v. A.. B.. Nieman. C.23-35. T. v. I.3. L. A. B.1. S. Bacterial endophytes in cotton: localization and interaction with other plant-associated bacteria. a nitrogenfixing organism associated with roots of Kallar grass (Leptochloa fusca (L. J. S. Hurek. . Reinhould.52.. ICRISAT. W. Ottawa..)Kunth). nov. Cereal nitrogen fixation research under the BNF coordinated project of the ICAR. Rao. .. Dinitrogen-fixing bacteria: computer assisted identification of soil isolates. Rodrigue-Caceres. J. 2003a. p.. ed. Canadian Journal of Microbiology.. Técnicas utilizadas na qualificação da fixação biológica de nitrogênio. Döbereiner. Reinhold-Hurek. 26p. 7-21. v. H. U. T. Hurek. Reiter. B.. v. v. B. n. Atrosptica.. D. R. v.67-69.26. p. L. G. Alves.. E. 1998b. E. 1998. & Parada.. S. in plants with C4 photosyntetic pathway. In: VOSE. Interaction of gramineous plants with Azoarcus spp and other diazotrophs: identification. 1980. Urquiaga. p. M.8 Referências Bibliográficas 120 Reinhold Hurek. C. 17. and T. 2002. p. B. J..29–39. A.. Ottawa. Specificity of infection by Azospirillum spp. R. Gonzales-Anta. R.1275-1283. p. C. A. Biology and Fertility of soils. J. 1994.. J. Boddey.. localization.. P. Resende. R. (1998b) Life in grasses: diazotrophic endophytes. Sessitsch.. I.. Associative N2 fixation. . S. Arid Soil Research and Rehabilitation. M.. R. S. Seropédica: Embrapa Agrobiologia. J. and perspectives to study their function. B. R. v.11.. Azospirillum brasilense and Bacillus polymyxa inoculation in yield response on field grown wheat in an Argentine semiaridregion. A.. B. M. Use og green manures in incresing inputs of biologically fixed nitrogen to sugar cane. Di Ciocco.68. Rushel. P. R. Arizona. Critical Reviews in Plant Sciences. Urquiaga. Rennie. A. Rocha. p. P. J. 37. Schwab. Boddey. Alves.139–144. Berlim. B. 215-220. S. and Hurek. M. Boca ration: CRC Press. v. Applied and Environmental Microbiology. Trends Microbiology. Baldani.22612268.. 1981. A. Pfeifer. Response of endophytic bacterial communities in potato plants to infection with Erwinia carotovorasbsp. J. p.. R. Resende. 2003b. Quesada. J. 1998. Xavier. Lopez. 6. PachecoBasirco.. 22. . Aquarone. 2469-2475. Mihoc. UFSCAR. A. v. 29. Döbereiner. M. Kirchhof. Heinzmann.8 Referências Bibliográficas 121 Sabaratnam. syringae B728a and Pantoea agglomerans BRT98 in epiphytic and endophytic colonization of leaves. v. Selection of specific endophyticbacterial genotypes by plants in response to doil contamination. p. Washington. p. Shishido. S.163(2). G . W.. G. Sancar. Fortin. P. Sly. 1985. Applied Environmental Microbiology. nov.. & Hartmann. Cairo. Beaumier. The American University.H. Schmidell. v. Wisse. C. volume 2. U. 69.. K. A. p. C. to accommodate Conglomeromonas largomobilis subsp. Engenharia Bioquímica – Coleção Biotecnologia Industrial..P. L.191196. G. FEMS Microbiology Ecology. Differences between Pseudomonas syringae pv. p.. A. Anabio 1. Sadasivan. Ouellette. A. In Hegazi.. Lee. Borzani. L.. Edgard Blücher Ltda. Journal of Bacteriology. 1994. 716-723. 2001. 1999. N. M. 2003. C. EDS. p.0: um programa para análise de biorreatores. 2003..A. L. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: Exopolysaccharides and Cyst Formation. Immunological studies of the wheat-root-colonization by the Azospirillum brasilense strains Sp 7 and Sp 245 using strains-specific monoclonal antibodies. M. W.. R.. Bachino Jr. & Chanway. K. N. C. G. Nitrogen fixation non-legumes. Greer. F.. Schloter. v...67. S. Silva. D. Fayez. Endophytic colonization of spruce by plant growth-promoting rhizobacteria. parooensis following the . nov.. G. Banks. J. S. Roy. Departamento de Engenharia Química. Breuil. W.. M. and Smith Applied Environmental Microbiology. Whyte. E. A.. Description of Skermanella parooensis gen. Schwab. & Neyra. L... Almeida. C. sp. Labelle. E..291-297. 1220–1228. Ed. and Beattie. U. M.. D. D. & Stackebrandt.. 2001. & Monib. Siciliano. Pergamon Press. v. v. Principles of fermentation Technology. R. J.. Sturz. Plant growth regulators and amino acids released by Azospirillum sp. J.. 2000. & Whitaker. S. 1016-1024.. Ladha. Malarvithi. W. I. Diem. p. M. G. R. v. 1978. B. Nov. T. So. J. A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group with description a new genus. J. J. V. Sprent. Christie.. H. Bruijin. R. A.1-30. nov. & Hubbell. H. B. Letters in Applied Microbiology.541±544. 37. R. Stanbury. . A. and Barbosa. P. Nowak.967-980. Azospirillum gen. Bacterial endophyttes: potential role in developing sustainable systems of crop production. P. P. nov. 1997. J. p.174–178. largomobilis to the genus Azospirillum. D. H..S.19. Handro. 1984. 1990.194. E.. N. Galkins. 1999. Floh. H..). Tien. J. Thuler. I. 1979. Applied Environmental Microbiology.J. Krieg. Stoltzfus. v.37.8. M. p. Ottawa. Nitrogen fixing organisms – pure and applied aspects. F. v. Tarrand. Oxford. Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. F. K.25-36. Sprent.. Isolation of endophytic bacteria from rice and assessment of their potential for supplying rice with biologically fixed nitrogen. Critical Sciences.. Canadian Journal of Microbiology. p. 2003.. n. and two species. London: Chapman and Hall. in chemically defined media.24. p. Plant and Soil. Döbereiner. R. P. International Journal of Systematic Bacteriology. Plant-growth substances produced by Acospirillum brasilense and their effect on growth of pearl millet (Pennisetum americanum L. Ottawa.. p. v.8 Referências Bibliográficas 122 transfer of Conglomeromonas largomobilis subsp. and Azospirillum brasilense sp. D. 256p..49. 2000a Umali. DF: EMBRAPAC-CPAC. Fangcham. v. A.219-226. O. Yield maximization of feed grain by associative N2-fixing bacteria. Madson.. Cap. Microbiol. 37. M. 193-201. v. J. Agronomy Journal. 1216. Crit. F. A.Garcia. H. p.8 Referências Bibliográficas 123 Traore. de C. M. may. M. P. Van Loon. The genetics of the Azospirillum-plant root association. Physiology of Nitrogen Fixation in Azospirillum lipoferum Br 17 (ATCC 29709). Siripin. Vasuvat. Volpon. 1980. Brasília. v. DF.. p. De Oliveira. Biologia dos solos dos cerrados. Y. Association of Azospirillum with grass roots. 863-869. G. M. 1999. A. P. J.. Bankok. p. J.. In:PROCEEDINGSOF ANINTERNATIONAL SEMINAR ON YIELD MAXIMIZATIONOF FEED GRAINS THROUGH SOIL AND FERTILIZER MANAGEMENT. J. 1981. p.. 492. C. 1997.. J. T. . M.. v. Gaskins. Bendassoli.C. W.. 1995. Hungria. H. Microbiological processes: In: Environmental Chemistry.. Thailand. & Dazzo. J. G. 1986. Planaltina. Trivelin. S. Pesquisa Agropecuária Brasileira.2.39. Vandebroek...445-466. A. p.371-375. v. T. W.14. A. Boca raton. 2002. A. De-Polli... Rev. & Chan-a-ram.. Nitrate redutase activity of diverse grain sorghum genotype and its relayionships to nitrogen use efficienty. 524p. D. Duffy. B. 15. New York: Oxford University. Vitti. Fusang. Hubbel. Maranville. B. Amsterdam. p. Vargas. p. n. D. 2001. W. Perdas do nitrogênio da uréia no sistema solo-planta em dois ciclos de cana-deaçúcar. H.91. & Vanderleyden. & Döbereiner.128.. G. Gava. S. Ottwa. Applied Environmental Microbiology. Plant Sci.. Arch. S. C..175-182. T. 2002. Applied and Environmental Microbiology. K. p. Higley. v. P. Whitesides... S. p.. E.453-457. Journal of Bacteriology. A. v. Spotts.Vidaver. New Delhi.6.. J. C. Chandrapalaiah. Characterization of Azospirillum isolated from nitrogenfixing roots of haversted sorghum plants. N. S. B. M.. R. 1990. C.38. Yamane. Z. Washington. Wani. 1987. 148-94. Inoculation with association nitrogen-fixing bacteria: role in cereal grain production improvement. Barletta. Frequency.. S. N. v.. distribution and characteristics of endophytic Pseudomonas syringae in pear trees. v.2198-2208. p. 363-393. R. A. P.. C. Lambrecht. Westby. Assimilation of NH4+ by Azospirillum brasilense grown under Nitrogen limitation and excess. p. Feng.81. D. 1991. Steinberg. Arunakumari. vol. S. P. Indian Journal of Microbiology. P. p. Fed-batch tecniques in microbial processes. J. n.68. 1979. G. 1985.. Ishimaru. & Meecks. A. Wong. A. N. Zinniel.169(9). Australian Journal of Experimental Agriculture. C. Kuczmarski. D..8 Referências Bibliográficas 124 Wani. Washington. . K. 1984. p. Enderlin.30. v. v. A.4211-4214. 30.. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. K. and Dsrt.. P. Applied andEnvironmental Microbiology.. Response of pearl millet cultivars to inoculation with nitrogen-fixing bacteria.. A.1189-1191. Harris. P. Phytopathology. Stenberg.. Shimizu.. Joseph. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants.21.