PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT. APHA 17 Edición, modificado Sección Microbiología de Alimentos 1.OBJETIVO PRT-712.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 1 de 8 Conocer el número de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus (microorganismos característicos del yogurt) presentes en una muestra de yogurt. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Se aplicará a las muestras de yogurt o en otros alimentos que se requiera su investigación. 3. FUNDAMENTO El método consiste en sembrar un volumen dado de una muestra representativa y homogénea del alimento a analizar y/o diluciones de la misma en placas Petri, utilizando medios de cultivo selectivo y en condiciones de tiempo, temperatura y exigencias de oxígeno apropiados para cada microorganismo: a) Medio MRS acidificado, seguido de una incubación anaeróbica a 37ºC ± 1º C por 72 horas para el conteo de Lactobacillus delbrueeckii subsp bulgaricus. b) Medio M17 completo seguido por un incubación a 37º C ± 1ºC por 48 horas para el conteo de Streptococcus thermophilus. Después del período de incubación, se cuentan las colonias características y se confirma mediante pruebas apropiadas y examen microscópico. El número de microorganismos característicos por gramo de muestra es calculado a partir del número de colonias obtenidas en placas cuyos niveles de dilución muestren un resultado significativo. El Reglamento Sanitario vigente en el artículo 220 estipula que los microorganismos lácticos presentes en el producto final deberán ser viables y en cantidad superior a 106 ufc/g. 4. 4.1 4.2 4.3 REFERENCIAS “Standard Methods for the Examination of Dairy Products”, APHA 17 Edición, capítulo 9.080. ISO/DIS 7889 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-Colony count technique a 37 ºC . International Organization for Standardization. 1985. Norma cubana: NC ISO7889:2009 “Yogurt _ Enumeración de los microorganismos característicos- técnica del conteo de colonias a 37ºC” (ISO 7889:2003, IDT) PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT.1. Al microscopio estos microorganismos aparecen como bacilos. generalmente cortos. Streptococcus thermophilus: Microorganismos termófilos que forman colonias lenticulares de diámetro desde 1 mm a 2 mm en medio M-17.5 6. modificado Sección Microbiología de Alimentos 5. bajo las condiciones especificadas en este procedimiento.2 l= Oxoid) Stomacher 400 Baño de agua regulado a 47ºC ± 2ºC.2 5.1.1 TERMINOLOGÍA PRT-712. estos microorganismos aparecen como células ovoides o esféricas (de diámetro 0. AnaeroGen: Sistema generador de atmósfera anaeróbica que contiene como componente activo ácido ascórbico. Indicador anaeróbico: Es una tira de algodón impregnada en una solución indicadora redox y que permite controlar visualmente que las condiciones anaeróbicas han sido alcanzadas y mantenidas. no móviles y catalasa negativos. No forman esporas.5 L= Oxoid HP 11) (jarra 2. La reacción del ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica y alcanza una temperatura de 65 º C.7 . 5.7 m a 0.1.4 6.1.9 m). Lactobacillus delbrueckii subsp. pHmetro 5.3 6. INSUMOS Y EQUIPOS EQUIPOS Contador de colonia Incubadora regulada a 37º C ± 1 Baño de agua termorregulado a 50ºC Equipo de incubación en atmósfera de CO2 : (jarra 3.3 5.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 2 de 8 Atmósfera anaeróbica: al emplear el sobre de Anaerogen se reduce el nivel de oxígeno de la jarra por debajo de 1% en 30 minutos. MATERIALES.1.2 6. La condición anaeróbica se visualiza por el cambio de color del rojo al blanco. en ocasiones alargados.4 5.1. El nivel resultante de dióxido de carbono oscilará entre 9 y 13 %. en pares o en cadenas largas. que forma colonias lenticulares y frecuentemente aguzadas de diámetro desde 1 mm a 3 mm en el medio MRS acidificado.1. Al microscopio. son Gram positivos. bulgaricus: Microorganismo termófilo. Son Gram positivos y catalasa negativos.1 6.6 6. 6. APHA 17 Edición.5 6.1 6. Sobre generador de atmósfera anaeróbica (AnaeroGen): para jarra 3.7 6.3.3 6.5 MATERIALES Placas de Petri de 100 mm de diámetro. Acido acético para reducir pH a 5. Reactivos Tinción de Gram.1 % en frascos tapa rosca con 90 mL Agua peptonada 0.1 6.2. Agar MRS. Indicador de anaerobiosis (Oxoid BR55) Espátulas estériles MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Agua peptonada 0.3. modificado Sección Microbiología de Alimentos PRT-712.3. 7.2.1 % en tubos graduados con 9 mL.4 6.PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT.3 6. Agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 3 de 8 6. Láminas portaobjetos. APHA 17 Edición.2 6. Leche descremada reconstituida al 0.3.2.1 6.2 6.4 ± 0.6 6.5 L utilizar Oxoid AN35 (envase c/ 10 bolsitas) para jarra 2.3. .1 7.5 L utilizar Oxoid AN25 (envase c/ 10 bolsitas) 6.3 6.5 6.3.2 6.2. Pipetas graduadas de 1 ml y 10 ml estériles. DESARROLLO Para requerimientos generales.2.2.3.7 6.8 7.4 6.6 6.1 Yogures no afrutados: Mezclar cuidadosamente el contenido del recipiente de la muestra usando una espátula.1.3. ver ISO 8261/ IDF 122. Solución de lactosa al 10%.1% (para blancos de dilución). Frascos Schott de 250 mL con tapa rosca para envasar los medios de cultivo.1 en agar MRS después de la esterilización.2. 2 7.4 7. Repetir 7.1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible (utilizar un tubo de centrífuga de fondo redondo de cristal resistente de 200 mL o la concavidad del mezclador rotatorio o el recipiente plástico del mezclador peristáltico). Tomar 1 mL de la dilución 10-1 y colocar en un tubo con 9 mL de agua peptonada 0.8 7.4. 7. Hacer diluciones decimales tomando 1 ml de dil -1 a 9 mL de agua peptonada.1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible como se describe en 7.3 7. APHA 17 Edición. Se tiene la dilución 10-2 Repetir el punto 7.2 7. Se tiene la dilución 10-1.PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT.2 7.1 %.2 PRT-712. Mezclar por 1 minuto con el mezclador.4.1.2.4.9 7. Otra manera de preparar diluciones es a los 10 g preparados en 7. observando varios campos de un frotis de la muestra previamente teñida de azul de metileno.1 7.1 7. para estimar la densidad de los dos tipos de bacterias.9 hasta dil -7 si es necesario. Yogures afrutados Mezclar el contenido completo del recipiente de la muestra por 1 minuto usando el mezclador. Tomar 2 mL de la dilución 1/2 y colocar en un tubo con 8 mL de agua peptonada 0.4.4.4.4.7 7. hasta realizar la dilución 10-7.5 7.4. cocos y bacilos y seleccionar el rango de dilución apropiado que será empleado para el conteo de cada tipo.4.6 7. Preparar diluciones decimales utilizando agua peptonada 0. Diluir a 100 g con el diluyente para obtener una dilución 10-1.4.4.1.1 y 7.1 % y pipetas de 1 mL.3.4 7. Examen microscópico Realizar un examen microscópico preliminar.2.3 7. Se tiene la dilución 1/2.2. Pesar 10 g ± 0. Preparación dilución primaria Tomar 10 mL o g de muestra de yogurt y colocar en un tubo con tapa rosca con 10 mL de buffer fosfato pH 7.10 .1 %.4 4.2 agregar el diluyente a estas porciones hasta una masa de porción de ensayo 50 g. modificado Sección Microbiología de Alimentos 7.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 4 de 8 Pesar 10 g ± 0.1 7. 5 7.PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT.7. Marcar placas de Petri en duplicado de la dilución 10-4.6.1 7.6.6. Colocar el porta placas dentro de la jarra.6.6 7. APHA 17 Edición. PRT-712. de las paredes y de la tapa de la jarra.2 7.7. Las placas con Agar MRS en posición invertida en el portaplacas de la jarra incubarlas a 37ºC ± 1ºC por 72 h en atmósfera de aproximadamente 10-20% de dióxido de carbono (CO2).6.1 7.7 .6. Verter 15 ml de medio M 17 con B-glicerofosfato de sodio previamente fundido y temperado a 47º C ± 2ºC en las placas marcadas para Streptococcus thermophilus.7 7. Sembrar por duplicado en placas de Petri 1 ml de cada una de las diluciones seleccionadas.3 7. al agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio y al agua peptonada 0.4 7. modificado Sección Microbiología de Alimentos 7. Abrir el sobre de aluminio y extraer la bolsa de AnaeroGen. de las paredes y del techo de la incubadora.1 7. para Streptococcus thermophilus.5.2 7.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 5 de 8 Realizar control de esterilidad al agar MRS. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de otras.6. Colocar no más de 6 placas por pila.7. 10-5.4 7.6. Vertir 15 ml de medio Agar MRS acidificado previamente fundido y temperado a 47º C ± 2ºC en las placas marcadas para Lactobacillus bulgaricus.7.6.2 Controles Realizar control de ambiente con placas con agar Plate Count.6.6.5 7. Poner el indicador de anaerobiosis en la pared de la jarra. 10-5. Incubar las placas bajo las siguientes condiciones según el medio de cultivo: Las placas con agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio en posición invertida e incubarlas a 37 ºC ± 1ºC por 48 h en aerobiosis.6 7.6.1 %.6.7. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio por rotación y dejar solidificar sobre una superficie plana y fría. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de otras.6 7.7.5 7. Inoculación e incubación Marcar placas de Petri en duplicado de la dilución 10-4.6.7. 7.3 7.5. Colocar no más de 6 placas por pila. para Lactobacillus bulgaricus. 7. redondas o lenticulares. 7. redondas o lenticulares o en forma de estrella. Nota: Si las placas son revisadas y requieren reincubación debe utilizarse un nuevo sobre de AnaeroGen siguiendo el proceso desde el punto. Examinar las colonias dudosas cuidadosamente. 7. Nota: El tiempo que transcurre entre que se abre el sobre de aluminio y que se cierra la jarra no debe ser mayor de 1 minuto. suaves y opacas sin pigmento. Examinar las placas bajo condiciones de luz adecuadas.7.2 . convexas.6.1. para enviarla como basura de riesgo a la Unidad de Ingeniería (el ISP la elimina en bolsa roja).7.7. Eliminar la bolsita de AnaeroGen en bolsa compactadora.6.6. 7.1.6. las colonias de Streptococcus thermophilus son blanquecinas de 1-2 mm de diámetro. 7.7. modificado Sección Microbiología de Alimentos PRT-712.9 Finalizado el período de incubación retirar las placas de la jarra.8 7.7. Antes de abrir la jarra verificar que el indicador de anaerobiosis halla virado a color blanco.8 Colocar la tapa de la jarra inmediatamente. Una exposición mas prolongada hace disminuir la reactividad y puede dar lugar a que no se obtenga totalmente las condiciones anaeróbicas de la jarra. de bordes lisos o rugosos.1 7.PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT.10 7.7 7. APHA 17 Edición. y contar las colonias características: En el agar M 17 con B-glicerofosfato de sodio.2 7.11 Dejar por lo menos 20 a 30 minutos que la bolsita de AnaeroGen alcance la temperatura ambiente antes de eliminarla en los contenedores. para facilitar el conteo puede emplearse el contador de colonias. empleando una lupa de mayor aumento requerido para distinguir las colonias de partículas extrañas. No cometer errores al contar restos de partículas disueltas o precipitadas de la muestra como colonias.1 Conteo de colonias Seleccionar las placas que contengan entre 25 a 250 ufc. En el agar MRS las colonias de Lactobacillus bulgaricus son blanquecinas de 2-3 mm de diámetro.6.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 6 de 8 Nota: la bolsita de AnaeroGen se calienta cuando es expuesta al aire. de bordes lisos. obtenido en las placas correspondientes a la dilución seleccionada. Las colonias provenientes del agar M17 son cocos Gram positivos en cadenas o en pares.6 7. Confirmar por coloración de Gram (IT-712.8. La identificación de cepas dudosas puede ser realizada acorde a la ISO 9232/IDF 146 Anotar los resultados en el registro RG-712.8. catalasa negativos.4 7.8.9 7.9.PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT. . no formadores de esporas.1 7. APHA 17 Edición.3 Confirmación PRT-712.00-042.02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 7 de 8 Seleccionar las colonias de las placas usadas para el conteo tal que el número tomado de las mismas sea igual a la raíz cuadrada del conteo total de colonias.2 = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento Cuando no se pueda aplicar la fórmula y se obtenga promedio. d 7.1 x n2 ) ] x d 7.8.5 7.8 7. se multiplica por el factor de dilución correspondiente. Las colonias provenientes del agar MRS son bacilos Gram positivos. n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva. generalmente largos y delgados. modificado Sección Microbiología de Alimentos 7. Cálculo y Expresión de los resultados Calcular el recuento el número de microorganismos característicos en la muestra de ensayo usando la siguiente ecuación cuando se obtengan dos diluciones consecutivas dentro de placas normales: ΣC [ ( 1 x n1 ) + ( 0.2 7. se promedian los resultados y el valor final se expresa en ufc por gramo o por ml según corresponda.8.9. el número de unidades formadoras de colonias.8.1 N= donde: N = número de colonias por ml o g de producto Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = número de placas contadas de la menor dilución.00-066) si es necesario las características morfológicas de los microorganismos investigados. en cadenas o filamentos algunos presentan granulaciones internas y catalasa negativos. 02-047 Fecha emisión: Marzo 1999 Revisión: 2 Fecha revisión: 02-07-2010 Página 8 de 8 Los resultados para cada microorganismo presente en la muestra se expresan en unidades formadoras de colonias por gramo o por ml (ufc/g o ufc/ml). Los resultados deberán ser expresados como número de 1. No Aplica .9. Si hay sólo recuentos menores a 10. modificado Sección Microbiología de Alimentos 7. Registrar como recuento estimado. por gramo de muestra es igual a: N = NL + NS 7. N.9. ANEXOS 9.9. El número total de microorganismos característicos.9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada.5 7.3 7.9.1 REGISTROS Registro de resultados análisis recuento de lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus en muestras de yogurt. 8. reportar el número de microorganismos por gramo como: Menor que 10 x 1/d (siendo d el valor correspondiente a la dilución más baja) Si hay sólo recuentos que exceden los 250 ufc.PROCEDIMIENTO RECUENTO DE LACTOBACILLUS BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS EN YOGURT. hacer un recuento estimada de las placas que tengan un recuento más cercano a 250 ufc y multiplicar por el recíproco del valor correspondiente a la dilución más alta.9.4 PRT-712. APHA 17 Edición. bulgaricus por gramo. 8.0 a 9.7 Donde : NL = es el valor numérico del Lactobacillus delbrueckii subsp. NS = es el valor numérico de Streptococcus thermophilus por gramo.6 7.
Report "Procedimiento Recuento de Lac to Bacillus Bulgaricus y Streptococcus Thermophilus en Yogurt."