Presentación Criopreservación de Cepas

April 3, 2018 | Author: ENRIQUE | Category: Bacteria, Chemistry, Earth & Life Sciences, Biology, Chemicals


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CRIOPRESERVACIÓN DE CEPASFEBRERO, 2018 PRESERVACIÓN DE LAS COLECCIONES BACTERIANAS En un laboratorio de bacteriología, donde se realizan cultivos y aislamiento de cepas bacterianas, hay que pensar en mantener las colecciones (cepario) durante largos períodos (años) y no solo de algunos meses, por lo tanto se utilizan métodos que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos. LA PRESERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS  Método de elección o de conservación a largo plazo -Conservación por congelación -Conservación por liofilización  Métodos Alternativos -Conservación por transferencia periódica MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Congelación  Albajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo de éste se reduce el metabolismo bacteriano drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo; por ejemplo con nitrógeno líquido con el cual se alcanza una temperatura de -196°C. OBJETIVOS DE PRESERVAR CULTIVOS BACTERIANOS a) Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de preservación. b) Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células. c) Mantener las células genéticamente estables. PRECAUCIONES A CONSIDERAR EN EL PROCESO DE LA CONGELACIÓN La formación de cristales de hielo (pueden romper las células), para evitar esto se deben utilizar:  Suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles  Algunos investigadores recomiendan una disminución gradual de temperatura (1°C/min) de -20°C hasta -30°C para luego sumergir en N2 líquido. Así mismo al momento de sacar un vial del ultracongelador la descongelación del mismo debe ser rápida. CONGELACIÓN CON N2 LÍQUIDO VENTAJAS  Se puede usar por períodos largos o cortos de tiempo.  Se utiliza N2 líquido (alcanzando hasta -196˚C).  Elmicroorganismo se cultiva al empezar la fase estacionaria (muestra más resistencia a daños por congelación y descongelación).  Se utiliza un crio-protector. CRIOPROTECTORES OBJETIVOS: *Minimizar daños durante la congelación. *Limitar la formación de hielo (tasa de congelación) *Vitrificación del agua • Glicerol 10% CARACTERISTICAS: • Leche descremada *No tóxico para la célula. *Penetrar fácilmente en la membrana celular. *Unirse a los electrolitos o a las moléculas de agua. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VIABILIDAD Y ESTABILIDAD DE LAS CEPAS TEMPERATURAS DE ALMACENAMIENTO  -196°C: N2. Se utiliza para la conservación de bacterias, virus y líneas celulares. Existen varios problemas prácticos: el N2 se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien cerrados para evitar la pérdida del N2.  -30°C: congelador de frigoríficos.  -70°C: nieve carbónica (CO2 sólido) o de ultracongeladores Es el método más utilizado en los laboratorios de bacteriología. ALTA DENSIDAD CELULAR:  Usar entre 108 a 109 células/ml: para minimizar lisis celular. RECUPERACIÓN POST-CONGELACIÓN • STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos microorganismos inmediatamente en pruebas fisiológicas, realizar 1 o 2 pases previos. • Transferir a medios adecuados dependiendo del microorganismo conservado (caldos o medios con agar). • Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento por previo estado de STREESS. CRIOPRESERVACIÓN Ventajas:  Viabilidad 7 a 10 años  Baja o nula variabilidad genética  Apto para una gran variedad de microorganismos.  Simple, pre‐tratamiento mínimo. Desventajas:  Equipamiento y mantenimiento $$$.  Criotubos, racks para criotubos, etc.  Monitoreo de la Temperatura.  Suministro constante de energía eléctrica. (Ultra congelador) CONTROLES DE CALIDAD: Realizarlo ANTES Y DESPUÉS de la preservación.  Viabilidad y pureza  Estabilidad de caracteres relevantes.  Requerimientos para el crecimiento.  Métodos de preservación.  Frecuencia de controles de mantenimiento (1 control al año) Cuando se ha estandarizado en tiempo y viabilidad, en caso contrario lo recomendable es el monitoreo de las cepas conservadas por ultra congelación cada mes. METODOLOGÍA EMPLEADA EN LA LA CONGELACIÓN • Obtener el crecimiento del cultivo hasta su máximo de densidad celular (al inicio de la fase estacionaria). • Resuspender el cultivo en tubos con solución salina fisiológica, rotulados previamente. • Adicionar a esta suspensión el medio criopreservador de elección, homogeneizar perfectamente. • Alicuotar la suspensión en viales o crio tubos previamente rotulados. • Congelar los viales cerrados herméticamente, se recomienda congelación lenta, 1°C por minuto hasta -30°C antes de pasarlos a nitrógeno líquido; sin embargo en el laboratorio se sumergen inmediatamente en el N2 líquido • Almacenar inmediatamente al ultracongelador a -70ºC. REQUERIMIENTOS PARA CONGELAR POR SU ATENCIÓN GRACIAS Departamento de Bacteriología, laboratorio de IRAB, personal para disipar sus dudas respecto a congelación. [email protected] ENRIQUE HERRERA GONZÁLEZ [email protected] SUGEI GÁMEZ CONTRERAS
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