CRIOPRESERVACIÓN DE CEPASFEBRERO, 2018 PRESERVACIÓN DE LAS COLECCIONES BACTERIANAS En un laboratorio de bacteriología, donde se realizan cultivos y aislamiento de cepas bacterianas, hay que pensar en mantener las colecciones (cepario) durante largos períodos (años) y no solo de algunos meses, por lo tanto se utilizan métodos que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos. LA PRESERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS Método de elección o de conservación a largo plazo -Conservación por congelación -Conservación por liofilización Métodos Alternativos -Conservación por transferencia periódica MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Congelación Albajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo de éste se reduce el metabolismo bacteriano drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo; por ejemplo con nitrógeno líquido con el cual se alcanza una temperatura de -196°C. OBJETIVOS DE PRESERVAR CULTIVOS BACTERIANOS a) Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de preservación. b) Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células. c) Mantener las células genéticamente estables. PRECAUCIONES A CONSIDERAR EN EL PROCESO DE LA CONGELACIÓN La formación de cristales de hielo (pueden romper las células), para evitar esto se deben utilizar: Suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles Algunos investigadores recomiendan una disminución gradual de temperatura (1°C/min) de -20°C hasta -30°C para luego sumergir en N2 líquido. Así mismo al momento de sacar un vial del ultracongelador la descongelación del mismo debe ser rápida. CONGELACIÓN CON N2 LÍQUIDO VENTAJAS Se puede usar por períodos largos o cortos de tiempo. Se utiliza N2 líquido (alcanzando hasta -196˚C). Elmicroorganismo se cultiva al empezar la fase estacionaria (muestra más resistencia a daños por congelación y descongelación). Se utiliza un crio-protector. CRIOPROTECTORES OBJETIVOS: *Minimizar daños durante la congelación. *Limitar la formación de hielo (tasa de congelación) *Vitrificación del agua • Glicerol 10% CARACTERISTICAS: • Leche descremada *No tóxico para la célula. *Penetrar fácilmente en la membrana celular. *Unirse a los electrolitos o a las moléculas de agua. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VIABILIDAD Y ESTABILIDAD DE LAS CEPAS TEMPERATURAS DE ALMACENAMIENTO -196°C: N2. Se utiliza para la conservación de bacterias, virus y líneas celulares. Existen varios problemas prácticos: el N2 se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien cerrados para evitar la pérdida del N2. -30°C: congelador de frigoríficos. -70°C: nieve carbónica (CO2 sólido) o de ultracongeladores Es el método más utilizado en los laboratorios de bacteriología. ALTA DENSIDAD CELULAR: Usar entre 108 a 109 células/ml: para minimizar lisis celular. RECUPERACIÓN POST-CONGELACIÓN • STREESS!! Una vez recuperadas nunca utilizar estos microorganismos inmediatamente en pruebas fisiológicas, realizar 1 o 2 pases previos. • Transferir a medios adecuados dependiendo del microorganismo conservado (caldos o medios con agar). • Tiempo de incubación: puede disminuir la velocidad de crecimiento por previo estado de STREESS. CRIOPRESERVACIÓN Ventajas: Viabilidad 7 a 10 años Baja o nula variabilidad genética Apto para una gran variedad de microorganismos. Simple, pre‐tratamiento mínimo. Desventajas: Equipamiento y mantenimiento $$$. Criotubos, racks para criotubos, etc. Monitoreo de la Temperatura. Suministro constante de energía eléctrica. (Ultra congelador) CONTROLES DE CALIDAD: Realizarlo ANTES Y DESPUÉS de la preservación. Viabilidad y pureza Estabilidad de caracteres relevantes. Requerimientos para el crecimiento. Métodos de preservación. Frecuencia de controles de mantenimiento (1 control al año) Cuando se ha estandarizado en tiempo y viabilidad, en caso contrario lo recomendable es el monitoreo de las cepas conservadas por ultra congelación cada mes. METODOLOGÍA EMPLEADA EN LA LA CONGELACIÓN • Obtener el crecimiento del cultivo hasta su máximo de densidad celular (al inicio de la fase estacionaria). • Resuspender el cultivo en tubos con solución salina fisiológica, rotulados previamente. • Adicionar a esta suspensión el medio criopreservador de elección, homogeneizar perfectamente. • Alicuotar la suspensión en viales o crio tubos previamente rotulados. • Congelar los viales cerrados herméticamente, se recomienda congelación lenta, 1°C por minuto hasta -30°C antes de pasarlos a nitrógeno líquido; sin embargo en el laboratorio se sumergen inmediatamente en el N2 líquido • Almacenar inmediatamente al ultracongelador a -70ºC. REQUERIMIENTOS PARA CONGELAR POR SU ATENCIÓN GRACIAS Departamento de Bacteriología, laboratorio de IRAB, personal para disipar sus dudas respecto a congelación. [email protected] ENRIQUE HERRERA GONZÁLEZ [email protected] SUGEI GÁMEZ CONTRERAS