PRACTICA 1.NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD 4. Cuestionario. ¿Qué es bioseguridad? Es el conjunto de medidas preventivas que tienen como objetivo proteger la salud y la seguridad del personal, de los pacientes y de la comunidad frente a diferentes riesgos producidos por agentes biológicos, físicos, químicos y mecánicos. ¿Cuáles son las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología? Normas generales de bioseguridad. Mantener una actitud responsable, no se permite hacer bromas, jugar, correr o gritar. No se permite el ingreso de personas ajenas al laboratorio y/o que no porten sus implementos de bioseguridad adecuados. No se permitirá el ingreso de personas bajo efectos de bebidas alcohólicas o sustancias psicoactivas. Para el ingreso a los laboratorios, préstamo de material o equipo se debe presentar el carnet vigente. Todas las superficies de trabajos se limpiaran y desinfectaran diariamente y siempre que se produzca un derrame. Usar bata de manga larga con puños, la cual debe estar completamente cerrada. Usar guantes de nitrilo, tapabocas, gorro, gafas de seguridad y todos los elementos de seguridad solicitados dependiendo del riesgo. Evitar tocar sus ojos o piel con las manos enguantadas. Usar cabello recogido, calzado cerrado y bajo, no usar falda, joyas, manillas, reloj o elementos que puedan entorpecer la manipulación de los materiales o equipos. Bajo ninguna circunstancia se permitirá comer, beber o fumar en el laboratorio. Bajo ninguna circunstancia, se debe tocar, oler o probar las sustancias químicas o biológicas utilizadas en el desarrollo de las prácticas. No trabajar nunca solo en el laboratorio. No pipetear sustancias con la boca. Cuando en el desarrollo de las prácticas se utilice diluciones, agregue el ácido sobre el agua. ácido y agua en No devolver reactivos a los frascos, así no hayan sido utilizados. Siga fielmente todas las recomendaciones dadas por el docente responsable del laboratorio. Al calentar los tubos de ensayo en el mechero dirija la boca donde nadie corra peligro de quemarse. Los residuos y muestras de procedimientos de microbiología que van a ser incinerados fuera del laboratorio deber ser sometidos a desactivación en autoclave. Como norma general no se podrá verter ninguna sustancia peligrosa para el medio ambiente por el desagüe. Al culminar el trabajo, dejar limpio y ordenado el mesón, devolver los elementos y materiales perfectamente limpios, asegúrese de dejar cerrado el gas, agua y lavarse las manos. Para la eliminación de los residuos se deben utilizar los recipientes destinados para este fin siguiendo las indicaciones del docente responsable del laboratorio. Cualquier accidente por pequeño que sea debe comunicarse al docente responsable del laboratorio. Trabajo con material de vidrio No se debe calentar recipientes de vidrio común. No calentar directamente al mechero de gas ni colocar recipientes de vidrio vacíos o húmedos por fuera en la parrilla eléctrica. Cuando utilice cubreobjetos, se deben revisar los mesones y evitar que queden sobre ellos. Comprobar la temperatura del material de vidrio. No forzar el cierre del material. Comprobar cuidadosamente la temperatura de los recipientes que hayan estado sometidos a calor antes de tomarlos directamente con las manos. No lavar los elementos de vidrio de laboratorio con medios abrasivos que al rayar la superficie debilitan el vidrio. Al lavar el material utilice guantes y gafas de seguridad y no deje residuos. Al lavar la vidriería de laboratorios no se debe someter a cambios brusco de temperatura. PRACTICA 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 4. Cuestionario. 1. ¿Qué es un medio de cultivo; de qué están compuestos principalmente; cómo se clasifican según su proporción de Agar y según su suministro de nutrientes? Un medio de cultivo es una mezcla de diversos nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los micro organismos bajo determinadas condiciones físico-químicas. Macronutrientes. Micronutrientes o elementos traza. Factores de crecimiento. Son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Un medio de cultivo está compuesto principal mente de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Los medios de cultivos se pueden clasificar de acuerdo al porcentaje de Agar en tres grupos: medios sólidos, medios semi-sólidos y medios líquidos. El agar nutritivo es usado como medio de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos, pero no para virus (aunque los virus bacteriófagos crecen frecuentemente en bacterias cultivadas en agar). Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez. Agar Kligler: Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos conmás detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sódico. Agar Levine ó EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas. Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias.El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV. Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios. Agar Gardnerella:Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia. Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):Se utiliza para el aislamiento de bacterias del género Legionella CLASES DE NUTRIENTES Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías: Universales (es decir, aquellos que son requeridos por todos los procariotas): agua, CO2, fosfatos y sales minerales; Particulares; Factores de crecimiento. 2.1 2.1.1 NUTRIENTES UNIVERSALES EL AGUA Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es: el principal constituyente del protoplasto bacteriano; el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas; un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas). Las fuentes de agua pueden ser: endógena: procedente de procesos de oxido-reducción; exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas. Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria: Existen determinadas sustancias que absorben y superficies que adsorben de modo más o menos intenso moléculas de agua, dejándolas inasequibles para la bacteria. Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo. La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como aW= PS/PW donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y P W es la presión parcial de vapor del agua destilada. ¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la aW = humedad relativa/100). Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99. Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a 1. Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales, tienen aW de alrededor de 0.995. Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980. Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0.950. En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba citadas: procariotas halófilos extremos, como la arquea Halobacterium, que habita en lagunas hipersalinas; bacterias (y sobre todo, ciertos microrganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares. 2.1.2 EL CO2 El anhidrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias: Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos). Las arqueas metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía de modo litotrofo: CO2 + 4H2 --> CH4 + 2H2O (G'0<0) Además, algunas arqueas no sólo usan CO 2 como aceptor de electrones para obtener energía, sino que, además lo usan como fuente de carbono celular (arqueas metanogénicas autotrofas). Los heterotrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y catabólicas. El origen del CO2 puede ser: endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono; exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas. Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO 2 atmosférico (0.03%), pero algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO 2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales. 2.1.3 FÓSFORO Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece también en coenzimas y en proteínas. 2.1.4 SALES MINERALES Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl -) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, Ca++, Fe++. El ión potasio (K+): interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la síntesis de proteínas. En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared. El ión magnesio (Mg++): estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos; como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera. Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas. El ión calcio (Ca++): es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas. El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro (p.ej., hidroxamatos y enterobactina). El hierro participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S); interviene como cofactor en ciertas enzimas. Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como micronutrientes o elementos traza: El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++. El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co+ + libre). El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARNpolimerasas. El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico. El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2. 2.2 NUTRIENTES PARTICULARES 2.3.1 NITRÓGENO Y AZUFRE Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades biosintéticas. Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido: el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas); el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA. ¿En qué formas químicas entran N y S a las bacterias? La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterotrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada: como NO3--, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitritoreductasas asimilatorias. como SO42-. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S. Muchas bacterias heterotrofas pueden usar alguna forma reducida de N inorgánico: amonio (NH4+) de S inorgánico: sulfuros (S2-, SH-) de N orgánico: aminoácidos, péptidos de S orgánico:cisteína. Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden usar nitratos. 2.3.2 FIJACIÓN DE NITRÓGENO La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N 2), que procede de microorganismos desnitrificantes (véase el capítulo 10). Sin embargo, esta gran reserva sólo puede servir de fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha evolucionado en eucariotas. (Lo más a que ha llegado la evolución es a seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariotas diazotrofos y ciertos eucariotas, como p. ej., la simbiosis entre raíces de leguminosas y bacterias del grupo de Rhizobium). La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular en amoniaco, según la siguiente ecuación: N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP ---------> 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi) Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes: Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S8-homocitrato)[2] Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se denomina a veces ferroproteína). Mecanismo del complejo dinitrogenasa: Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina o una flavodixina (FeS proteínas no hémicas), que los transfiere al componente II, que queda reducido. El componente II reducido se une a dos moléculas de ATP, y cambia su conformación, lo que le permite unirse al componente I. Entonces se produce la transferencia de electrones desde el componente II al componente I, con hidrólisis de ATP, lo que a su vez provoca la separación del componente II respecto del I. Una vez reducido el componente I (la molibdoferroproteína), éste transfiere los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). El amoniaco entra entonces en las rutas biosintéticas para convertirlo en N orgánico, incorporable a las macromoléculas. Mecanismo de la nitrogenasa 2. ¿Cuál es la utilidad de los medios de cultivo y qué diferencia un caldo de un medio sólido? UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Aislamiento de bacterias desde una muestra o material patógeno (secreción purulenta, orina, órgano, fecas, etc.) o de un alimento (leche, carne, etc.) 2. Estudio morfológico de las colonias. 3. Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o cepario). 4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en medios diferenciales. 5. Obtención de toxinas o investigación de sus características. 6. Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos (vacunas, antígenos, bacterinas, toxoides, etc.) SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA). 1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. 2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, yagaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos. 3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias 3. ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué? La esterilización La esterilización es un proceso a través del que se puede l o g r a r l a d e s t r u c c i ó n t o t a l d e l o s microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidadd e n t r o d e l c a m p o f a r m a c é u t i c o , y a q u e e x i s t e n m u c h o s p r o c e s o s q u e r e q u i e r e n l a u t i l i z a c i ó n d e materiales estériles. Entre éstos podemos destacar: ° La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. ° El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizadoen los laboratorios de microbiología. ° La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo demicroorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos,cosméticos, alimentos, etc.) Existen diversos métodos de esterilización. La selección del mét o d o a a p l i c a r e n c a d a c a s o e s t á determinada por el tipo de producto a esterilizar. PRACTICA 3. MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE 5. Cuestionario. Consulte la composición de los medios de cultivo empleados y regístrelos en su informe ¿Qué es un medio de cultivo selectivo y un medio de cultivo no selectivo? Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Los virus, por ejemplo, son obligados parásitos intracelulares, por lo que necesitan un medio que contenga células vivas. Un medio selectivo es un medio de cultivo en el que sólo puede crecer un tipo de microorganismo (hongos, bacterias entéricas, protozoos...). Un ejemplo de medio selectivo sería usar un medio rico en un antibiótico, como la ampicilina, para permitir únicamente el crecimiento de las bacterias resistentes a éste. En ciertos procesos industriales se requiere de áreas blancas. ¿Qué significa el término anterior? Dado que la creación de Zonas Blancas en espacios naturales vírgenes puede acabar siendo un ghetto para los sujetos hipersensibles, el grupo de expertos de Domosalud propone crear Áreas Blancas en el entorno urbano, espacios con Polución Cero. Para muchas personas sensibles será imposible vivir en una Zona Blanca - Zona Cero, sea en los Pirineos, el Maestrazgo o la Serranía de Ronda, porque tienen compromisos cotidianos, como escuela, familia o trabajo, y deben permanecer en la ciudad a pesar de la polución. Definimos el concepto más cercano de Área Blanca, un criterio que puede permitir tener un “hábitat blanco” en el entorno urbano, desde una guardería o un ambulatorio, hasta una casa rural o balneario, y sobre todo en las viviendas. Un hábitat blanco es el entorno saludable que precisan las personas con hipersensibilidad ambiental, como los alérgicos, asmáticos, bronquíticos, y más aún los que sufren sensibilidad química o electrosensibilidad. Domosalud propone como ÁREA BLANCA cualquier hábitat artificial donde se respetan en lo posible los criterios ambientales de Zona Blanca - Zona Cero. Del mismo modo que tenemos “zona no fumadores”, un Área Blanca será un espacio sin humo, sin olores, sin tóxicos, sin ruido y también sin radiaciones, o sea con Polución Cero (o casi). Tener un hábitat blanco puede exigir el blindaje físico de las radiaciones (microwave filter), un escudo frente a las radiaciones electromagnéticas recomendado por Next-Up (France). Deben considerarse las radiaciones de alta frecuencia (1-5 GHz) como las de baja frecuencia (50 Hz), y tanto las fuentes externas, como las internas de la propia vivienda. Generalmente también se requiere aislamiento acústico, filtrado y purificación del aire respirable y del agua potable, materiales biológicos en construcción, iluminación biodinámica y redes eléctricas biocompatibles, u otros equipamientos, para garantizar la calidad ambiental interior. Esta es nuestra praxis habitual, la Domoterapia, que es especialmente útil cuando existen sujetos hipersensibles, enfermos, ancianos o niños, para proteger las viviendas de las inmisiones nocivas. Crear un Área Blanca en la casa empieza porr la aplicación de criterios biológicos en la construcción, teniendo por referencia la Bäubiologie, como la exclusión de materiales de construcción tóxicos, especialmente los radiactivos, y la realización de instalaciones biocompatibles. Una vez definida y normalizada, la Certificación de Área Blanca de Domosalud podrá generalizarse como una referencia de salubridad ambiental, y aplicarse en los centros médicos, en particular a quirófanos, neonatos, UCI, UVI, etc. Y también deben aplicarse en todos los “espacios sensibles”, como guarderías, escuelas, asilos, hoteles, balnearios, etc. Como plantea la Bioconstrucción estos criterios de Áreas Blancas deben aplicarse habitualmente en la construcción de todas las viviendas, con mayor exigencia en los dormitorios, para tener Polución Cero, garantizando el descanso y la salud de toda la población. PRÁCTICA 4. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS PRACTICA 5. TÉCNICAS DE TINCIÓN 4. Cuestionario. Establezca las diferencias entre una coloración simple y una coloración de Gram Investigue que coloración se debe utilizar para observar las endoporas o esporas bacterianas, y para observar la cápsula. Mecanismos de Coloración: La coloración celular y tejidos son una combinación de fenómenos físicos y químicos de absorción: los fenómenos físicos de absorción, capilaridad y ósmosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes básicos por los tejidos ácidos y viceversa indican que hay reacción química. Los Colorantes: Son compuestos, orgánicos que contienen radicales cromóforos esto es que producen color y grupo de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son cromóforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los cromóforos imparten la propiedad cromógena al colorante y los anxocromos permiten que el colorante se una con la fibra o tejido. Preparación de Frotis Bacteriano para Coloración: Entes de la tinción las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro líquido en un porta objeto limpio y son extendido en una película uniforme y delgada. Se deja que la película seque en el aire y los microorganismos son fijados por sustancias químicas o por el calor moderado. Tinciones: Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de microorganismos Leer más: http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtml#ixzz3ZY0MqR72 COLORACION SIMPLE La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tinción puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior. Utiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).La tinción simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y lasestructuras celulares básicas. En las tinciones simples se usa un único reactivo, que preferentemente es de tipo básico y contiene un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se utilizansolamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas delmismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, seañade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente (sustancia química utilizada par intensificar la coloración), hay que añadirlo justo antes del colorante. COLORACION DE GRAM La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella. La mancha Schaeffer-Fulton es una técnica diseñada para aislar endosporas tiñendo cualquier endosporas presentes verde, y cualesquiera otros organismos bacterianos rojo. La mancha verde es verde malaquita, y la de contraste es safranina, que tiñe cualquier otro organismo bacterianas rojo. METODOS Tinciones Tinción de esporas (técnica de Shaeffer-Ffulton) Estructura y formación de las endosporas están descritas en este curso Encontrará información más completa sobre las endosporas bacterianas en los apuntes on line del Profesor E. Iañez Fundamento: envuelta La envuelta de la endospora es mas compleja e impermeable que la envuelta de las células vegetativas en las que se forma. Solo se puede teñir el contenido de la espora alterando su envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas dificulta que las endosporas se decoloren una vez teñidas. Verde de malaquitaEl verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células vegetativa . Cuando se calienta la preparación también penetra las endosporas.Decoloración Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no de la endospora. SafraninaEl colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas (decoloradas por el agua)Material necesarioCultivos de Bacillus subtilis y de Bacillus megaterium. Verde malaquita al 5 % en agua y Safranina al 1% en agua. Platina de Koch.Método de la tinción de endosporasCubrir la extensión con papel de filtro (dificulta la precipitación del colorante sobre las bacterias) verde de malaquitaDepositar la preparación sobre una platina de Koch. Añadir verde de malaquita. Esperar un minuto Vídeo.calorSeguir la tinción con calor : en emisión de vapores durante 5-10 minutos. Vídeo .Dejar enfriar. lavar Lavar con agua abundante. SecarsafraninaTeñir con safranina (dos minutos). Lavar con agua. Secar. Observar con objetivo de inmersión.Resultado Esporas teñidas de verde y células vegetativas teñidas de rosa. Observar la forma, tamaño relativo y posición de la espora en la célula vegetativa. Cultivo de 24 horas de Klebsiella Rhinoscleromatis en Macconkey o citrato de simmons (puede aislarse del excremento seco de palomas) Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa) Cepa de 24 horas en Agar Saboraud Cryptococcus neoformans. Tinta china ( recientemente filtrada) Frasco con mordente de Knaysi Frasco con rojo congo Frasco con mordente de cápsula La cápsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. El tamaño de estas cápsulas está influenciado por el medio en el que crece la bacteria. En algunos casos el grosor de la cápsula es sólo una fracción del diámetro de la célula, en otros casos la cápsula es mucho mayor que la célula. Las cápsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y además sirven de reservorio de alimento almacenado. Tienen Propiedad Antifagocitaria : Dificulta o impide la fagocitosis, lo cualpotencia su virulencia ya que favorece la multiplicación y facilita la invasión. Brinda Protección frente a Fagos.: Dificulta la fijación de bacteriófagos e impide el pasaje su pasaje que puedan afectar a la bacteria Las cápsulas de ciertas bacterias productoras de enfermedades aumentan la capacidad infectiva de las bacterias. Si la bacteria pierde totalmente su cápsula, puede perder su virulencia y por lo tanto su capacidad de producir enfermedad Algunos ejemplos de bacterias productoras de cápsulas son: neumococos, Klebsiella., aunque también puede estar presente en bacterias gram positivas y Gram. negativas Sin embargo las cápsulas tiene diversas propiedades como: Induce la producción de anticuerpos protectores (esto es útil en la producciónde algunas vacunas) y Permite la diferenciación de tipos serológicos dentro de la misma especie ya sea por aglutinación con sueros